Wir sind dankbar für das französische Ministerium für Hochschulbildung und Forschung, Konventionen Industrielles de Formation Par la Recherche (CIFRE) und IFP Energies Nouvelles für ihre finanzielle Unterstützung.

1. die Probenvorbereitung
<ol><li>Die Probe in einem Mörser zerkleinern und verteilen es im Alkohol oder destilliertem Wasser; einen Tropfen der Probe auf einem Mikroskopie-Raster legen und trocknen lassen. Hinweis: Proben wie Siliziumdioxid Aluminiumoxid oder Titania Aluminiumoxid können ein Pulver oder eine extrudierte Material, zerkleinert und verteilt in einer Lösung mit Hilfe von Ultraschall. In der Regel für ET-Analyse ist es wichtig, dass die probenkonzentration in der Startaufstellung niedrig, zum Beispiel Überlagerung und shadowing ist, wenn das Raster in einem großen Winkel kippen zu vermeiden. Die 200-Mesh-Mikroskopie-Gitter, die einen Film von löchrigen Kohlenstoff oder lacey Carbon unterstützen sollten.</li>
	<li>Mit einer Pipette, legen Sie ein Tröpfchen einer kolloidalen Lösung mit kugelmarker über die Probe. Jede überschüssige Lösung zu absorbieren und trocknen lassen. Hinweis: Die kugelmarker sind gut kalibrierten Au Nanopartikel in einer Lösung suspendiert. Die kugelmarker können auch über das Netz verteilt werden, vor der Zugabe der Probe. Als Beispiel wenn die Probe von Nanopartikeln mit ähnlichen Größen als die kugelmarker erfolgt, Zahlen Sie ein, die kugelmarker über das Raster um sie auch während der Datensegmentierung und Quantifizierung zu trennen. Die kugelmarker sind Positionsangaben verwendet, wenn die gekippte Bilder ausrichten.</li>
</ol>2. Aufnahme der gefilterten Tilt-Serie Bilder
<ol><li>Finden Sie mit dem Elektronenmikroskop eine isolierte Probe in der Mitte des Rasters Mikroskopie. Hinweis: In dem Elektronenmikroskop ist der x-Achse entlang der Probenhalter, die Y-Achse steht senkrecht auf der Probenhalter und die Z-Achse ist entlang des Elektronenstrahls. Um der Probe bei der maximale Kippwinkel kippen zu können, analysieren Sie eine Probe so nah wie möglich an der x-Achse liegt.</li>
	<li>Sobald die Probe gut aufgestellt ist, überprüfen Sie die chemische Zusammensetzung der Probe. Eine chemische Analyse mit Energy dispersive x-ray Spektrometrie (EDS) oder Elektronen Energie-Verlust-Spektrometrie (AALE) durch Fokussierung des Strahls über die gewählte Probe, und zeichnen Sie ein Spektrum. Enthält die Probe der chemischen Elemente von Interesse, vom es und führen Sie die nächsten Tests auf einer nahe gelegenen repräsentativen Stichprobe.</li>
	<li>Überprüfen Sie den Elektronenstrahl Intensität über die Probe, die Breite der energiefenster der gefilterten Bilder und die Expositionszeit der einzelnen gefiltert Bild. Finden Sie den besten Kompromiss für die Probe zwischen Balken Schaden und das chemische Signal aufgezeichnet in den chemischen Projektionen12,13,17. Hinweis: Um die maximale chemisches Signal in die gefilterte Bilder aufzuzeichnen, verwenden Sie die maximale Strahlintensität. Allerdings muss ein Bestrahlung Test vor jeder Analyse für Änderungen der Probe von der Wirkung des Elektronenstrahls zu überprüfen durchgeführt werden. Um dies zu tun, berechnen Sie die Elektron-Dosis während der Aufnahme der Tilt-Serie. Darüber hinaus kann eine einfache Prüfung erfolgen durch den Vergleich ein Bild vor und ein Bild nach dem Experiment.</li>
	<li>Verwenden Sie Lutetium-Modus von der Recording-Software, um eine chemische 2D-Karte mit der drei-Fenster-Methode zu berechnen, und überprüfen Sie, ob ein ausreichendes chemische Signal aufgezeichnet wird. Hinweis: Die Software zeichnet drei gefilterte Bilder; die ersten beiden werden verwendet, um den Hintergrund aus dem dritten Bild zu schätzen.<ol>
<li>Wählen Sie in der Software das chemische Element unter Untersuchung und Ionisation Rand. Legen Sie die Breite des Fensters Energie und die Belichtungszeit. Zeichnen Sie die Bilder und dann berechnen Sie die chemische Karte mit einem Potenzgesetz Hintergrund zu extrahieren. In einer 32-Bit-Umgebung mit 512 x 512 Pixel ist das minimale Signal ca. 300-400 zählt pro Pixel in einem chemischen Bild aufgezeichnet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Probe in der euzentrische Höhe und Überprüfung der minimalen Neigungswinkel, d. h.,-70 ° oder weniger und maximalen Neigungswinkel, d. h., + 70 ° oder mehr.</li>
	<li>Bringen Sie die Probe analysiert werden, wieder ins Blickfeld und zeichnen ein Bild (das Bild vor der Anschaffung werden). Dann nehmen Sie die geneigte Reihe von gefilterten Bilder mittels geeigneter Software. Hinweis: Die engagierten Lutetium-Tomographie-Plugins können mehrere Tilt Serie gleichzeitig aufzeichnen. Dies bedeutet, dass bei jedem Neigungswinkel, mehrere aufeinander folgende Bilder aufgenommen werden können. Das erste Bild kann ein gefiltertes Bild zentriert auf NULL-Verlust und dieses Bild ist ein typisches Hellfeld Bild. Die Pre-Kante-Bilder und dann das Bild nach dem Rand des ersten chemischen Elements folgen die Pre-Kante-Bilder und das Bild nach dem Rand des zweiten chemischen Elements. Die Nachfolge der chemischen Elemente ist durch ihre ausgewählten Ionisation Kante gegeben.<ol>
<li>In der Aufnahme Lutetium kippen Serie Software, wählen Sie die Breite der einzelnen Energie-Fenster und die Belichtungszeit, und dann die maximale und minimale kippen Winkel und der eckige Schritt der Neigung. Um Kompromiss zwischen der Anzahl der Bilder in der Tilt-Serie und gesamtbelichtungszeit von der Probe der Elektronenstrahl, verwenden Sie einen Tilt-Schritt 4°, d. h., 51 Bilder pro Serie Neigung zwischen ± 71 °; jedoch kann ein kleiner Neigung Schritt gewählt werden, wenn die Probe unter dem Balken nicht verschlechtert.</li>
		<li>Zeichnen Sie für jedes chemische Element drei Tilt-Reihe von gefilterten Bilder um die chemische Projektion mit den drei Windows-Methode zu berechnen. Zur Quantifizierung der natürliche Drift der Probe bei jedem Neigungswinkel während der Aufnahme die gefilterte Bilder (die Probe kann bei bestimmten Neigungswinkel für mehr als 1 min bleiben), kann das erste Bild ein gefiltertes Bild auf NULL Verlust Signal sein, damit das zuletzt aufgenommene Bild wird ein unfil registrierten Bild durch die Elektronen bei allen Energien gebildet. Diese beiden Bilder können verwendet werden, um die Karte der Dicke der Probe zu berechnen. Daher für die Beobachtung der Chemiedistribution von zwei Elementen in jedem Neigungswinkel, 7 gefilterte Bilder aufnehmen (1 Verlust, 3 für das erste chemische Element, 3 für das zweite chemische Element null) und 1 ungefiltertes Bild (insgesamt 8 Tilt-Serie aufgenommen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ausrichtung und Rekonstruktion der Baureihe Tilt
<ol><li>Die drei gefilterten Bilder jedes chemische Element für jeden Neigungswinkel entsprechend ausrichten und die chemischen Karte mit einem spezialisierten EFTEMTJ15,18 Plugin von ImageJ zu berechnen. In der ImageJ-Software, verwenden Sie den Pfad Datei | Offene und wählen Sie die Dateien entsprechend der Filter Bilder Tilt-Serie. Öffnen Sie alle drei gefilterten Tilt-Serie: zwei Pre-Flanke und einer Post-Flanke.<ol>
<li>Öffnen Sie das spezielle EFTEMTJ-Plugin. Klicken Sie auf + | Bild oder Stapel und wählen Sie die Tilt-Serie, die bereits geöffnet sind.</li>
		<li>In der Tabelle, die angezeigt wird, wurde füllen die Energiewende für jede Neigung-Serie, d.h., die Energie an die jeweils schräg Serie aufgenommen. Darüber hinaus füllen Sie die Schnittbreite, d.h., die energiefenster. Füllen Sie die "Belichtungszeit" jedes gefilterten Bildes. Überprüfen Sie alle drei Tilt Serie zuordnen. Klicken Sie auf nächste.</li>
		<li>Wählen Sie das erste Bild als Referenz-Bild und klicken Sie dann auf übernehmen. Klicken Sie auf nächste: eine Vorschau der vorgeschlagenen Ausrichtung angezeigt. Visuell zu überprüfen, dass die 3 Bilder aufgenommen in den gleichen Neigungswinkel gut überlagert (keine Verschiebung zwischen den Bildern sind zu beachten). Hinweis: Dieses Protokoll wurde auf die Version 0.9 von das EFTEMTJ-Plugin durchgeführt. In diesem Moment erfasst die gefilterte Bilder at der gleichen Neigungswinkel ausgerichtet sind.</li>
		<li>Wählen Sie im Fenster "EFTEMTJ" die Bilder entsprechend in den Hintergrund und die chemischen Rand. Wählen Sie das Modell der Signalextraktion als macht, und klicken Sie dann auf Create Karte. Wählen Sie auf ImageJ, Datei | Speichern und suchen Sie den Pfad zum Speichern dieser letzten Datei. Hinweis: Die Tilt-Series der chemischen Karte erhält. Weitere Informationen darüber, wie das Plugin ist online verfügbar.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.1 für alle chemischen Tilt-Serie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Richten Sie die NULL-Verlust Tilt Series mit einer Version des Imod Software19 im Jahr 2009 veröffentlicht die Tilt Series ausrichten. Die Software ermöglicht die Anwendung der berechneten Achsen auf eine Tilt-Serie eine andere Neigung-Serie. Hinweis: Die Alignment-Software schreibt über die Datenträgerdateien enthält alle Verschiebungen auf jedes Bild angewendet. Die Ausrichtung Verfahren mit Imod20 ist an anderer Stelle überprüft und ist nicht im Rahmen dieses Artikels.</li>
	<li>Verwenden Sie die Ausrichtung für die NULL-Verlust Tilt Series berechnet, und wenden Sie es auf die zuvor berechnete chemische Tilt Series. Hinweis: In dieser Version der Software ist es möglich, die NULL-Verlust Tilt seriendatei mit einer chemischen Tilt-Serie-Datei zu ändern, durch Erhaltung der Name der Datei und die Anwendung der früheren berechneten Verschiebungen. Ansonsten für die Software die Datei haben den gleichen Namen, die gleiche Anzahl von Bildern von der gleichen Größe, aber es enthält NULL Verlust Bilder aber chemische Bilder.</li>
	<li>Quantifizieren die Drift durch cross-das erste Bild, d. h., Zentrum auf die NULL Verluste, und die letzte korrelieren (das ungefilterte Bild). Die Probe kann einige Sekunden in jedem Neigungswinkel verbringen, während die gefilterte Bilder aufgezeichnet werden. Während dieser Zeit driftet die Probe natürlich eine kleine Menge.<ol>
<li>ImageJ Software, klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie und wählen Sie die NULL Verlust ausgerichtet kippen Serie, dann öffnen die chemische Karten ausgerichtet Tilt-Serie.</li>
		<li>Klicken Sie auf Bearbeiten | Farbe | Kanäle zusammenfügen. Wählen Sie die Datei entspricht NULL Verlust für die rote Farbe, das erste chemische Element für Grün und das zweite chemische Element für blau, in dieser Reihenfolge. Deaktivieren Sie die Option Erstellen Sie zusammengesetzte und Halten Quellbildzu überprüfen. Ein Stapel ist bei jedem Neigungswinkel für die aufgenommenen Bilder erstellt.</li>
		<li>Klicken Sie auf -Plugins | Richten Sie RGB Pläne21. Rot ist die Referenz-Bild. Wählen Sie grün und mit den Pfeilen, es über die rote Linie überschneiden. Klicken Sie auf Weiter, und wiederholen Sie für alle Winkel.</li>
		<li>Klicken Sie auf Bearbeiten | Farbe | Split-Kanäle und RGB-Stapel aufgeteilt in drei Stapeln: rot entspricht NULL Verlust, und grün und Blau entspricht der chemischen Karten mit dem Drift korrigiert. Klicken Sie auf -Datei | Speichern Sie um die Tilt-Serie zu retten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie auf -Plugins | Tomoj22,23 , die Last Winkel Formulardatei auszuwählen. Da die Tilt-Series bereits ausgerichtet sind, navigieren Sie direkt zum Wiederaufbau. Berechnen Sie das Volumen der NULL-Verlust sowie die chemische Bände mit rekonstruktionsalgorithmen wie Kunst, SIRT, OS-Kunst etc.. Hinweis: Es wird empfohlen, einen iterativen Algorithmus für den Wiederaufbau der chemischen Volumes zu verwenden. Durch die Verwendung dieser Software ist es möglich, die Volumen mit Hilfe der GPU zu rekonstruieren.</li>
	<li>Sobald alle Volumes berechnet werden, die Option Kanäle zusammenfügen verschiedene Farben anwenden, um die erhaltenen Mengen und in einem einzigen Band, zu der chemischen 3D-Karte überlappen.</li>
</ol>(4) 3D-Modellierung und Quantifizierung
<ol><li>Vollständig rekonstruierte ZL-Volumen durch Auswahl der entsprechenden grauen Ebene, die die Lautstärke in weiß erhältlich sein wird (die Intensität ist in 8-Bit, 255) und schwarz (in 8 Bit, die Intensität ist 0). In ImageJ die Option "ausgewählte Schwelle". Wählen Sie alle Pixel, die entsprechend der Probenmaterials (bei einem BF-Bild die dunkleren Pixel entsprechen zum Beispiel Masse) und machen eine Band wo die Probe ist weiß und das Vakuum ist schwarz. Hinweis: Das NULL-Verlust-Volumen bietet morphologische Informationen von der analysierten Probe, d.h., die Form und die Größe der Stichprobe.</li>
	<li>Teilen Sie die binäre Lautstärke NULL Verlust durch 255, und erhalten Sie eine Menge wo die Intensitäten innerhalb der Probe 1 und anderswo sind 0. Dies ist der normalisierte Band.</li>
	<li>Multiplizieren Sie die normalisierten Volumens mit jeder der berechneten chemische Bände (Schritt 4.1), ein Volumen zu erhalten, wo die Intensitäten innerhalb der Probe entspricht der chemischen Informationen, und diese Intensitäten sind 0 an anderer Stelle. Hinweis: Die chemische Informationen ergibt sich aus der Probe und daher alle Artefakte sind ausgeschlossen.</li>
	<li>In ImageJ das Histogramm der chemischen Volumen zu berechnen und die Werte des Histogramms in einer passenden Software importieren.<ol>
<li>Löschen Sie in der passenden Software die Zeile mit einer Intensität Heist Anzahl 0 (diese Linie entspricht dem Vakuum).</li>
		<li>In einer neuen Spalte berechnen des Anteils an jede Intensität des Volumens. Teilen Sie die Anzahl der jede Intensität durch die Summe von allen Anklagepunkten und mit 100 multiplizieren.</li>
		<li>In einer neuen Spalte berechnen des Anteils entsprechend der Intensität des gesamten Volumens durch inkrementell Hinzufügen des aktuelle Anteils der Grafen, zuvor mit dem bisherigen Anteil berechnet. Hinweis: In den chemischen Bänden entsprechen die hohen Intensitäten die chemische Informationen. Die Intensitäten sind jedoch gering und das Rauschen in die Lautstärke hoch. Die Schwelle ist durch Auswahl der höchsten Intensitäten erstellt.</li>
		<li>Zu wissen, die relative Konzentration des chemischen Elements in der Probe berechnet aus dem Spektrum der AALE, wählen Sie die Heist Intensitäten. Ab 255 (falls vorhanden) und verringern Sie Intensität, die Konzentration des chemischen Elements entspricht.</li>
		<li>Um die niedrigste Intensität entsprechend der chemischen Konzentration zu finden, navigieren Sie zu der Spalte, wo der Anteil der entsprechenden Intensität wurde berechnet in das Gesamtvolumen die 100 % normalerweise die Intensität von 255 entspricht. Aus 100 % extrahieren den berechnete relativen Anteil des chemischen Elements (aus dem AALE Spektrum): das Ergebnis wird die minimale Intensität in den Schwellenwert entspricht. Auf diese Weise sind chemische binarisierten Volumen erreicht, wo die Voxel entspricht das chemische Element mit der Intensität von 255 und der ganze Rest sind 0. Wiederholen Sie den Vorgang für das zweite Element und erhalten Sie zwei chemischen binarisierten Bände.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überschneiden sich die binarisierten chemische Bände mit der Option "Kanäle zusammenfügen" und jedes Element Volume, ein RGB-Volumen zu machen eine andere Farbe zuweisen. Hinweis: Durch Überlappung der binarisierten chemischen zweibändigen, Voxel, die überlagert werden, die zu beiden chemischen Elemente (Gemeinde Voxel) gehören und Voxeln, die nicht mit einem chemischen Elemente (Kostenlose Voxel) gehören werden hervorgehoben. Beispielsweise erstellen die binarisierten chemische Bände der roten und grünen Gemeinde Voxeln, die gelb sind.</li>
	<li>Verwandeln Sie die RGB-Lautstärke in 8 Bit Volumen; die Farben haben verschiedene graue Intensitäten. Mit dem Schwellenwert-Option Wählen Sie die Voxel, die sowohl chemische Spezies (gelb in die RGB-Lautstärke) angehören. Wählen Sie dann mit dem gleichen Schwellenwert-Option die Voxel, die keines chemische Element gehören (sie haben niedrigere Intensitäten als die ausgewählte früher Voxel). Wählen Sie das Vakuum nicht mit Intensität 0.</li>
	<li>Die Bände der Gemeinde Voxel und das Volumen des freien Voxel zu normalisieren. Multiplizieren Sie die Datenmengen die kostenlose Voxel durch die chemische Volumina, dann ziehen Sie das andere chemische Volume. Hinweis: Dies berechnet das chemische Element in jedem Voxel, die die höchste Intensität hat.</li>
	<li>Fügen Sie die Mengen die Voxel, die gehören und die Voxel, die nicht auf das Volumen des chemischen Elements gehören, die die höchste Intensität in die Voxel hat. Hinweis: Auf diese Weise jede Gemeinde Voxel oder kostenlose Voxel ist differenziert und zugeteilt, das Volumen des chemischen Elements, das die höchste Intensität in die Voxel hat. Dies kann durch die Option "Bildrechner" durchgeführt werden:</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56671/56671eq1v3.jpg">
<ol start="9"><li>Um die Anzahl der Voxel zu quantifizieren, die die Probe bilden, importieren Sie die segmentierten Volumina in spezialisierten Oberfläche Rendering-Software, wie z. B. einen 3D Slicer. Multiplizieren Sie die Lautstärke ein Voxel in nm3 , das Volumen der Probe in 3D zu erhalten.</li>
	<li>Über die Konturen finden Option quantifizieren Sie die Voxel bildet die Oberfläche der Probe, und multiplizieren Sie mit dem Voxel-Bereich in nm2 auf der Oberfläche der Probe zu erhalten.</li>
	<li>Die spezifische Oberfläche zu berechnen, indem man die Oberfläche der Probe durch die Masse der Probe. Hinweis: Die Masse der Probe kann geschätzt werden, mithilfe der theoretischen Dichte der Probe. Im Allgemeinen ist die spezifische Oberfläche berechnet, indem ET 10 weniger als die spezifische Oberfläche durch spezielle Methoden wie N2 Adsorption Desorption berechnet.</li>
	<li>Um die Porenverteilung Größe zu berechnen, verwenden Sie das binarisierten Volumen der NULL Verlust (BF-Volumen). Das binäre Volumen der BF Rekonstruktion ist erweitert mit der 3D Toolkit/Morphological 3D Plugin erweitern, bis alle Poren fallen und dann erodiert mit 3D Toolkit/Morphological Erodieren 3D beliebig oft erweitert. Dann wird das gewonnene Volumen multipliziert das invertierte Volumen des binarisierten BF-Volumens zu Poren Verteilung Volumen führen, die mit einer speziellen Oberfläche Rendering-Software visualisiert werden können.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Tomography - Methods for Three-Dimensional Visualization of Structures in the Cell. , (2006).</li><li>Midgley, P. A., Dunin-Borkowski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+and+holography+in+materials+science.">Electron tomography and holography in materials science.</a> Nat. Mater. 8, 271-280 (2009).</li><li>Carenco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+contribution+of+transmission+electron+microscopy+to+functional+nanomaterials+engineering.">The core contribution of transmission electron microscopy to functional nanomaterials engineering.</a> Nanoscale. 8 (3), 1260-1279 (2016).</li><li>Radon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uber+die+Bestimmung+von+Funktionen+durch+ihre+Integralwerte+langs+gewisser+Mannigfaltigkeiten.">Uber die Bestimmung von Funktionen durch ihre Integralwerte langs gewisser Mannigfaltigkeiten.</a> Akad. Wiss. 69, 262-277 (1917).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radon+transform+techniques+for+alignment+and+three-dimensional+reconstruction+from+random+projections.">Radon transform techniques for alignment and three-dimensional reconstruction from random projections.</a> Scanning Microscopy. 11, 171-177 (1997).</li><li>Roiban, L., Sorbier, L., Pichon, C., Pham-Huu, C., Drillon, M., Ersen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-TEM+investigation+of+the+nanostructure+of+a+&#948;-Al2O3+catalyst+support+decorated+with+Pd+nanoparticles.">3D-TEM investigation of the nanostructure of a &#948;-Al2O3 catalyst support decorated with Pd nanoparticles.</a> Nanoscale. 4 (3), 946-954 (2012).</li><li>Georgescu, D., Roiban, L., Ersen, O., Ihiawakrim, D., Baia, L., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+Ag+doped+porous+TiO2+nanostructures:+a+comprehensive+study+of+their+structural+and+morphological+characteristics.">Insights on Ag doped porous TiO2 nanostructures: a comprehensive study of their structural and morphological characteristics.</a> RSC Adv. 2 (12), 5358 (2012).</li><li>Shakeri, M., Roiban, L., Yazerski, V., Prieto, G., Gebbink, M. J. M. G., de Jongh, P. E., de Jong, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+Sizing+Nanoreactors+To+Confine+Metal+Complexes+for+Enhanced+Catalytic+Performance.">Engineering and Sizing Nanoreactors To Confine Metal Complexes for Enhanced Catalytic Performance.</a> ACS Catal. 4 (10), 3791-3796 (2014).</li><li>Midgley, P. A., Weyland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+electron+microscopy+in+the+physical+sciences:+the+development+of+Z-contrast+and+EFTEM+tomography.">3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).</li><li>Ersen, O., Florea, I., Hirlimann, C., Pham-Huu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+nanomaterials+with+3D+electron+microscopy.">Exploring nanomaterials with 3D electron microscopy.</a> Mater. Today. 18 (7), 395-408 (2015).</li><li>Lepinay, K., Lorut, F., Pantel, R., Epicier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+3D+tomography+of+28nm+high+K+metal+gate+transistor:+STEM+XEDS+experimental+method+and+results.">Chemical 3D tomography of 28nm high K metal gate transistor: STEM XEDS experimental method and results.</a> Micron. 47, 43-49 (2013).</li><li>Roiban, L., Sorbier, L., Pichon, C., Bayle-Guillemaud, P., Werckmann, J., Drillon, M., Ersen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Chemistry+of+Multiphase+Nanomaterials+by+Energy-Filtered+Transmission+Electron+Microscopy+Tomography.">Three-Dimensional Chemistry of Multiphase Nanomaterials by Energy-Filtered Transmission Electron Microscopy Tomography.</a> Microsc. Microanal. 18 (05), 1118-1128 (2012).</li><li>Roiban, L., Sorbier, L., Hirlimann, C., Ersen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+D+Chemical+Distribution+of+Titania-Alumina+Catalyst+Supports+Prepared+by+the+Swing-pH+Method.">3 D Chemical Distribution of Titania-Alumina Catalyst Supports Prepared by the Swing-pH Method.</a> ChemCatChem. 8 (9), 1651-1657 (2016).</li><li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).</li><li>Messaoudi, C., Aschman, N., Cunha, M., Oikawa, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Chemical+Mapping+by+EFTEM-TomoJ+Including+Improvement+of+SNR+by+PCA+and+ART+Reconstruction+of+Volume+by+Noise+Suppression.">Three-Dimensional Chemical Mapping by EFTEM-TomoJ Including Improvement of SNR by PCA and ART Reconstruction of Volume by Noise Suppression.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (6), 1669-1677 (2013).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), (2004).</li><li>Roiban, L., Ersen, O., Hirlimann, C., Drillon, M., Chaumonnot, A., Lemaitre, L., Gay, A. S., Sorbier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Analytical+Surface+Quantification+of+Heterogeneous+Silica-Alumina+Catalyst+Supports.">Three-Dimensional Analytical Surface Quantification of Heterogeneous Silica-Alumina Catalyst Supports.</a> ChemCatChem. 9 (18), 3503-3512 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Align RGB planes. ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://ImageJ.net/Align_RGB_planes">https://ImageJ.net/Align_RGB_planes</a> (2018)</li><li>MessaoudiI, C., Boudier, T., Sorzano, C., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TomoJ:+tomography+software+for+three-dimensional+reconstruction+in+transmission+electron+microscopy.">TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy.</a> BMC Bioinf. 8 (1), 288 (2007).</li><li>Saxton, W. O., Baumeister, W., Hahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+imperfect+two-dimensional+crystals.">Three-dimensional reconstruction of imperfect two-dimensional crystals.</a> Ultramicroscopy. 13 (1-2), 57-70 (1984).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Papier soll beschreiben, wie man chemische 3D-Karten mit Lutetium-Tomographie zu erhalten. Dieses Protokoll ist komplett original und wurde von den Autoren entwickelt.
Lutetium-Tomographie wie hier beschrieben hat mehrere Nachteile: (i) nur Proben, die Elektronen Strahl resistent sind analysiert werden können, aufgrund der langen Belichtungszeit erforderlich für den Erhalt der gefilterte Bilder. (Ii) Lutetium-Tomographie ist empfindlich gegenüber der Beugung Kontrast. (Iii) viele der Achsen wurden manuell durchgeführt. Um chemische 3D-Karte zu erhalten, müssen die Zero-Loss-Lautstärke und die chemische Bände in einem System von Koordinaten. Dies setzt voraus, dass die Tilt-Serie perfekt im gleichen Koordinatensystem ausgerichtet werden. Dies stellt einen langen Zeitraum von mindestens zwei Wochen pro Probe. Obwohl es ist zeitaufwendig, ermöglicht dieses Protokoll die Berechnung der chemischen 3D-Karten mit Nanometer Auflösung. Darüber hinaus kann in Kombination mit anderen spektroskopischen und analytische Techniken wie, Röntgenfluoreszenz, Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie, FTIR-Spektroskopie oder Magie-Winkel-Spinnen (MAS) NMR-Spektroskopie, eine vollständige Beschreibung der funktionellen Material sein erstellt.
Die Strahlintensität Elektron wird in der Regel durch Kondensation des Elektronenstrahls gesteuert. Die Breite des Fensters Energie durch die gefilterte Bilder aufgezeichnet sind, und ihre Belichtungszeit beeinflusst die chemischen Signalintensität aufgezeichnet in jedem chemischen Projektion, die als schräge Projektionen verwendet wird, um die chemische Lautstärke zu rekonstruieren. Die Belichtungszeit der gefilterten Bilder wird während der Aufnahme der Baureihe Tilt gesamtbelichtungszeit von der Probe unter einer intensiven Elektronenstrahl beeinflussen. Wenn eine Probe zu viel Zeit unter dem Balken bleibt, kann es drastische Änderungen leiden. Die Breite der energiefenster beeinflusst die Hintergrund-Annäherung mit einem Potenzgesetz, um das chemische Signal aus dem Post-Rand gefiltertes Bild mit der drei-Fenster-Methode zu extrahieren.
Denn es ist eine anspruchsvolle Technik und zeitaufwendig, Lutetium-Tomographie ist nicht praktisch für breite Skala Umsetzung. Technische Neuerungen wie die Entwicklung von empfindlicher Spektrometer25 und schnelle Aufnahme Kameras26,27 (die Kameras-Referenzen-Liste ist eine unvollständige Liste) verringert jedoch die totale Rekordzeit von der Neigung Serie und die energetische Auflösung der chemischen Karten verbessern wird. Wie bereits erwähnt, sind viele der Achsen manuell, von Signalextraktion und Berechnung der chemischen Projektionen auf die Ausrichtung der alle Projektionen auf die gleiche Referenz. Die Entwicklung von automatischen Verfahren erstellt eine allgemeinere Verwendung von Lutetium-Tomographie in der Routineanalytik.

Die Eigenschaften von Funktionsmaterialien sind ihre 3D Parametern abhängig. Um voll begreifen, ihre Eigenschaften und ihre Funktionen zu verbessern, ist es wichtig, ihre Morphologie und Chemiedistribution in 3D zu analysieren. Elektronenstrahl-Tomographie1 (ET) ist eines der besten Techniken, um diese Informationen auf der Nanometer-Skala2,3. Es besteht aus drehen die Probe über einen großen Winkelbereich und Aufnahme ein Bild bei jedem Winkel Schritt. Die erhaltenen Tilt Series wird verwendet, um das Volumen der Probe zu rekonstruieren, mithilfe von mathematischen Algorithmen basieren auf der Radon-Transformation4,5. Auswahl der Graustufen in der Band hilft, Modell Probe in 3D und 3D Parameter wie Partikel Lokalisierung6 und Größe Verteilung7zu quantifizieren, pore, Position und Größe Verteilung8, etc.
Im Allgemeinen erfolgt durch Kippen der Probe auf den maximal möglichen Winkel, vorzugsweise mehr als 70° in beide Richtungen ET mit einem Elektronenmikroskop. Bei jedem Neigungswinkel ist eine Projektion der Probe aufgezeichnet bilden eine Bilder-Tilt-Serie. Die Tilt-Serie ist ausgerichtet und verwendet, um das Volumen der Probe rekonstruieren die segmentiert und quantifiziert werden. Da die Probe von-90 ° bis + 90 ° gedreht werden kann nicht, hat das rekonstruierte Volumen eine anisotrope Auflösung entlang der orthogonalen Achsen9 aufgrund der blind Aufnahme-Winkel.
ET kann in verschiedenen bildgebenden Modi durchgeführt werden. Die Hellfeld-TEM-Modus (BF-TEM) wird verwendet, um amorphe Materialien, biologischen Proben, Polymere zu studieren, oder Katalysator unterstützt mit komplexen Formen. Die Bildanalyse basiert auf die Differenzierung der Graustufen charakterisieren die Dichte der Komponenten10 (eine dichten Komponente werden mehr dunkel als ein Feuerzeug, d. h., weniger dichten Komponente). High-Angle annular Dunkelfeld im scanning-Modus TEM (HAADF-Stamm) wird verwendet, um kristalline Proben zu analysieren. Das Signal enthält chemische Informationen in Abhängigkeit von der Ordnungszahl; eine starke Komponente der Probe erscheinen heller, leichter eine9. Andere Modi, wie Energie energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX), die das Röntgenbild von der materiellen11und Energie emittiert sammelt gefiltert bildgebenden Modus (Lutetium)12,13, sind auch in der Lage beurteilen die 3D Chemiedistribution in der Probe.
In der Bildgebung Lutetium, können chemische 2D-Karten mit einem TEM mit einem Elektron Energie Spektrometer aufgezeichnet werden. Das Spektrometer wirkt als Magnet Prisma durch Dispergieren der Elektronen in Abhängigkeit von ihrer Energie. Ein Bild entsteht durch die Elektronen abhängig von der Energieverlust aus der Interaktion mit einem bestimmten Atom. Wenn die gleichen chemischen 2D-Karte auf unterschiedliche Neigungswinkel, eine Neigung, die Reihe von chemischen Projektionen vorliegt berechnet wird, kann die chemische 3D-Volumen rekonstruieren verwendet werden.
Nicht alle Materialien können durch Lutetium-Tomographie analysiert werden. Die Technik ist für Proben mit einem schwachen oder ungeordnete Materialien vorbehalten. Dennoch kann es verwendet werden, für die Analyse von leichter Elementen, die sehr schwer zu unterscheiden, wenn mit anderen bildgebenden Verfahren. Darüber hinaus muss die Dicke des Materials um zuverlässige chemische 2D-Karten zu erhalten, kleiner als die mittlere freie Weglänge der Elektronen durch die materielle14sein. Unter dieser Bedingung ist die Wahrscheinlichkeit des Habens eines einzelnen Elektrons Interaktion mit einem einzelnen Atom am größten. Zwei Methoden zur Berechnung einer chemischen 2D-Karte. Die erste und die am häufigsten verwendete ist die "drei-Fenster-Methode", wo zwei gefilterten energiefenster vor der Ionisierung Kante des Elements unter Analyse und ein Drittel nach der Ionisation Kante13aufgenommen. Die ersten beiden Bilder werden verwendet, um den Hintergrund zu schätzen, die extrapoliert wird mit einem Potenzgesetz an der Position des dritten Fenster und abgezogen. Das erhaltene Bild ist die Projektion der 3D Verteilung der analysierten chemischen Elements in das Probenvolumen. Die zweite Methode wird der "Sprung-Ratio"; Es nutzt nur zwei Energie-gefilterte Bilder vor und nach der Ionisation Kante. Diese Methode ist qualitativ, wie das endgültige Bild ergibt sich nur durch das Verhältnis zwischen diesen beiden Bildern durchführen, und nicht für Hintergrund Energie Variation berücksichtigt.
Durch die Kombination von Lutetium mit ET, erhalten Sie die analytische Tomographie der gefilterte Energie. Lutetium-Tomographie und Atom Probe Tomography (APT) sind sich ergänzende Techniken. Im Vergleich zu APT ist Lutetium-Tomographie eine zerstörungsfreie Charakterisierung-Analyse, die nicht komplexe Probenvorbereitung braucht. Es kann verwendet werden, verschiedene Charakterisierungen auf ein einzigartiges Nanopartikel durchführen. Lutetium-Tomographie kann Dämmstoffe, analysieren, während APT am allerwenigsten Laser Hilfe braucht, um sie zu messen. APT läuft auf atomarer Skala, während Lutetium-Tomographie angemessen mit einer niedrigeren Auflösung führt. Lutetium-Tomographie ist nur für Proben, die Balken Abbau während des Experiments zu widerstehen. Um die gefilterten Bilder an alle geneigten Winkel zu erfassen, kann die Probe der Elektronenstrahl 2 h lang ausgesetzt werden. Um eine maximale chemisches Signal in den 2D-Karten aufzuzeichnen, können darüber hinaus längere Exposition Laufzeiten bei Fernlicht Intensität erforderlich sein. Unter solchen Bedingungen leiden Strahl empfindlichen Proben morphologische und chemischen Veränderungen. Daher muss eine präzise Messung der Probe Empfindlichkeit zu den Elektronenstrahl vor dem Experiment hergestellt werden. Darüber hinaus ist Lutetium-Tomographie das Ergebnis der Aufnahme möglichst viele Schichtbilder wie nötig zu bestimmen die räumliche Position und die Natur der chemischen Elemente, die in der Probe. Dennoch kann Lutetium-Tomographie wichtige Informationen über die 3D Chemiedistribution für Proben, wie Katalysator unterstützt, um neue Erkenntnisse geben für die Modellierung von deren katalytische Anwendungen bereitstellen.
Heute ist es möglich, speziellen Software verwenden, der das Energie-Intervall auswählen können, Energie Fenster Bilder gefiltert und berechnen Sie die Chemikalie in verschiedene Neigungswinkel Karten. Sie ermöglichen kippen die Probe, tracking, Fokussierung und das gefilterte Bild im Lutetium Modus Aufnahme. Chemische 2D-Karten können berechnet werden, kann und dann die Tilt Series ausgerichtet werden können, die chemische Volumen mit iterative Algorithmen berechnet und schließlich die Serie segmentiert und quantifizierte15,16.

<table><tbody><tr><td>JEOL 2100f</td><td>JEOL</td><td></td><td>Electron microscope</td></tr><tr><td>Tridiem Gatan Imaging Filter (GIF)</td><td>Gatan</td><td></td><td>Post colum energy filter</td></tr><tr><td>Digital micrograph</td><td>Gatan</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Gatan EFTEM tomography plugin</td><td>Gatan</td><td></td><td>Dedicated software to record filtered tilt series for EFTEM tomograohy</td></tr><tr><td>Tomoj</td><td>Imagej plugin http://www.cmib.fr/en/download/softwares/</td><td></td><td>Free software developed by Currie Institute in Paris, France for electron tomography</td></tr><tr><td>EFTEM-Tomoj</td><td>Imagej plugin http://www.cmib.fr/en/download/softwares/</td><td></td><td>Free software developed by Currie Institute in Paris, France , for EFTEM imaging</td></tr><tr><td>Imod</td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td><td></td><td>Free software developed by University of Colorado, USA for electron tomography</td></tr><tr><td>Imagej</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td>Free software developed by National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA for images treatment</td></tr><tr><td>Merge channels</td><td>https://imagej.net/Color_Image_Processing</td><td></td><td>Fonction in Imagej allowing to give different colors to volumes while they are overlapped</td></tr><tr><td>3D Slicer</td><td>https://www.slicer.org/</td><td></td><td>Free software developed by a large consortium lead by Ron Kikinis , Harvard Medical School, Boston, MA, SUA</td></tr><tr><td>Chimera</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td><td></td><td>Free software developed by the Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco,for data segmentation, cuatification and visualisation of 3D models</td></tr><tr><td>silica alumina support of catalyst</td><td>IFPEN</td><td></td><td>sample prepared for eleboration of this protocol</td></tr><tr><td>titania alumina support of catalyst</td><td>IFPEN</td><td></td><td>sample prepared for eleboration of this protocol</td></tr><tr><td>alcohol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Au nanoparticles of 5 nm</td><td>BBI Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holey carbn film 200 mesh microscopy grid</td><td>Agar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDX sepctrometer</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obtaining 3d chemical maps by energy filtered transmission electron microscopy tomography

Energie, die gefilterte Übertragung Elektronenmikroskopie Tomographie (Lutetium-Tomographie) dreidimensionale (3D) chemische Materialien im Nanometer-Maßstab Karten anbieten kann. Lutetium-Tomographie kann chemische Elemente trennen, die sehr schwer zu unterscheiden, mit anderen bildgebenden Verfahren. Das hier beschriebene experimentelle Protokoll zeigt, wie Sie chemische 3D-Karten Verständnis der Chemiedistribution und Morphologie eines Materials zu erstellen. Probe Vorbereitungsschritte für Datensegmentierung werden vorgestellt. Dieses Protokoll ermöglicht die 3D Verteilungsanalyse der chemischen Elemente in einer nanometrischen Probe. Allerdings ist anzumerken, dass derzeit die chemische 3D-Karten nur für Proben können, die nicht Träger empfindlich erzeugt werden, da die Aufnahme des gefilterten Bilder lange Belichtungszeiten zu einem intensiven Elektronenstrahl erfordert. Das Protokoll wurde angewandt, um die chemische Verteilung der Komponenten von zwei verschiedenen heterogenen Katalysator unterstützt zu quantifizieren. In der ersten Studie wurde die Chemiedistribution von Aluminium und Titan im Titania-Aluminiumoxid unterstützt analysiert. Die Proben wurden mit der Schaukel-pH-Methode vorbereitet. Im zweiten Fall wurde der Chemiedistribution von Aluminium und Silizium in Silica-Alumina unterstützt, die bereit waren, mit den Sol-Pulver und mechanische Mischung Methoden untersucht.

Referenz13zeigt ein Beispiel für die Anwendung dieses Protokolls. Lutetium-Tomographie wurde verwendet für die Analyse von Titania-Aluminiumoxid-Katalysator unterstützt. Verbesserung die katalytische Aktivität der aktiven Phase der MoS2 Nanopartikel in Anwendungen wie Hydrodesulfurierung (HDS), ist es wichtig, dass Titania überlegene an der Auflagefläche, und im Kontakt mit der aktiven Phase. Es ist bekannt, dass Titania eine kleinere spezifische Oberfläche als Aluminiumoxid. Das Ziel der Studie ist es, konstruieren Titania von Aluminiumoxid unterstützt (und somit eine verbesserte spezifische Oberfläche erstellen), und dann es als Katalysator Unterstützung zu testen. Hier ist die Lutetium-Tomographie zum Analysieren der Titania-Aluminiumoxid heterogener Katalysator Unterstützung durch die Swing-pH-Methode vorbereitet. In dieser Studie werden drei Proben von verschiedenen Titania Konzentrationen analysiert. Probe 1 besteht aus 50 % Aluminiumoxid und 50 % Titania, Probe 2 besteht aus 70 % Aluminiumoxid und 30 % Titania und Beispiel 3 besteht aus 90 % Aluminiumoxid und 10 % Titania. In Figur 1a–1 c, werden die Querschnitte der chemischen Karten parallel zur XY-Ebene angezeigt. Grün steht für die räumliche Chemiedistribution von Titania, Rot steht für die Verteilung von Aluminiumoxid und Blau steht für das Vakuum. Die chemischen Mengen sind aus der Tilt-Serie mit den drei Windows-Methode berechnet. Die gefilterte energiefenster waren wie folgt: 10 eV breit, zentriert auf 59, 70 und 81 eV, mit einer Expositionszeit von 3 s für die Al L23 Kante befindet sich am 73 eV und 30 eV breit, zentriert auf 415 445 und 482 eV, mit einer Aufnahmedauer von 15 s für die Ti L23 Kante liegt bei 455 eV. Die Position sowie die Breite und die Belichtungszeit der gefilterten Bilder wurden ausgewählt, um eine chemische Karte mit einem nachweisbaren chemisches Signal zu bekommen. Die Tilt-Serie wurden-71 ° bis + 71 ° mit einem Inkrement von 4° die Saxton Modus24 in ca. 119 min. gedreht.
Es wurde festgestellt, dass Titania in einer hohen Konzentration Cluster bilden, die in der Tonerde eingebettet sind. Die Modelle sind in Abbildung 1 d (Beispiel 1), 1e (Beispiel 2) und 1f (Beispiel 3) angezeigt. Bei den Modellen der Titania in blau angezeigt und das Aluminiumoxid transparent rot angezeigt wird. Diese Modelle wurden mit der Chemiedistribution von Titania und Aluminiumoxid auf der Oberfläche der Proben quantifiziert. Es wurde festgestellt, dass unabhängig von der Anteil der Titania und Aluminiumoxid in der Probe, die Oberfläche der Probe mit Titania in einem Anteil von 30 % fällt. Allerdings steigt die spezifische Oberfläche der Probe, während der Titania Anteil rückläufig ist, um die spezifische Oberfläche der Tonerde zu erreichen. Probe 3 mit nur 10 % Titania, eine Schicht von etwa 10 nm Dicke bildet sich auf der Oberfläche der Probe. Auch die chemische Karte entsteht durch überlappende drei Bände: Silica in rot, Titania in grün und NULL Verlust in blau. Die Mischung zwischen rot und grün sind gelbe Voxel. Die gelben Voxel werden im Modell auf das Element mit der höchsten Intensität in die Voxel zugeschrieben. Dies ist eine Einschränkung in die räumliche Auflösung der chemischen 3D-Karten, die direkt die anisotropen Auflösung in ET und die Auflösung der chemischen 2D-Karten zur Verfügung gestellt von Lutetium zusammenhängt. Die Analyse ist korreliert mit anderen analytischen Techniken wie Röntgenfluoreszenz, Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie und N2 porosimetrie. Es wurde festgestellt, dass der Unterschied zwischen der spezifischen Oberflächen in die katalytischen Anwendungen eine Rolle spielen könnten.
Als zweites Beispiel ist die Studie in17 detailliert gezeigt. In dieser Studie analysierten wir eine Reihe von Siliziumdioxid Aluminiumoxid Katalysator unterstützt. Dieser Katalysator unterstützt haben eine Säure von der Mischung aus Aluminiumoxid und Siliziumdioxid, bilden ein Silikat zur Verfügung gestellt. Ziel der Studie war es, die Mischung zwischen den beiden Komponenten zu quantifizieren. Die experimentelle Herausforderung lag in der Tatsache, dass die L23 Kanten der Al und Si ganz in der Nähe, bei 73 eV und 99 eV bzw. sind und Ionisation Rand des Al überschneidet sich mit der Ionisation Rand des Si. Unter diesen Bedingungen ist die drei-Fenster-Methode weniger genau für das chemische Signal extrahieren. Um die zwei Signale von Al und Si zu differenzieren, wurde die "R-Verhältnis" Methode entwickelt, detaillierte Referenz12. Die gefilterte Bilder Tilt Series wurden durch Kippen des Beispielformulars-71 ° bis + 71 ° mit einem Inkrement Schritt von 4 ° in die Saxton Modus in ca. 83-104 min aufgezeichnet. Drei gefilterte Bilder wurden aufgenommen, um das Signal der L23 Ionisation Kante des Si zu isolieren. Die Bilder wurden zentriert auf 59 eV, eV 70 und 81 eV wurden 10 eV breit und exponierten für 5 s. Nach dem Signal entsprechend L23 Rand des Al, nur zwei gefilterten Bilder wurden aufgezeichnet, zentriert auf 99 eV und 110 eV, 10 eV breit und exponierten für 12 s.
In dieser Studie haben wir eine Reihe von vier Proben von Al und Si vorbereitet durch verschiedene Methoden analysiert. Abbildung 2a ist ein Querschnitt durch die chemische Karte Parallel zu der XY-Ebene und das Modell der Probe von der Sol-Pulver-Methode zubereitet. In diesem Beispiel wurde thermisch behandelt unter Dampf, nachgeben der zweiten Stichprobe, deren chemische Ablaufdiagramm und Modell werden angezeigt in Abbildung 2 b. Abbildung 2 c zeigt die chemische Karten von der Probe durch mechanische Mischung vorbereitet. Aus diesem Beispiel erhielten nach einer thermischen Behandlung unter heißem Dampf, wir die vierte Probe in Abb. 2ddargestellt. Die chemische Karten und Modelle für Aluminiumoxid sind rot und Kieselsäure sind grün, während die erweiterte Blau steht für die Grenze an der Oberfläche zwischen der Kieselsäure und Tonerde. Die Säure katalytische Aktivität wird durch die Mischung aus Aluminiumoxid und Siliziumdioxid auf der Oberfläche der Probe gegeben. Es wird festgestellt, dass unabhängig von der Art der Zubereitung, die Kieselsäure nur 30 % der Probenoberfläche abdeckt. Nach der thermischen Behandlung der Chemiedistribution ist homogener und die Oberfläche ist mit 50 % Kieselsäure und 50 % Aluminiumoxid bedeckt. Die Sol-Pulver-Methode bietet Proben mit einer hohen Homogenität zwischen den Bauteilen im Vergleich mit der mechanischen Mischung. Kleine Bereiche der Kieselsäure aus Aluminiumoxid eingebettet sind in der Probe vorhanden. Für die Probe vorbereitet durch mechanische Mischung Kieselsäure bildet den Kern der Probe und Aluminiumoxid ist als eine Schale vorhanden. Ein allgemeines Merkmal beider Proben, die nicht thermisch behandelt werden, die Kieselsäure ist in der Mitte sowie die Aluminiumoxid ist auf der Oberfläche.
Die sauren Seite Dichte zur Verfügung gestellt von der Silikat-Phase durch die intime Mischung aus Kieselsäure und Tonerde, Erstellen von Brønsted sauren Standorten an seiner Oberfläche gebildet wird gemessen in beliebigen Einheiten (a.u.)/m2 durch CO-Adsorption. Die Quantisierung der Grenze zwischen Kieselsäure und Tonerde erklang in m/g oder m/m2, die physikalische Einheiten bekannt sind. Natürlich, die Schnittstelle zwischen Kieselsäure und Tonerde könnte dicker sein, aber die räumliche Auflösung erreicht erlaubte nicht die Berechnung der genauen Wert der entsprechenden Breite. Diese Studie öffnet, den Weg für ein tieferes Verständnis für die Schnittstelle zwischen Kieselsäure und Tonerde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56671/56671fig1.jpg"> Abbildung 1: Querschnitte und rekonstruierten Modelle der Titania und Aluminiumoxid Proben. Querschnitte durch die chemische Karte parallel zu der XY-Ebene, wo die chemische Verteilungen für Titania (in grün), Aluminiumoxid (in rot) und das Vakuum (in blau) angezeigt: (ein) Probe 1, 50 % Aluminiumoxid und 50 % Titania, (b) Probe 2, 70 % Aluminiumoxid und 30 % Titania, und (c) Probe 3, 90 % Aluminiumoxid und 10 % Titania. (d) (e) und (f) die Modelle der Probe 1, Probe 2 und Beispiel 3, bzw. mit Titania in blau und Aluminiumoxid in transparent rot angezeigt. In Beispiel 1 und Beispiel 2 bettet das Aluminiumoxid der Titania. In Beispiel 3, eine dünne Schicht von 10 nm von Titania bildet sich auf der Oberfläche der Probe. Diese Zahl wurde von Roiban Et Al. modifiziert 13 <a href="/files/ftp_upload/56671/56671fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56671/56671fig2.jpg"> Abb. 2: Querschnitte und rekonstruierten Modelle der Kieselsäure und Tonerde Proben. Auf der linken Seite sind die Querschnitte parallel zur XY-Ebene von den chemischen Volumen, auf der rechten Seite sind die rekonstruierten Modelle. Tonerde in rot angezeigt wird, sind Kieselsäure in grün und die Grenze zwischen den Oberflächen der Kieselsäure und Tonerde in blau angegeben. In diesen Modellen wird die Grenze künstlich durch eine 4-Voxel Kugel sichtbar machen aufgedehnt. (ein) die Probe vorbereitet durch das Sol-Pulver-Methode, (b) die Probe von der Sol-Pulver-Methode vorbereitet und thermisch behandelt, (c) die Probe vorbereitet durch mechanische Mischung Methode und (d) die Probe vorbereitet durch die mechanische Mischung Methode und thermisch behandelt. Diese Zahl wurde von Roiban Et Al. modifiziert 17 <a href="/files/ftp_upload/56671/56671fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining 3D Chemical Maps by Energy Filtered Transmission Electron Microscopy Tomography at JoVE.com

Obtaining 3D Chemical Maps by Energy Filtered Transmission Electron Microscopy Tomography

Gewinnung chemische 3D-Karten von Energy Transmission Electron Microscopy Tomographie gefiltert

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll zur chemischen 3D-Karten Energie gefiltert Bildgebung und Elektron Tomographie kombiniert zu erreichen. Die Chemiedistribution von zwei Katalysator unterstützt durch Elemente, die schwer zu unterscheiden von anderen bildgebenden Verfahren gebildet wurde untersucht. Jede Anwendung besteht aus mapping überlappende chemische Elemente - bzw. Abstand Ionisation Kanten.

Energy filtered transmission electron microscopy tomography (EFTEM tomography) can provide three-dimensional (3D) chemical maps of materials at a ...

obtaining-3d-chemical-maps-energy-filtered-transmission-electron

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

6.4K Aufrufe.  Université Claude Bernard Lyon 1. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll zur chemischen 3D-Karten Energie gefiltert Bildgebung und Elektron Tomographie kombiniert zu erreichen. Die Chemiedistribution von zwei Katalysator unterstützt durch Elemente, die schwer zu unterscheiden von anderen bildgebenden Verfahren gebildet wurde untersucht. Jede Anwendung besteht aus mapping überlappende chemische Elemente - bzw. Abstand Ionisation Kanten.

Serie: Obtaining 3D Chemical Maps by Energy Filtered Transmission Electron Microscopy Tomography

Energy Dispersive X-ray Tomography for 3D Elemental Mapping of Individual Nanoparticles

Energy dispersive X-ray spectroscopy within the scanning transmission electron microscope (STEM) provides accurate elemental analysis with high spatial resolution, and is even capable of providing atomically resolved elemental maps. In this technique, a highly focused electron beam is incident upon a thin sample and the energy of emitted X-rays is measured in order to determine the atomic species of material within the beam path. This elementally sensitive spectroscopy technique can be extended to three dimensional tomographic imaging by acquiring multiple spectrum images with the sample tilted along an axis perpendicular to the electron beam direction.
Elemental distributions within single nanoparticles are often important for determining their optical, catalytic and magnetic properties. Techniques such as X-ray tomography and slice and view energy dispersive X-ray mapping in the scanning electron microscope provide elementally sensitive three dimensional imaging but are typically limited to spatial resolutions of &gt; 20 nm. Atom probe tomography provides near atomic resolution but preparing nanoparticle samples for atom probe analysis is often challenging. Thus, elementally sensitive techniques applied within the scanning transmission electron microscope are uniquely placed to study elemental distributions within nanoparticles of dimensions 10-100 nm.
Here, energy dispersive X-ray (EDX) spectroscopy within the STEM is applied to investigate the distribution of elements in single AgAu nanoparticles. The surface segregation of both Ag and Au, at different nanoparticle compositions, has been observed.

The use of energy dispersive X-ray tomography in the scanning transmission electron microscope to characterize elemental distributions within single nanoparticles in three dimensions is described.

Energieröntgentomografie für 3D-Elementar Zuordnung einzelner Nanopartikel

Energy dispersive X-ray spectroscopy within the scanning transmission electron microscope (STEM) provides accurate elemental analysis with high spatial ...

Forschung

Ingenieurwesen

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Biotechnik

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Biologie

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Simplified Volumetric Models as an Effective Strategy for Segmenting Actin Networks in Cryo-Electron Tomograms

Efficient methods for the extraction of features of interest remain one of the biggest challenges for the interpretation of cryo-electron tomograms. Various automated approaches have been proposed, many of which work well for high-contrast datasets where the features of interest can be easily detected and are clearly separated from one another. Our inner ear stereocilia cryo-electron tomographic datasets are characterized by a dense array of hexagonally packed actin filaments that are frequently cross-connected. These features make automated segmentation very challenging, further aggravated by the high-noise environment of cryo-electron tomograms and the high complexity of the densely packed features. Using prior knowledge about the actin bundle organization, we have placed layers of a highly simplified ball-and-stick actin model to first obtain a global fit to the density map, followed by regional and local adjustments of the model. We show that volumetric model building not only allows us to deal with the high complexity, but also provides precise measurements and statistics about the actin bundle. Volumetric models also serve as anchoring points for local segmentation, such as in the case of the actin-actin cross connectors. Volumetric model building, particularly when further augmented by computer-based automated fitting approaches, can be a powerful alternative when conventional automated segmentation approaches are not successful.

Here, we present a protocol to place simplified volumetric models into noisy, complex, tomographic 3D volumes. This allows the fast segmentation of actin filament densities, detection of systematic filament bending and of gaps in hair bundle filaments, as well as convenient quantification of volumetric model properties, such as distances.

Efficient methods for the extraction of features of interest remain one of the biggest challenges for the interpretation of cryo-electron tomograms. ...

Neurowissenschaften

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Eine kartographische 3D-Beschreibung der Zelle durch Kryo-Soft-Röntgentomographie

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, replication, segregation, etc.) remain poorly understood, partially due to the lack of experimental approaches to high-resolution visualization of specific chromatin loci in structurally preserved nuclei. Here we present a protocol for the visualization of replicative domains in monolayer cell culture in situ,&#160;by combining EdU labeling of newly synthesized DNA with subsequent label detection with Ag-amplification of Nanogold particles and ChromEM staining of chromatin. This protocol allows for the high-contrast, high-efficiency pre-embedding labeling, compatible with traditional glutaraldehyde fixation that provides the best structural preservation of chromatin for room-temperature sample processing. Another advantage of pre-embedding labeling is the possibility to pre-select cells of interest for sectioning. This is especially important for the analysis of heterogeneous cell populations, as well as compatibility with electron tomography approaches to high-resolution 3D analysis of chromatin organization at sites of replication, and the analysis of post-replicative chromatin rearrangement and sister chromatid segregation in the interphase.

This protocol presents a technique for high-resolution mapping of replication sites in structurally preserved chromatin in situ that employs a combination of pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold labeling and ChromEMT.

Abbildung replikativer Domänen in ultrastrukturell konserviertem Chromatin mittels Elektronentomographie

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

Kryo-Elektronen-Tomographie Ferndatenerfassung und Subtomogramm-Mittelwertbildung

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is solidified into a glass (i.e., vitrified) without crystallization. The cryo-EM method is widely used to determine the structure of biological macromolecules recently at a near-atomic resolution. The approach has been extended to the study of organelles and cells using tomography, but the conventional mode of wide-field transmission EM imaging suffers a severe limitation in the specimen thickness. This has led to a practice of milling thin lamellae using a focused ion beam; the high resolution is obtained by subtomogram averaging from the reconstructions, but three-dimensional relations outside the remaining layer are lost. The thickness limitation can be circumvented by scanned probe imaging, similar to the scanning EM or the confocal laser scanning microscope. While scanning transmission electron microscopy (STEM) in materials science provides atomic resolution in single images, the sensitivity of cryogenic biological specimens to electron irradiation requires special considerations. This protocol presents a setup for cryo-tomography using STEM. The basic topical configuration of the microscope is described for both two- and three-condenser systems, while automation is provided by the non-commercial SerialEM software. Enhancements for batch acquisition and correlative alignment to previously-acquired fluorescence maps are also described. As an example, we show the reconstruction of a mitochondrion, pointing out the inner and outer membrane and calcium phosphate granules, as well as surrounding microtubules, actin filaments, and ribosomes. Cryo-STEM tomography excels in revealing the theater of organelles in the cytoplasm and, in some cases, even the nuclear periphery of adherent cells in culture.

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryo-STEM tomography provides a means to visualize organelles of intact cells without embedding, sectioning, or other invasive preparations. The 3D resolution obtained is currently in the range of a few nanometers, with a field of view of several micrometers and an accessible thickness in the order of 1 &#181;m.