Wir sind dankbar, Qing Xu für die Entwicklung der Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual Reporter mESC Linie und Jennifer Tyson, Asif Maroof, sowie Tim Petros für ihre frühen Arbeiten zu helfen, dieses Protokoll zu entwickeln. Wir danken auch den CHOP Flow Cytometry Kern für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde von einem NIH R01 MH066912 (SA) und F30 MH105045-02 (DT) unterstützt.

Hinweis: Die dual Reporter mESC Linie beschrieben in diesem Protokoll sind auf Anfrage möglich (sande@mail.med.upenn.edu).
(1) Media-Vorbereitung
Hinweis: Warm alle Medien auf 37 ° C vor der Verwendung in der Zellkultur.
<ol><li>
Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) Medien (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>449 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) und Filter durch eine Filteranlage 500 mL 0,22 µm Pore 50 mL fetalen bovine Serum (FBS) hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C für bis zu 1 Monat oder Aliquote und Store bei ≤-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
N2-Medien (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>Geben Sie 5 mL L-Alanin-L-Glutamin (100 X) und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) bis 489,5 mL DMEM: Nährstoff-Mischung f-12 (DMEM/F-12) und Filter durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) und 5 mL N2 Anhang-B nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 1 Monat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Serumfreien Wachstumsmedium (KSR) (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>Fügen Sie 75 mL serumfreien Medium Ergänzung, 5 mL L-Glutamin (100 X), 5 mL MEM nicht-essentiellen Aminosäuren (MEM-NEAA) (100 X), und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) auf 413,5 mL nicht-Glutamin enthält DMEM und Filtern durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maus embryonalen Stammzellen Medien (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>75 mL Stammzellen Grade FBS, 5 mL MEM-NEAA hinzufügen (100 X), 5 mL L-Glutamin (100 X), und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) auf 413,5 mL nicht-Glutamin enthält DMEM und Filtern durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C im Dunkeln für bis zu 1 Monat oder Aliquote und Store bei ≤-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kultivierung mESCs
<ol><li>Platte mitotically inaktiven MEF Feeder Zellen in MEF Medien auf Gewebekultur behandelt Teller mit 3-4 x 104 Zellen/cm2. Lassen Sie mindestens 12 Stunden für sie in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 Regeln vor der Beschichtung der mESCs. Wenn nicht sofort verwendet wird, ersetzen Sie die MEF-Medien alle 3 Tage. Entsorgen Sie MEFs, wenn nicht innerhalb von 7 Tagen nach der Beschichtung verwendet.</li>
	<li>MEF-Platten in mESC Medien Maus Leukämie hemmenden Faktor (mLIF) (1.000 U/mL) mit fügen Sie mESCs (Dichteumfang von 1-4 x 104 Zellen/cm2 hinzu). Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.</li>
	<li>Durchgang mit Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) mESCs (1:5-1:10) Sobald das Gericht wird ~ 70-80 % Zusammenfluss oder wenn die Kolonien beginnen zu berühren. Dies in der Regel erfolgt alle 2 Tage, aber kann bis zu 4 oder 5 Tage, je nach der anfänglichen Beschichtung Dichte nehmen.</li>
	<li>Pflegen Sie die mESCs auf einem MEF Feeder Layer mESC Mittel-und Pluripotenz zu halten.</li>
	<li>
Vor Beginn der Differenzierung, die passage der Zellen mindestens einmal auf Gelatine beschichtete Platten ohne MEFs, die MEFs zu verdünnen.
	<ol>
<li>Bereiten Gelatine beschichtete Platten durch Zugabe von 0,1 % Gelatine in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 +/Mg2 + zu einem Gericht Gewebekultur behandelt und bei 37 ° C für mindestens 1 h Platte 1,5-2 x 106 Zellen/10 cm Platte verlassen (2,7 bis 3,6 x 104 Zellen/cm2) und lassen Sie die Zellen, für 2 Tage vor Beginn der Differenzierung zu erweitern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mESCs in Richtung MGE-ähnliche Teleenzephalischer Stammväter Differenzierung
<ol><li>
Differenzierung-Tag (TT) 0 = "float Zellen"
	<ol>
<li>Nachdem die mESCs gewachsen sind, auf Gelatine beschichtete Platten für 2 Tage, aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Fügen Sie genügend Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) bedecken die Oberfläche der Platte (in der Regel 4 mL Trypsin-EDTA für eine 10 cm Gewebekultur Teller), und legen Sie die Zellen wieder in den Brutschrank bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 4 min.</li>
		<li>Stillen Sie nach 4 min die Trypsin-EDTA mit 2 Mal das Volumen mit mESC Medien. Die Zellen auf eine entsprechend dimensionierte Zentrifugenröhrchen übertragen und die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie nach 5 min das Rohr und aspirieren Sie die Medien ohne zu stören das Pellet. Aufschwemmen das Pellet in 1 mL KSR:N2 Medien (1:1) mit der BMP-Inhibitor LDN-193189 (250 nM) und der Wnt-Inhibitor XAV-939 (10 µM).</li>
		<li>Messen Sie die Zellkonzentration unter Verwendung eines Hemocytometer oder automatisierte Zelle Zähler. Start wachsenden Zellen als Embryoid Körper (EBs) durch Zugabe von 75.000 Zellen/mL in KSR:N2 Medium (1:1) mit LDN-193189 (250 nM) und XAV-939 (10 µM) in Gewebekultur-anhaftende Gerichte. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am DD1 bereiten Sie für Zelle "Landung" durch Beschichtung Gewebekultur behandelt Gerichte mit Poly-L-Lysin (10 µg/mL in PBS mit Ca2 +/Mg2 +) über Nacht (O/N) bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchte oder mindestens 1 h.</li>
	<li>DD2, Aspirieren der Poly-L-Lysin und Beschichten der Platten mit Laminin (10 µg/mL in PBS mit Ca2 +/Mg2 +) O/N bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit. Hinweis: Während O/N optimal ist, weniger als 2 h kann ausreichend sein. Wenn Platten nicht am nächsten Tag verwendet werden, Aspirieren Laminin, ersetzen mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen aufbewahren.</li>
	<li>
DD3 ("land Zellen")
	<ol>
<li>Vor Beginn der EB Dissoziation, Aspirieren der Laminin und die Platten trocken in einer Gewebekultur-Haube. Verwenden Sie keine Platten, die glänzende oder sichtbar nass erscheinen. Übertragen Sie die EBs mit Medien in eine 15 mL-Tube und Zentrifuge für 3-4 min 15 x g oder bis der EBs haben oelletiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirieren Sie die Medien und 3 mL Zelle Ablösung Lösung mit DNase (2 U/mL) und Inkubation bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchte und 5 % CO2 für 15 min. sanft flick das Rohr alle 3 min um EB Dissoziation zu erleichtern.</li>
	<li>Sobald der EBs sind nicht mehr sichtbar oder 15 Minuten vergangen sind, fügen Sie 6 mL KSR:N2 (1:1) mit DNase (1 U/mL) und Zentrifuge für 5 min bei 200 X g.</li>
	<li>Die Zellen in KSR:N2 (1:1) mit LDN-193189 Platte (250 nM), XAV-939 (10 µM), und der ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 µM) bei 4,5-5 x 104 Zellen/cm2.</li>
</ol>(4) SST-Anreicherung Protokoll: "DD12 GFP hohe Sonic Hedgehog (SHH)" (Fortsetzung von Schritt 3,7)
<ol><li>Ändern Sie auf DD5, Medien mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und SSH (50 ng/mL).</li>
	<li>Gewebekultur Platten vorbereiten, wieder am Tag 8 (Schritt 4.4) Beschichtung mit in Schritte 3.2-3.3 aufgeführten Anweisungen.</li>
	<li>Ändern Sie auf DD7, Medien mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und SHH (50 ng/mL).</li>
	<li>
Auf DD8 Platte wieder die Zellen. Hinweis: Während dieser Schritt nicht notwendig ist, kann wieder galvanischen Zellen frühen differenziert, unerwünschte Zelltypen reduzieren. Re Beschichtung auch Kugeln aus Zellen, die die nachgelagerten immunhistochemische Analysen erschweren bricht, und erhöht die Effizienz der FACS zu späteren Zeitpunkten.<ol>
<li>Neu Platte Zellen, die Zellen von der Platte mit Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) für 5 min bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2zu lösen. Die Trypsin-EDTA mit 2 Mal das Volumen mit KSR:N2 zu stillen und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min. filtern die Zellen durch einen 40 µm Filter Schlauch, Klumpen zu entfernen. Platte wieder die Zellen bei 250.000 Zellen/cm2 N2/KSR (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und Y-27632 (10 µM) mit SHH (50 ng/mL). Hinweis: Wenn stattdessen die Entscheidung getroffen wird, nicht auf die Zellen auf DD8 Re Platte wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit SHH (50 ng/mL) alle 2 Tage ab DD7, DD12 und IGF-1 hinzufügen (20 ng/mL) und FGF-2 (10 ng/mL) bis DD9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auf DD10, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit SHH (50 ng/mL).</li>
	<li>
Auf DD12, um Zellen zu erhalten, die für SST Untertypen angereichert sind, verwenden FACS, um Lhx6::GFP zu isolieren-Zellen nur zum Ausdruck zu bringen.
	<ol>
<li>Um die Zellen zu entfernen, verwenden Sie eine nicht-Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Reagenz als Trypsin-EDTA. Waschen Sie Zellen einmal mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Fügen Sie vorgewärmt nicht Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Reagenz mit DNase (2 U/mL) auf die Zellen. Legen Sie sie in den Inkubator bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 10-30 Minuten oder bis die Zellen getrennt haben. Klopfen Sie leicht die Platten alle 5 min um die Dissoziation zu unterstützen. Hinweis: Für DD11-12 Kulturen kann nur 10-15 Minuten erforderlich sein. Für DD15-16 Kulturen kann 30 Minuten oder mehr für vollständige Dissoziation erforderlich.</li>
		<li>Sobald die Zellen komplett von der Platte gehoben haben, fahren Sie mit FACS Isolierung unter Verwendung von standard-Protokollen oder verwenden Sie die Zellen in anderen nachgeschalteten Analysen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PV-Anreicherung Protokoll: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (Fortsetzung von Schritt 3,7)
<ol><li>Auf DD5, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>Gewebekultur Platten vorbereiten, wieder Beschichtung auf DD8 (Schritt 4.4) mit die Anweisungen gemäß 3.2-3.3 Schritte.</li>
	<li>Am DD7, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>Auf DD8, neu Platte Zellen wie unter Schritt 4.4 mit folgenden Ausnahmen: Wenn die Zellen neu Plattieren, SHH mit gespachtelten Agonist zu ersetzen (SAG; 30 nM) und atypische PKC-Hemmer (aPKCi; 2 µM) hinzufügen. Zusammengenommen, die erneut Galvanik Medien jetzt N2/KSR (1:1) enthält FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM), und aPKCi (2 µM).</li>
	<li>Auf DD10 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM).</li>
	<li>
DD11 Hinweis: an dieser Stelle sind Nkx2.1::mCherry+ Zellen angereichert um PV CIns zu werden.<ol>
<li>Trennen Sie die Zellen aus der Platte für FACS verwenden das gleiche Protokoll in Schritt 4.6 beschrieben. Wenn die Entscheidung getroffen wird, um Nkx2.1::mCherry+ Zellen an einem späteren Tag Differenzierung zu sammeln, ignorieren Sie diesen Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auf DD12 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Auf DD14 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Auf DD16 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Sammeln Sie auf DD17 die Nkx2.1::mCherry+ Zellen unter Verwendung des gleichen Protokolls in Schritt 4.6 beschrieben.</li>
</ol>(6) PV-Anreicherung Protokoll: "DD17 mCherry Low SHH" (Fortsetzung von Schritt 3,7)
<ol><li>Auf DD5, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL). Am DD7, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>
Auf DD9 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1). Ab diesem Zeitpunkt sind keine zusätzliche Wachstumsfaktoren notwendig.
	<ol>
<li>Weiterhin die Medien alle 2 Tage bis zur Ernte der Zellen auf DD17 ändern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während diese Methode ist sehr effektiv bei der Musterung J1 abgeleitet mESCs (SCRC-1010), erlebten wir Variablen Erfolg mit anderen mESC Linien und klonale Isolate. Zum Beispiel, Foxg1::venus mESCs (EB3 abgeleitet; Danjo Et al. 13) reagieren schlecht auf dieses Protokoll und Foxg1 Induktion durch DD12 ist in der Regel in der Größenordnung von 1 %-2 %. Aus Gründen, die wir nicht vollständig verstehen, produziert ein weiteres Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter Klon (genannt JQ59), die gleichzeitig als die Linie beschrieben in diesem Protokoll (genannt JQ27), isoliert wurde weniger als 1 % Nkx2.1 exprimierenden Zellen wenn gewachsen unter identischen Bedingungen. Die Ausgangslinie (J1; ATCC SCRC-1010), allerdings reagiert gut auf dieses Protokoll und produziert Prozentsätze von Nkx2.1 exprimierenden Zellen auf DD12 ähnlich wie in Abbildung 1 bgezeigt. Bei Bedarf können die Konzentrationen von XAV-939 und SHH/SAG die Differenzierung Bedingungen auf einer Zeile für Zeile Basis optimieren angepasst werden. Unsere Erfahrung mit diesem Protokoll, um andere mESC Linien in MGE-ähnlichen Vorfahren zu unterscheiden ist jedoch begrenzt.
Über unsere Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Linie express nicht alle Nkx2.1 + Zellen mCherry. Obwohl fast alle mCherry + Zellen Nkx2.1 Protein ausdrücken, hinkt Reporter Ausdruck Nkx2.1 Protein-Expression, vor allem in frühen Phasen der Differenzierung (DD7-9). Der Anteil der Nkx2.1 +-Zellen, die mCherry stetig ausdrücken erhöht sich im Laufe der Differenzierung. Bei Pegelspitzen (~ DD12-14) mCherry ist in etwa 30 % aller Nkx2.1 mit dem Ausdruck ihrer Vorfahren17ausgedrückt. Darüber hinaus wurde die gleiche bakterielle künstliche Chromosom verwendet, um Laufwerk mCherry Ausdruck zur Cre-Rekombinase in Nkx2.1-Ausdruck Domänen von transgenen Mäusen24fahren. In diesen Mäusen Cre-Expression wurde schwach in den Nkx2.1 exprimierenden Zellen der dorsalen-die meisten Region die MGE und Schicksal-Mapping mit dieser Maus erschien unter Label SST exprimierenden CIns, die bekanntermaßen weitgehend aus dieser Region25erzeugt werden, 26,27,28. Jedoch trotz dieser Unstimmigkeiten absperrbar Millionen von GFP oder mCherry exprimierenden Zellen mit nur ein paar Stunden von FACS.
Es gibt zwei Hauptvorteile dieser Technik. Erstens in Kombination mit unseren Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP Dual-Reporter mESC Linie ist es möglich, große Anzahl von Interneuron Vorprodukten angereichert um PV oder SST-fated kortikalen Interneuron Subtypen werden zu erhalten. Der zweite wesentliche Vorteil ist die relative Leichtigkeit, mit welcher zahlreicher Interneuron beschieden, dass Zellen erreicht werden können. Obwohl einige andere modifizierte EB Techniken existieren, um MGE Stammväter und Neuronen unterscheiden, verlassen diese Protokolle in der Regel über die Verwendung der Wnt-hemmenden Moleküle wie Dkk113,14,29. Wir haben festgestellt, dass die Wnt-Inhibitor XAV-939 die Generation der pallidal Teleenzephalischer Vorfahren verbessert, wie Foxg1 und Nkx2.1 Ausdruck15belegt.
Wie bereits erwähnt, gibt es mehrere andere Methoden zur Erzeugung von MGE-ähnlichen Vorfahren aus mESCs. Watanabe Et al. 14 leistete Pionierarbeit im Bereich der Teleenzephalischer Differenzierung von mESCs indem es als erstes eine serumfreien Aussetzung Kultur Methode gefolgt von erneut auf eine anhaftende Oberfläche Galvanik entwickelt. Sie fanden, dass die Wnt und Nodal-Antagonisten, Dkk1 und LeftyA, beziehungsweise, effizient mESCs in frühen Neuroectodermal Linien13Gefahren. SHH auf dieser Kulturen anwenden, sie beobachtet, dass zwischen 5-15 % aller Zellen in Kultur Co exprimierten Nkx2.1/Foxg1 und könnte als MGE-ähnlichen Vorfahren13angesehen werden. Jedoch während der Grundstein für viele Studien zu kommen, haben diese Studie keinen Weg zu isolieren MGE Stammväter oder für bestimmte CIn Subtypen zu bereichern.
Einige Jahre später, Danjo Et al. 13 verwendet die gleichen serumfreien Aussetzung-Kultur-Methode in Kombination mit der zeitgesteuerten Verwaltung der verschiedenen Wachstumsfaktoren in bestimmten SHH subregionalen Spezifikation mESC abgeleitet ventralen Teleenzephalischer Gewebe zu erreichen. Mit einem Foxg1::venus Reporter, fanden sie, dass SHH-Verwaltung von DD3-12 nach Dkk1 Behandlung zwischen 45-68 % aller Zellen in Kultur, die mit dem Ausdruck der Foxg1::venus Reporter13geführt. Bei der Foxg1::venus + Bevölkerung ausgedrückt etwa 32 % der Zellen Nkx2.113. Durch Substitution von SHH für SAG und Hinzufügen von Fgf8, verbessert sie weiter den Bruch von Nkx2.1 Vorfahren innerhalb der Foxg1::venus + Bevölkerung auf etwa 41 %13. Wenn für Schicksal untersucht, produziert diese Zellen ca. 17 % SST, 21 % BW, 18 % NPY und 8 % Calretinin Subtypen13. Jedoch während dieser Studie eine Methode dahingehend CGE versus MGE abgeleitet CIn Schicksale beschrieben, beschreiben es keine Methode, um selektiv bereichern für PV oder SST Subtypen.
Im folgenden Jahr, Cambray Et al. 11 verwendet eine serumfreien Monolayer-Methode mit Re Beschichtung auf DD5, um die Wirkung von Activin auf die Differenzierung und Identität des Teleenzephalischer neuronalen Vorstufen abgeleitet von Mäusen und menschlichen WSR zu studieren. Obwohl diese Studie nicht den Prozentsatz der Nkx2.1 Zellen, die in ihrem Protokoll generiert melden, berichten sie, dass etwa 54 % der Zellen in Kultur Nestin/Foxg1 auf DD2 (5 Tage des Wachstums im Serum ausgedrückt, freie Medien um weitere 2 Tage Kultur gefolgt, Co Nach erneuten Beschichtung)11. Sie berichteten auch, dass mit dem Zusatz von Activin, ~ 55 % der Zellen Co ausgedrückt nestin und CouptfII, darauf hinweist, dass diese Zellen kaudalen ganglionic Eminenz-wie Zellen darstellen können, erzeugen die meisten Calretinin exprimierenden kortikale Interneurone 11. 39 % der Zellen fanden in der Tat um 8 Tage in Kultur (insgesamt 13 Tage) Calretinin/BIII-Tubulin, Co auszudrücken, während 59 % der Zellen gefunden wurden, GABA/BIII-Tubulin11Zusammenarbeit zum Ausdruck bringen. Diese Studie habe nicht geprüft, die Produktion von PV oder SST Subtypen.
Noch einmal mit einem modifizierten EB Methode, Chen Et al. 12 unter Beweis gestellt, dass MGE-spezifische Enhancer, die Elemente verwendet werden könnten, zu folgen und zu reinigen Stammzellen abgeleitet MGE-wie Zellen12. In der vorliegenden Studie verglichen sie die Wirkung der verschiedenen Kulturbedingungen während gerichtete Differenzierungen des mESCs in MGE-ähnlichen Vorfahren über eine Lhx6::GFP-Reporter-Leitung; die gleiche Linie diente als der Ausgangslinie für die Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP-Dual-Reporter-Linie in diesem Manuskript beschrieben. Sie zeigten, dass durch das Hinzufügen von Dkk1 zur Kultur Bedingungen von DD0-3, gefolgt durch die Zugabe von SAG, ab ~ 10 % aller Zellen in Kultur ausgedrückt Lhx6::GFP12. Sie fanden auch, dass das gleiche Protokoll, auf der Foxg1::venus Linie von Danjo Et Al. beschrieben angewendet 12, führte zu etwa 37 % aller Zellen, die mit dem Ausdruck der Foxg1::venus Reporters. Als Lhx6::GFP Zellen transplantierten in Vivowaren, wurde die folgenden durchschnittlichen Prozentsätze CIn Subtyp Marker beobachtet: 22 % PV, SST 58 % und 16 % NPY12.
Andere Gruppen haben in jüngerer Zeit, die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren Linie definieren verwendet, um direkt CIns anzugeben. Vielleicht war dies die erste Demonstration von Petros Et al. 10 , die Doxycyclin-induzierbaren Promoter verwendet, um Nkx2.1 Ausdruck in Ainv15 mESCs zu fahren, die modifiziert wurden, um ein Lhx6::GFP bakterielle künstliches Chromosom enthalten. Dieser Studie verwendet, Kulturbedingungen ähnlich wie beschrieben im aktuellen Manuskript aber ohne die Zugabe von XAV-93910. Jedoch aus Gründen, die schlecht verstanden werden, ein geringer Prozentsatz an Lhx6::GFP +-Zellen beobachtet den gleichen Bedingungen Differenzierung im Vergleich zu Verwendung der J1 Lhx6::GFP Ausgangslinie in diesem Manuskript10beschrieben. Trotz vergleichbarer Foxg1 Ausdruck (total % unbekannt), gab es ein moderater Rückgang der Gesamtzahl der Nkx2.1 Zellen ohne mehr als 2 % aller Zellen der Lhx6::GFP Reporter10zum Ausdruck zu bringen. Diese Studie unterstreicht die angeborene Unterschiede, die zwischen verschiedenen ESC-Linien und die Herausforderungen bestehen, dass Forscher Gesicht beim ESC Linien unterscheiden sich von denen Differenzierung Protokolle zuweisen, mit denen ursprünglich die Protokolle entwickeln.
Mit Hilfe einer eleganten Ansatz, Au Et al. 9 zur die sequentielle erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren Erzeugung von spezifischen Subtypen der kortikale Interneurone, die mit dem gleichen ventralen Teleenzephalischer Differenzierung Paradigma von Watanabe Et Al. entwickelt 14 , während sie die genauen Prozentsätze von Foxg1 + Nkx2.1 + und Olig2 + Vorstufen in Kultur produziert nicht berichten, erklären sie, dass ca. 50 % aller Zellen in Kultur in GABAergen Neuronen9 differenziert. 11 Tage Post-Differenzierung EBs wurden getrennt und in die MGE E13.5 Host Embryonen9verpflanzt. Ein kleiner Prozentsatz davon (weniger als 1 %) von der MGE in der Hirnrinde, wo sie durch ihre Dlx5/6-eGFP-Reporter identifiziert und analysiert für Schicksal9migriert. Die Autoren beobachteten eine Vielzahl der Prozentsätze der PV, SST und CGE-ähnliche Schicksale basierend auf ihren gewählten Zwangsinduktion Strategie9. Interessanterweise mit Expression des Transkriptionsfaktors Lmo3, sie beobachtet im Durchschnitt etwa 57 % PV, 21 % SST und 15 % CGE-abgeleitete Subtypen (SST- / reelin + oder VIP-nur +)9. Der größte Anteil der SST-Subtypen beobachtet wurde mittels einer Nkx2.1/Dlx2 GOF-Linie, die ungefähr 32 % SST, 35 % PV und 25 % CGE-abgeleitete Subtypen9produziert erhalten.
Im Jahr 2015, Colasante Et al. 30 zeigten, dass die erzwungene Ausdruck der fünf Transkriptionsfaktoren (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5 und Lhx6) in Fibroblasten von GAD67-GFP Reporter Mäusen GABAergen-artigen CIns 15 % aller Zellen umgewandelt. Bemerkenswerterweise ging etwa 90 % dieser Zellen auf PV, nur selten Zellen mit dem Ausdruck SST30zum Ausdruck zu bringen. Obwohl diese Methode nicht auf mESCs angewendet wurde, diente es mit menschlichen iPSCs, wo wurde es geschätzt, dass etwa 30 % aller Zellen einen GABAergen Identität30angenommen.
Wie in Abbildung 2dargestellt, gibt es mehrere Möglichkeiten, angereicherte Populationen von PV oder SST CIns zu generieren. Die wichtigsten Vorteile der PV-Protokoll unter Verwendung aPKCi über das DD17-Protokoll sind die größere Zahl der Zellen einer kann isolieren, Zell-Lebensfähigkeit und die Dauer der Kultur. Obwohl wir Daten für DD17 Induktion Ebenen nicht in Abbildung 1zeigen, gibt es rund doppelt so viele mCherry + Zellen bei DD11 wie es bei DD17 (Daten nicht gezeigt). Beim Sammeln von Zellen für Transplantationszwecke finden wir, dass eine größere Anzahl von Zellen (siehe unten) ist vorteilhaft, da etwa 30-50 % der Zellen sind in den Prozess der Injektionslösung Konzentration verloren. Darüber hinaus kann eine größere Anzahl von Zellen mit kürzeren FACS, die schränkt die Menge der Zeit, dass die Zellen auf dem Eis und senkt die Gesamtkosten erworben werden. Wahrscheinlich weil ein höherer Prozentsatz der Kirsche + Zellen sind Vorfahre, weisen Zellen aus früheren Stadien der Kultur (z.B.DD11) größere überleben im Vergleich zu DD17 Zellen nach der Transplantation in Neugeborenen Neokortex. Wenn große Anzahl der lebensfähigen Zellen benötigt werden, ist zum Beispiel bei Stammzelltransplantation zur Behandlung von Epilepsie, mit einer größeren Bevölkerung ab und größere Rentabilität ein großer Vorteil.
Wie in Abbildung 2dargestellt, abhängig vom Protokoll, analysiert ca. 25-39 % Lhx6::GFP + Zellen 30 Tage nach Transplantation drücken nicht nachweisbare Konzentrationen von PV oder SST Protein mit Routine Immunohistochemistry. In der Regel diese PV- / SST-Zellen express GABA sowie Sox6, ein Marker für MGE abgeleitet kortikale Interneurone (siehe Tyson Et Al. 15, Tischfield Et al. 17). weniger als 1 % der PV- / SST - Lhx6::GFP + Zellen ausdrückliche Marker für andere Interneuron Untergruppen, wie z. B. Calretinin reelin oder Neuropeptid Y (Daten nicht gezeigt). Dies ist vergleichbar mit in Vivo Schicksal Mapping Studien, die gezeigt haben, dass zwischen ~ 15-25 % der MGE abgeleitet Interneuronen nicht ausdrücklich PV oder SST23,25,31. Als Nkx2.1::mCherry+ oder Lhx6::GFP + Zellen isoliert und auf Ratte kortikalen Feeder in-vitro-plattiert, fanden wir, dass ~ 40-70 % der Lhx6::GFP + analysiert nach 28 Tagen in Kultur PV - Zellen / SST-mit einer Mehrheit von denen, die positive Fleck mit dem Ausdruck SST. Dieser Anstieg der PV- / SST-Zellen können aufgrund des Fehlens von einer extrinsischen maturational Signal, das vorhanden in Vivo, ist vor allem bei Reifen PV Ausdruck oder suboptimale elektrophysiologische Input von Feeder-Zellen der Fall sein mag. Was auch immer die Gründe sein mögen, bevorzugen wir Zellen in Neugeborenen Neokortex Schicksal Analyse eher als in-vitro- Differenzierung zu verpflanzen.
Für die meisten Transplantation Experimente empfehlen wir schwimmend auf DD0 ein Minimum von zwei 10-cm-anhaftende Gewebekultur Gerichte jedes enthaltenden 7,5 x 105 mESCs in 10 mL N2/KSR (7,5 x 104 Zellen/mL, 20 mL Gesamtvolumen). Zusammen, erbringt beide Platten in der Regel 8-12 x 106 Zellen nach EB Dissoziation auf DD3, davon 5,4 x, die 106 Zellen verwendet werden, um zwei behandelt 6-Well-Zellkultur-Platten (50.000 Zellen/cm2; ca. 110 cm2 insgesamt) Samen. Durch DD8 ergibt jede 6-Well-Platte ca. 5-7 x 107 Zellen, die dann verwendet werden, um eine zusätzliche drei bis fünf 6-Well-Platten bei einer Dichte von 250.000 Zellen/cm2 (erfordert insgesamt 4,05 x 107 Zellen bei drei 6-Well seed Platten oder 6,75 x 107 Zellen bei fünf 6-Well-Platten). Von DD14 erbringt jeder 6-Well-Platte in der Regel 1-2,5 x 106 mCherry oder GFP exprimierenden Zellen. Je nach den Bedürfnissen des Experiments haben wir ein Minimum von 7,5 x 105 mESCs für kleine immunhistochemische Analysen zu aufwärts von 6 x 106 mESCs für große Transplantation Projekte schwebte.
Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind die mESCs in einen pluripotenten Zustand vor Beginn Differenzierung und der Landung/Dissoziation Schritt auf DD3 beibehalten. Wenn die Zellen richtig beibehalten wurden und die Landung/Dissoziation auf DD3 sorgfältig erfolgt, wird die Differenzierung in der Regel erfolgreich sein. Nur Stammzellen, die gesund erscheinen und sollte für die Differenzierung verwendet werden. Wenn EBs nicht bilden zwischen DD0-3 oder mehrere bilden, dürfte kleine, asymmetrische Körper, die Differenzierung nicht erfolgreich sein. Darüber hinaus sollte bei EB Dissoziation auf DD3, die EB bis nicht mehr sichtbar vom Auge über längere Zeit zu nicht-Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Regent zu vermeiden überwacht werden.
In diesem Whitepaper vorgestellten Ergebnisse wurden unter optimierten Bedingungen mit qualitätsgeprüften Reagenzien. Dies ist wichtig zu beachten, da wir gelegentlich haben Schwierigkeit, robuste Nkx2.1 Induktion erzielen und durch Verlängerung, mCherry und GFP Reporter Ausdruck. Basierend auf unserer Erfahrung, unseres Erachtens, dass viel zu viel Variabilität der FBS am ehesten Konten für diese Änderungen. Als solches ist es ratsam, die verschiedene Partien FBS zu bestimmen, welche am besten funktionieren, für die Aufrechterhaltung der mESCs zu testen. Obwohl wir nicht das 2i/LIF-System (serumfreien Medium mit der MEK-Inhibitor PD03259010 und GSK-3α/β-Inhibitor CHIR99021) verwendet haben, ist es möglich, dass serumfreien mESC Bedingungen konsistentere Ergebnisse produzieren können. Wir haben jedoch nicht, diese Hypothese getestet und haben keine Daten, ob die Verwendung von mESC serumfreie Medien die Differenzierung des mESCs in MGE-ähnlichen Vorfahren betrifft. Darüber hinaus achten Sie darauf, frische Wachstumsfaktoren wenn möglich durch Aliquotierung verwenden Sie für den einmaligen Gebrauch. Abhängig von der Benutzer müssen möglicherweise Zelldichten erhöht werden, um ausreichende Zelle überleben, vor allem bei der Landung auf DD3 zu erreichen.
Interneuronen haben die bemerkenswerte Fähigkeit zu überleben, Migration und Integration in die Host-Schaltung nach Transplantation. So dieses Protokoll kann zur Transplantation Interneuron Vorstufen in epileptischen Mausmodellen und andere Modelle der neurologische und neuropsychiatrische Krankheit (siehe Southwell Et Al. 32 und Tyson und Anderson33 Bewertungen von Interneuron Zelle basierte Therapien). Zum Beispiel in einer aktuellen Studie Donegan Et al. 34 bereichert Populationen von PV und SST CIns für Transplantationen in einem Mausmodell der Schizophrenie. Sie fanden heraus, dass PV und SST Transplantationen produziert unterschiedliche Auswirkungen auf Verhalten der Maus, angereichert mit PV bereichert Populationen Normalisierung der Schizophrenie Endophenotypen, die sie studierten.
In den letzten Jahren hat das PiggyBac Transposon System eingesetzt, um stabile Expression von transgenen in einer Anzahl von Systemen zu erreichen. Wir haben dieses System verwendet, um schnell und einfach erstellen stabil Doxycyclin-induzierbaren MiRNA Konstrukte zur Untersuchung der Rolle von bestimmten Genen während Interneuron Entwicklung zum Ausdruck zu bringen. Wir sind auch mit dieser Technologie dual Reporter mESC Linien erstellen, die Channelrhodopsin-2 (ChR2), Optogenetically express Laufwerk mESC abgeleitet Interneuronen oder DREADD-Rezeptor-Technologie zu aktivieren oder deaktivieren transplantierten Zellen massenhaft.

Bei Mäusen und Menschen, rund die Hälfte aller kortikalen hemmenden Interneuronen (CIns) stammen im Rahmen einer vorübergehenden subkortikale Struktur bekannt als mediale ganglionic Eminenz (MGE), wo neuroepithelialer Vorfahren der CIns und anderen neuronalen und Gliazellen Untergruppen Ausdrücken der Transkriptionsfaktor Nkx2.11,2. CIn Untergruppen oder Subtypen sind durch sich überschneidende morphologische, neurochemische, elektrophysiologische und Konnektivität Merkmale3,4definiert. MGE-abgeleitete CIns in gruppiert werden können meist nicht überlappende Untergruppen basierend auf ihren Ausdruck der PV oder SST, der Ausdruck der welche korreliert mit bestimmten elektrophysiologische und Konnektivität Tendenzen5. Dysfunktion von Interneuronen, insbesondere in der PV-Untergruppe hat in mehreren-neuropsychiatrischen Störungen und Krankheiten6,7verwickelt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, mitotischen Vorläuferzellen Stammzellen abgeleitet und wandernden Vorstufen für PV oder SST CIn Schicksal für kortikale Interneuron Biologie zu studieren und für den Einsatz in zellbasierten Therapien angereichert zu produzieren.
Wir haben eine skalierbare und hocheffiziente Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen von mESCs entwickelt. Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Zeile8, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6 exprimierenden Post-mitotischen Nachkommen über FACS isoliert und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet werden können. Durch die Manipulation einer Anzahl der Signalwege, Dauer der Kultur und Modus der Neurogenese, erhalten wir Millionen von Eindringmittel beschrifteten Interneuron Vorstufen für eine Vielzahl von downstream-Anwendungen geeignet.
Obwohl einige andere Methoden gibt es zur Erzeugung von MGE-ähnlichen Vorfahren aus mESCs9,10,11,12,13,14, unsere Methode, die stützt sich auf die Wnt Antagonist XAV-939 ist besonders effizient zu generieren Foxg1/Nkx2.1 Co Teleenzephalischer Vorfahren zum Ausdruck zu bringen. Stark erhöht die Fähigkeit, für Interneuron Stammväter oder Post-mitotischen Lhx6 exprimierenden Nachkommen über unser dual Reporter-System wählen die Fähigkeit, verschiedene Vorfahren und deren Nachkommen zu erzeugen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Corning 352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M)</td>
			<td>MTI-Globalstem</td>
			<td>GSC-6101G</td>
			<td>1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>Ant-pm-2</td>
			<td>Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement-B</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7156</td>
			<td>Do not filter with base media -- add after filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td>Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone FBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82013-578</td>
			<td>Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated dish (10cm)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-adherent sterile petri dish (10cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor (mLIF)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Do not freeze, store at 4&#39;C. References: 9,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin Solution</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC PCS-999-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 RNase-Free DNase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN-193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Resuspend in DMSO and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0046</td>
			<td>Resuspend in DMSO and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhFGF-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIGF-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>291-G1</td>
			<td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Resuspend in DMSO and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist (SAG)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>566660-1MG</td>
			<td>Resuspend in H20 and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rm Sonic Hedgehog/SHH</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>464-SH-025</td>
			<td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#950; Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>539624</td>
			<td>Resuspend in H20 and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse embryonic stem cells into cortical interneuron precursors

Kortikale GABAergen Interneuronen sind eine heterogene Bevölkerung der Zellen, die kritische Rollen bei der Regelung des Ausgang des exzitatorischen pyramidale Neuronen sowie synchronisieren die Ausgänge der pyramidalen Neuron Ensembles spielen. Defizite im Interneuron Funktion haben in einer Vielzahl von neuropsychiatrischen Störungen wie Schizophrenie, Autismus und Epilepsie verwickelt. Die Ableitung der kortikale Interneurone aus embryonalen Stammzellen nicht nur für das Studium ihrer Entwicklung und Funktion ermöglicht, sondern bietet einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Pathogenese der kortikalen Interneuron-Erkrankungen. Interneuronen haben auch die bemerkenswerte Fähigkeit, überleben, Migration und Integration in Host kortikalen Schaltung nach Transplantation, so dass sie ideale Kandidaten für den Einsatz in zellbasierten Therapien. Hier präsentieren wir Ihnen eine skalierbare, hocheffiziente, modifizierte Embryoid Körper-Monolayer-Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs). Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Linie, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6-mit dem Ausdruck nach dem mitotischen Nachkommen isoliert über Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet. Wir bieten auch Methoden bereichern Parvalbumin (PV) oder Somatostatin (SST) Interneuron Untergruppen, die für das Studium Aspekte des Schicksal Bestimmung oder für den Einsatz in therapeutischen Anwendungen möglicherweise hilfreich, die von Interneuron Untergruppe angereicherte profitieren würde Transplantationen.

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Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-cortical-interneuron

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.3K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Serie: Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

Ultraschall-gesteuerte Mikroinjektion in der Maus Vorderhirnneuronen In Utero In E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Forschung

Neurowissenschaften

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

Wachstum und Differenzierung von adulten Hippocampus Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the demyelinating disease Multiple Sclerosis (MS). We have shown that transplantation of NSCs into the spinal cords of sick mice results in a significant improvement in both remyelination and in clinical outcome. Cell replacement therapies for the treatment of chronic neurologic diseases are now a reality and in vivo models are vital in understanding the interactions between the engrafted cells and host tissue microenvironment. This presentation provides an adapted method for transplanting cells into the spinal cord of JHMV-infected mice. In brief, we provide a procedure for i) preparation of NSCs prior to transplant, ii) pre-operative care of mice, iii) exposure of the spinal cord via laminectomy, iv) stereotactic injection of NSCs, and iv) post-operative care.

The transplantation of mouse neural stem cells (NSCs) into the spinal cords of mice with established demyelination is detailed. The preparation of NSCs, the laminectomy of thoracic vertebra 9 (T9), and transplantation of NSCs is outlined along with the pre- and post-operative care of the mice.

Chirurgische Transplantation von Maus Neural Stem Cells in den Rückenmark von Mäusen mit neurotropen Maus Hepatitis Virus infiziert

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.