Wir danken Dr. Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) und Dr. Gregory Pazour (University of Massachusetts Medical School) für die Bereitstellung von einigen Plasmide. Das Projekt wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (NIH-GM097037, GM116204 und GM122552, W.Y.).

(1) NIH-3 t 3 Zelle Vorbereitung für Geschwindigkeit Mikroskopie ab Lager
<ol><li>1,5 Wochen vor dem Experiment, Wiederherstellen einer frischen Kultur NIH-3 t 3 Zellen aus einem gefrorenen bestand bei 37 ° C Auftauen und die Zellen in einem 25 cm2 Zelle Kultur Kolben mit 3 mL der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 110 mg/mL Natrium-Pyruvat, 2 mM Glutamin fötalen Rinderserum 10 % und 1 % Penicillin/Streptomycin.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.</li>
	<li>Teilen von Zellen bei 80 % Konfluenz, etwa alle zwei Tage mindestens dreimal vor experimentellen am Tag, um Homogenität des Zellzyklus. Trypsinize Zellen mit 0,25 % Trypsin für 2 min bei 37 ° C, Aspirieren Trypsin und ersetzen Sie es mit 2 mL des Mediums. Pipette das Medium immer wieder zu brechen Zellcluster, die gewünschte Anzahl von Zellen zu entfernen und bringen Gesamtvolumen der Medien zurück bis 3 mL. Hinweis: NIH-3 t 3 waren zuvor gentechnisch auszudrücken NPHP-4, ein Protein, das die TZ26, verschmolzen am C-Terminus, mCherry lokalisiert. mCherry ist ein Fluorophor die mit 561 nm Beleuchtung quantitativ lokalisieren die TZ Selektivität Barriere und richten Sie die primären Zilien angeregt werden kann.</li>
	<li>Zwei Tage vor dem Experiment, Platte die Zellen in einem 35 mm Glasboden Schale bei 60-70 % Konfluenz mit 1,5 mL des gleichen Mediums als Schritt 1.1 und Rückkehr der Zellen in den Inkubator.</li>
	<li>Transfizieren Sie einen Tag vor dem Experiment, chemisch die Zellen mit dem gewünschten Plasmid. 500-1000 ng des gewünschten Plasmids (siehe Hinweis unten) im Verhältnis 1: 2,5 mit Transfection Reagens in 0,25 mL reduzierte Serum-Medien ohne Antibiotika für 30 min. Aspirat Medien aus dem 35 mm Glas unten Schüssel mischen und ersetzen Sie ihn durch das Plasmid 0,25 mL / Transfection Reagens Mix plus eine zusätzliche 1,25 mL reduzierte Serum-Medien ohne Antibiotika. Reduzierte Serum Medien dient dem Zweck, eine erfolgreiche Transfektion zu erleichtern, induzierende primäre Zilien Wachstum sowie die Zellen am Leben zu halten lange genug Experiment durchführen. Zellen in den Inkubator für das Experiment am nächsten Tag zurück. Hinweis: Bei der Einzelmolekül-Tracking der IFT20 ist ein Plasmid enthält, die eine genetisch veränderte IFT20 an der C-Terminus zu GFP verschmolzen verwendete25. Bei Einzelmolekül-tracking von SSTR3, ein Plasmid mit einem genetisch veränderten SSTR3 verschmolzen in der N-Terminus zu einer Domäne Akzeptor Peptid (AP) und C-Terminus zu GFP ist gebrauchte22. Neben dem SSTR3 Konstrukt ein Plasmid mit Biotin-Ligase BirA Co ausgedrückt werden muss und die Transfektion Medien mit 10 µM Biotin ergänzt werden. BirA legt dann Biotin auf der AP-Domäne neu synthetisierte AP SSTR3 GFP-Moleküle auf der Ebene der ER. Alexa647 auf drei der vier Biotin-Bindungsstellen an Streptavidin, konjugiert können im Durchschnitt dann an die Medien vor imaging Eindringmittel Label die AP-SSTR3-GFP-Moleküle auf der äußeren Oberfläche der Zelle22,27 ergänzt werden . GFP und AlexaFluor647 werden bei dieser Methode verwendet; jedoch können andere fluoreszierenden Sonden verwendet werden, wenn sie ähnlich hohe Lichtstabilität und Quantum ergeben haben.</li>
	<li>Wenn mit der extern beschriftet SSTR3 Konstrukt, entfernen Sie die Medien aus den Glasboden Schale 1 h vor dem Experiment, waschen die Zelle 5 Mal mit 1 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 1 mL der reduzierte Serum Medien ergänzt mit 1 µM Alexa647 konjugiert Streptavidin.</li>
	<li>Nicht mehr als 15 min vor dem Experiment, entfernen Sie Medien aus der Glasschale unten und waschen Sie transfizierten und beschrifteten Zellen 5 Mal mit 1 mL PBS.</li>
	<li>Platz 1 mL bildgebenden Puffer (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) in die untere Glasschale. Hinweis: In der Bildgebung Puffer sind Zellen tragfähig für nicht mehr als 3 h. Daher werden nur 2 h von Experimenten auf jedes Gericht durchgeführt.</li>
</ol>2. SPEED-Mikroskopie
Hinweis: Die Geschwindigkeit Mikroskopie Setup enthält eine invertierte Fluoreszenzmikroskop ausgestattet mit einen 1,4-NA 100 × Ölimmersion apochromatische Objektive, 35 mW 633 nm He-Ne Laser, 50 mW 488 nm und 561 nm Festkörperlaser, einen Gewinn auf dem Chip Multiplikation Kamera Verbindung-Ladegerät und ein Mikroskop-Software-Paket für die Datenerfassung und Verarbeitung (Abbildung 1). Für die einzelnen Kanal Bildgebung, GLP, mCherry und Alexa647 sind begeistert von 488 nm, 561 nm oder 633 nm Laser, beziehungsweise. Für Einzelmolekül-Tracking wird Einzelpunkt-Beleuchtung verwendet, um einzelne Eindringmittel beschriftet Moleküle zu verfolgen. Für Epifluoreszenz Bildgebung befindet sich eine konkave Linse im Laser Beleuchtung Pfad, den Strahl in ein einheitliches Feld der Beleuchtung zu erweitern. Die Fluoreszenz-Emissionen werden durch das gleiche Ziel gesammelt, gefiltert durch eine dichroitische Filter (405/488/561/635) und eine Emission Filter (405/488/561/635) und abgebildet mit den oben genannten CCD-Kamera bei 500 Hz für Einzelmolekül-Tracking oder 2 Hz für Epifluoreszenz Bildgebung.
<ol><li>Befestigen Sie die Glas-Bodenplatte auf die Bühne des Mikroskops und suchen Sie eine Zelle, die richtig die gewünschte Konstrukte zum Ausdruck zu bringen ist. Sobald eine geeignete Zelle gefunden worden ist, richten Sie die NPHP4-mCherry Fleck an der Basis der primären Zilien mit dem Standort auf der Abbildungsebene, die der Laser Einzelpunkt-Beleuchtung entspricht.</li>
	<li>Erstellen eines Epifluoreszenz-Abbildes der NPHP4-mCherry und IFT20-GFP oder AP-SSTR3-GFP mit der "Snap" Funktion im Reiter "Kamera" von den "Fokus" Fenster "" Wenn der digitalen Mikroskopie-Software-Paket zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Diese Bilder werden als Referenz für die anschließende Einzelmolekül-Standorte handeln.</li>
	<li>Sobald die Referenzbilder erhalten werden, lokal reduzieren Sie die Konzentration der beschrifteten Einzelmoleküle. Foto-Bleichmittel die TZ mit 1 mW Laser Beleuchtung für 20 s oder bis der Fluoreszenzintensität des Hintergrundfluoreszenz nahekommt. Hinweis: Wenn die genaue Konzentration kann gesteuert werden, 0,1-1 nM einzelne Moleküle gekennzeichnet sind, verwendet.</li>
	<li>Zur Vorbereitung der Einzelmolekül-Tracking reduzieren Sie die Laserleistung Beleuchtung ~0.15 mW für einzelne Moleküle mit GFP beschriftet oder ~0.5 mW für Moleküle mit Alexa647 beschriftet.</li>
	<li>Sobald die Laserleistung und imaging-Parameter festgelegt sind, maximale Verstärkung und Intensivierung und 2 ms Bildrate für die Einzelmolekül-Bildgebung, den entsprechenden Beleuchtung Laser zu engagieren und erfassen nicht-Photobleached, einzelne Moleküle gekennzeichnet, wie sie transportiert werden durch die Photobleached Region der TZ durch Anklicken des Buttons "Stream" in der Registerkarte "Kamera" des Fensters "Fokus Controls". Hinweis: Nicht mehr als 2 min Video sollte erfasst werden, um die Auswirkungen der ciliary Drift auf ein geringfügiges Maß zu minimieren.</li>
	<li>Verarbeiten Sie nach der Aufnahme der Einzelmolekül-Video die Videos mithilfe eines 2D "glockenförmig" passenden Algorithmus, wie der Blick durch das Gelles Lab, das genau der Schwerpunkt jedes einzelne Molekül Erregung PSF in einem umfassenden Bereich von Interesse (AOI) lokalisiert.</li>
	<li>Wählen Sie alle Einzelmolekül-Standorte mit Präzision < 10 nm und korrigieren Sie das Zentrum der Zilien basierend auf Verteilung der Einzelmolekül-Standorte mit einer 2D Gauß-Funktion ausgestattet. Hinweis: Mithilfe von 2D zu 3D Umwandlung Algorithmus sind die 3D Transportwege des IFT20-GFP und AP-SSTR3 Routen auf ciliary axonemal oder ciliary Membran, bzw. deutlich.</li>
</ol>(3) 2D zu 3D Umwandlung
<ol><li>Sobald mehrere tausend Lokalisierungen für Transit-Moleküle (Signal-Rausch Verhältnis > 11) in die Zilie erhoben werden, wählen Sie die Längsachse der Zilie als die X-Dimension. Ein Y-Dimension-Histogramm der Standorte zu machen und bin Summen in Schritten von 10 nm erhalten. Hinweis: Die 2D zu 3D Umwandlung kann von Hand oder Software oder Programmiersprache ausgewertet werden. Die Autoren haben die Transformation in Matlab und Python 2.7 erfolgreich umgesetzt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Leung, B. O., Chou, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+super-resolution+fluorescence+microscopy+for+biology.">Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology.</a> Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+size-exclusion+permeability+barrier+and+nucleoporins+characterize+a+ciliary+pore+complex+that+regulates+transport+into+cilia.">A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia.</a> Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).</li><li>Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steric+volume+exclusion+sets+soluble+protein+concentrations+in+photoreceptor+sensory+cilia.">Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).</li><li>Nachury, M. V., Seeley, E. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates.">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).</li><li>Handel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+targeting+of+somatostatin+receptor+3+to+neuronal+cilia.">Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia.</a> Neuroscience. 89, 909-926 (1999).</li><li>Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraflagellar+transport+protein+IFT20+is+associated+with+the+Golgi+complex+and+is+required+for+cilia+assembly.">The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).</li><li>Awata, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHP4+controls+ciliary+trafficking+of+membrane+proteins+and+large+soluble+proteins+at+the+transition+zone.">NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone.</a> J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).</li><li>Howarth, M., Ting, A. 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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Geschwindigkeit Mikroskopie auf die primäre Zilie, ein zellulärer Signalisierung Organell, das hoch effiziente Protein Transport abhängig ist. Geschwindigkeit-Mikroskopie kann hochauflösende (< 10 nm) für Gewebekulturen beschriftet Moleküle bieten Durchschreiten der Einzelpunkt-Beleuchtung auf die TZ zentriert. Zuvor ist angewendet worden, um das Protein des Menschenhandels durch die NPC-6,7,8zu studieren. Jedoch kann es verlängert werden, um Menschenhandel durch jede Sub Beugung zellulären Hohlraum zu studieren. Diese Technik hat einen Vorteil gegenüber anderen hochauflösenden bildgebenden Verfahren, dass es sich in der Lage, die Dynamik der einzelnen Protein Transport in live Zellsysteme mit einer räumlichen und zeitlichen Auflösung von erfassen < 10 nm und < 2 ms, beziehungsweise. Ein weiterer Vorteil ist, dass man muss nur Fluoreszent-Label ein Protein des Interesses und zum Ausdruck bringen des Konstrukts über Transfektion, Molekularbiologie plädierte Protein Lokalisierung, aufnehmen der Durchführung Geschwindigkeit Mikroskopie zu studieren. Man muss im Hinterkopf behalten, dass die Einzelpunkt-Beleuchtung mit einem High-Power-Laser das Feature, das gut getrennt, hochauflösende Einzelmolekül Standorten bietet. Allerdings auch Grenzen der Leuchtfläche und macht die Technik nicht geeignet für weites Feld Lokalisierung. Glücklicherweise gibt es viele weites Feld Superresolution Techniken für Ermittler zur Auswahl, falls gewünscht. Ein weiterer zu beachtender Punkt ist, dass Geschwindigkeit Mikroskopie erfasst nur Standorte Einzelmoleküle zu bewegen. Kombination mit FRAP, die den Anteil der gesamten Moleküle bestimmen können, die mobil sind, kann daher eine sinnvolle Ergänzung zur Analyse sein.
Die Konvertierung zwischen den kartesischen und den zylindrischen Koordinatensystem ist eine virtuelle 3D Wahrscheinlichkeitsdichte Karte zu generieren, anstatt eine 3D-Ansicht auf 3D-Tracking Einzelmolekül-basiert. Im Detail haben Elektronenmikroskopie Daten ergab, dass primären Zilien rotationssymmetrische Struktur haben, die eine einheitliche Molekül Verteilung entlang bestimmten Radius generieren konnte. Diese gleichmäßige Verteilung führt, dass die räumliche Verteilung entlang θ Dimension im zylindrischen System konstant ist. Dann können die 3D Koordinaten (X, R, θ) vereinfacht werden, um die 2D Koordinaten (R, X, konstante) werden. Eigentlich ist unser Transformations Prozess zwischen den kartesischen und den zylindrischen Systemen von 2D (X, Y) in 2D (R, X, konstante). Die konstante θ bezieht sich auf die räumliche Dichte p, wird berechnet, indem die Gleichung A<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq3.jpg">(Abbildung 2). Einen Matrix-Rechner verwenden, um den Vektor berechnen <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq4.jpg"> </img>, das entspricht die relative Bereiche zwischen benachbarten konzentrischen Ringen im Querschnitt Ansicht6,7Aj s die gesamte Interaktion Standorte an Position j direkt aus Experimenten gemessen; So pi, räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte der Interaktion Seiten Rich, kann durch das Lösen der Matrixgleichung aberechnet werden<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq3.jpg">. 
Ein wichtiger Schritt im Protokoll ist jede Störung der Mikroskopie Setup zwischen den Referenz-Bildaufnahme und Einzelmolekül video zu minimieren. Wenn jede Bewegung auftritt, ist es nicht möglich getrost die Einzelmolekül-Standorten zuordnen die Ultrastruktur der primäre Zilien, die mittels Epifluoreszenz Imaging abgerufen wurde. Ein weiterer wesentlicher Schritt ist es, Photobleach Bereich der Beleuchtung genug, um die Konzentration von Eindringmittel beschrifteten Einzelmoleküle lokal zu reduzieren, aber nicht soviel, das die Bevölkerung ist völlig Photobleached. Im Falle von SSTR3, die Diffusionskoeffizienten ist langsam im Vergleich zu lösliche Moleküle und die Bewegung von einer Bevölkerung von un-Photobleached SSTR3 Moleküle zurück in den Photobleached Bereich werden länger als zwei Minuten, die Zeit, jenseits derer die ciliary Drift ist, ein nicht zu vernachlässigenden Faktor. Wenn die richtige Ebene der Immunofluoreszenz schwer ist zu erreichen und ein hohes Maß an Hintergrundfluoreszenz noch vorhanden ist, kann ein abgewinkelte Beleuchtung Laser verwendet werden, um Eindringmittel beschrifteten Einzelmoleküle reduzieren, die oben und unten angeregt werden die Abbildungsebene. Dies reduziert den Hintergrund und verbessern das Signal-Rausch-Verhältnis für jede erfasste Einzelmolekül.
Zusammenfassend ist Geschwindigkeit Mikroskopie in der Lage, durch die Zugabe von einer Laser-Lichtquelle, damit verbundenen Spiegel und high Speed CCD Kamera ohne weiteres auf konventionellen Mikroskopie-Setups implementiert werden. Der wichtigsten Fortschritt gegenüber anderen ähnlichen Techniken sind der geneigten Laser, der die Hintergrundfluoreszenz reduziert und die 2D zu 3D Umwandlung Algorithmus, der die 3D räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte-Karte aus der 2D Einzelmolekül-rekonstruiert Standorten. Aus biologischer Sicht ist keine zusätzliche Kennzeichnung neben einem Fluorophor konjugiert Protein des Interesses erforderlich. Diese Features ermöglichen Geschwindigkeit Mikroskopie, einzelne Moleküle mit hoher verfolgen raumzeitlichen (5-10 nm, 0,4-2 ms) Auflösung wie sie über einen Sub-Mikrometer-Bio-Hohlraum oder Bio-Kanal mit rotationssymmetrischen Strukturen Verkehr. Gekoppelt mit einem 3D Wahrscheinlichkeitsdichte Transformationsalgorithmus, können die 3D Transportwege der tagged Proteine durch die Höhle oder Kanal bestimmt werden. Die Anwendung dieser Technik wurde früher verwendet, um 3D Transportwege von Proteinen und RNAs durch den NPC zu unterscheiden, und hier zeigen wir, dass die 3D Transport von transmembranen Protein, SSTR3 und eine cytosolische Protein, IFT20, in der TZ der erreicht werden kann primäre Zilien. Andere Superresolution Techniken wie 3D-STORM erhalten haben X, y, Z-Positionen für einzelne Moleküle durch die Platzierung einer Zylinderlinse in den optischen Pfad schafft eine asymmetrische Verzerrung der Einzelmolekül-PSF abhängig von seiner Position oberhalb oder unterhalb die Brennebene28. Ein weiterer Fortschritt kann versuchen, implementieren Sie virtuelle Lochkamera Technologien zu verringern Sie die Breite der PSF-Emission und somit Auflösung noch weiter erhöhen. Die oben genannten Techniken könnte ganz leicht auf Geschwindigkeit Mikroskopie implementiert werden. Insgesamt bietet Geschwindigkeit Mikroskopie einen einzigartigen Ansatz bei gleichzeitig Transport Kinetik Einzelmolekül-Ebene und 3D Karte von Transportwege mit super-hochauflösende raumzeitlichen für Inter- und Intra-Organelle molekulare Menschenhandel unter bestimmten Umständen in live Zellsysteme.

Da Ernst Abbe im Jahre 1873 erklärte, hat die Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopie angenommen wurde, beschränkt sich auf etwa 200 nm durch Lichtbeugung aus dem Ziel1,2. Derzeit Höchstauflösung lichtmikroskopische Techniken brechen diese Einschränkung und ermöglicht die Erfassung von dynamischen Bildern mit Sub-Beugung (< 200 nm) Auflösung. Die Techniken in der Regel fallen in zwei Hauptkategorien: stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie-basierte Ansätze, die Sub-Beugung Beleuchtung Volumen durch nichtlineare optische Reaktion des Fluorophore Proben3; generieren und photoaktiviert Lichtmikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (STORM)-basierte Höchstauflösung Techniken, die mathematische Funktionen zum Zentroiden des Fluorophore lokalisieren und dann rekonstruieren diese Zentroide nutzen Super-Resolution Bilder4,5zu bilden. Derzeit sind aufgrund der relativ unkomplizierten optische Aufbau PALM und Sturm ausgiebig beschäftigt durch die Aktivierung nur einer kleinen Teilmenge der Fluorophore in jedem Frame ein langes Video eines biologischen Präparates. Dies ermöglicht genauere Lokalisierung von 2D "glockenförmig" Einbau von fluoreszierenden Ort bezeichnet die Point-spread-Funktion (PSF), Fluoreszent-markierten Proteine in jedem Frame des Videos. Die 2D Position jedes Molekül Eindringmittel beschriftet kann dann auf einen einzigen Abbildungsebene Höchstauflösung Bilder des biologischen Vorbereitung1,2überlagert werden. Während diese Lokalisierung Einzelmolekül-Höchstauflösung Ansätze zur Mikroskopie sicherlich revolutioniert wie Bildgebung von biologischen Proben durchgeführt wurde, gibt es noch Herausforderungen zu bewältigen. Beispielsweise können Sturm und PALM erreichen ihre beste räumlicher Auflösung nach der Fixierung von biologischen Proben und so präsentieren eine statische Darstellung der Fluoreszent-markierten Proteine, die eine ähnliche Einschränkung der Elektronenmikroskopie. Darüber hinaus müssen die Erreichung hohen räumlichen Auflösung für jedes Fluoreszent-markierten Protein in lebenden Zellen, Proben bei sehr langen Frameraten abgebildet werden die Proteindynamik erfassen können. Daher ist es notwendig, diese wichtigsten technische Hürden zu überwinden.
Um eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung zu erhalten, die gut geeignet für die Erkennung von schnelllebigen Proteine oder RNA in lebenden Zellen ist, entwickelten wir Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in unserem Labor (Abbildung 1)6,7, 8. mehrere große technische Fortschritte in der Geschwindigkeit Mikroskopie haben zuvor konnten wir erfolgreich Nucleocytoplasmic Transport von kleinen Molekülen verfolgen, Proteine, mRNA und Virus durch Native nuclear pore komplexe (NPCs)6, 7 , 8. kurz, die folgenden Merkmale des SPEED-Mikroskopie werden zur schnelllebigen Makromoleküle durch Sub-Mikrometer rotationssymmetrisch Strukturen in lebenden Zellen, wie NPCs und primäre Zilien verfolgen: (1) eine geneigte oder eine vertikale Beleuchtung PSF ermöglicht die Anregung von einzelnen Molekülen in einem kleinen Beugungsgrenze Volumen in der Brennebene (Abbildung 1). (2), die geneigt PSF können stark vermeiden Sie Out-of-Focus Fluoreszenz und damit das Signal-Rausch-Verhältnis verbessern. (3) die optische Dichte von 100 bis 500 kW / cm2 bei der Beleuchtung PSF ermöglicht Tausende von Photonen aus einzelnen Fluorophore mit schnellen Erkennung Geschwindigkeiten (> 500 Hz) gesammelt werden. (4) die schnelle Erkennung Geschwindigkeit reduziert auch die räumliche Lokalisation Einzelmolekül-Fehler (< 10 nm) bei der Bestimmung der räumlichen Trajektorien fluoreszierende Moleküle in lebenden Zellen zu bewegen, weil molekulare Diffusion einer der wichtigsten Faktoren ist Unvollkommenheiten der Einzelmolekül-Lokalisierung für die Bewegung der Moleküle verursacht. (5) etablierte 2D zu 3D Umwandlung Algorithmen ermöglichen Ihnen 3D räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte Karten der Transportwege für Moleküle in der NPC oder der primäre Zilie zu bieten. Es ist bemerkenswert, dass unsere Konvertierung zwischen den kartesischen und den zylindrischen Koordinatensystem verwendet wird, um ein 3D räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte Karte anstatt 3D Einzelmolekül-Tracking (Abbildung 2) zu generieren. Bisher haben Elektronenmikroskopie Daten zeigten, dass die NPC9,10 und die primäre Zilie11 beide eine rotationssymmetrische Struktur haben. Grundsätzlich sollte nach dem Zufallsprinzip diffundierende Moleküle durch die NPC oder primäre Zilie rotationssymmetrische Distributionen auch haben. Wie in Abbildung 2dargestellt, eine hohe Anzahl von nach dem Zufallsprinzip diffundierende Moleküle im Inneren des Zylinders erzeugt rotationssymmetrische Verteilungen der Querschnitt durch das in der NPC, weiter führt eine etwa gleichmäßige räumliche Verteilung innerhalb jeder sehr kleinen Sub-Region zwischen zwei benachbarten Ringen (Abb. 2E). Diese gleichmäßige Verteilung führt, dass die räumliche Verteilung entlang θ Dimension im zylindrischen System konstant ist. Dann können die 3D Koordinaten (X, R, θ) vereinfacht werden, um die 2D Koordinaten (R, X, konstante) werden. Eigentlich ist unsere Konvertierung zwischen den kartesischen und den zylindrischen Systemen von 2D (X, Y) in 2D (R, X, konstante). Die konstante θ bezieht sich auf die räumliche Dichte p in Abbildung 2E, wird berechnet, indem die Gleichung A<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg">.
Letztlich Einzelmolekül-Tracking hat breite Anwendung in der biologischen Forschung, so ist es natürlich, dass eine Vielzahl von Techniken entwickelt, um spezifische biologische Nischen12,13,14füllen. Dies ist der Fall mit SPEED-Mikroskopie. Zuvor wurde zusammen mit einem 3D Transformationsalgorithmus diese Technik entwickelt, um 3D Transportwege von Transit-Moleküle durch die NPCs, eine sub-diffraction-Größe und rotationssymmetrische biologische Struktur6zu beheben. In diesem Papier primäre Zilien erweisen sich als ausgezeichnetes Modell Organellen sowie. Primäre Zilien sind zylindrisch, Antenne-wie Organellen (~ 125 nm Radius), die von der Oberfläche der meisten Säugetier-Zellen15,16,17zu projizieren. Sie sind verantwortlich für externe Signale empfangen und übertragen eine intrazelluläre Reaktion in der Regel verbunden mit Wachstum und Stoffwechsel15,16. Also flux von Strukturproteinen, recycling von transmembranen Rezeptoren und Übertragung von intrazellulären Botenstoffe sind wichtige Aufgaben der primären Zilien. An der Verbindungsstelle zwischen der primären Zilien und Zellkörper ist eine kritische Selektivität Schwelle, so genannte Übergangszone oder TZ, wodurch dieser Protein-Transport11,18,19erfolgen muss, 20. Neben der gating-Funktion von der TZ sind mindestens zwei Transportprozesse, intraflagellar Transport und passive Diffusion, vermutlich verantwortlich für die Bewegung des Proteins durch diese Region16,21, 22. aus Sicht der menschlichen Gesundheit, der Verlust der primäre Zilien und anschließenden Deregulierung der nachgeschalteten Signalisierung ist charakteristisch für viele Krebsarten. Darüber hinaus sind viele Erbkrankheiten wie Bardet-Bardet-Syndrom und polyzystischen Nierenerkrankung, defekte Protein Transport23zugeordnet. Die Größenbeschränkung von Sub-Beugung und den komplexen Prozess der selektiven Protein Transport durch die TZ machen die primären Zilien ein bevorzugtes Ziel für diese Technik. In diesem Methodenpapiers demonstrieren wir die Verfolgung von ciliary transmembranen Protein, Somatostatin Rezeptor 3 (SSTR3)24, extern mit Alexa Fluor 647 und Bestandteil des IFT, IFT2025, beschriftet mit einem geschmolzenen GFP-Molekül gekennzeichnet.

<table><tbody><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture dish</td><td>Corning</td><td>VV-01936-00</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ThermoFisher</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass bottom dish</td><td>MatTek</td><td>P35GCOL-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-conjugated streptavidin</td><td>ThermoFisher</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>633 nm He-Ne laser</td><td>Melles Griot</td><td>25-LHP-928-249</td><td></td></tr><tr><td>561 nm solid state laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS 561-50 LS</td><td></td></tr><tr><td>488 nm solid state laser</td><td>Coherent</td><td>1185053</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>1.4-NA 100&amp;times; oil-immersion apochromatic objective</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100&amp;times;</td><td></td></tr><tr><td>On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera</td><td>Roper Scientific</td><td>Cascade 128+</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic filter</td><td>Semrock</td><td>Di01- R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/561/635-25X5.0</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td>digital microscopy software</td></tr></tbody></table>

application of high-speed super-resolution speed microscopy in live primary cilium

Die primäre Zilie ist eine Vorwölbung Mikrotubuli-basierte auf der Oberfläche vieler eukaryotischer Zellen und enthält einer einzigartige Ergänzung der Proteine diese Funktion kritisch in Zelle Motilität und Signalisierung. Da Zilien nicht in der Lage eigene Protein zu synthetisieren sind, müssen fast 200 einzigartige ciliary Proteine zwischen dem Cytosol und primäre Zilien verschleppt werden. Es ist jedoch immer noch eine technische Herausforderung für dreidimensionale (3D) Standorte der Transportwege für diese Proteine in live primäre Zilien aufgrund der Einschränkungen der derzeit bestehenden Karte Techniken. Um die Herausforderung zu erobern, haben vor kurzem wir entwickelt und beschäftigt eine High-Speed-virtuelle 3D Höchstauflösung Mikroskopie, Einpunkt-Kante-Erregung Sub Beugung (Geschwindigkeit) Mikroskopie, um festzustellen, die 3D räumliche Lage der Transportwege für bezeichnet Beide cytosolischen und Membranproteine in primäre Zilien von lebenden Zellen. In diesem Artikel zeigen wir die detaillierte Setup SPEED-Mikroskopie, die Vorbereitung der Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-Protein-Label ciliary Proteine, die Echtzeitverfolgung der Einzelmolekül-einzelne Proteine in live Zilie und die Erreichung Karten 3D räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte der Transportwege für ciliary Proteine.

Dieser Abschnitt zeigt die Durchführung Geschwindigkeit Mikroskopie in der TZ primäre Zilien den Transportweg von SSTR3, verbunden durch ein ~ 15 nm externe Linker, Alexa647 studieren gewonnenen Daten(Abbildung 3). Es dient dem doppelten Zweck der Überprüfung des 3D-Transformation Algorithmus. Alexa647 sollten nur Label die Außenfläche der primäre Zilie und sich somit der 3D Transportweg High-Density Transportweg an dieser Stelle verraten sollte. NIH-3 t 3 stabil mit dem Ausdruck NPHP3-mCherry bei der TZ muss mit AP-SSTR3-GFP transfiziert und gemäß dem oben genannten Protokoll mit Streptavidin-konjugiert Alexa647 inkubiert. Weites Feld Bildgebung der mCherry Bezeichnung wird verwendet, um die TZ zu lokalisieren, während die GFP verwendet wird, um sicherzustellen, dass eine Zelle das gewünschte SSTR3 Konstrukt zum Ausdruck gebracht hat. Darüber hinaus ist weites Feld Bildgebung des Alexa647 Labels mit 633 nm Beleuchtung notwendig zu bestätigen, dass die Zelle das BirA Plasmid richtig zum Ausdruck gebracht hat und hat ausreichend Biotin aus den Medien aufgenommen. Positive Bestätigung ist gekennzeichnet durch eine sichtbare Zilie unterscheidet sich von der Hintergrundfluoreszenz (Abb. 3B). Effiziente Kennzeichnung von AP-SSTR3-GFP-Konstrukt mit Streptavidin-konjugiert Alexa647 kann nur unter diesen Bedingungen auftreten. Gewonnene positive Bestätigung für selektive Kennzeichnung der primäre Zilie durch Alexa647 ermöglicht Immunofluoreszenz und Einzelpunkt-Beleuchtung der TZ mit einem 633 nm Laser einzelne Moleküle visualisiert werden. Vor Datenanalyse ist die Überlagerung der Einzelmolekül-Video auf dem weiten Feld Beleuchtung eine nützliche Überprüfungsschritt (Abb. 3C). Zum Beispiel, wenn der Laser nicht richtig ausgerichtet ist, erscheint keine einzelne Moleküle zusammen mit der TZ lokalisiert. Ein weiterer Pre Daten Analyse Validierungsschritt um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten ist die Intensität in der TZ über die Länge der einzelnen Moleküls video (Abbildung 3E) zu überprüfen. Eine solche Analyse kann schnell in ImageJ mithilfe der Funktion "plot-Z-Achse-Profil" durchgeführt werden. Die Gipfel in Abbildung 3F entsprechen die Darstellung eines einzelnen Moleküls bei der TZ mit einem Signal-Rausch-~ 5.0. Dieses Diagramm ist auch gewährleistet, dass genügend Immunofluoreszenz aufgetreten ist, wie die gut getrennten Häufigkeit der Einzelmoleküle belegt. Abbildung 3 G zeigt eine geringe Signal-Rausch-Verhältnis von < 0,5. Eine Erklärung wäre, dass der Laser nicht direkt auf die TZ ausgerichtet ist. Ein weiterer Grund kann sein, dass die Laser-Beleuchtungsstärke zu niedrig ist. Beide Erklärungen führen niedrige Erregung und daher niedrige Emission von Fluorophore bei der TZ. Nachdem diese Überprüfungen vorgenommen wurden, produzieren 2D Gaußsche Anpassung der einzelnen Moleküle ihre Flugbahnen in der TZ (Abbildung 3H). Überlagerung von vielen Bahnen wird den Transportweg der beschrifteten Proteins des Interesses in der TZ (Abbildung 3ich) produzieren. Da das 2D "glockenförmig" Fitting die Pixelwerte auf den Detektor, X, entspricht können y Einzelmolekül-Daten zusammengeführt werden mit dem weiten Feldbild der TZ und primäre Zilien weiter veranschaulichen das Protein des Interesses der Lokalisierung (Abbildung 3J ).
IFT20 ist eine Komponente des komplexen, IFT die Fracht entlang der Mikrotubuli in primäre Zilien25trägt. Arl13b-mCherry, ein weit verbreitetes ciliary Marker Protein wurde verwendet, um primäre Zilien19beschriften. Weitfeld-Epi-Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um die primäre Zilie mit dem Ausdruck Arl13b-mCherry und IFT20-GFP Bild und wechselte dann zum SPEED-Mikroskopie, einzelne IFT20-GFP-Proteine in primäre Zilien nach einer Pre-Immunofluoreszenz der GLP zu verfolgen Fluoreszenz auf Einzelmolekül-Niveau im Bereich Beleuchtung der Geschwindigkeit Mikroskopie (Abbildung 4A-4 C).
Schließlich können die primäre Zilie einer live Zelle (Abbildung 4D) Hunderte von Einzelmolekül-IFT20-GFP Standorte mit einer systematischen Lokalisierung Genauigkeit von < 16 nm entnommen werden. Nach unserer Simulation 250 einzelne Molekül Standorte mit einem Radius von 95 nm war genug, um einen zuverlässigen 3D Transportweg (Abbildung 5) zu generieren. Eine endgültige Bestimmung des IFT20-GFP Transportweges basiert auf Tausenden von Einzelmolekül-IFT20-GFP Standorte von zehn Zilien (Abbildung 4E) gesammelt. Da primäre Zilien eine Struktur mit Rotationssymmetrie besitzen, wurde die 2D zu 3D Umwandlung Algorithmus auf die projizierte 2D-Daten angewendet. Interessant ist, die 3D räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte Karten von IFT20 darauf hingewiesen, dass nur eine einzige High-Density-Region mit einer Breite von ~ 60 nm ~ 95 erreichte nm entlang der Radius der primäre Zilien (Abbildung 4E). Dieser High-Density-Region wahrscheinlich lokalisiert zusammen mit den axonemal Mikrotubuli im Einvernehmen mit der bekannten Position der IFT-Route (Abbildung 4F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56475/56475fig1.jpg"> Abbildung 1 . Vereinfachte schematische Darstellung der Geschwindigkeit Mikroskopie. Eine vertikale (Pfad 1) oder eine Punktfunktion Ausbreitung geneigt (Weg 2) wird verwendet, um einzelne Fluorophor-Moleküle in der Brennebene zu beleuchten. "d" bezieht sich auf den Abstand zwischen vertikale Beleuchtung Laserstrahl verläuft durch die Mitte des Ziels und abgewinkelte Beleuchtung, die durch die Konzentration des Beleuchtung Lasers am Rande des Ziels erreicht wird. Zwei oder mehreren Lasern durch eine optische Chopper um einen ein-/ Anregung-Modus haben geregelt werden verwendet, um die einzelnen Moleküle Transit durch den NPC oder der primäre Zilie verfolgen. Die Ausschaltzeit ist mindestens zehnfach länger Immunofluoreszenz Fluorophor-Label auf die gezielte Moleküle. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56475/56475fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56475/56475fig2.jpg"> Abbildung 2 . Grafischen Demonstration von 2D zu 3D Konvertierung. Schaltpläne zeigen die 2D zu 3D Umwandlung Algorithmus für Moleküle, z. B. Wenn sie innerhalb der zentralen Lumen (A-F) oder einer peripheren Region (G-L) aus einem Rohr diffundieren. (A) ideale 3D räumliche Positionen von nach dem Zufallsprinzip diffundierende Moleküle in einem Rohr können in ein zylindrisches Koordinatensystem (X, R, θ) koordiniert werden. In der Geschwindigkeit wird nur die 3D Dichtekarte letztlich aus der 2D räumlichen Positionen berechnet. Dies ist jedoch eine idealisierte Fall zeigen, dass die 3D Dichtekarte gleichwertig ist ob 2D oder 3D räumlichen Positionen bekannt sind. (B) die 3D molekulare Standorte in A sind auf eine 2D-Ebene projiziert in einem kartesischen Koordinatensystem (X, Y, Z) durch Mikroskopie-Bildgebung. (C) eine sehr dünne Scheibe (Δx) aus dem Zylinder a entlang x Maß geschnitten. (D) die 3D räumlichen Positionen in dem Segment in C gezeigt können innerhalb einer engen 2D Region projiziert werden. (E) Querschnitt durch alle Positionen in die dünne Scheibe in C. gezeigt Diese Orte können in den Subregionen zwischen konzentrischen Ringen gruppiert werden. Angesichts der hohen Anzahl zufällig verteilten Moleküle in den Zylinder und den Schnitt sehr dünne Scheibe, die räumliche Dichte der Standorte (pich) in jede Teilregion (Si) zwischen zwei benachbarten Ringen werden rotatorisch symmetrisch und gleichmäßig. Diese Orte können weiter in 1D entlang der Y-Dimension projiziert werden. Wenn die Orte entlang der Y-Dimension in einem Histogramm mit j Spalten gruppiert sind. Die Gesamtzahl der Standorte in jeder Spalte (Aj) ist gleich <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq2.jpg"> </img>, die experimentell gemessen werden wie in (F) dargestellt. (G-L) Ähnlich wie oben, präsentiert der Transformationsprozess für Moleküle diffundieren in einer peripheren Region einer Röhre. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56475/56475fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56475/56475fig3.jpg"> Abbildung 3 . 3D räumliche Verortung des Transportweges für SSTR3 auf live primäre Zilien zugeordnet, indem Geschwindigkeit Mikroskopie. (A) grafische Darstellung der Geschwindigkeit Mikroskopie auf Verfolgung von GFP-Tags SSTR3 durch die TZ, gekennzeichnet durch NPHP4-mCherry angewendet wird. (B) Epifluoreszenz Bild des NPHP4-mCherry (rot), AP-SSTR3-GLP (grün), Alexa647 zur Beschriftung von extern AP-SSTR3-GLP (weiß) verwendet, und das endgültige zusammengefügte Bild. Maßstabsleiste: 2 µm. (C) Verfolgung von einer einzigen Alexa 647 beschriftet AP-SSTR3-GFP (weiß), die durch den Punkt Beleuchtungsfeld für vier Frames (2 ms/Rahmen) verläuft. Maßstabsleiste: 2 µm. (D) Einzelmolekül Flugbahn (weiß) von (C) überlagert das Epifluoreszenz-Bild der NPHP4-mCherry (rot) und AP-SSTR3-GLP (grün). Maßstabsleiste: 2 µm. (E) weiß gestrichelte Quadrat Highlights Bereich der Einzelpunkt-Beleuchtung zentriert auf der TZ. Maßstabsleiste: 2 µm. (F) Photon Graf Vs Frame Nummer Diagramm für ein einzelnes Molekül mit einem high-Signal Rauschabstand bestimmt, indem die maximale Fluoreszenz der einzelnen Moleküls dividiert durch die Hintergrundfluoreszenz video. (G) Photon Graf Vs Rahmen Nummer Diagramm für ein einzelnes Molekül video mit einem low-Signal Rauschabstand. (H) Flugbahn aus (E) und (D) lokalisiert in jedem Frame von 2D "glockenförmig" Lampe und überlagert eine genaue grafische Darstellung der TZ, auch von 2D "glockenförmig" Lampe lokalisiert. Die 2D Gaußsche Anpassung passt eine Gaußsche Funktion, um die X und Y Profilmaße Intensität ein Bereich von Interesse (AOI) umfasst die Einzelmolekül PSF.(I) 2D Höchstauflösung räumliche Verteilung der einzelnen 220 Alexa Fluor 647-Label AP-SSTR3-GFP Standorten aus eine einzelne primäre Zilie gesammelt. (J) Höchstauflösung Einzelmolekül Standorten aus (I) überlagert das Epifluoreszenz-Bild der NPHP4-mCherry (rot) und AP-SSTR3-GLP (grün). Maßstabsleiste: 2 µm. (K) durch eine 2D zu 3D Umwandlung Algorithmus, die räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte Verteilung der Alexa Fluor 647 beschriftet AP-SSTR3-GLP auf primäre Zilien entlang der R-Dimension erhielt. Basierend auf Gaußsche Funktion passend, Alexa Fluor 647 beschriftet AP-SSTR3-GFP in erster Linie auf die ciliary Membran in einem Radius von 131±3 nm mit einer volle Breite am halben Maximum (FWHM) von 24±1 nm liegt. (L) Querschnitt durch die räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte Verteilung (grüne Wolke) von Alexa Fluor 647 beschriftet AP-SSTR3-GLP auf primäre Zilien. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56475/56475fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56475/56475fig4.jpg"> Abbildung 4 . 3D räumliche Verortung des Transportweges für IFT20 innen live primäre Zilien zugeordnet, indem Geschwindigkeit Mikroskopie. (A-C) Repräsentatives Bild der Arl13b-mCherry (A) und IFT20-GLP (B) zusammen in einer NIH3T3 Zelle und der zusammengeführten (C) ausgedrückt. Der Kreis (Cyan) zeigt, dass die Lage der Einzelpunkt-Beleuchtung der Geschwindigkeit Mikroskopie auf eine primäre Zilie an der Seite einer Zelle (weiße gestrichelte Linien) wuchs deren Kanten durch IFT20-GFP Fluoreszenz in den Zellkörper und Hellfeld-Beleuchtung (nicht bestimmt werden angezeigt). Maßstab: 10 µm. (D) 2D Höchstauflösung räumliche Verteilung der 286 IFT20-GFP Mikrolagen aus eine einzelne primäre Zilie gesammelt. (E) durch eine 2D zu 3D Umwandlung Algorithmus ist die räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte Verteilung der IFT20-GLP in primäre Zilien entlang der R-Dimension erhalten. Basierend auf Gaußsche Funktion Armatur, IFT20-GFP in erster Linie suchen Sie in einem Radius von 95±1 nm mit einer volle Breite am halben Maximum (FWHM) von 56±5 nm. (F) Querschnitt durch die räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte-Verteilung (grüne Wolken) der IFT20-GLP in primäre Zilien, überlagert mit dem Schaltplan in H. Maßstabsleiste: 100 nm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56475/56475fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56475/56475fig5.jpg"> Abbildung 5 . Simulation wurde verwendet, um die minimale Anzahl von 2D Einzelmolekül-Standorte eine zuverlässige 3D räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte-Karte für die 2D zu 3D Umwandlung Algorithmen generieren schätzen. (A) 100 rechnerisch erzeugte Einzelmolekül-Standorte probieren Sie zufällig von einer radialen Dichte Normalverteilung zentriert auf 95 nm (entsprechend dem primären Transportweg von IFT20 in unseren Experimenten bestimmt). Genauigkeit der Lokalisierung von 16 nm wird für jeden Einzelmolekül-Standort simuliert, indem Probenahme aus einer Normalverteilung mit σ = 16 nm. Wie in Abbildung 2C, eine sehr dünne Scheibe (Δx) in der X-Dimension wird zur Transformation Algorithmen und die X-Dimension ist deshalb nicht im rechnerisch erzeugten 2D Einzelmolekül-Standorten dargestellt. (B) Transformation zwischen Y-dimensionalen Projektdaten und 3D R-dimensionale Dichte erzeugen die Histogramme der 3D R-dimensionalen dichten für fünf verschiedene simulierte Datensätze (jeweils 100 Punkte). Die Zahl oben ist die Peak Position ± Montage Fehler. (C-D) Simulationsergebnisse basierend auf 250 Einzelmolekül-Standorten. (E-F) Simulationsergebnisse basierend auf 500 Einzelmolekül-Standorten. (G-ICH) 3D Dichte Histogramme von 100, 250 und 500-Punkte-Simulationen bzw. durchschnittlich. Fehlerbalken stellen Variabilität in den Histogramm bin Höhen, während die Zahl über den Gipfel der durchschnittlichen Position ± Standardabweichung ist. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56475/56475fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Vor kurzem abgebildet wir die dreidimensionale (3D) räumlichen Positionen der Transportwege für verschiedene Proteine in primäre Zilien in lebenden Zellen translocating. Hier leben diese Papier-Details, die in der Versuchsanordnung, den Prozess der biologischen Proben und der Datenanalyse für die 3D Höchstauflösung Fluoreszenz imaging Ansatz neu angewendet primäre Zilien.

Anwendung des High-Speed-Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in Live primäre Zilie

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

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Serie: Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

2D- und 3D-humaninduzierte pluripotente Stammzell-basierte Modelle zur Sezierung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Beobachtung der Flimmerbewegung von Plexus Epithelzellen<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Neurowissenschaften

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Ex-vivo-Verfahren für High Resolution Imaging von Cilia Motilität in Nagetier Atemwegsepithelien

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Biologie

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Super-Resolution Imaging zur Untersuchung der Kolokalisierung von Proteinen und synaptischen Markern in primärer Neuronen

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

Einfacher Nachweis der primären Cilia durch Immunfluoreszenz

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures the interaction of homologous chromosomes is the assembly of the synaptonemal complex (SC) in meiotic prophase I. Even though there is little sequence homology between protein components within the SC among different species, the general structure of the SC has been highly conserved during evolution. In electron micrographs, the SC appears as a tripartite, ladder-like structure composed of lateral elements or axes, transverse filaments, and a central element. 
However, precisely identifying the localization of individual components within the complex by electron microscopy to determine the molecular structure of the SC remains challenging. By contrast, fluorescence microscopy allows for the identification of individual protein components within the complex. However, since the SC is only ~100 nm wide, its substructure cannot be resolved by diffraction-limited conventional fluorescence microscopy. Thus, determining the molecular architecture of the SC requires super-resolution light microscopy techniques such as structured illumination microscopy (SIM), stimulated-emission depletion (STED) microscopy, or single-molecule localization microscopy (SMLM). 
To maintain the structure and interactions of individual components within the SC, it is important to observe the complex in an environment that is close to its native environment in the germ cells. Therefore, we demonstrate an immunohistochemistry and imaging protocol that enables the study of the substructure of the SC in intact, extruded Caenorhabditis elegans germline tissue with SMLM and STED microscopy. Directly fixing the tissue to the coverslip reduces the movement of the samples during imaging and minimizes aberrations in the sample to achieve the high resolution necessary to visualize the substructure of the SC in its biological context.

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-resolution microscopy can provide a detailed insight into the organization of components within the synaptonemal complex in meiosis. Here, we demonstrate a protocol to resolve individual proteins of the Caenorhabditis elegans synaptonemal complex.

Super-Resolution-Mikroskopie des synaptonemalen Komplexes in der Keimbahn von Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...