Wir möchten danken Dr. Arnulfo Mendoza in der PuMA-Technik geschult. Darüber hinaus möchten wir DRS. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) und Sam Aparicio (BC Cancer Agency) für die Nutzung von ihren Mikroskopen im Laufe dieser Studie anerkennen. Diese Forschung wurde von Intramural Research Program des National Institutes of Health, Center for Cancer Research, Pädiatrische Onkologie-Zweig (teilweise) unterstützt. M.M.L. vom nationalen Instituten der Gesundheit intramuralen Besuch Fellow Programm (Award 15335) unterstützt wurde und wird derzeit von einem Joan-Parker-Stipendium in Metastasen Forschung unterstützt. P.H.S. wird von der British Columbia Cancer Foundation unterstützt.

Alle tierischen Protokolle aus denen Bilddaten stammen wurden mit Genehmigung der Animal Care und Use Committee des National Cancer Institute, National Institutes of Health durchgeführt. Alle tierischen Protokolle diskutiert und dargestellt in dem Artikel video wurden von der University of British Columbia Animal Care Ausschuss genehmigt.
1. Vorbereitung der Tumorzellen für Einspritzung und Materialien für das PuMA-Modell
Hinweis: Die Menge der Lösungen und Zellen werden genug für 1 Maus. Skalieren Sie nach Bedarf, wenn mehr Mäuse in der Studie verwendet werden. Medien-Rezepte finden Sie in Tabelle 1 und Tabelle 2.
<ol><li>Wärmen Sie 5 mL A-Media in einem 15 mL konische Rohr in ein Wasserbad 37 oC vor.</li>
	<li>Die 1,2 % niedrig schmelzende Agarose Lösung (in sterilem Wasser) unter Verwendung der Lab-Mikrowelle zu schmelzen.</li>
	<li>5 mL flüssige Agarose in ein 15 mL konische Röhrchen zu übertragen, und in einem 37 oC Wasserbad warm halten. Sicherstellen Sie, dass die geschmolzene Agarose 37 oC und Flüssigkeit vor der Lunge Insufflation Schritt ist.</li>
	<li>Pre-chill 30 mL der Zellkultur Klasse PBS mit 1 X Pen/Strep in einem Eiskübel ergänzt.</li>
	<li>Pre-Einweichen Sie in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte einen Gelatine-Schwamm in 1,5 mL B-Medien. Der Schwamm wird der Support für Anker für die Lunge-Scheiben sein.</li>
	<li>Sicherzustellen, dass die OS-Zellen sind etwa 70-90 % konfluierende am Tag des Verfahrens. Verwenden Sie keine Zellen, die übermäßige Zusammenfluss oder wenn das Medium Orange ist bis gelb, da die Zellen in der Regel betont sind und haben zu diesem Zeitpunkt Lebensfähigkeit vermindert. Für das Osteosarkom-Zell-Linien, MNNG und HOS, wird 5 x 105 in einem Volumen von 100 μl zu injizieren in die Vene Tail 1 Maus verwendet werden. Gehobene entsprechend, wenn mehr Mäuse für die Studie verwendet werden.</li>
	<li>Ernten Sie die Tumorzellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA (3 mL für ein T75-Fläschchen oder 2 mL in einer Kulturschale 10 cm). Wenn Zellen beginnen die Platte abheben, neutralisieren Sie die Trypsin-EDTA mit kompletten Medien. Spin-down Zellen und einmal mit Zellkultur Grade PBS abspülen. Aufschwemmen Sie Pellet in 5 mL PBS.</li>
	<li>Führen Sie eine Zellzahl von Standardmethoden. Es ist am besten, um mehr Zellsuspension als was tatsächlich benötigt wird, da Verlust der Zellsuspension oft während der Nadel erarbeiten tritt und Injektion Versuche scheiterten.</li>
	<li>Führen Sie einen Trypan blau-Ausschluss-Assay auf einer Stichprobe von der Zellsuspension auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen. Gehen Sie nur dann, wenn die Zelle 90 % Rentabilität zeigen oder höher.</li>
	<li>5 x 105 Zellen in einem Volumen von 100 μl zu injizieren. Um ein Übermaß an 2 X dieses Betrags vorzubereiten, sollte 1 x 106 Zellen nach unten gedreht und Nukleinsäuretablette in 0,2 mL HBSS.</li>
	<li>Stelle die Zellsuspension in einem Eiskübel während du die Mäuse für die Injektion.</li>
</ol>(2) tail Vene Einspritzen und Lunge Insufflation
Hinweis: Die Menge der Lösungen und Zellen in diesem Abschnitt werden genug für 1 Maus. Skalieren Sie nach Bedarf, wenn mehr Mäuse in der Studie verwendet werden. Eine Liste von Geräten, Materialien und chirurgische Instrumente verwendet, die in den folgenden Schritten finden Sie in Tabelle 3 und Tabelle 4.
<ol><li>Wärmen Sie eine weibliche Maus (Alter 6-8 Wochen) unter eine Wärmelampe für 5 min um ihre Rute Vene deutlicher ersichtlich zu machen. Verwenden Sie für murine K7M2 oder K12 Zellen Balb/c Mäuse. Verwenden Sie für menschliche MG63.3, MG63, MNNG und HOS Zellen Severe Combined Immunodeficiency Mäuse.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass die Zellsuspension einheitlich ist, durch das Rohr vorsichtig schütteln. Erarbeiten Sie sorgfältig die Zellsuspension in 1 mL Spritze ohne Nadel. Kappe der Spritze mit einer 27 gauge Nadel. Stellen Sie sicher, dass die Nadel Abschrägung auf der gleichen Seite wie die Volumen-Markierungen auf der Nadel ist.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in die Restrainer, und wischen Sie die Rute mit einem Alkohol abwischen.</li>
	<li>Gehen Sie zum Durchführen einer Rute Vene Injektion und injizieren die 100 μL der Zellsuspension. 5 min nach der Injektion, platzieren Sie den Mauszeiger in einer CO-2 -Kammer und der Euthanasie Standardarbeitsanweisung (als Umriss Ihres institutionellen Tierpflege-Ausschusses) beginnen. Zervikale Dislokation sollte nicht als Mittel zur Sterbehilfe verwendet werden, da das Verfahren die Luftröhre beschädigt wird.</li>
	<li>Sobald die Maus eingeschläfert ist, beginnen Sie die Vorbereitung der Laminar-Flow-Haube für Insufflation der Maus-Lunge mit der Agarose/A-Media-Lösung. Innerhalb der Laminar-Flow-Haube einen Arbeitsbereich mit Ihrem sterilen Pad eingerichtet. Auf diese Unterlage platzieren Sie Ihre sterilisierte Instrumente, IV Katheter IV Erweiterungssatz und Schwerkraft Perfusion Apparat (siehe ergänzende Abbildung1).</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger im dorsalen Recumbancy. Sezieren Sie mit sterilen kleine Schere sorgfältig aus dem Brustbein, die Brusthöhle verfügbar zu machen. Achten Sie darauf, nicht die Lunge punktieren, da eine Agarose/A-Media-Lösung verwendet wird, um die Lunge zu insufflieren.</li>
	<li>Wenn aus dem Brustbein zu sezieren, zerlegen Sie vorbei an den thorakalen Einlass auf beiden Seiten der Luftröhre. Setzen Sie die Luftröhre durch sezieren entfernt das umliegende Weichgewebe.</li>
	<li>Cannulate der Luftröhre mit einem 20 Gauge-IV-Katheter. Verknoten Sie locker chirurgische Verwendung steril Darmsaite Naht um die kanülierte Luftröhre.</li>
	<li>Legen Sie ein IV Erweiterungssatz von katheterisiert Luftröhre zu 10 mL Spritze der Schwerkraft Perfusion Vorrichtung.</li>
	<li>Kombinieren Sie die vorgewärmte 37 oC Agarose (5 mL) und A-Media (5 mL) in ein 1:1-Gemisch. Gießen Sie die flüssige Agarose/A-Media-Lösung in 10 mL Spritze von der Schwerkraft Perfusion Gerät. Sicherzustellen Sie vor Insufflation der Lungen mit Agarose/A-Media-Lösung, dass die gesamte Länge der Erweiterungssatz mit Agarose/A-Media, damit unbeabsichtigte Insufflation von Proben der Lunge mit Luft zu negieren grundiert worden ist.</li>
	<li>Füllen Sie die Lunge die Agarose/A-Media-Lösung, bis die Lunge voll insuffliert wird.</li>
	<li>Sobald die Lunge voll insuffliert, entfernen der Kanüle und fest binden Sie den chirurgischen Knoten Auslaufen der Agarase/A-Media-Lösung durch die Luftröhre zu verhindern.</li>
	<li>Fahren Sie mit der zupfen (Luftröhre, Herz und Lunge) aus der Brusthöhle zu sezieren. Achten Sie darauf, keine Punktion oder die Oberfläche der Lunge schädigen.</li>
	<li>Ort der zupfen (in keine bestimmte Ausrichtung) in die vorgekühlt 30 mL PBS mit 1 X Pen/Strep ergänzt und ermöglichen die Agarose/A-Media für 20 min zu festigen.</li>
	<li>Verwendung von feinen Scheren und Pinzetten, Schneide kleine Stücke der Lunge (3 x 1,5 mm), wie in Figur 1Agezeigt. Kleinere Lunge Scheiben können leicht mit einem 2,5 X Objektiv abgebildet werden. Mehrere Scheiben ist in der Regel 4 bis 10 Scheiben pro Gruppe pro Versuchsbedingung, kürzbar. Hinweis: Für jede Versuchsgruppe, legen Sie die Lunge Scheiben in einen separaten Brunnen (6-Well-Platte) mit einem 2 x 2 cm Gelatine Schwamm eingeweicht in B-Medien. Die Anzahl der Medien pro Bohrloch sollte 1,5 mL betragen. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Für Medikamentenstudien ist die Häufigkeit der Wechsel der Medien/Droge Benutzer bestimmt.</li>
</ol>(3) Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung Lung Slices und Analyse
Hinweis: Für Weitfeld Fluoreszenz sind bildgebende, kleinere Scheiben (3 x 1,5 x 1 mm) geschnitten um die Lunge Abschnitt in 1 Bild mit einem 2,5 X Objektiv passen.
Bildaufnahme auf dem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop:
<ol><li>Lunge-Scheiben werden in der Regel bei 0, 3, 7 und 14 Tage nach der Injektion abgebildet. In der sterilen Umgebung des biologischen Kabinetts sorgfältig übertragen die Lunge Scheiben aus der Gelatine Runde Schwämme zu einem sterilen 35 mm Glasboden Schale. Achten Sie darauf, aus die überschüssige Flüssigkeit aus der Lunge Slice Tupfen, da die überschüssige Flüssigkeit als ein Spiegel fungiert und fluoreszierendes Licht aus der Tumorzellen zu reflektieren.</li>
	<li>Ordnen Sie die Lunge Scheiben in ähnlicher Weise dargestellt in Abbildung 1A. Jede Spalte würde eine andere experimentelle Erkrankung darstellen. Achten Sie darauf, nicht Kreuz-die Lungen mit der Pinzette verunreinigen. Mit 70 % Ethanol spülen und trocknen vor dem Umgang mit Lunge Scheiben aus einer anderen experimentellen Gruppe.</li>
	<li>Optimieren der bildgebenden Parameter (dh. Gain, Offset, Belichtung Zeit, binning), bietet den besten Kontrast zwischen der fluoreszierenden Tumorzellen und Hintergrund Lungengewebe im Steuerelement (Fahrzeug unbehandelt) Gruppe. Verwenden Sie die gleichen Parameter aus der Kontrollgruppe zu die experimentellen Gruppen Bild. Speichern Sie als TIFF-Bildformat.</li>
	<li>Zu Referenzzwecken eine Skala nehmen Sie ein digitales Foto von einem Mikrometer auf das gleiche Ziel.</li>
	<li>Da Lunge Auto-Fluoreszenz im Laufe der Zeit ändert, müssen die bildgebenden Parameter jeder bildgebenden Sitzung zu den Lungen Kontrolle angepasst werden. Die bildgebende Parameter für eine Sitzung unbedingt nicht optimal für nachfolgende bildgebende Sitzungen.</li>
</ol>Bildanalyse: Hinweis: Die folgenden Bild-Bearbeitungsschritte erfolgen mit ImageJ 1,51 h Software Paket 17.
<ol><li>Öffnen Sie eine Bilddatei in ImageJ (Abb. 3A).</li>
	<li>Subtrahieren Sie Hintergrund: Prozess > subtrahieren Hintergrund > Rolling Ball Radius (Start mit 50 Pixel), deaktivieren Sie die Option "Licht Hintergrund" (Abb. 3 b).</li>
	<li>Bild 8-Bit-Format zu konvertieren: Bild > Art > 8 - Bit (Abbildung 3).</li>
	<li>Einheiten auf Pixel festgelegt: Bild > Enter "Pixel" Längeneinheit, geben Sie 1 in "Pixelbreite", "Pixelhöhe", "Voxel Tiefe". Aktivieren Sie die Kontrollkästchen "Global" auf nachfolgende Bilder anwenden.</li>
	<li>Mit dem Polygon-Auswahl-Werkzeug, skizzieren Sie die Form des gesamten Lung Slices und ermitteln Sie Bereich (Pixel2) des gesamten Lunge Slice. Dieser Wert wird verwendet werden, um die prozentuale Tumorlast der Lunge zu berechnen.</li>
	<li>Schwelle Bild: Bild > anpassen > Schwellenwert > Markieren Sie "Standard" und "B & W" > verwenden Sie den Schieberegler Schwelle das Bild so, dass die Mehrheit der Tumorzellen genau hervorgehoben werden. "Apply" drücken führt zu einer schwarz / weiß Bild, wo die Lunge ist ganz schwarz, und die fluoreszierenden Läsionen sind weiß (Abbildung 3D). Ein zweites Drücken der "Übernehmen" wird das Bild invertieren, wo alle fluoreszierende Strukturen jetzt schwarze Formen (Abbildung 3E sind).</li>
	<li>Quantifizierung von der Anzahl und Form der Läsionen: Analysieren > Messungen festlegen > "Area" zu überprüfen. Deaktivieren Sie alle anderen Kontrollkästchen. Analysieren Sie Partikel > Größe (Pixel2): 0-unendlich repräsentiert den Bereich der Formen, die ImageJ auflisten wird. Bestimmen Sie empirisch die kleinste Läsion, die als eine einzelne Tumorzelle in Tag 0 Fahrzeugbilder gilt. Verwenden Sie den Bereich von diesem einzelnen Tumorzelle als untere Grenze für die restlichen Bilder im Dataset. Für die Arbeit in diesem Papier präsentiert ist 11 Pixel2 als untere Grenze festgelegt. Für die Arbeit in der video-Beispiel vorgestellt ist 24 Pixel2 als untere Grenze festgelegt. Lassen Sie "Rundheit" Palette als 0-1. "Show" auf eingestellt werden "Nichts". Alternativ, wenn "Show" und "Umrisse" ausgewählt ist, wird eine Zeichnung von allen Formkonturen generiert. Suchen Sie ein separates Fenster Messungen Pop-up "Ergebnisse anzeigen". Optional sparen mit "Add to Manager" Kontrollkästchen aktiviert alle Shapes, die quantifiziert mit einem ROI-Manager, die für die spätere Verwendung gespeichert werden können. Nach dem "OK" drücken, erscheint ein Fenster "Ergebnisse" mit allen aufgezählten Formen und Flächenmaße (Abbildung 3F).</li>
	<li>Kopieren und Einfügen der Daten aus dem Fenster "Ergebnisse" in eine Tabellenkalkulation. Verwenden Sie die mathematische Summe-Funktion in Excel fassen wir alle Bereiche der metastatischen Läsionen für diesen bestimmten Lunge-Slice. Um die Tumorlast Prozent Lunge Lunge Slice zu bewerten, teilen Sie die Summe der Flächen der metastatischen Läsionen durch die Gesamtfläche des Lung Slices. Dieser Parameter ist auch bekannt als Bereich Bruchteil (einA) die beschrieben wird durch Underwood 18weiter. Lunge Tumorlast = Summe der metastatischen Läsion Bereiche/Gesamt Fläche von Lung Slice</li>
	<li>Berechnen Sie die Lunge Tumorlast für den Rest der Lunge Abschnitte in Kontrollgruppe und verbleibenden Gruppen. Zeichnen Sie die durchschnittliche Lunge Tumorlast pro Gruppe in 0, 3, 7 und 14 Tagen. Vertreter Weitfeld fluoreszierende Bilder hoch und niedrig metastasierendem menschlicher OS Zellen wachsen in das PuMA-Modell zu progressive Zeitpunkten werden (Abb. 4A) angezeigt. Ein Liniendiagramm zeigt die Falte-Änderung (normiert auf Tag 0) in Prozent metastasierendem Tumorlast im Laufe der Zeit ist (Abbildung 4 b) gezeigt.</li>
</ol>4. konfokale Fluoreszenz-Bildgebung des PuMA-Modells
Hinweis: Für die konfokale Bildgebung ist Gewebe Verarbeitung ähnlich wie im vorherigen Abschnitt außer dass größere Lunge Scheiben (komplette Querschnitte, 1-2 mm dick) geschnitten werden, um für mehr ROIs, abgebildet werden können.
Kennzeichnung des Lungenparenchyms mit DAR4M:
<ol><li>Tauchen Sie Lunge Scheiben in 10 μμM DAR4M (in HBSS) für 45 min bei 37 ° C. DAR4M Etiketten reaktivem Stickstoff-Spezies innerhalb der Zellen der Lunge.</li>
	<li>Spülen Sie nach 45 min Inkubation die Lunge Scheiben mit frischen HBSS.</li>
	<li>Legen Sie die Lunge Scheibe in einem 35 mm-Glasboden Runde Schüssel und Bild auf das konfokale Mikroskop.</li>
	<li>Die bildgebende Parameter für die Beispielbilder, die in Abbildung 5 dargestellten sind in Tabelle 5aufgeführt.</li>
	<li>Erwerben Sie einen Z-Stapel für eine Region von Interesse. Verwenden Sie die empfohlene Z Scheibendicke für Nyquist Sampling. In Movie 1 und ergänzende Film 1kostenfrei ein repräsentativen Film eines 3D Stacks zeigt grüne fluoreszierende OS Zellen im Lungengewebe DAR4M beschriftet.</li>
</ol>Für die konfokale Beispielbilder in Abbildung 5gezeigt war die bildgebende Session terminal. Wenn längs Bildgebung erforderlich ist, wird die Verwendung eines 2-Photonen oder Multi-Photonen ausgestattete konfokale LSM Mikroskops für die Bildgebung empfohlen, da gibt es weniger lichtbedingten lebenden Gewebe19,20. Bildgebung Mito-RFP mit dem Ausdruck ihrer MG63 Zellen in das PuMA-Modell:
<ol><li>Führen Sie das PuMA-Protokoll als Gliederung in Schritt 1 und 2 mit MG63 Zellen mit dem Ausdruck der Mito-RFP-Konstrukt.</li>
	<li>Legen Sie die Lunge Scheibe in einem 35 mm-Glasboden Runde Schüssel und Bild auf das konfokale Mikroskop.</li>
	<li>Die bildgebende Parameter für die in Abbildung 6 gezeigten Beispielbilder sind in Tabelle 6aufgeführt. Einen repräsentativen Film eines 3D Stacks grüne fluoreszierende OS Zellen mit rot fluoreszierende Mitochondrien erfolgt in Movie 2 und zusätzliche Movie 2zeigen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die folgende technischen Artikel beschreibt einige praktische Aspekte des Modells bei der Untersuchung der Lunge Kolonisation in OS PuMA. Im folgenden: einige wichtige Schritte in das Protokoll, wo Forscher besonders vorsichtig nehmen sollte
(a) Kanülierung der Luftröhre. Die Luftröhre kann leicht beschädigt werden, während sie sezieren die umliegenden Muskeln und Bindegewebe. Darüber hinaus kann die Nadel des Katheters leicht durch die Luftröhre gedrückt werden. Achten Sie besonders a...

Bessere Ergebnisse für pädiatrische Patienten mit metastasierendem Osteosarkom (OS) bleibt noch ein kritischer ungedeckten klinischen Bedarf 1. Dies unterstreicht die Bedeutung der Entwicklung neuer molekular zielgerichtete Therapien. Herkömmliche Chemotherapeutika, die Ziel-Tumor-Zell-Proliferation haben nicht als wirksam erwiesen bei der Behandlung von Metastasen und damit neue Strategien muss der metastatischen Prozess selbst 2ausgerichtet. Der aktuelle Artikel beschreibt die praktischen Aspekte der eine relativ neue Art von ex Vivo Lunge Metastasen Modell, entwickelt von Mendoza und Kollegen3, wonach ein nützliches Werkzeug bei der Entdeckung neuer pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) molekularen Treiber in der Lunge Metastasen Progression in OS 4,5. Bevor Sie fortfahren, es wäre klug, kurz auf einige aktuelle Modelle von Metastasen zu berühren, und wie das PuMA-Modell bietet mehrere Vorteile gegenüber konventionellen in-vitro- Tests.
Die meisten experimentelle Modellen genutzt, um Metastasen zu untersuchen umfassen in Vitro und in Vivo -Systeme, die entweder einem bestimmten Schritt oder mehrere Stufen der metastatischen Kaskade zu rekapitulieren. Diese Schritte umfassen: (1) die Migration vom Primärtumor, 2) Intravasation in nahe gelegenen Gefäße (Blut- oder Lymphgefäße) und Transitländern im Umlauf, Tumorzellen (3) verhaften am sekundären Standort, 4) Extravasation und Überleben am sekundären Standort, Bildung (5) Fixierungsprotokoll, und 6) Wachstum in vaskularisierte Metastasen (Abbildung 1). In-vitro- Modelle von Metastasen können 2-dimensionale (2D) Migration und 3-dimensionale (3D) Matrigel Invasion Assays, die in überprüft werden ausführlich an anderer Stelle 6. Für in-Vivo -Modelle, die zwei häufig verwendete Modellsysteme umfassen: 1) das spontane Metastasierung Modell ist wo ein Tumor-Zellen sind Orthotopically, die in einem bestimmten Gewebetyp einen lokalen Tumor bilden, die spontan metastasierende Zellen wirft injiziert an entfernten Standorten; (2) die experimentelle Metastasierung Modell ist wo Tumorzellen in das Blutgefäß stromaufwärts von dem Zielorgan injiziert werden. Zum Beispiel eine Rute Vene Injektion von Tumor-Zellen-Ergebnisse in der Entwicklung Lunge Metastasen5,7,8. Andere experimentelle Metastasen-Modelle verfügen über Injektion von Tumorzellen in die Milz oder mesenterialen Vene führt zu die Entwicklung von Lebermetastasen9,10. Praktische Erwägungen dieser in-Vivo -Modelle werden von Welch 11ausführlich erörtert. Ein weiteres in-Vivo -Modell zur Untersuchung von Metastasen in den pädiatrischen Sarkome ist der Nieren Nieren subkapsuläre Tumor Implantation Modell ergibt sich lokale Tumorbildung und spontane Metastasen in der Lunge 12,13. Eine technisch anspruchsvolle Technik wie intravitalen Videomicroscopy können direkt sichtbar zu machen, in Echtzeit, Wechselwirkungen zwischen metastatischen Krebszellen und den Microvasculature einer metastatischen Website (dh. Lunge oder Leber) wie beschrieben von MacDonald14 und Entenberg15oder Krebs Zelle Extravasation in der chorioallantoic Membrane wie beschrieben durch Kim 16.
Das PuMA-Modell ist ein ex-Vivo, Lunge Gewebe Explant, geschlossenes Kultursystem wo kann das Wachstum von Tumorzellen fluoreszierende längs über Fluoreszenz-Mikroskopie über einen Zeitraum von einem Monat beobachtet werden (siehe Abb. 2A). Dieses Modell rekapituliert die Anfangsphase der Lunge Kolonisation (Schritte 3-5) in der metastasierten Kaskade. Einige große Vorteile gegenüber konventionellen in-vitro- Modellen des Modells PuMA sind: 1) Es bietet die Möglichkeit, metastasiertem Krebs Zelle Wachstum in einem 3D Mikroumgebung längs zu messen, die viele Funktionen der Lunge Mikroumgebung behält Vivo 3; (2) PuMA ermöglicht den Forscher zu beurteilen, ob der Zuschlag einer Kandidaten-gen oder Drogenmissbrauch Behandlung Anti-metastatischen Aktivitäten im Zusammenhang mit einem 3D Lunge Mikroumgebung hat; (3) das PuMA-Modell sind flexibel mit vielen Arten von Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen (Abbildung 2 b) wie Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie oder konfokale Laser-scanning-Mikroskopie, Beispiele für jede Abbildung 2 & Dzeigt, bzw.. Dieser Artikel wird erläutert, wie mithilfe der PuMA-Modell um längs Bilddaten auf metastasiertem Wachstum der erweiterten grün fluoreszierendes Protein (eGFP) zu erhalten-mit dem Ausdruck, menschliche Ebbe und metastasierendem Osteosarkom Zellen (MNNG und HOS Zellen) mit niedrig-Vergrößerung Weitfeld Fluoreszenz. Beispiele für imaging ein Fluoreszenzfarbstoff, der Lungenparenchyms Etiketten und ein rot-fluoreszierende Protein, die genetische Reporter der Mitochondrien in OS Etiketten im PuMA Modell konfokale Laser-scanning-Mikroskopie mit Zellen werden ebenfalls besprochen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Table 2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNNG-HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1547</td><td>highly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td>poorly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Amy LeBlanc Laboratory (NCI)</td><td>N/A</td><td>highly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td><td>poorly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>10X M199 media</td><td>Thermofisher</td><td>11825015</td><td>Base media for A-media and B-media</td></tr><tr><td>Distilled Water (sterilized)</td><td>Thermofisher</td><td>15230-147</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>7.5% sodium bicarbonate solution</td><td>Thermofisher</td><td>25080094</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>Hydrocortizone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>H6909</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>Retinol acetate-water soluable</td><td>Sigma-Alrich</td><td>R0635-5MG</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media, complete media.</td></tr><tr><td>Bovine insulin solution (10mg/ml)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>I0516-5ML</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Thermofisher</td><td>11965092</td><td>Base media of Complete Media</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>Component of Complete Media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermofisher</td><td>16000044</td><td>Component of Complete Media</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td>Used in cell culture.</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Thermofisher</td><td>14175095</td><td>Used to resuspend cell pellet prior to injection</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Thermofisher</td><td>25200114</td><td>Used in cell culture.</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>Used to label lung parenchyma.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table 3&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for PuMA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Upright LSM confocal microscope</td></tr><tr><td>Zeiss 780 Confocal LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Inverted LSM confocal microscope</td></tr><tr><td>SCID mice</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks</td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-9863</td><td>Used as a support for lung tissue sections.</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>Used during insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>1 ml syringe with 27 gauge needle</td><td>Fisherscientific</td><td>14-826-87</td><td>Used for tail vein injection.</td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>BD</td><td>309604</td><td>Used for insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>20 gauge catheter</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2032CA</td><td>Used during insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>Abbott IV extension set (30&quot;, Sterile)</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>Used during insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>Alcohol swabs</td><td>BD</td><td>326895</td><td>For wiping tail vein before injection</td></tr><tr><td>Sterile surgical gloves</td><td>Fisherscientific</td><td>Varies with size</td><td>Asceptic handing of mouse lungs</td></tr><tr><td>30 cm ruler</td><td>Staples</td><td></td><td>Used for insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>Support stand for ruler</td><td>Pipette.com</td><td>HS29022A</td><td>Used for insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>35 mm glass-bottomed culture dish</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Used during imaging of lung slices</td></tr><tr><td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>Used to line the sterile work area in the biological hood.</td></tr><tr><td>Catgut Plain Absorbable Suture</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td>Used to tie off cannulated trachea.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table 4&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical instruments for PuMA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors 3.5&quot; Straight Sharp/Sharp</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>For cutting lung sections</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td>For manipulating/holding lung sections.</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>For manipulating/holding lung sections.</td></tr><tr><td>Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5&quot; Length; 1.3 mm Tip Width</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>For general dissection.</td></tr><tr><td>Thumb Dressing Forceps 4.5&quot; Serrated 2.2 mm Tip Width</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>For general dissection.</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5&quot; Straight Sharp/Sharp, 20mm blade</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td>For general dissection.</td></tr><tr><td>Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4&quot; Overall Length</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>For general dissection.</td></tr></tbody></table>

practical considerations in studying metastatic lung colonization in osteosarcoma using the pulmonary metastasis assay

Pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) ist ein ex-Vivo Lunge Explant und geschlossenen Zellkultursystem, die es Forschern erlaubt, die Biologie der Lunge Besiedlung in Osteosarkom (OS) durch Fluoreszenz-Mikroskopie zu studieren. Dieser Artikel enthält eine ausführliche Beschreibung des Protokolls und erläutert, Beispiele von Bilddaten auf metastasiertem Wachstum mit Weitfeld oder konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen zu erhalten. Die Flexibilität des Modells PuMA erlaubt Forschern, nicht nur das Wachstum von OS-Zellen in der Lunge Mikroumgebung zu studieren, sondern auch die Auswirkungen der anti-metastatischen Therapeutika im Zeitverlauf zu beurteilen. Konfokale Mikroskopie ermöglicht eine noch nie da gewesenen, hochauflösende Bildgebung von OS-Zell-Interaktionen mit dem Lungenparenchym. Darüber hinaus Wenn das PuMA-Modell mit Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszierende Protein genetische Reporter kombiniert wird, können Forscher die Lunge Mikroumgebung, zellulärer und subzellulärer Strukturen und Genfunktion Promotoraktivität in metastasierenden OS Zellen untersuchen. Das PuMA-Modell bietet ein neues Tool für Osteosarkom-Forscher entdecken neue Metastasen Biologie und die Aktivität der neuartigen anti-metastatischen, gezielte Therapien zu bewerten.

Low-Vergrößerung Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie
Für Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie von PuMA Lung Slices sind repräsentative Bilder und Quantifizierung Daten in Abbildung 2und Abbildung 4A und Bdargestellt. Die metastatischen Neigungen für hohe und niedrige metastasierendem Zelllinien sind über progressive Zeitpunkten ...

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Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung des Protokolls für die pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) zur Verfügung zu stellen. Dieses Modell erlaubt Forschern, metastasierendem Osteosarkom (OS) Zellwachstum im Lungengewebe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop zu studieren.

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

practical-considerations-studying-metastatic-lung-colonization

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.0K Aufrufe.  National Institutes of Health. Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung des Protokolls für die pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) zur Verfügung zu stellen. Dieses Modell erlaubt Forschern, metastasierendem Osteosarkom (OS) Zellwachstum im Lungengewebe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop zu studieren.

Serie: Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Lung Tumor Zelle Rekrutierung Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Forschung

Krebsforschung

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Experimentelle Metastase Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Medizin

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Models von Knochenmetastasen

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These lesions compromise bone structure, increase the risk of pathologic fracture, and leave patients with limited treatment options. Primary bone tumors metastasize to distant organs, with some types capable of spreading to other skeletal sites. However, recent evidence suggests that with many solid tumors, cancer cells that have spread to bone may be the primary source of cells that ultimately metastasize to other organ systems. Most syngeneic or xenograft mouse models of primary bone tumors involve intra-osseous (orthotopic) injection of tumor cell suspensions. Some animal models of skeletal metastasis from solid tumors also depend on direct bone injection, while others attempt to recapitulate additional steps of the bone metastatic cascade by injecting cells intravascularly or into the organ of the primary tumor. However, none of these models develop bone metastasis reliably or with an incidence of 100%. In addition, direct intra-osseous injection of tumor cells has been shown to be associated with potential tumor embolization of the lung. These embolic tumor cells engraft but do not recapitulate the metastatic cascade. We reported a mouse model of osteosarcoma in which fresh or cryopreserved tumor fragments (consisting of tumor cells plus stroma) are implanted directly into the proximal tibia using a minimally invasive surgical technique. These animals developed reproducible engraftment, growth, and, over time, osteolysis and lung metastasis. This technique has the versatility to be used to model solid tumor bone metastasis and can readily employ grafts consisting of one or multiple cell types, genetically-modified cells, patient-derived xenografts, and/or labeled cells that can be tracked by optical or advanced imaging. Here, we demonstrate this technique, modeling primary bone tumors and bone metastasis using solid tumor graft implantation into bone.

Bone metastasis models do not develop metastasis uniformly or with a 100% incidence. Direct intra-osseous tumor cell injection can result in embolization of the lung. We present our technique modeling primary bone tumors and bone metastasis using solid tumor graft implantation into bone, leading to reproducible engraftment and growth.

Modellierung von primären Knochentumoren und Knochenmetastasen mit Implantation eines soliden Tumortransplantats in den Knochen

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival compared to surgery alone. To address this problem, the aim of the study is to refine a lesser-known model of OS in rats with a comprehensive histologic, imaging, biologic, implantation, and amputation surgical approach that prolongs survival. We used an immunocompetent, outbred Sprague-Dawley (SD), syngeneic rat model with implanted UMR106 OS cell line (originating from a SD rat) with orthotopic tibial tumor implants into 3-week-old male and female rats to model pediatric OS. We found that rats develop reproducible primary and metastatic pulmonary tumors, and that limb amputations at 3 weeks post implantation significantly reduce the incidence of pulmonary metastasis and prevent unexpected deaths. Histologically, the primary and metastatic OSs in rats were very similar to human OS. Using immunohistochemistry methods, the study shows that rat OS are infiltrated with macrophages and T cells. A protein expression survey of OS cells reveals that these tumors express ErbB family kinases. Since these kinases are also highly expressed in most human OSs, this rat model could be used to test ErbB pathway inhibitors for therapy.

Here, a syngeneic orthotopic implantation followed by an amputation procedure of the osteosarcoma with spontaneous pulmonary metastasis that can be used for preclinical investigation of metastasis biology and development of novel therapeutics is described.

Ein syngenes orthotopes Osteosarkom Sprague Dawley Rattenmodell mit Amputation zur Kontrolle der Metastasenrate

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival rate of osteosarcoma patients with pulmonary metastasis is less than 30%.Therefore, the utilization of mouse models mimicking the osteosarcoma development in humans is of great significance for understanding the fundamental mechanism of osteosarcoma carcinogenesis and pulmonary metastasis to develop novel therapeutics. Here, detailed procedures are reported to generate the primary osteosarcoma and pulmonary metastasis mouse models via&#160;intratibia injection of osteosarcoma cells. Combined with the bioluminescence or X-ray live imaging system, these living mouse models are utilized to monitor and quantify osteosarcoma growth and metastasis. To establish this model, a basement membrane matrix containing osteosarcoma cells was loaded in a micro-volume syringe and injected into one tibia of each athymic mouse after being anesthetized. The mice were sacrificed when the primary osteosarcoma reached the size limitation in the IACUC-approved protocol. The legs bearing osteosarcoma and the lungs with metastasis lesions were separated. These models are characterized by a short incubation period, rapid growth, severe lesions, and sensitivity in monitoring the development of primary and pulmonary metastatic lesions. Therefore, these are ideal models for exploring the functions and mechanisms of specific factors in osteosarcoma carcinogenesis and pulmonary metastasis, the tumor microenvironment, and evaluating the therapeutic efficacy in vivo.

The present protocol describes intratibia osteosarcoma cell injection to generate mouse models bearing orthotopic osteosarcoma and pulmonary metastasis lesions.

Intratibiale Osteosarkom-Zellinjektion zur Erzeugung orthotoper Osteosarkom- und Lungenmetastasen-Mausmodelle

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...