Diese Arbeit ist unterstützt das Programm zur Verbesserung der Forschungslandschaft für junge Forscher aus Sondermitteln Koordination für die Förderung von Wissenschaft und Technik (SCF) (zu T.S), Grants-in-Aid für wissenschaftliche Forschung (Nr. 16 K 09494, T.S, Nr. 26293052, zu T.F) aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) von Japan. Wir freuen uns über Brainvision und Herrn Kenji Tsubokura für die technische Unterstützung, und wir schätzen auch Mr. John Martin für seine sprachliche Unterstützung.

Dieser Tierversuch wurde genehmigt und unter der Verordnung von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss von Tokio medizinischen und zahnmedizinischen Universität durchgeführt.
1. Vorbereitung
<ol><li>Stammlösungen<ol>
<li>Lösen der Spannung-empfindlichen Farbstoffen (di-4-ANEPPS und RH237) und Ca2 + Indikator (Rhod 2 bin) mit 100 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), Stammlösungen mit Konzentrationen von 6 mM, 10 mM und 10 mM, bzw. zu machen.</li>
		<li>Auflösen der Erregung-Kontraktion (E-C) Entkuppler, Blebbistatin, mit 90 % DMSO, eine 50 mM-Stammlösung zu machen.</li>
		<li>Aliquoten Stammlösungen in einem 0,2 mL PCR Rohr in einem dunklen Raum, und ersetzen Sie die Luft in das Lager Rohr mit Stickstoffgas um Oxidation zu vermeiden.</li>
		<li>Wickeln Sie die Lager Rohre in Alu-Folie individuell für den Lichtschutz und bei-20 ° c lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Funktionierende Lösungen<ol>
<li>Bereiten Sie 1 L Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2 + (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,0 mM Na2HPO4und 1,5 mM KH2PO4pH 7,40 durch NaOH eingestellt)</li>
		<li>Bereiten Sie 1 L Tyrode Lösung (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-Glukose und 5,0 mM HEPES, pH 7,40 durch NaOH eingestellt).</li>
		<li>Tyrode Lösung mit einem 0,22 µm Flasche Top Filter filtern und durch Blase Belüftung über einen Ausströmerstein angeschlossen an eine Gasflasche O2 gut belüften.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optische Zuordnung in Langendorff durchblutet Herzen
<ol><li>Montieren Sie die optische Mapping-System mit zwei komplementäre Metalloxid-Halbleiter (CMOS)-Kameras (Abb. 1aund b)<ol>
<li>Montieren Sie die CMOS-Kameras, Strahlteiler, Objektive, Objektiv-Revolver, Lichtquelle, dichroitischen spiegeln, Filter und andere Teile in der optischen Mapping-System wie in Figur 1a& bgezeigt.</li>
		<li>Wählen Sie die Vergrößerung durch das Objektiv in einem Turm, ausgestattet mit verschiedenen Vergrößerungen (1,6 X und 5 X) ändern. Hinweis: Die Größe des CMOS-Sensors ist 10 mm × 10 mm, mit einer Auflösung von 100 × 100, d. mit 5 X Objektiv h., bietet dieses System eine räumliche Auflösung von 20 µm.</li>
		<li>Legen Sie das Anregungslicht mit einer Leuchtdiode (LED) Lampe mit einer Wellenlänge von Zentrum von 530 nm, durchlaufen einen Bandpass-Filter (520/35 nm), und mit einem dichroitischen Spiegel reflektiert (560 nm).</li>
		<li>Aufzeichnen der Emission Signal geteilt durch einen Splitter (665 nm), in welcher Einstellung Kamera 1 mit einem langen pass Filter (697/75 nm) erkennt die Fluoreszenz, die mit einer Membran Spannung-empfindlichen Farbstoff (di 4-ANEPPS oder RH237) und Kamera 2 mit einem Bandpass-Filter (572/28 nm) erkennt die Signal von der Ca2 + Indikator (Rhod2-Uhr).</li>
	</ol></li>
	<li>Montieren Sie die Langendorff Perfusion Schaltung<ol>
<li>Befestigen Sie Polyvinylchlorid (PVC) Röhren an einer peristaltischen Pumpe.</li>
		<li>Legen Sie die Saugseite des PVC-Rohres in Tyrode Lösung mit 100 % O2 belüftet, wie in Schritt 1.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Der Druckseite des PVC-Rohres an eine handgefertigte Luftfalle anschließen, dann ordnen Sie die 5 µm Filter, drei-Wege-Hähne, Druckaufnehmer, Heizung Glas Spule und abgestumpften 21-Gauge-Nadel (die Nadelstärke ist entsprechend der Aorta Größe veränderbar) gegenüber dem Vorquartal , mit anderen PVC-Rohre.</li>
		<li>Füllen Sie die Perfusion Schaltung mit Tyrode Lösung, die Vermeidung von Luftblasen in der Schaltung zu, und stoppen Sie den Fluss zu, bis das Herz mit der Schaltung verbunden ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Heparinisierung und Anästhesie<ol>
<li>Spritzen Sie unfraktioniertem Heparin (200 IU, unabhängig vom Körpergewicht) intraperitoneal in eine Maus mit einem 25-Gauge-Nadel und Spritze 1 mL.</li>
		<li>Betäuben Sie die Maus durch eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (65mg/kg) 10 min nach der Injektion von Heparin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kanülierung und Durchblutung<ol>
<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in die Rückenlage. Bestätigen Sie die Tiere betäubt, durch mangelnde Reaktion bis zu den Zehen Prise. Öffnen Sie die Bauchdecke unter dem Xiphoid Prozeß-Niveau mit einer Schere. Machen eine Quereinschnitt im Zwerchfell, durchs Herz beidseitig der Rippen in der medialen Axillarlinie ohne Schäden und die vorderen Brustwand nach oben kippen. Gebogene Pinzette hinter dem Herzen voraus, und halten Sie die absteigende Aorta, Speiseröhre und minderwertige Vena Cava. Dann, Verbrauchsteuern Sie Herzen mit einer Schere schnell zusammen mit dem angrenzenden Gefäße und Gewebe, wie die Aorta, Lunge, Luftröhre, Speiseröhre, Fettgewebe und Thymus.</li>
		<li>Das Herz mit 10 mL eiskaltem PBS in einer Petrischale zu waschen, und das anliegende Gewebe zu entfernen.</li>
		<li>Stellen Sie die Spitze der abgestumpften 21-Gauge-Nadel in der Aorta ascendens an die Perfusion-Kreislauf angeschlossen, und befestigen Sie es mit Gewinde unter einem Stereomikroskop.</li>
		<li>Beginnen Sie, das Herz für 10 min mit Tyrode Lösung mit 100 % O2belüftet durchspülen.</li>
		<li>Überwachen Sie den Perfusionsdruck kontinuierlich mit der Drucksensor an der Verstärker und der Recorder angeschlossen.</li>
		<li>Halten Sie den Perfusionsdruck zwischen 80-100 MmHg (in der Regel 2-5 mL/min für den Durchfluss entsprechend) während der folgenden Schritte.</li>
		<li>Während der anfänglichen Perfusion (Schritt 2.4.4.) legen Sie die dünnen Polyethylen (PE)-Rohr (Außendurchmesser: 0,8 mm) in der SVC und befestigen Sie es mit einem Faden. Legen Sie dann das Herz in die vorgewärmte Glas-Kammer (Abbildung 1 b& c).</li>
		<li>Punktion eine innewohnende 24-Gauge-Nadel (Außendurchmesser: 0,7 mm) in der linken Herzkammer (LV) Aussparung durch die ventrikuläre Apex zu vermeiden Schäden in den Vorhof, und entfernen die innere Nadel verlassen die äußere Kanüle in das LV.</li>
		<li>Führen Sie einen 1-Französisch Größe benutzerdefinierte Elektrode Katheter durch das PE-Rohr in der SVC elektrischen Stimulation in der RA durchführen Bei Bedarf vorab des Katheters in den rechten Ventrikel (RV) für ventrikuläre Stimulation.</li>
		<li>Legen Sie eine Pin-Elektrode in ventrikuläre Apex kontinuierlich aufzeichnen der bipolaren Elektrokardiogramm (EKG) zwischen Pin Elektrode und Kanülierung Nadel in der Aorta ascendens (Abbildung 1 c).</li>
		<li>Überwachung des EKG und Perfusion Drucks während der gesamten Studie weiter.</li>
		<li>Schalten Sie das Licht, und führen Sie das folgende Experiment in einem dunklen Raum.</li>
		<li>Gehen Sie zu Schritt 2.5. für eine einzelne Aufnahme die Membrane Spannung oder 2.6. für eine doppelte Aufnahme der Membran Spannung und Ca2 + Transient.</li>
	</ol></li>
	<li>Für eine einzelne Aufnahme der Membran Spannung Färbung<ol>
<li>Wartung der Perfusion-Lösung bei dieser Färbung Protokoll für eine einzelne Aufnahme der Membran Spannung bei 37 ° c erwärmt.</li>
		<li>Verdünnen Sie 8.3 µL der Stammlösung di-4-ANEPPS (6 mM) mit 10 mL der Tyrode Lösung (die Endkonzentration ist 5 µM).</li>
		<li>Ziehen Sie das Gesamtvolumen (10 mL) der verdünnten Lösung di-4-ANEPPS in das Herz über die Perfusion Route für 2-5 min, gefolgt von einer Auswaschung mit Tyrode Lösung für 5 min.</li>
		<li>Verdünnen Sie 5 µL der Stammlösung Blebbistatin (50 mM) mit 1mL der Tyrode Lösung (die Endkonzentration beträgt 250 µM).</li>
		<li>Den Gesamtbetrag der verdünnte Blebbistatin-Lösung über die Perfusion Route zu verwalten.</li>
		<li>Überspringen Sie 2.6 Schritt und fahren Sie mit Schritt 2.7 für auswaschen.</li>
	</ol></li>
	<li>Für eine doppelte Aufzeichnung der Membran Spannung und Ca2 + Transient Färbung<ol>
<li>Die Tyrode-Lösung bei Zimmertemperatur aufbewahren. Hinweis: Diese anfängliche Einstellung der Temperatur ist anders als in der Färbung für eine einzelne Aufnahme der Membran Spannung (Schritt 2.5.).</li>
		<li>Verwalten Sie die Blebbistatin auf die gleiche Weise wie in den Schritten 2.5.4 und 2.5.5.</li>
		<li>Mix 3 µL der Stammlösung Rhod2AM (10 mM) und 30 µL Polyoxyethylen-Polyoxypropylene block Copolymer F-127 (20 % DMSO), dann die Mischung mit 10 mL der Tyrode Lösung verdünnen.</li>
		<li>Laden Sie den Gesamtbetrag der Rhod2AM Lösung (3 µM) über 2 bis 5 min über den gleichen Weg wie die Blebbistatin.</li>
		<li>Verdünnen Sie 7 µL der Stammlösung RH237 (10 mM) mit 10 mL der Tyrode Lösung.</li>
		<li>Verwalten den Gesamtbetrag der verdünnte RH237-Lösung (7 µM) über 2 bis 5 min.</li>
		<li>Beginnen Sie nach Abschluss des oben genannten Verfahrens, die Tyrode-Lösung bei 37 ° c zu erhitzen.</li>
	</ol></li>
	<li>Auswaschung<ol>
<li>Halten Sie die Temperatur der Tyrode Lösung bei 37 ° c in das folgende Experiment.</li>
		<li>Durchspülen Sie das Herz mit Tyrode Lösung für mindestens 5 min zum Auswaschen der übermäßigen Farbstoffe. Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit, die Durchflussmenge während dieser auswaschen Schritt zu erhöhen (siehe Schritt 2.4.6.)</li>
		<li>Bestätigen Sie das Verschwinden der jede Bewegung Artefakt aufgrund von Kontraktionen und die homogene Färbung im perfundierten Herzen.</li>
	</ol></li>
	<li>Probenahme und Datenanalyse<ol>
<li>Das Deckglas (25 mm × 60 mm) auf perfundierten Herzen sorgfältig, um das Vorhofflimmern Oberfläche ohne zu viel mechanische Beanspruchung zu glätten und verhindern Sie Bewegung Artefakt aus Schwingung der Lösung zu. Bestätigen Sie, dass entsprechend dem Deckglas Atrium beimisst.</li>
		<li>Aufzeichnen die Fluoreszenz von CMOS-Kameras mit einer Sampling rate bis zu 0,1 ms für di 4-ANEPPS und 1 ms für die RH237 und Rhod2AM Färbung.</li>
		<li>Analysieren Sie die erhaltenen Aufnahmen mit der Analyse-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers für den eigentlichen Betrieb der Software.</li>
		<li>Erstellen Sie eine Aktivierung Karte und Film nach dem Extrahieren der Region von Interesse, Drift-Entfernung, zeitliche Filterung und 3 X 35binning.</li>
	</ol></li>
</ol>(3) elektrophysiologische Untersuchung
<ol><li>Einstellung des Schrittmachers Elektroden und stimulator<ol>
<li>Den Kontakt der maßgeschneiderte Tempo Elektrodenspitze in der RA für die Stimulation des Gewebes zu bestätigen (siehe Schritt 2.4.9.).</li>
		<li>Liefern Sie alle Tempo Reize aus der pacing Katheter mit der programmierbaren Stimulator verbunden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmung der Tempo-Schwelle<ol>
<li>Satz das Tempo Intervall zwischen 100 und 150 ms (Impulsbreite von 0,4 ms), Vermeidung von jedem inneren Rhythmus übertraf die Tempo Rate.</li>
		<li>Liefern Sie konstante Tempo Stimulierung für mindestens 20 Schläge, eine stabile atriale Stimulation zu erhalten.</li>
		<li>Das Tempo auf 5 Ausgabe eingestellt mV, dann allmählich reduzieren, bis der gelieferten Tempo schlägt fehl, das Atrium zu depolarisieren.</li>
		<li>Bestätigen Sie die atriale Anregung durch die Anwesenheit von P-Wellen im EKG und/oder ein Vorhofflimmern Erregersignal durch die optische Erfassung.</li>
		<li>Ermitteln Sie die minimale Stimulation Ausgabe, die in der Lage, das Atrium als Tempo-Schwellenwert zu depolarisieren.</li>
		<li>Setzen Sie den Tempo Ausgang für folgenden Studien an zweimal das Tempo Schwelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konstante und Burst Stimulation<ol>
<li>Liefern konstante Tempo für 99 Beats, mit einem Tempo Intervall ab 150 ms oder das längste Intervall, das vermeidet übertraf den inneren Rhythmus.</li>
		<li>Reduzieren Sie das Tempo Intervall schrittweise mit 5 ms-Schritten, bis zu 40 ms oder bis erreichen des Intervalls, das nicht 1:1 Aufnahme des Atriums zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Einzelne Extrastimulus Tempo<ol>
<li>Soll die Tempo Zykluslänge von der grundlegende Antrieb (S1) 120 ms, 100 ms und 80 ms, wenn der innere Rhythmus übertrifft der grundlegende Antrieb oder das Tempo nicht 1:1 Vorhofflimmern Erregung zu erhalten.</li>
		<li>Legen Sie die Anzahl der Tempo Reize auf 10 Schläge für den grundlegenden Antriebsstrang.</li>
		<li>Legen Sie die erste Extrastimulus (S2) auf-10 ms für die grundlegende Zykluslänge.</li>
		<li>Liefern Sie S2 nach den letzten Tempo Reiz der grundlegende Antrieb.</li>
		<li>Verkürzen Sie die Kupplung Intervall von S2 nach und nach mit 5 ms-Schritten, bis die S2 versagt, das Atrium zu depolarisieren.</li>
		<li>Bestimmen Sie die effektiven Refraktärzeit (ERP) als das längste S2-Intervall, das nicht zu den Vorhof zu depolarisieren.</li>
		<li>ERP mit mindestens 3 verschiedene grundlegende Zykluslängen zur Frequenzadaptation des ERP-Bewertung zu bewerten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doppel- und Dreibettzimmer Extrastimuli Tempo atriale Tachyarrhythmien induzieren<ol>
<li>Das S2-Intervall auf einen Punkt 20 ms außerhalb der ERP-S2 zurückgesetzt, wenn keine Rhythmusstörungen beobachtet werden.</li>
		<li>Fügen Sie eine zweite Extrastimulus (S3), beginnend mit der gleichen Intervall als S2.</li>
		<li>Verringern Sie die Kupplung Intervall zwischen S2 und S3 schrittweise mit 5 ms-Schritten, bis S3 nicht das Atrium zu depolarisieren.</li>
		<li>Das Intervall der S2 auf einen Punkt 10 ms außerhalb der ERP zurückgesetzt, dann wiederholen Sie Schritt 3.5.3.</li>
		<li>Die S2 und S3 Intervalle auf Punkte 20 ms außerhalb jedes ERP zurückgesetzt.</li>
		<li>Hinzufügen einer dritten Extrastimulus (S4), beginnend mit der gleichen Intervall als S3.</li>
		<li>Verringern Sie die Kupplung Intervall zwischen S3 und S4 schrittweise mit 5 ms-Schritten, bis S4 nicht das Atrium zu depolarisieren.</li>
		<li>Das S3-Intervall auf einen Punkt 10 ms außerhalb der ERP zurückgesetzt, dann wiederholen Sie Schritt 3.5.7.</li>
		<li>Die S2 und S3 Intervalle auf Punkte 10 ms außerhalb der ERP zurückgesetzt, dann wiederholen Sie Schritt 3.5.7.</li>
		<li>Definieren Sie die Inducibility atrialen Tachyarrhythmien durch die reproduzierbare Induktion mit entsprechend programmierten reizen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bewertung der Inducibility der atrialen Tachyarrhythmien<ol>
<li>Kontinuierlich zeichnen Sie das EKG während alle Tempo-Protokolle (Schritt 3.3-3.5. auf).</li>
		<li>Führen Sie optische Aufnahmen, während und nach jeder Stimulation, die Induktion von atriale Tachykardie (AT) oder sich wiederholende Vorhofflimmern Antwort (RAR) aufnehmen.</li>
		<li>Bestätigen Sie die Reproduzierbarkeit, indem Sie das gleiche Tempo Protokoll anwenden, wenn AF oder ein RAR induziert wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Optische Abbildung ist ein gut etabliertes Manöver für das Studium der kardialen Elektrophysiologie7und ist ein sehr nützliches Werkzeug, um nicht nur ventrikuläre Arrhythmien8,9, sondern auch Vorhofflimmern beurteilen10,11 . Gleichzeitige Zuordnung der transmembranen Potenzial und Ca2 + Transienten ist hilfreich für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen von Rhythmusstörungen bei Herzinsuffizienz und anderen Herzerkrankungen12,13. Vergleicht man die andere elektrophysiologische Bewertungsmethoden, wie z. B. die Verwendung einer einzelnen Zelle oder Zellen Blatt, einer der absoluten Vorteile der optischen Abbildung in der perfundierten Herzen ist die Bewertung des Musters Wärmeleitung im intakten Atrium und Ventrikel, nicht nur bei Sinusrhythmus, sondern auch während der induzierten Arrhythmien14. Versuch, murine Herzen, vor allem das Atrium als Surrogat des Menschen nutzen aufgetreten Schwierigkeiten vor allem aufgrund ihrer geringen Größe, aber die Maus ist ein attraktives experimentellen Modell im Hinblick auf die Beurteilung in einem gentechnisch veränderte Tier Modell, und dieses Problem überwunden werden müssen. Unser Ansatz bietet eine Richtung um es zu beheben.
Obwohl unser optische Zuordnung Apparat im Grunde ähnlich wie das konventionelle System für ganze murinen Herzen15war, hat unsere Methode den Vorteil der murine Atrium durch einige Änderungen an es zu bewerten. Zunächst verfolgten wir um eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung von bis zu 0,1 ms/Rahmen und 20 µm/Pixel und diese hochauflösende Abbildung dazu beigetragen, eine genauere Messung der Wärmeleitung Geschwindigkeit und Vermehrung Muster im murinen Atrium zu erhalten. Zweitens wird zur Vermeidung von unnötigen mechanischen Schäden oder Dehnung des Atriums, die elektrophysiologischen Eigenschaften 16,17verändern könnte, eine innewohnende Nadel direkt in das LV zur Druckreduzierung der Intra-Kammer eingefügt, statt durch die LA einzufügen, wie in der vorherigen Studie15. Darüber hinaus der Tempo Reiz wird durch eine Sondergröße gemacht 1-Französisch Elektrode Katheter platziert in der RA geliefert, aber nicht durch eine Nadelelektrode, die das Atrium verletzen könnte. Alle Pins werden bei der Festsetzung der atrial Appendage vermieden, die verwendet wurden in der letzten Studie15. Drittens ist ein programmierte Stimulation Protokoll atriale Tachyarrhythmien induzieren in Bezug auf die Bewertung des zugrunde liegenden Mechanismus der die Arrhythmien, entscheidende18,19. Wir führen identisch mit der programmierten Anregung elektrophysiologische Studien, einschließlich Burst Stimulation und bis zu dreifache Extrastimuli Tempo, mit einer Änderung des Schrittmachers Intervalls für die Maus-Herz. So konnte neben der Grundlinie Messparameter, das Protokoll Inducibility des AT bewerten. Im Bedarfsfall wird die Inducibility des AT mit der Verwaltung von Isoproterenol oder anderen Drogen bewertet. Nach unserer Erfahrung zeigen die Wildtyp Mäusen kaum irgendwelche ATs auch nach eine vollständige Stimulation-Protokoll. So sollten die Inducibility AT wichtige Informationen für die Bewertung des Beitrags von mehreren pathologischen Zuständen wie genetische Mutationen, chirurgische Eingriffe und die Gabe von Medikamenten11sein. Diese Änderungen konnten die genaue elektrophysiologische Bewertung im intakten murinen Atrium optimieren.
Diese Methode hat auch einige Einschränkungen. Erstens mit einer maximalen räumlichen Auflösung mit einer 5 X Objektiv, das Sichtfeld (FOV) beschränkt sich auf einen Teil des Atriums (zB. nur die linken atrial Anhängsel wie dargestellt in Abbildung 2a). Ein 1,6 X-Objektiv ist für den Erhalt der größeren FOV des Atriums, manchmal vorzuziehen (Abb. 2 b). Zweitens ist es ohne Befestigung des Atriums mit Stiften, manchmal schwierig die atriale Wärmeleitung Eigenschaften richtig messen da Vorhofflimmern Fläche gekrümmt ist. Also legten wir das Deckglas auf seiner Oberfläche zu glätten es statt der Festsetzung es durch Stifte. Diese Methode ist auch vorteilhaft für Bewegung Artefakt aus Schwingungen der Lösung zu verhindern. Drittens: mit unserer Methode, es ist ziemlich schwierig, die gesamte FOV, zu erhalten, die vordere und hintere Ansicht richtig zu verwenden ist also wichtiger in unserem Ansatz als in den anderen Ansatz wie in Abbildung 2dargestellt. Der Vorteil der anterioren Ansicht wäre die klare Beobachtung der Wiedereintritt bei pathologischen Zuständen, vor allem in die Anhängsel (Abbildung 4). Auf der anderen Seite die hintere Ansicht hat einen Vorteil erlangen eine gute Sicht auf das Vorhofflimmern hinteren Wand, und möglicherweise eine detaillierte Erfassung der Aktivität aus der myokardialen Hülse auslösen. Wenn es schwierig ist, eine entsprechende Ansicht zu erhalten und mit unserer Methode die gekrümmte Oberfläche glätten, kann das Atrium mit minimalen Spannung durch Stifte fixiert werden.
Mit unserer Methode gibt es 3 mögliche Probleme, mangelnde Färbung, Tempo und Arrhythmie Induktion. Für das Scheitern der Färbung, wenn keine oder leichte Fluoreszenz beobachtet, sollten Sie überprüfen, ob der optische Zuordnung Apparat richtig montiert ist, und ob das Reagenz entsprechend gespeichert und verwendet. Der Zustand der Perfusion Lösung ist auch entscheidend, das kann auch Auswirkungen auf die elektrophysiologischen Eigenschaften des Herzens selbst, also den Zustand der Lösung einschließlich den pH-Wert, Temperatur, und ob gab es genügend Belüftung muss streng überwacht werden. Es ist auch wichtig, eine Luft-Embolie im Herzen zu vermeiden. Für Tempo scheitern, wenn das Tempo Reize das Atrium begeistern können nicht überprüfen Forscher, ob die Verdrahtung korrekt mit einem Schaltkreis-Tester ist. Wenn das Tempo Reize richtig ausgegeben werden, ist das Problem der Kontakt der Elektrode mit dem Gewebe. Neupositionierung der Elektroden kann das Problem beheben, und unser Ansatz, mit dem Tempo Katheter erleichtert. Für Schwierigkeiten bei der Arrhythmie Induktion RV Tempo für die Induktion von einem AT in einigen wenigen Fällen einsetzbar. Verwenden einen vierpolige Elektrode Katheter, von dem die distalen zwei Elektroden und proximalen Elektroden in der RV und RA, bzw. gefunden werden können, ist es einfacher Wechsel des Schrittmachers Website von RA zu RV. Dieser Katheter ist auch nützlich für die ventrikuläre Erregung zu verlagern, wenn eine gleichzeitige ventrikuläre Aktivierungssignal das Vorhofflimmern Anregungssignal Masken.
Diese Methode trägt zur Beurteilung des Genotyp-Phänotyps-Interaktionen in der AF im Zusammenhang mit Gene neu durch die neuartige Studien wie GWAS, vor allem für die Gene mit denen die Untersuchung konnte nicht zeigen, durch andere Ansätze gefunden. Mit dem Fortschritt von Geräten und Techniken können der elektrophysiologischen Eigenschaften der Pulmonalvene Hülse, die die wichtige Quelle des AF20, in der intakten Herz mit diesem Ansatz bewertet werden.

Das Herz besteht aus 4 Kammern bei Säugetieren. Die oberen zwei Kammern sind Atrien und die unteren Herzkammern sind. Herzkammern arbeiten als Pumpe Blut in die systemische oder pulmonaler Kreislauf auswerfen. Atria Blut Rückkehr aus der systemischen oder pulmonalen Venen zu erhalten, und helfen beim Transport von Blut in die Ventrikel, eine effiziente kardiale Pumpfunktion zu erhalten. Von einer elektrophysiologischen Aspekt ist die wichtige Funktion der Vorhöfe, den Herzrhythmus zu regulieren. Die elektrischen Signale stammen aus der Sinusknoten befindet sich an der Kreuzung zwischen der Vena Cava superior (SVC) und rechten Vorhof (RA), dann verbreiten die RA und den linken Vorhof (LA) und führen um die Ventrikel durch die Atrioventricular-Knoten und His-Purkinje Wärmeleitung-System.
Behandlung von Herzrhythmusstörungen, die Herzrhythmusstörungen sind, werden in Vorhofflimmern und ventrikuläre entsprechend ihrer Herkunft klassifiziert. Vorhofflimmern (AF) ist die häufigste anhaltende Form eine Arrhythmie, zeichnet sich durch eine zufällige und schnelle Erregung der Vorhöfe. Neuere genetische Analysen und genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben die Verbindung zwischen AF und genetische Mutationen oder Monopolymorphisms1,2,3,4gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass AF zumindest teilweise eine genetische Ursache zugeordnet ist. Daher ist es wichtig, die Genotyp-Phänotyp-Interaktionen in die Vorhöfe mit einer gentechnisch Tiermodell zu bewerten. Es ist weithin anerkannt, dass die Maus die etabliertesten Säugetier für gentechnische Veränderung ist.
Die optische Mapping-Technik wurde entwickelt, um die Anregung von Herzgewebe zu bewerten. Allerdings ist die Beobachtung des murinen Atriums durch optische Zuordnung von seiner relativ geringen Größe behindert. Wir versuchen, eine detaillierte Bewertung der murinen Atrium mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu erreichen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(-)-Blebbistatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>B0560-1MG</td>
			<td>E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61018</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2AM</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>50024</td>
			<td>Ca indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 20% solution in DMSO</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#59000</td>
			<td>To enhance the staining with Rhod2AM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>041-29111</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>046-21981</td>
			<td>Solvent for reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td>For filtering Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haparin Sodium</td>
			<td>Mochida Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To avoid blood clots in the coronary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air stone (&#966;8 mm x 10 mm)</td>
			<td>Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for aeration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For an anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable stimulator</td>
			<td>Fukuda Denshi</td>
			<td>BC-05</td>
			<td>Fukuda Denshi kindly rented us.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Lab</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Powerlab 26/8SP</td>
			<td>To record blood pressure and electrocardiogram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Amp</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>ML132</td>
			<td>Amprifier for electrocardiogram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP Amp</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>FE117</td>
			<td>Amprifier for blood pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Version 7</td>
			<td>Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable BP transducer</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT0670</td>
			<td>pressure transducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Fr custom made electrode catheter</td>
			<td>Unique Medical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To pace right atrium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm)</td>
			<td>Natume Seisakujo</td>
			<td>SP31</td>
			<td>Put into superior vena cava to introduce electrode catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-SV 5.00 &#956;m</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td>To filter the circulating Tyrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-gauge indwelling needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SR-FS2419</td>
			<td>Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SN-2170</td>
			<td>We cut the tip of needle and blunted it by filing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-guage needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2525R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ml syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tube</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SF-ET0525</td>
			<td>for Langendorff&#39;s perfusion circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcock</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>TS-TL2K</td>
			<td>for Langendorff&#39;s perfusion circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>As one</td>
			<td>3-1491-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custum made heating glass coil</td>
			<td>Motohashi Rika</td>
			<td>N/A</td>
			<td>to keep temperature of perfusion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custum made warming glass chamber</td>
			<td>Motohashi Rika</td>
			<td>N/A</td>
			<td>to keep temperature of perfusion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature circulating device</td>
			<td>Lauda</td>
			<td>E100</td>
			<td>connected to heating coil and warming chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (25 mm &#215; 60 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C025601</td>
			<td>Put on the atria to flatten the recording area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perista pump</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>SJ-1211</td>
			<td>peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiCAM ULTIMA-L2</td>
			<td>Brainvision Inc.</td>
			<td>UL-L2</td>
			<td>Optical mapping System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV_Ana Software</td>
			<td>Brainvision Inc.</td>
			<td>BV_Ana</td>
			<td>Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THT Macroscope</td>
			<td>Brainvision Inc.</td>
			<td>THT-ZS</td>
			<td>Epi-Illumination Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Light Source</td>
			<td>Brainvision Inc.</td>
			<td>LEX2-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror 560nm</td>
			<td>Brainvision Inc.</td>
			<td>DM560</td>
			<td>Epi-Illuminatinon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter 520/35nm</td>
			<td>Semrock, Inc.</td>
			<td>FF01-520/35-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Projection lens Plan S 1.0X</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>435200-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Drive</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>435400-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens Revolver</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>435302-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Focus Column</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>435400-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macroscope Base</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>435430-9901-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Light Guide</td>
			<td>MORITEX Corporation</td>
			<td>MSG10-2200S</td>
			<td>Epi-Illuminatinon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser Lens</td>
			<td>MORITEX Corporation</td>
			<td>ML-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLANAPO 5.0X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10447243</td>
			<td>Objective Lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLANAPO 1.0X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10447157</td>
			<td>Objective Lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLANAPO 1.6X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10447050</td>
			<td>Objective Lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam-Splitter</td>
			<td>Brainvision Inc.</td>
			<td>FLSP-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror 665nm</td>
			<td>Brainvision Inc.</td>
			<td>DM665</td>
			<td>Beam-Splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter 572/28nm</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>#84-100</td>
			<td>Rhod2-AM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter 697/75nm</td>
			<td>Semrock, Inc.</td>
			<td>FF01-697/75-25</td>
			<td>RH237 and Di-4-ANEPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>671201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum foil</td>
			<td>Toyo alumi</td>
			<td>0020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping

Den letzten genomweite Assoziationsstudien targeting Vorhofflimmern (AF) haben darauf hingewiesen, dass eine starke Assoziation zwischen dem Genotyp und elektrophysiologische Phänotyp in den Vorhöfen. Das ermutigt uns, nutzen Sie ein gentechnisch Mausmodell um den Mechanismus der AF zu erhellen. Es ist jedoch schwierig, die elektrophysiologischen Eigenschaften in murinen Vorhöfe aufgrund ihrer geringen Größe zu bewerten. Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der Vorhöfe mit einer optischen Mapping-System mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in murinen Herzen Langendorff durchblutet. Die optische Mapping-System setzt sich dual High-Speed-komplementäre Metalloxid-Halbleiter-Kameras mit hoher Vergrößerung objektive Objektive, um die Fluoreszenz der Spannung-empfindlichen Farbstoff und Ca2 + Kennzeichen zu erkennen. Um konzentrieren sich auf die Beurteilung der murinen Atrien, ist mit einer Fläche von 2 mm × 2 mm oder 10 mm x 10 mm, mit 100 × 100 Auflösung (20 µm/Pixel oder 100 µm/Pixel) und Sampling-Rate von bis zu 10 kHz (0,1 ms) bei maximaler optische Zuordnung durchgeführt. Eine 1-Französisch Größe vierpolige Elektrode pacing Katheter befindet sich in den rechten Vorhof durch die Vena Cava superior eine mechanische Beschädigung in den Vorhof zu vermeiden, und Tempo Stimulation wird durch den Katheter geliefert. Eine elektrophysiologische Untersuchung erfolgt mit programmierte Stimulation einschließlich konstanten Tempo, platzen, Tempo, und bis zu dreifache Extrastimuli Tempo. Die optische Abbildung aufgenommen unter eine spontane oder Tempo, Rhythmus der Dauer des Aktionspotentials, Aktivierung Karte Leitgeschwindigkeit und Ca2 + vorübergehend einzeln in der rechten und linken Herzvorhof. Darüber hinaus bestimmt die programmierte Stimulation auch die Inducibility atrialen Tachyarrhythmien. Präzise Aktivierung Zuordnung wird durchgeführt, um die Ausbreitung der Erregung im Vorhof während einer induzierten atrialen Tachykardien zu identifizieren. Optische Abbildung mit einer speziellen Einstellung ermöglicht eine gründliche elektrophysiologische Bewertung des Atriums in murinen pathologischen Modelle.

Die optische Zuordnung Experimente werden durchgeführt mit den Geräten, wie in Figur 1adargestellt. Das Schema des optischen Systems ist in Abbildung 1 bdargestellt. Das System bietet eine hochauflösende Analyse des Membranpotentials und Ca2 + vorübergehend im Atrium.
Wie in Abbildung 1 c und ddargestellt, ist das isolierte Herz in einem temperierten Raum positioniert. Ein 1-Französisch Größe Elektrode Katheter befindet sich in der RA durch ein PE-Rohr in der SVC eingefügt, und ein weiteres innewohnende PE-Rohr wird in der LV-Hohlraum von der LV-Spitze zur Vermeidung übermäßigen Druck auf die Herzkammer eingefügt. Für eine gleichzeitige EKG-Aufzeichnung die Kathode (ECG Blei [-]) an die Kanülierung Nadel angeschlossen ist, und die Anode (ECG Blei [+]) ist verbunden mit der Pin-Elektrode in die ventrikuläre Spitze eingefügt. Die Funktion dieser Versammlung soll die Vorhöfe mechanische Beschädigungen zu vermeiden.
Für die Bewertung der Membran Spannung wird Fluoreszenz mit di-4-ANEPPS mit bis zu einer 10.000 Bilder/s Abtastrate (Abbildung 2) aufgezeichnet. Die Aktivierung der Karte ergibt sich bei konstant Tempo geliefert aus VA. Die Feinkartierung ermöglicht die Analyse des Musters detaillierte Wärmeleitung in kleinen murinen Atrien.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Spuren der Membran Spannungen und Ca2 + Transienten in der LA mit RH237 und Rhod2AM bei konstant Tempo aus VA. Wir reduzieren die Sampling-Rate für die Zuordnung zu 1000 Bilder/s, eine ausreichende Signal-/Rauschverhältnis des Rhod2AM-Signals mit der derzeitigen Einstellung zu erhalten. Allerdings stellt das System eine ausreichende Qualität für Analyse der Beziehung zwischen dem Aktionspotential und Ca2 + Transienten.
Wir führen dann eine Induktion eine atriale Tachykardien mit programmierte Stimulation mit Mäusen unter einem pathologischen Zustand. Abbildung 4 zeigt eine optische Aufnahme von einer induzierten AT in einem murinen Atrium gebeizt mit di-4-ANEPPS. Die Maus erfährt eine transversale Aortenstenose Verengung Verfahren um eine Drucküberlastung auf das Atrium 10 Tage vor dem Experiment6anzuwenden. Wir induzieren AT durch dreifache Extrastimuli Tempo (120/100/100/80) und die Ausbreitung der reentrant Schaltung zu beobachten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig1.jpg"> Abbildung 1: Optische Entschlüsselungssystem. a. Generalversammlung der Elektrophysiologie/optische Mapping-System. b. schematische Darstellung der Zusammensetzung des optischen Mapping-System: der blaue Pfeil zeigt das Anregungslicht durch die Lichtquelle erzeugt. Das Objektiv kann mit dem Turm ausgetauscht werden. Das emittierte Licht aus dem bunten Herzen wird zwischen Kamera 1 und 2 aufgeteilt. Kamera 1 erkennt die Langwellen-Signale für die Membran-Spannung und Kamera 2 nimmt die Wellenlängen mit einem Bandpassfilter von 580 ± 20 nm für die Ca2 + vorübergehend. Während des Verfahrens der EKG und Perfusion Druck werden kontinuierlich erfasst, und das EKG-Signal ist auch gleichzeitig die optische Karte recording-Software importiert. c. Vorbereitung der isolierten Herzen: die Herzen sind mit einer stumpfen Nadel über die Aorta ascendens Durchblutung kanülierte. Für gleichzeitige ECG Aufnahmen die Kathode an die Kanülierung Nadel angeschlossen ist, und die Anode mit der Pin-Elektrode wird in die ventrikuläre Spitze eingefügt. d. Kanülierung Rohr und die Elektroden: das Herz ist mit einer abgestumpften 21-Gauge-Nadel für Perfusion (Kanülierung Nadel) kanülierte. Eine 1-Französisch Größe Stimulation Elektrode (Elektrode) befindet sich im rechten Vorhof durch eine Polyethylen-Rohr in die überlegene Vena Cava eingefügt. Die Glas-Kammer wird durch erwärmte Wasser zirkuliert in den Hohlraum der Kammer bei 37 ° c erwärmt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56478/56478fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig2.jpg"> Abbildung 2: Aktivierung der Karte im Atrium. a. Vertreter Aktivierung Karten in der Ansicht von ventral mit 5 X Objektiv und b. in der hinteren Ansicht mit einem 1,6 X Objektiv. (Links Panel) Schematische Darstellung der isolierte Herz und Atrium. (Rechte Abbildung) Karte der Aktivierung des linken Vorhofs mit di-4-ANEPPS Färbung auf 10.000 Bilder/s erzielt. Die Aufnahme erfolgt unter konstanten Tempo mit der anregenden Elektrode platziert im rechten Vorhof. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56478/56478fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig3.jpg"> Abbildung 3. Dual Aufnahme des Aktionspotentials und Ca2 + vorübergehend in den linken Vorhof. a. Schaltplan für das isolierte Herz. b. repräsentatives Bild von der Intensität der Fluoreszenz in den linken Vorhof mit RH237 für die Membrane Spannung (Vm) und Rhod2AM für die Ca2 + vorübergehend. Die Aufnahme erfolgt mit einer 5 X Objektiv bei 1.000 Bildern/s. c. Gleichzeitige Aufnahme von der EKG (oben), RH237 Signal (Mitte) und Rhod2AM Signal (unten), während konstante Tempo mit der Stimulationselektrode im rechten Vorhof. Die schwarzen Pfeile zeigen die Stimulation Spitzen und gelben Pfeilen die ventrikuläre Erregung. Eine leichte Streuwirkung aus dem Ventrikel kann auch (gelbe Pfeilspitzen) sowohl in der RH237 und Rhod2AM Signal beobachtet werden. d. eine zusammengeführte RH237 und Rhod2AM-Spur. Das Aktionspotential und vorübergehende Ca2 + Änderungen werden gleichzeitig erfasst. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56478/56478fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig4.jpg"> Abbildung 4. Zuordnung der Aktivierung während atriale Tachykardie. (Links Panel) Schematische Darstellung der isolierte Herz. (Mitte Platte) Aktivierung der Karte während eine atriale Tachykardie (AT). AT war durch dreifache Extrastimuli Tempo induziert geliefert von den rechten Vorhof. (Rechte Abbildung) Aktivierung-Karte während Sinusrhythmus inmitten derselben Maus. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56478/56478fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Film 1. Repräsentative Film des Membranpotentials im Atrium mit Färbung mit di-4-ANEPPS. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56478/Supplementary_movie_1.zip">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Film 2. Repräsentative Filme der Aktivierung Zuordnung während atriale Tachykardie und Sinus-Rhythmus. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56478/Supplementary_movie_2.zip">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der murinen Atrien mit Hilfe einer optischen Mapping-Systems mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, darunter zweite Aufnahmen der Membran Spannung und Ca2 + vorübergehend unter programmiert Stimulation durch eine spezielle Elektroden-Katheter.

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

electrophysiological-assessment-murine-atria-with-high-resolution

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K Aufrufe.  Tokyo Medical and Dental University. Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der murinen Atrien mit Hilfe einer optischen Mapping-Systems mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, darunter zweite Aufnahmen der Membran Spannung und Ca2 + vorübergehend unter programmiert Stimulation durch eine spezielle Elektroden-Katheter.

Serie: Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

High-frequency High-resolution Echocardiography: First Evidence on Non-invasive Repeated Measure of Myocardial Strain, Contractility, and Mitral Regurgitation in the Ischemia-reperfused Murine Heart

Ischemia-reperfusion (IR) was surgically performed in murine hearts which were then subjected to repeated imaging to monitor temporal changes in functional parameters of key clinical significance. Two-dimensional movies were acquired at high frame rate (8 kHz) and were utilized to estimate high-quality myocardial strain. Two-dimensional elastograms (strain images), as well as strain profiles, were visualized. Results were powerful in quantitatively assessing IR-induced changes in cardiac events including left-ventricular (LV) contraction, LV relaxation and isovolumetric phases of both pre-IR and post-IR beating hearts in intact mice. In addition, compromised sector-wise wall motion and anatomical deformation in the infarcted myocardium were visualized.  The elastograms were uniquely able to provide information on the following parameters in addition to standard physiological indices that are known to be affected by myocardial infarction in the mouse: internal diameters of mitral valve orifice and aorta, effective regurgitant orifice, myocardial strain (circumferential as well as radial), turbulence in blood flow pattern as revealed by the color Doppler movies and velocity profiles, asynchrony in LV sector, and changes in the length and direction of vectors demonstrating slower and asymmetrical wall movement. This work emphasizes on the visual demonstration of how such analyses are performed. 

High-frequency High-resolution Echocardiography: First Evidence on Non-invasive Repeated Measure of Myocardial Strain, Contractility, and Mitral Regurgitation in the Ischemia-reperfused Murine Heart 

High frequency Doppler ultrasound is a novel technology for assessing regional myocardial function. This work presents first evidence demonstrating applicability of this versatile imaging platform for the repeated measure of myocardial strain, dp/dt, and mitral regurgitation in the ischemia-reperfused (IR) murine heart.

Hochfrequenz-High-Resolution Echokardiographie: First Evidence on Non-invasive Wiederholte Messung der myokardialen Strain, Kontraktilität und Mitralinsuffizienz in der Ischämie-Reperfusion Murine Herz

Ischemia-reperfusion (IR) was surgically performed in murine hearts which were then subjected to repeated imaging to monitor temporal changes in ...

Forschung

Medizin

High-Resolution Endocardial and Epicardial Optical Mapping in a Sheep Model of Stretch-Induced Atrial Fibrillation

Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance seen in clinical practice and its prevalence is expected to increase in the coming years.3 Increased intra-atrial pressure and dilatation have been long recognized to lead to AF,1,4 which highlights the relevance of using animal models and stretch to study AF dynamics. Understanding the mechanisms underlying AF requires visualization of the cardiac electrical waves with high spatial and temporal resolution. While high-temporal resolution can be achieved by conventional electrical mapping traditionally used in human electrophysiological studies, the small number of intra-atrial electrodes that can be used simultaneously limits the spatial resolution and precludes any detailed tracking of the electrical waves during the arrhythmia. The introduction of optical mapping in the early 90's enabled wide-field characterization of fibrillatory activity together with sub-millimeter spatial resolution in animal models5,6 and led to the identification of rapidly spinning electrical wave patterns (rotors) as the sources of the fibrillatory activity that may occur in the ventricles or the atria.7-9 Using combined time- and frequency-domain analyses of optical mapping it is possible to demonstrate discrete sites of high frequency periodic activity during AF, along with frequency gradients between left and right atrium. The region with fastest rotors activates at the highest frequency and drives the overall arrhythmia.10,11 The waves emanating from such rotor interact with either functional or anatomic obstacles in their path, resulting in the phenomenon of fibrillatory conduction.12 Mapping the endocardial surface of the posterior left atrium (PLA) allows the tracking of AF wave dynamics in the region with the highest rotor frequency. Importantly, the PLA is the region where intracavitary catheter-based ablative procedures are most successful terminating AF in patients,13 which underscores the relevance of studying AF dynamics from the interior of the left atrium. Here we describe a sheep model of acute stretch-induced AF, which resembles some of the characteristics of human paroxysmal AF. Epicardial mapping on the left atrium is complemented with endocardial mapping of the PLA using a dual-channel rigid borescope c-mounted to a CCD camera, which represents the most direct approach to visualize the patterns of activation in the most relevant region for AF maintenance.

This report provides a detailed description of the methodology and results of simultaneous endocardial and epicardial optical mapping of electrical excitation in the intact left atrium of a Langendorff-perfused sheep heart during stretch-induced atrial fibrillation.

High-Resolution Endocardial und Epikardiale Optical Mapping in ein Schaf Modell Stretch-Induced Vorhofflimmern

 Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

Beurteilung der Gefäßfunktion bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Murine Ileocolic Bowel Resection with Primary Anastomosis

Intestinal resections are frequently required for treatment of diseases involving the gastrointestinal tract, with Crohn&#8217;s disease and colon cancer being two common examples. Despite the frequency of these procedures, a significant knowledge gap remains in describing the inherent effects of intestinal resection on host physiology and disease pathophysiology. This article provides detailed instructions for an ileocolic resection with primary end-to-end anastomosis in mice, as well as essential aspects of peri-operative care to maximize post-operative success. When followed closely, this procedure yields a 95% long-term survival rate, no failure to thrive, and minimizes post-operative complications of bowel obstruction and anastomotic leak. The technical challenges of performing the procedure in mice are a barrier to its wide spread use in research. The skills described in this article can be acquired without previous surgical experience. Once mastered, the murine ileocolic resection procedure will provide a reproducible tool for studying the effects of intestinal resection in models of human disease.

Ileocolic resection is commonly performed in several human diseases; however, little is known regarding the impact of intestinal resection on surgical illnesses. This article provides instruction on executing the procedure in mice with high success, providing a means to study the effects of ileocolic resection in models of disease.

Murine Ileocolische Darmresektion mit primärer Anastomose

Intestinal resections are frequently required for treatment of diseases involving the gastrointestinal tract, with Crohn&#8217;s disease and colon cancer ...

Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings

Electroencephalogram (EEG) has been traditionally used to determine which brain regions are the most likely candidates for resection in patients with focal epilepsy. This methodology relies on the assumption that seizures originate from the same regions of the brain from which interictal epileptiform discharges (IEDs) emerge. Preclinical models are very useful to find correlates between IED locations and the actual regions underlying seizure initiation in focal epilepsy. Rats have been commonly used in preclinical studies of epilepsy1; hence, there exist a large variety of models for focal epilepsy in this particular species. However, it is challenging to record multichannel EEG and to perform brain source imaging in such a small animal. To overcome this issue, we combine a patented-technology to obtain 32-channel EEG recordings from rodents2 and an MRI probabilistic atlas for brain anatomical structures in Wistar rats to perform brain source imaging. In this video, we introduce the procedures to acquire multichannel EEG from Wistar rats with focal cortical dysplasia, and describe the steps both to define the volume conductor model from the MRI atlas and to uniquely determine the IEDs. Finally, we validate the whole methodology by obtaining brain source images of IEDs and compare them with those obtained at different time frames during the seizure onset.

This video introduces the preparation, recording, and source analysis procedures of high-resolution EEG on sedated rats with a particular preclinical model of focal epilepsy under noninvasive conditions.

Gehirn Quelle Imaging in präklinischen Rattenmodellen von fokalen Epilepsie mit hochauflösenden EEG Recordings

Electroencephalogram (EEG) has been traditionally used to determine which brain regions are the most likely candidates for resection in patients with ...

Assessing Cortical Cerebral Microinfarcts on High Resolution MR Images

Cerebral microinfarcts are frequent findings in the post-mortem human brain, and are related to cognitive decline and dementia. Due to their small sizes it is challenging to study them on clinical MRI scans. It was recently demonstrated that cortical microinfarcts can be depicted with MRI scanners using high magnetic field strengths (7T). Based on this experience, a proportion of these lesions is also visible on lower resolution 3T MRI. These findings were corroborated with ex vivo imaging of post-mortem human brain tissue, accompanied by histopathological verification of possible cortical microinfarcts.
Here an ex vivo imaging protocol is presented, for the purpose of validating MR observed cerebral microvascular pathology with histological evaluation. Furthermore, guidelines are provided for the assessment of cortical microinfarcts on both in vivo 7T and 3T MR images. These guidelines provide researchers with a tool to rate cortical microinfarcts on in vivo images of larger patient samples, to further unravel their clinical relevance in cognitive decline and dementia, and establish these lesions as a novel biomarker of cerebral small vessel disease.

A high resolution ex vivo 7T MR imaging protocol is presented, to perform MR-guided histopathological validation of microvascular pathology in post-mortem human brain tissue. Furthermore, guidelines are provided for the assessment of cortical microinfarcts on in vivo 7T as well as 3T MR images.

Beurteilung kortikale zerebrale Mikroinfarkten auf Hochauflösende MR Bilder

Cerebral microinfarcts are frequent findings in the post-mortem human brain, and are related to cognitive decline and dementia. Due to their small sizes ...

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular preparations of dissociated cardiomyocytes are not representative of the complex in vivo structure of cardiomyocytes, non-myocytes and extracellular matrix, which influences both mechanical and electrophysiological properties of the heart. Here we describe a technique to prepare viable ventricular slices of adult mouse hearts with a preserved in vivo like tissue structure, and demonstrate their suitability for electrophysiological recordings. After excision of the heart, ventricles are separated from the atria, perfused with Ca2+-free solution containing 2,3-butanedione monoxime and embedded in a 4% low-melt agarose block. The block is placed on a microtome with a vibrating blade, and tissue slices with a thickness of 150-400 &#181;m are prepared keeping the vibration frequency of the blade at 60-70 Hz and moving the blade forward as slowly as possible. Thickness of the slices depends on the further application. Slices are stored in ice cold Tyrode&#39;s solution with 0.9 mM Ca2+ and 2,3-butanedione monoxime (BDM) for 30 min. Afterwards, slices are transferred to 37 &#176;C DMEM for 30 min to wash out the BDM. Slices can be used for electrophysiological studies with sharp electrodes or micro electrode arrays, for force measurements to analyze contractile function or to investigate the interaction of transplanted stem cell-derived cardiomyocytes and host tissue. For sharp electrode recordings, a slice is placed into a 3 cm cell culture dish on the heating plate of an inverted microscope. The slice is stimulated with a unipolar electrode, and intracellular action potentials of cardiomyocytes within the slice are recorded with a sharp glass electrode.

Here, we describe the preparation of viable ventricular slices from adult mice and their use for sharp electrode action potential recordings. These multicellular preparations provide a preserved in vivo like tissue structure, which makes them a valuable model for electrophysiological and pharmacological studies in vitro.

Murine Kurze Axis Ventrikuläre Herzscheiben für elektrophysiologische Studien

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In these cases, questions remain regarding disease pathogenesis and effective interventions. An optimized technique that allows functional assessment of the salivary glands is invaluable for investigating exocrine gland biology, dysfunction, and therapeutics. Here, we present a step by step approach to performing pilocarpine stimulated saliva secretion, including tracheostomy and the dissection of the three major murine salivary glands. We also detail the appropriate murine head and neck anatomy accessed during these techniques. This approach is scalable, allowing for multiple mice to be processed simultaneously, thus improving the efficiency of the work flow. We aim to improve the reproducibility of these methods, each of which has further applications within the field. In addition to saliva collection, we discuss metrics for quantifying and normalizing functional capacity of these tissues. Representative data are included from submandibular glands with depressed salivary gland function 2 weeks following fractionated radiation (4 doses of 6.85 Gy).

We present a detailed approach to performing saliva collection, including murine tracheostomy and the isolation of three major salivary glands.

Murine Speichel funktionale Bewertung über Pilocarpin Stimulation folgenden fraktioniert Bestrahlung

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Hochdurchsatzanalyse optischer Mapping-Daten mit ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

Real-Time Monitoring of Neurocritical Patients with Diffuse Optical Spectroscopies

Neurophysiological monitoring is an important goal in the treatment of neurocritical patients, as it may prevent secondary damage and directly impact morbidity and mortality rates. However, there is currently a lack of suitable non-invasive, real-time technologies for continuous monitoring of cerebral physiology at the bedside. Diffuse optical techniques have been proposed as a potential tool for bedside measurements of cerebral blood flow and cerebral oxygenation in case of neurocritical patients. Diffuse optical spectroscopies have been previously explored to monitor patients in several clinical scenarios ranging from neonatal monitoring to cerebrovascular interventions in adults. However, the feasibility of the technique to aid clinicians by providing real-time information at the bedside remains largely unaddressed. Here, we report the translation of a diffuse optical system for continuous real-time monitoring of cerebral blood flow, cerebral oxygenation, and cerebral oxygen metabolism during intensive care. The real-time feature of the instrument could enable treatment strategies based on patient-specific cerebral physiology rather than relying on surrogate metrics, such as arterial blood pressure. By providing real-time information on the cerebral circulation at different time scales with relatively cheap and portable instrumentation, this approach may be especially useful in low-budget hospitals, in remote areas and for&#160;monitoring in open fields (e.g., defense and sports).

Presented here is a protocol for non-invasively monitoring cerebral hemodynamics of neurocritical patients in real-time and at the bedside using diffuse optics. Specifically, the proposed protocol uses a hybrid diffuse optical systems to detect and display real-time information on cerebral oxygenation, cerebral blood flow and cerebral metabolism.

Echtzeit-Monitoring neurokritischer Patienten mit diffuser optischer Spektroskopie

Neurophysiological monitoring is an important goal in the treatment of neurocritical patients, as it may prevent secondary damage and directly impact ...