Die Autoren danken Véronique de Berardinis für fruchtbare Diskussionen und Alain Perret, Christine Pellé und Peggy Sirvain für den technischen Support.

(1) Enzympräparat
<ol><li>Express und Proteine als zuvor beschriebenen26zu reinigen. Hinweis: Rekombinante Proteine wurden mit den folgenden Endkonzentrationen erhalten: αKAO von Catenulispora Acidiphila, UniProtKB-ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO von C. Pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL; PLP-DCs von S. Rumirantium, UniProtKB-ID: O50657 (LDCSrum), freie Zelle extrahieren mit insgesamt Enzym 12,44 mg/ml; PLP-DC von C. Pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM7 (DC-Cpin), 2,62 mg/mL.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Lösungen
Hinweis: Die folgenden Lösungen sind in entionisiertem Wasser bereit.
<ol><li>Bereiten Sie 1 M HEPES-Puffer, pH 7,5; mit 5 M NaOH einstellen. Hinweis: Während der pH-Wert Einstellung Schritt tragen Sie Schutzhandschuhe, Schutzkleidung, Augenschutz und Gesichtsschutz (P280). Spülen Sie bei Berührung mit den Augen (P305 P351, P338) vorsichtig mit Wasser mehrere min. entfernen Kontaktlinsen wenn möglich. Weiter spülen und rufen Sie sofort einen poison Center oder Arzt (P310). Der P-Code bezieht sich auf den Sicherheitshinweis (Gefahrenklasse und Kategorie; siehe, z.B., pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mM L-Lysin, 100 mM (5S) - hydroxy - L-Lysin, 150 mM α-Ketoglutaric Säure, 100 mM Natrium Ascorbat, 10 mM Ammonium Eisen(II) Sulfat Hexahydrat (Mohr Salz), 100 mM Pyridoxal-5-Phosphat (PLP) und 100 mM Dithiothreitol (DTT).</li>
	<li>Bereiten Sie 1 M, 2M und 6M Salzsäure (HCl) von einem 37 % HCl Lösung (ca. 12 M), Anschluss an die gleichen Sicherheitshinweise wie in 2.1 beschriebenen vor. Hinweis: Die Lösungen der α-Ketoglutaric Säure, Natrium-Ascorbat und Ammonium Eisen(II) Sulfat Hexahydrat müssen frisch am Tag der Benutzung erfolgen. Die Lysin-Lösung kann für mehrere Monate bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Die PLP-Lösung kann für einen Monat bei 4 ° c aufbewahrt werden Die DVB-t-Lösung kann für einen Monat bei-20 ° c gelagert werden</li>
</ol>3. analytische Waage Reaktionen
<ol><li>Methodenentwicklung für die Decarboxylierung Reaktion (5R) - hydroxy - L-Lysin<ol>
<li>Fügen Sie 11 µL 1 M Lösung von HEPES-Puffer pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM) zu einem 2 mL Reaktionscup. Fügen Sie 22 µL 100 mm (5S) - hydroxy - L-Lysin (Endkonzentration 10 mM), 2.2 µL 100 mm PLP (Endkonzentration 1 mM), und 2.2 µL 100 mm DTT (Endkonzentration 1 mM). Hinweis: Bei Reaktion mit LDCSrumist die Zugabe von DVB-t nicht erforderlich.</li>
		<li>Fügen Sie die gereinigte PLP-DC (Endkonzentration 0,1 mg/mL). Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 220 µL.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 3 h. Hinweis: Schütteln das Reaktionsgemisch mit offenen Deckel unter freiem Himmel sorgt für eine gute Sauerstoffversorgung der Reaktionsmedien. Es entfällt daher Sauerstoff in den Reaktionsmedien Blasen wirft.</li>
		<li>Sammle 10 µL des Reaktionsgemisches nach der Reaktion-monitoring-Verfahren in Schritt 6 beschrieben analysiert werden. Die Proben sind vorzugsweise derivatisiert und unmittelbar nach der Probenahme analysiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Methodenentwicklung für die enzymatische Kaskade Reaktion verbindet eine Hydroxylierung Schritt katalysiert durch αKAO mit Decarboxylierung katalysiert durch PLP-DC<ol>
<li>Fügen Sie 11 µL 1 m HEPES-Puffer pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM) zu einem 2 mL Reaktionscup. Fügen Sie 22 µL 150 mm von α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 5,5 µL von 100 mM von Natrium-Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM), 22 µL 10 mM von Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM), und 22 µL 100 mm L-Lysin (Endkonzentration 10 mM).</li>
		<li>Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 220 µL, unter Berücksichtigung der Volumen der Enzymlösung in Schritt 3.2.3 hinzugefügt werden.</li>
		<li>Fügen Sie die erforderlichen gereinigten αKAO Enzym nach der gezielten Regioselectivity: KDO1 für Hydroxylierung in Position c-3 oder KDO2 für Position c-4 L-Lysin. Die Endkonzentration des gereinigten Enzyms (0,05-0,5 mg/mL) wurde festgestellt, um eine komplette Umwandlung in ca. 3 h zu ermöglichen.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 3 h.</li>
		<li>2.2 µL von 100 mM von PLP hinzufügen (Endkonzentration ~ 1 mM) und 2.2 µL von 100 mM von DVB-t (Endkonzentration ~ 1 mM). Hinweis: Bei Reaktion mit LDCSrumist die Zugabe von DVB-t nicht erforderlich.</li>
		<li>Fügen Sie die gereinigte PLP-DC in einer Konzentration ermöglicht vollständige Umwandlung in 18 h: LDCSrum auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,1 mg/mL für die Kaskade Reaktion mit KDO1 und DCCpin auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL für die Kaskade-Reaktion mit KDO2.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien bei 300 u/min für 18 h.</li>
		<li>Führen Sie ein monitoring-Verfahren wie in Schritt 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Methodenentwicklung für die enzymatische Kaskade Reaktion verbindet zwei Hydroxylierung Schritte katalysiert durch αKAOs mit Decarboxylierung katalysiert durch PLP-DC<ol>
<li>Führen Sie Schritte 3.2.1-3.2.2.</li>
		<li>Fügen Sie KDO1 auf eine Endkonzentration von 0,05 mg/mL. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 3h.</li>
		<li>Eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, anhand der ursprünglichen Reaktionsvolumen fügen Sie KDO2 hinzu. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 18 h.</li>
		<li>3.2.5 Schritt ausführen.</li>
		<li>Fügen Sie die gereinigten PLP-DC-DC-Cpin am eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, mit der ursprünglichen Reaktionsvolumen berechnet. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit einem geöffnetem Deckel im Freien, bei 300 u/min für 18 h.</li>
		<li>Führen Sie das monitoring-Verfahren wie in Schritt 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. semi-präparative Eintopfreaktion biokatalytische
Hinweis: Die enzymatische Reaktionen erfolgen auf 0,1 Mmol L-Lysin in einer Open-Air-250 mL Glas Erlenmeyerkolben für ein Gesamtvolumen von 10 mL.
<ol><li>Synthese von Monohydroxylated-Derivaten<ol>
<li>Fügen Sie 0,5 mL 1 M HEPES-Puffer, pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM) in den Kolben. Fügen Sie 1 mL 100 mM L-Lysin (Endkonzentration 10 mM), 1 mL 150 mM α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM Natrium Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM), und 1 mL 10 mM Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM).</li>
		<li>Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 10 mL, unter Berücksichtigung der Volumen der Enzymlösung in Schritt 4.1.3 hinzugefügt werden.</li>
		<li>Fügen Sie die erforderlichen gereinigten αKAO Enzym nach der gezielten Regioselectivity: KDO1 auf eine Endkonzentration von 0,075 mg/mL für Hydroxylierung in Position c-3 oder KDO2 auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/mL für Position c-4 L-Lysin. Die Endkonzentration des gereinigten Enzyms war entschlossen, eine komplette Umwandlung in ca. 3 h zu ermöglichen.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur bei 300 u/min, für die entsprechende Dauer. Wenn die Reaktionskontrolle zeigt eine abgeschlossene Hydroxylierung Reaktion (führen Sie die Schritte, die in Schritt 6 für die Reaktion, die Überwachung Protokoll detailliert), fahren Sie mit Schritt 4.1.5. Eine typische Reaktionszeit ist 3 h.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch αKAO 100 µL 100 mm PLP hinzufügen (Endkonzentration ~ 1 mM). Fügen Sie 100 µL 100 mm DTT (Endkonzentration ~ 1 mM), außer bei Verwendung von LDCSrum.</li>
		<li>Fügen Sie gereinigtes PLP-DC: LDCSrum auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,05 mg/mL für die Kaskade Reaktion mit KDO1 oder DCCpin auf eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL für die Kaskade-Reaktion mit KDO2.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur, 300 u/min, 18 h und direkt im Schritt 4.3 beschriebenen Schritte weiter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthese der Dihydroxylated Ableitung<ol>
<li>Fügen Sie 0,5 mL 1 M HEPES-Puffer, pH 7,5 (Endkonzentration 50 mM), 1 mL 100 mM L-Lysin (Endkonzentration 10 mM), 1 mL 150 mM α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM Natrium Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM) , und 1 mL 10 mM Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM). Komplett mit H2O für ein Endvolumen von 10 mL, unter Berücksichtigung der Volumen der Enzymlösung in Schritt 4.2.2 hinzugefügt werden.</li>
		<li>Eine Endkonzentration von 0,075 mg/mL KDO1 hinzufügen. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur, bei 300 u/min für die entsprechende Dauer.</li>
		<li>Wenn die Reaktionskontrolle zeigt eine abgeschlossene Hydroxylierung Reaktion (siehe Schritt 6 für die Reaktion, die Überwachung Protokoll), fahren Sie mit Schritt 4.2.5. Eine typische Reaktionszeit ist 3 h.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL 150 mM α-Ketoglutaric Säure (Endkonzentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM Natrium Ascorbat (Endkonzentration 2,5 mM), und 1 mL 10 mM Mohr-Salz (Endkonzentration 1 mM).</li>
		<li>Eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, anhand der ursprünglichen Reaktionsvolumen fügen Sie KDO2 hinzu. Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur bei 300 u/min für 18 h.</li>
		<li>Wenn die Reaktionskontrolle zeigt eine abgeschlossene Dihydroxylation Reaktion (siehe Schritt 6 für die Reaktion, die Überwachung Protokoll), fahren Sie mit Schritt 4.2.7. Eine typische Reaktionszeit beträgt 18 h.</li>
		<li>Hinzufügen von 100 mM von DVB-t 100 µL (Endkonzentration ~ 1 mM), außer bei Verwendung der LDC-Srum.</li>
		<li>Fügen Sie die gereinigten DCCpin am eine ungefähre Endkonzentration von 0,5 mg/mL, mit der ursprünglichen Reaktionsvolumen berechnet.</li>
		<li>Schütteln Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur bei 300 u/min für 18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abschrecken<ol>
<li>Das Reaktionsgemisch indem man das Glas 250 mL Erlenmeyerkolben im Eisbad abkühlen.</li>
		<li>Fügen Sie sorgfältig über ca. 1 min., 0,25 mL 6 M HCl durch das abgekühlte Reaktionsgemisch manuell sanft schütteln. Befolgen Sie die gleichen Sicherheitshinweise wie in Schritt 2.1 beschrieben.</li>
		<li>Übertragung der saure Mischung in ein 50 mL konischen Boden Zentrifuge tube mit einem Glas Pasteurpipette ausgestattet mit einer Glühbirne, dann auf 1.680 x g und 4 ° C für 15 min zentrifugieren.</li>
		<li>Zurückziehen des Überstands und in einem 250 mL Rundboden Kolben beiseite stellen.</li>
		<li>Die konischen Boden Zentrifugenröhrchen mit Pellet fügen Sie 10 mL entionisiertem Wasser hinzu. Wirbel, die Pellets wieder auszusetzen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 1.680 x g, 4 ° C für 15 Minuten.</li>
		<li>Zurückziehen des Überstands und fügen Sie es in der 250 mL Rundboden Kolben mit der ersten überstand (Schritt 4.3.4).</li>
		<li>Frieren Sie der gesammelten Überstände durch Eintauchen des Kolbens in flüssigem Stickstoff mit konstanter Hand wirbeln ein, und übertragen Sie die Flasche sofort auf vielfältige Benchtop Einfrieren-Trockner zu verhindern, dass das Material Auftauen.</li>
		<li>Nach Abschluss der Gefriertrocknung (über Nacht), entfernen Sie die Flasche aus der Freeze-Trockner.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Reinigung der Amino-Alkohole aus Rohöl enzymatische Reaktionsmischung
<ol><li>Ionenaustausch-Harz<ol>
<li>Das gefriergetrocknete Produkt in den Mindestbetrag von wässrigen 0,1 M HCl (ca. 4 mL) auflösen bis feste Partikel nicht mehr für das nackte Auge sichtbar sind.</li>
		<li>Zustand eine Sulfonsäure Funktionsgruppe Kationenaustauschermembran Harz, in eine Glassäule (20 x 250 mm) 200-400 Mesh von eluierenden bei atmosphärischem Druck 1 M HCl (4 Spalte Bände) gefolgt von 0,1 M HCl (4 Spalte Bände; Spalte Volumen = 10 mL).</li>
		<li>Laden Sie die Probe sorgfältig an der Spitze des Harzes an den Wänden der Glassäule mit einer Mikropipette 1.000 µL. Spülen Sie die konischen Boden Zentrifugenröhrchen, die das Rohprodukt enthalten dreimal mit 1 mL 0,1 M HCl wässrigen Lösung pro waschen und die daraus resultierende spülen Volumes auf die Säule in der gleichen Weise zu laden.</li>
		<li>Eluieren mit einer nicht-linearen Farbverlauf: 4 Spalte Volumen von 0,1 M HCl, 4 Spalte Volumen Wasser, 4 Spalte Volumen von 5 % NH4OH, 4 Spalte Volumen von 10 % NH4OH, 4 Spalte Volumen von 15 % NH4OH, 4 Spalte Volumen von 20 % NH4OH , 4 Spalte Volumen von 25 % NH4OH und schließlich 4 Spalte Volumen von 28 % NH4OH.</li>
		<li>Die Reinigung mittels HPLC zu überwachen (siehe Schritt 6).</li>
		<li>Bündeln Sie die Fraktionen mit der Verbindung (NH4OH 20-28 %) und Gefriertrocknen Sie beschriebenen Schritte 4.3.8-4.3.9. Hinweis: Die Ionenaustausch Spalte kann nach der Elution mit entionisiertem Wasser zur Neutralisation der Elution Wasser (ca. 50 mL) gefolgt von Aufarbeitung von eluierenden mit 50 mL 1 M HCl wiederverwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SPE<ol>
<li>Lösen Sie die gefriergetrocknete Substanz in ca. 2 mL H3PO4/water (20 µL/mL).</li>
		<li>Statt einer gemischten Modus Kationenaustausch SPE 6 mL-Patrone auf eine Extraktion Verteiler angeschlossen ist eine Wasserpumpe. Zustand der Patrone durch Zeichnung durch 4 mL Methanol unter vermindertem Druck von dem Verteiler zur Verfügung gestellt. Equilibrate die Patrone von Zeichnung bis 4 mL H3PO4/water (20 µL/mL).</li>
		<li>Laden Sie die Probe auf die Patrone mit einem 1.000 µL Mikropipette an der Spitze des Harzes an den Wänden der Glassäule und spülen Sie das Fläschchen mit dem Produkt dreimal mit 0,75 mL H3PO4/water (20 µL/mL) pro Waschgang. Laden Sie die resultierende spülen-Lautstärke auf die Säule auf die gleiche Weise.</li>
		<li>Waschen Sie die Patrone mit der eluierenden unter vermindertem Druck, bereitgestellt durch das mannigfaltige, 4 mL 2 % HCOOH in Wasser, dann mit 4 mL Wasser. Eluieren mit einem Gefälle von NH4OH im Wasser (4 mL für jede Elution, ab 4 % NH4OH: 10 %, 15 %, 15 %, 20 % und 28 %).</li>
		<li>Überwachen Sie die Reinigung mittels HPLC analysiert jede Fraktion nach der Reaktion, die Überwachung Protokoll in Schritt 6 beschrieben. Halten Sie alle Fraktionen, die mit reinen gewünschte Ableitung nach ultravioletter (UV)-Chromatogramm und fahren Sie mit Schritt 5.2.6.</li>
		<li>Pool der Fraktionen mit der gewünschten Verbindung in eine 100 mL Runde untere Kolben, spülen Sie die Rohre mit den Fraktionen mit Wasser und 100 mL Spülung Volume hinzufügen runden unteren Kolben.</li>
		<li>Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit Drehverdampfer ausgestattet mit einem Thermostat Bad Wasserkocher bei 40 ° C und verbunden mit einer Vakuumpumpe auf 10 Mbar eingestellt.</li>
		<li>Lösen Sie der Feststoff in eine Mindestmenge an Wasser und übertragen Sie die Lösung in einer gewogenen 25 mL Runde untere Kolben. Spülen Sie die Flasche mit einem Mindestvolumen von Wasser, 25 mL Flasche spülen Volumen hinzu, und fahren Sie mit Schritt 5.2.9.</li>
		<li>Wiegen Sie das gereinigte Produkt und berechnen Sie die Ausbeute.</li>
		<li>Lösen Sie das gereinigte Produkt in das Mindestvolumen von 2M HCl auf, bis feste Partikel nicht mehr für das nackte Auge sichtbar sind und Gefriertrocknen Sie beschriebenen Schritte 4.3.8-4.3.9. Hinweis: Die Amino-Alkohole sind sensible Verbindungen und als deren Hydrochlorid Salze erhalten bleiben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Reaktionskontrolle und Produktanalyse
<ol><li>Derivatisierung der Substrate und Produkte vor der HPLC-Analytik Hinweis: Die Substrate und Produkte müssen als aromatische Derivate zu erhöhen Sie ihre UV chromatographische Ansprechempfindlichkeit derivatisiert. Wir haben 1-Fluor-2,4-Dinitrobenzene (DNFB). Jede Probe wurde unmittelbar nach Derivatisierung in der HPLC injiziert.<ol>
<li>Nehmen Sie 10 µL der enzymatischen Reaktion und Transfer nach einer 1,5 mL Reaktionscup. Fügen Sie 10 µL von 0,25 M Nahco33 wässrige Lösung, 100 µL Ethanol und 30 µL von 2,5 mg/mL DNFB-Lösung in Ethanol.</li>
		<li>Schließen Sie die Reaktionscup und schütteln Sie die resultierende Lösung für 1 h bei 65 ° C, bei 1.000 u/min. Stillen mit 10 µL 1 M HCl.</li>
		<li>Filtern Sie über einen 4 mm Durchmesser nicht sterile Spritze Filter mit einer 0,22 µm Pore Größe hydrophilen Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran mit einer 1 mL Luer-Spritze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachverfolgung der Dioxygenase Reaktion mit jedem System in der Lage, derivatisierte Aminosäuren zu trennen. Dieses Protokoll beinhaltet UV-Detektion von Aminosäuren, die von den Dinitrobenzene (DNB) Chromophor Gruppe27derivatisiert.<ol>
<li>Passen Sie die HPLC mit C18 mit einer Trimethyl Silyl Endcapping reversed-Phase Säule (5 µm, 3 x 150 mm).</li>
		<li>Equilibrate die C18-Säule mit Laufmittel (30: 70) B (MeCN + 0,1 % TFA), Laufmittel A (H2O + 0,1 % TFA) bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min und 35 ° C für 15 Minuten (entsprechend etwa 20 Spalte Bände).</li>
		<li>10 µL der derivatisierte Reaktionsmischung zu injizieren (siehe Punkt 6.1) auf die HPLC C18-Säule. Verwenden Sie eine Mischung von MeCN, 0,1 % TFA/H2O und 0,1 % TFA als Eluent mit einem linearen Farbverlauf (Verhältnis 30: 70, 70: 30 in 9 min., Temperatur 35 ° C, fließen 1 mL/min).</li>
		<li>Verwenden UV-Detektion setzen bei 400 nm, die Produkte auf der chromatographischen Säule eluiert zu analysieren. DNB-Lysin elutes in der Regel rund 6,5 min, hydroxylierten DNB-Lysin ca. 5,5 min Dihydroxylated DNB-Lysin rund 4,2 min und DNB-Aminodiol rund 5,3 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(7) NMR-Analyse des gereinigten Amino-Alkohole
<ol><li>Gereinigte Amino-Alkohole in D2O auflösen (700 µL) und die Lösung auf einem Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Rohr übertragen.</li>
	<li>Erwerben Sie 1H und 13C-NMR-Spektren nach entsprechenden NMR-Anlage Protokolle28.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Generation+of+Biocatalysts+for+Organic+Synthesis.">New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis.</a> Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).</li><li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysis+in+Organic+Chemistry+and+Biotechnology:+Past,+Present,+and+Future.">Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li><li>Turner, N. J., O'Reilly, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+retrosynthesis.">Biocatalytic retrosynthesis.</a> Nat. Chem. 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Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).</li><li>Schneider, J., Wendisch, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnological+production+of+polyamines+by+bacteria:+recent+achievements+and+future+perspectives.">Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).</li><li>Qian, Z. -. G., Xia, X. -. X., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+Escherichia+coli+for+the+production+of+cadaverine:+A+five+carbon+diamine.">Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).</li><li>Shin, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+microorganisms+for+the+production+of+L-arginine+and+its+derivatives.">Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives.</a> Microb. Cell. Fact. 13, (2014).</li><li>Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+Production+of+the+Diamine+Putrescine:+System+Metabolic+Engineering+of+Corynebacterium+Glutamicum.">Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum.</a> Metabolites. 5 (2), 211 (2015).</li><li>Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. 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Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).</li><li>Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Amino+Acid+Residues+Conferring+Substrate+Specificity+upon+Selenomonas+ruminantium+Lysine+Decarboxylase.">Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).</li><li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Approaches+towards+the+Synthesis+of+Chiral+Amino+Alcohols+from+Lysine:+Cascade+Reactions+Combining+alpha-Keto+Acid+Oxygenase+Hydroxylation+with+Pyridoxal+Phosphate-+Dependent+Decarboxylation.">Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation.</a> Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).</li><li>Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chiral+derivatizing+agents+in+the+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+amino+acid+enantiomers:+a+review.">Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).</li><li>. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy</a> (2017)</li><li>Hibi, M., Ogawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+biotechnology+applications+of+aliphatic+amino+acid+hydroxylases+belonging+to+the+Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent+dioxygenase+superfamily.">Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).</li><li>H&#252;ttel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Production+of+Chemical+Building+Blocks+in+Technical+Scale+with+&#945;-Ketoglutarate-Dependent+Dioxygenases.">Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with &#945;-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases.</a> Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).</li><li>Kourist, R., Guterl, J. -. K., Miyamoto, K., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Decarboxylation-An+Emerging+Reaction+for+Chemicals+Production+from+Renewable+Resources.">Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources.</a> ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).</li><li>Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+diversity+and+the+structural+basis+of+substrate+specificity+in+the+beta/alpha-barrel+fold+basic+amino+acid+decarboxylases.">Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases.</a> J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).</li><li>Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Enzymes+for+Industrial+Biocatalysis.">Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis.</a> ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Chirale Alkohole Aminosäuren und Derivate haben eine breite Palette von Anwendungen, von chiralen Hilfsmittel für die organische Synthese zur medikamentösen Therapie. Mehrstufigen Synthese zur Herstellung von Amino-Alkohole durch herkömmliche organische Synthese sind zahlreich, aber möglicherweise nicht immer effizient durch mühsame Schutz/Deprotection Schritte zusammen mit eine feinfühlige Steuerung der Stereochemie16. Ein biokatalytische Ansatz, der die Schutz/Deprotection Schritte verzic...

Trotz der Vorteile der Biokatalyse bleibt die Integration der biokatalytische Schritte in synthetischen Wege oder total biokatalytische Routen meist auf enzymatische kinetische Entschließungen beschränkt. Diese Routen haben weithin als ein erster Schritt in asymmetrischen Chemo-enzymatische Synthese, sondern Biokatalyse bietet viel mehr Möglichkeiten in der Funktionsgruppe Interconversions mit hoher Stereoselektivität1,2,3 . Darüber hinaus da biokatalytische Reaktionen unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt werden, ist es daher möglich, Kaskade Reaktionen in einem ein-Topf-Mode4,5durchführen.
Chirale Amino-Alkohole sind vielseitige Moleküle für den Einsatz als Hilfsstoffe oder Gerüste in organische Synthese6. Die amino Alkohol glyko-wird häufig in sekundären Pflanzenstoffen und pharmazeutische Wirkstoffe (API) gefunden. Primären β-amino Alkohole sind leicht zugänglich von der entsprechenden α-Aminosäuren durch konventionelle chemische Synthese, sondern Zugang zu chirale Alkohole γ-amino oder sekundäre amino Alkohole erfordert oft mühsame synthetischen Wege zusammen mit empfindlichen Kontrolle über die Stereochemie7,8,9,10. Aufgrund seiner hohen Stereoselektivität vorsehen Biokatalyse eine überlegene Syntheseweg auf diese chirale Bausteine11,12,13,14.
Wir haben bereits berichtet, die Synthese von Mono - und di-hydroxy-L-Lysines durch enzymatische Hydroxylierung Diastereoselective katalysiert durch Dioxygenases des Eisens (II) / α-Ketoacid-abhängigen Cyclooxygenase Familie (αKAO) (Abbildung 1)15. Vor allem ausgehend von L-Lysin, KDO1 Dioxygenase katalysiert die Bildung von (3S) - hydroxy-Derivat (1), während (4R) - Derivat (2) entsteht durch die Reaktion mit KDO2 Dioxygenase. Aufeinanderfolgenden Regiodivergent Hydroxylations KDO1 und KDO2 führen zur Bildung von (3R, 4R) - Dihydroxy - L-Lysin (3) in optisch reinen Form. Jedoch behindert Bereich begrenzt Substrat dieser Enzyme ihre große Auslastung in der chemischen Synthese, vor allem in die Hydroxylierung von einfachen Aminen, da eine Carbonsäure glyko-in der α-Position der amino-Gruppe für Aktivität16unverzichtbar ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg"> Abbildung 1: biokatalytische Umbauten von L-Lysin. Umwandlung in (3S) - hydroxy - L-Lysin (1) katalysiert durch KDO1 Dioxygenase; (4R) - hydroxy - L-Lysin (2) katalysiert durch KDO2 Dioxygenase; und 3R, 4R- Dihydroxy - L-Lysin (3) durch Kaskade Reaktion katalysiert sukzessive durch KDO1 und KDO2 Dioxygenases. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Decarboxylierung ist eine häufige Reaktion im Stoffwechsel17. Insbesondere Aminosäure DCs (EG 4.1.1) sind Kofaktor-frei (Pyruvoyl-abhängig) oder PLP-abhängige Enzyme und katalysieren die Decarboxylierung von Aminosäuren in den entsprechenden Polyamine in Bakterien und höheren Organismen18,19 , 20 , 21 , 22. die Mono - Dihydroxy Verbindungen (Abbildung 3) 4–7, 10–11 entsprechen hydroxylierten Cadaverin, das Diamin durch Decarboxylierung von L-Lysin erhalten. Cadaverin ist ein wichtiger Baustein für die chemische Industrie, speziell eine Komponente von Polyamid und Polyurethan Polymere. Daher biobasierte Herstellung von diesem Diamin aus nachwachsenden Rohstoffen hat Aufmerksamkeit als Alternative zum Erdöl-basierten Weg, und verschiedene Mikroorganismen haben für diesen Zweck entwickelt worden. In diese Stoffwechselwege ist Lysin DC (LDC) das Schlüsselenzym. LDC ist ein PLP-abhängige Enzym, Alanin Racemase (AR) strukturelle Familie23angehören. PLP-Abhängige DCs (PLP-DCs) sind dafür bekannt, hochspezifische Substrat sein. Jedoch wenige Enzyme besitzen die Fähigkeit, leichten Promiskuität, aktiv in Richtung L-Ornithin und L-Lysin Aminosäuren, wie zum Beispiel das LDC aus Selenomonas Rumirantium (LDCSrum), die hat ähnlicher kinetische Konstanten für Lysin und Ornithin zu Decarboxylierung24,25. Dieses erweiterte Substrat Spezifität macht dieses Enzym einen guten Kandidat für die Decarboxylierung von Mono - und di-hydroxy-L-Lysin. Darüber hinaus untersucht, um DCs aktiv in Richtung der Hydroxyl-Derivate von Lysin finden, wir die genomische Kontext der Gene kodieren die αKAO Enzyme. In der Tat sind in prokaryotischen Genomen die Genen Codierung an der gleichen biosynthetische Bahn beteiligten Enzyme in der Regel in gen-Cluster Co lokalisiert. Gens KDO2 (von Chitinophaga Pinensis) fand man zusammen mit einem Gen Kodierung vermeintliche PLP-DC (Abbildung 2) lokalisiert. Im Gegensatz dazu ist keine gen-Codierung für DC gefunden worden, bei der Analyse von genomischen Rahmen KDO1 Dioxygenase. Das PLP-DC-Protein aus C. Pinensis (DCCpin) wurde daher als ein viel versprechender Kandidat ausgewählt, um die Decarboxylierung Schritt der Kaskade Reaktion katalysieren.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg"> Abbildung 2: genomische Kontext des KDO2-Gens in C. Pinensis. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Infolgedessen haben wir entwickelt enzymatische Kaskade Reaktionen, Dioxygenases und DCs, die Synthese von aliphatischen chiralen β - und γ-amino Alkohole aus Aminosäuren (Abbildung 3) zu erreichen. Wie bereits berichtet führt die C-H-Oxidation, katalysiert durch die αKAO die Hydroxyl ersetzt Stereogenic Mitte mit insgesamt Diastereoselectivity; die Cβ/γ Chiralität erhalten im decarboxylative Schritt betrifft nur das Cα Carbon der Aminosäure glyko-16.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg"> Abbildung 3: Analyse der retrosynthetischen. (A) Retrosynthesis β - und γ-amino Alkohole (R) - 1,5 - Diaminopentan-2-Ol (4) (5R) - hydroxy - L-Lysin, und (S) - 1,5 - Diaminopentan-2-Ol (5) und 1,5-Diaminopentan-3-Ol (6) aus L-Lysin. (B) Retrosynthesis β, γ und δ-amino Diole (2S, 3S) β - 1,5 - Diaminopentane-2,3-Diol (10) und (2R, 4S) - 1,5 - Diaminopentane-2,4-Diol (11) ab (5R)- Hydroxy-L-Lysin, und 2R, 3R- 1,5 - Diaminopentane-2,3-Diol (7) ab L-Lysin. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
L-Lysin und seine (5R) ab-hydroxy-Derivat, berichten wir hierin eine zwei/drei Schritt, einen Topf, enzymatischen Verfahren, die Kombination von Dioxygenases und PLP-DCs, das Ziel Amino-Alkohole zu erhalten. Vor der Synthese im Labormaßstab der Zielmoleküle, die Methode wurde entwickelt auf der analytischen Ebene Anpassung der Reaktionsbedingungen, z.B., die Enzymkonzentrationen erforderlich, um vollständige Umwandlung der Ausgangsstoffe; ermöglichen Wir präsentieren dieses Verfahrens sowie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(5S)-hydroxy-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GPS NONH</td>
			<td>Out sourcing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-ketoglutaric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>201370250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal phosphate (PLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>82870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20825.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 37%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>435570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 0.1M</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>35335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83640.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-trifluoroacetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>153112E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia 28%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21182.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83638.32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Acros</td>
			<td>270480010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid 85%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>201145000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Acros</td>
			<td>320,710,075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4601-Y0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accela UHPLC System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accela PDA detector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4mm syringe filters - 0,22&#181;m - PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HSWA5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange resin 100-200&#160;mesh</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>217506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi</td>
			<td>531-0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer alpha 1-2 LDplus</td>
			<td>Christ</td>
			<td>L083302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 20 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 500 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtube</td>
			<td>CLEARLine</td>
			<td>CL20.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical-bottom centrifuge tube</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>05-539-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask 14/23</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10353331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL round-bottom flask 29/32</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11786183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL round-bottom flask 29/32</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11786183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL erlenmeyer flask</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>15496143</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine

Amino-Alkohole sind vielseitige Verbindungen mit einer Vielzahl von Anwendungen. Beispielsweise haben sie als chirale Gerüste in der organischen Synthese eingesetzt. Ihre Synthese von herkömmlichen organischen Chemie erfordert oft mühsame mehrstufigen Syntheseverfahren mit schwierigen Steuerung der stereochemischen Ausgang. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zum enzymatisch Programmbenutzer Amino-Alkohole leicht verfügbaren L-Lysin in 48 h ab. Dieses Protokoll verbindet zwei chemische Reaktionen, die sehr schwer von herkömmlichen organischen Synthese durchzuführen sind. Bei der ersten Schritt, der Regio und Diastereoselective Oxidation von einer nicht aktivierten C-H-Bindung der Lysin ist-Seitenkette durch ein Dioxygenase katalysiert; eine zweite Regio und Diastereoselective Oxidation, katalysiert durch ein Regiodivergent-Dioxygenase führt zur Bildung von 1,2-Diole. Im letzten Schritt ist die carboxylic Gruppe der alpha Aminosäure durch eine Pyridoxal-Phosphat (PLP)-Decarboxylase (DC) abgespalten. Dieser decarboxylative Schritt betrifft nur die alpha Kohlenstoff der Aminosäure, Beibehaltung der Hydroxyl ersetzt Stereogenic Mitte in der Beta/Gamma-Lage. Die daraus resultierende Amino-Alkohole sind daher optisch bereichert. Das Protokoll wurde auf der Semipreparative-Skala-Synthese von vier Amino-Alkohole erfolgreich angewendet. Überwachung der Reaktionen wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) nach Derivatisierung von 1-Fluor-2,4-Dinitrobenzene durchgeführt. Einfache Reinigung durch Festphasen-Extraktion (SPE) gewährt die Amino-Alkohole mit sehr guten Ausbeuten (93 %, > 95 %).

Wir haben bereits berichtet, die Synthese von Mono - und di-hydroxy-L-Lysines durch enzymatische Hydroxylierung Diastereoselective katalysiert durch Dioxygenases des Eisens (II) / αKAO Familie (Abbildung 1)16. Um das Protokoll der gesamten Kaskaden das hier vorgestellte zu optimieren, die ein oder zwei Hydroxylierung Schritte katalysiert durch ein αKAO gefolgt von einer Decarboxylierung Schritt katalysiert durch ein PLP-DC verbinden,...

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Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Chirale Amino-Alkohole sind vielseitige Moleküle für den Einsatz als Gerüste in der organischen Synthese. Ausgehend von L-Lysin, synthetisieren wir amino Alkohole durch eine enzymatische Kaskade Reaktion kombiniert Diastereoselective C-H-Oxidation katalysiert durch Dioxygenase gefolgt von Spaltung der Carbonsäure glyko-der entsprechenden Hydroxyl Aminosäure durch eine Decarboxylase.

Enzymatische Kaskade Reaktionen für die Synthese von chirale Alkohole Aminosäure L-Lysin

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

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12.0K Aufrufe.  CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay. Chirale Amino-Alkohole sind vielseitige Moleküle für den Einsatz als Gerüste in der organischen Synthese. Ausgehend von L-Lysin, synthetisieren wir amino Alkohole durch eine enzymatische Kaskade Reaktion kombiniert Diastereoselective C-H-Oxidation katalysiert durch Dioxygenase gefolgt von Spaltung der Carbonsäure glyko-der entsprechenden Hydroxyl Aminosäure durch eine Decarboxylase.

Serie: Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Microwave-assisted Intramolecular Dehydrogenative Diels-Alder Reactions for the Synthesis of Functionalized Naphthalenes/Solvatochromic Dyes

Functionalized naphthalenes have applications in a variety of research fields ranging from the synthesis of natural or biologically active molecules to the preparation of new organic dyes. Although numerous strategies have been reported to access naphthalene scaffolds, many procedures still present limitations in terms of incorporating functionality, which in turn narrows the range of available substrates. The development of versatile methods for direct access to substituted naphthalenes is therefore highly desirable.
The Diels-Alder (DA) cycloaddition reaction is a powerful and attractive method for the formation of saturated and unsaturated ring systems from readily available starting materials. A new microwave-assisted intramolecular dehydrogenative DA reaction of styrenyl derivatives described herein generates a variety of functionalized cyclopenta[b]naphthalenes that could not be prepared using existing synthetic methods. When compared to conventional heating, microwave irradiation accelerates reaction rates, enhances yields, and limits the formation of undesired byproducts.
The utility of this protocol is further demonstrated by the conversion of a DA cycloadduct into a novel solvatochromic fluorescent dye via a Buchwald-Hartwig palladium-catalyzed cross-coupling reaction. Fluorescence spectroscopy, as an informative and sensitive analytical technique, plays a key role in research fields including environmental science, medicine, pharmacology, and cellular biology. Access to a variety of new organic fluorophores provided by the microwave-assisted dehydrogenative DA reaction allows for further advancement in these fields.

Microwave-assisted intramolecular dehydrogenative Diels-Alder (DA) reactions provide concise access to functionalized cyclopenta[b]naphthalene building blocks. The utility of this methodology is demonstrated by one-step conversion of the dehydrogenative DA cycloadducts into novel solvatochromic fluorescent dyes via Buchwald-Hartwig palladium-catalyzed cross-coupling reactions.

Mikrowellen-unterstützte intramolekulare dehydrierende Diels-Alder-Reaktionen zur Synthese von funktionalisierten Naphthaline / Solvatochrome Dyes

Functionalized naphthalenes have applications in a variety of research fields ranging from the synthesis of natural or biologically active molecules to ...

Forschung

Chemie

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as an intrinsic probe to characterize virtually every chemical process. Nowadays, this technique is extensively applied to determine thermodynamic parameters of biomolecular binding equilibria. In addition, ITC has been demonstrated to be able of directly measuring kinetics and thermodynamic parameters (kcat, KM, &#916;H) of enzymatic reactions, even though this application is still underexploited. As heat changes spontaneously occur during enzymatic catalysis, ITC does not require any modification or labeling of the system under analysis and can be performed in solution. Moreover, the method needs little amount of material. These properties make ITC an invaluable, powerful and unique tool to study enzyme kinetics in several applications, such as, for example, drug discovery.
In this work an experimental ITC-based method to quantify kinetics and thermodynamics of enzymatic reactions is thoroughly described. This method is applied to determine kcat and KM of the enzymatic hydrolysis of urea by Canavalia ensiformis (jack bean) urease. Calculation of intrinsic molar enthalpy (&#916;Hint) of the reaction is performed. The values thus obtained are consistent with previous data reported in literature, demonstrating the reliability of the methodology.

Isothermal titration calorimetry measures heat flow released or absorbed in chemical reactions. This method can be used to quantify enzyme-catalysis. In this paper, the protocol for instrumental setup, experiment running, and data analysis is generally described, and applied to the characterization of enzymatic urea hydrolysis by jack bean urease.

Hot Biologische Katalyse: Isotherme Titrationskalorimetrie zu Enzymreaktionen Charakterisieren

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of trifluoromethoxylated aromatic compounds remains a formidable challenge in organic synthesis. Conventional approaches often suffer from poor substrate scope, or require use of highly toxic, difficult-to-handle, and/or thermally labile reagents. Herein, we report a user-friendly protocol for the synthesis of methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate using 1-trifluoromethyl-1,2-benziodoxol-3(1H)-one (Togni reagent II). Treating methyl 4-(N-hydroxyacetamido)benzoate (1a) with Togni reagent II in the presence of a catalytic amount of cesium carbonate (Cs2CO3) in chloroform at RT afforded methyl 4-(N-(trifluoromethoxy)acetamido)benzoate (2a). This intermediate was then converted to the final product methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate (3a) in nitromethane at 120 &#176;C. This procedure is general and can be applied to the synthesis of a broad spectrum of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives, which could serve as useful synthetic building blocks for the discovery and development of new pharmaceuticals, agrochemicals, and functional materials.

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

An operationally simple procedure for the synthesis of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives via a two-step sequence of O-trifluoromethylation of N-aryl-N-hydroxyacetamide followed by thermally induced intramolecular OCF3-migration is reported.

Protokoll für die Synthese von<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated Anilin-Derivate

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins with the synthesis of a hydrophilic poly(oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) (POEGMA) homopolymer using reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization. Under mild visible light irradiation (&#955; = 460 nm, 0.7 mW/cm2), this macro-chain transfer agent (macro-CTA) in the presence of a ruthenium based photoredox catalyst, Ru(bpy)3Cl2 can be chain extended with a second monomer to form a well-defined block copolymer in a process known as Photoinduced Electron Transfer RAFT (PET-RAFT). When PET-RAFT is used to chain extend POEGMA with benzyl methacrylate (BzMA) in ethanol (EtOH), polymeric nanoparticles with different morphologies are formed in situ according to a polymerization-induced self-assembly (PISA) mechanism. Self-assembly into nanoparticles presenting POEGMA chains at the corona and poly(benzyl methacrylate) (PBzMA) chains in the core occurs in situ due to the growing insolubility of the PBzMA block in ethanol. Interestingly, the formation of highly pure worm-like micelles can be readily monitored by observing the onset of a highly viscous gel in situ due to nanoparticle entanglements occurring during the polymerization. This process thereby allows for a more reproducible synthesis of worm-like micelles simply by monitoring the solution viscosity during the course of the polymerization. In addition, the light stimulus can be intermittently applied in an ON/OFF manner demonstrating temporal control over the nanoparticle morphology.

This article describes a process for producing polymeric self-assembled nanoparticles using visible light mediated dispersion polymerization. Using low energy visible light to control the polymerization allows for the reproducible formation of self-assembled worm-like micelles at high solids content.

Einfache Synthese von wurmartigen Mizellen durch sichtbares Licht Mediated Dispersion Polymerisation mit Photoredox Katalysator

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from benzimidazolium salts. Detailed and generalized protocols are also presented for testing the catalytic activity of such complexes in arylation and Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions. Representative results are shown for the catalytic activity of the four complexes in arylation and Suzuki-Miyaura type reactions. For each of the reactions investigated, at least one of the four complexes successfully catalyzed the reaction, qualifying them as promising candidates for catalysis of many carbon-carbon bond-forming reactions. The protocols presented are general enough to be adapted for the synthesis, purification and catalytic activity testing of new palladium N-heterocyclic carbene complexes.

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from benzimidazolium salts. The complexes were tested for catalytic activity in arylation and Suzuki-Miyaura reactions. For each reaction investigated, at least one of the four complexes successfully catalyzed the reaction.

Palladium<em&gt; N.</em&gt; -Heterocyclische Carbenkomplexe: Synthese aus Benzimidazoliumsalzen und katalytische Aktivität bei Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungs-bildenden Reaktionen

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These metabolites are produced endogenously by the cytochrome P450 class of enzymes. Because of their diverse and potent biological effects, there is considerable interest in studying these metabolites. Determining the unique roles of these metabolites in the body is a difficult task, as the epoxy fatty acids must first be obtained in significant amounts and with high purity. Obtaining compounds from natural sources is often labor intensive, and soluble epoxide hydrolases (sEH) rapidly hydrolyze the metabolites. On the other hand, obtaining these metabolites via chemical reactions is very inefficient, due to the difficulty of obtaining pure regioisomers and enantiomers, low yields, and extensive (and expensive) purification. Here, we present an efficient enzymatic synthesis of 19(S),20(R)- and 16(S),17(R)-epoxydocosapentaenoic acids (EDPs) from DHA via epoxidation with BM3, a bacterial CYP450 enzyme isolated originally from Bacillus megaterium (that is readily expressed in Escherichia coli). Characterization and determination of purity is performed with nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), high-performance liquid chromatography (HPLC), and mass spectrometry (MS). This procedure illustrates the benefits of enzymatic synthesis of PUFA epoxy metabolites, and is applicable to the epoxidation of other fatty acids, including arachidonic acid (AA) and eicosapentaenoic acid (EPA) to produce the analogous epoxyeicosatrienoic acids (EETs) and epoxyeicosatetraenoic acids (EEQs), respectively.

We present a method useful for large-scale enzymatic synthesis and purification of specific enantiomers and regioisomers of epoxides of arachidonic acid (AA), docosahexaenoic acid (DHA), and eicosapentaenoic acid (EPA) with the use of a bacterial cytochrome P450 enzyme (BM3).

Enzymatische Synthese von epoxidierten Metaboliten von Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic und Arachidonsäuren

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...