Diese Arbeit wird unterstützt von der NIH Forschung (A1R03AI120027 (RN) und 1R21AI20012 (RN)), institutionelle Research Grant (RN), Start-up zu gewähren (RN) und MD Anderson CIC Samen zu gewähren (RN).

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Texas MD Anderson Cancer Center genehmigt.
1. Vorbereitung des Peptids für den Impfstoff
<ol><li>Auflösen der gefriergetrockneten Peptid mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf die entsprechende Konzentration und Wirbel für 30 s. Hinweis: Für hgp10025–33, die Endkonzentration ist 1 mg/mL und für OVA257–264, die Endkonzentration 0,5 mg/mL. Peptid vor der Injektion zu rekonstruieren. Lagern Sie nicht nach der Rekonstitution.</li>
</ol>2. Isolierung des Splenocyten von transgenen Maus
Hinweis: Zelle isoliert aus der Milz muss auf sterile Weise durchgeführt werden.
<ol><li>
Einschläfern der OT-1 transgenen Maus mit der genehmigten CO2 Erstickung Methode und die Milz zu entfernen. Hinweis: Geeignete transgenen Maus wird in diesem Schritt spezifisch für das Peptid Wahl genutzt.<ol>
<li>Legen Sie die Maus auf der rechten Seite. Die linke Seite der Maus mit 70 % igem Ethanol (EtOH) besprühen. Ziehen Sie die Haut mit Pinzette und schneiden Sie die Haut mit einer chirurgischen Schere; die Milz ist innerhalb der Bauchhöhle sichtbar. Vorsichtig aufschneiden der Bauchhöhle um die Milz zu gelangen. Entfernen Sie die Milz mit Pinzette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disaggregieren der Milz, indem man es in einen 70 µm-Filter in einer Petrischale mit 2 mL Medium A (PBS mit 1 % fetalen bovine Serum (FBS)) und Zerschlagung der Milz mit dem Ende von einem Kolben.
	<ol>
<li>Sammeln Sie die Splenocyten aus der Petrischale und in einem 50 mL konische Röhrchen. Waschen Sie die Petrischale mit 5 mL Medium A zweimal, bis alle Zellen zu sammeln. 25 mL Medium A bis hinzu und Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur bei 475 X g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirieren Sie die Zellen und in 1 mL / pro Milz rote Blutzelle (RBC) Lysis Puffer aufzuwirbeln. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Fügen Sie 10 mL Medium A und Zentrifuge bei Raumtemperatur 475 X g. Aufschwemmen das Pellet in 10 mL Medium A und entfernen Sie Verschmutzungen durch Filterung der Zellsuspension durch einen 70 µm-Filter in einem sauberen 50 mL konisch.</li>
	<li>
Zählen der Zellen verwenden Trypan blau und ein Hemocytometer. Aufschwemmen Zellen in PBS, eine Endkonzentration von 106 - 1006 Zellen/mL. Für OVA257–töten,264 spezifische 106 Zellen/ml Aufschwemmen und für hgp100 töten,25–33 bestimmten 1006 Zellen/ml aufzuwirbeln.
	<ol>
<li>Spin die verbleibenden Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 X g. Aspirieren überstand und Aufschwemmen in 15 mL kaltem PBS, Zellen zu waschen. Wiederholen Sie der Waschschritt noch einmal. Spin die Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 X g. Aspirieren überstand und in kaltem PBS nach das Endvolumen in Schritt 2.4 ermittelten aufzuwirbeln.</li>
		<li>Übertragen Sie einzelne Zellsuspension auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und auf dem Eis bis Injektion Empfänger C57/BL6 Maus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Injektion von Splenocyten von transgenen Mäusen
<ol><li>Legen Sie Empfänger C57/BL6 Maus in eine einschränkende mit der dorsalen Seite nach oben. Sprühen Sie Injektion Schweif Grundfläche mit 70 % Isopropylalkohol. Verwalten Sie 100 µL der einzelnen Zellsuspension (Abschnitt 2) intravenös in die Rute Vene mit einer 27 G Nadel mit der abgeschrägten Seite nach oben.</li>
</ol>4. Covax Verwaltung
Hinweis: Wenn Zellen am Nachmittag injiziert werden, sollte die Covax am nächsten Morgen innerhalb von 18 Stunden Zelle Injektion verabreicht.
<ol><li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einer klaren Anästhesie-Box mit ca. 1-3 % Isofluran. Nachdem Mäuse vollständig betäubt sind, übertragen Sie die Mäuse an der Nase Kegel an den Verteiler in der Anästhesie-Kammer angebracht. Halten Sie Mäuse zurückhaltend mit der dorsalen Seite oben. Hinweis: Anesthetization wird bestätigt durch eine kurze Zehe Prise zu überprüfen, ob eine Rücknahme-Antwort nicht ausgelöst wird. Bundesgesetz schränkt Isofluran-Nutzung in der Größenordnung von einem zugelassenen Tierarzt.</li>
	<li>Sprühen Sie Injektion Schweif Grundfläche mit 70 % Isopropylalkohol. 100 µL der Peptidlösung (von Abschnitt 1) subkutan injizieren mit einer 27 G Nadel mit der Spritze, 4-5 mm in der Rute Basiszone der Nadel abgeschrägten Seite nach oben eindringt. Hinweis: Die Mäuse werden in einer Flanke mit subkutane Injektion an der Unterseite der Rute10geimpft.</li>
	<li>100 µL Anti-CD40 Antikörper (0,5 mg/mL Brühe) seitlich auf die Injektionsstelle Impfstoff zu injizieren.</li>
	<li>Imiquimod-Creme 50 mg/Maus sorgfältig auf die Impfung-Seiten anwenden Reiben Sie Imiquimod-Creme auf der Oberfläche, bis die Creme nicht mehr sichtbar ist und wird vollständig absorbiert.</li>
	<li>100 µL 100.000 IU/mL RhIL-2 Protein intraperitoneale Injektion (i.p.) an der unteren Bauchregion. Beobachten Sie Mäuse für 5 Minuten, nachdem sie vollständig aus der Narkose zu erholen. Hinweis: Experiment wird an dieser Stelle für 3 Tage angehalten.</li>
</ol>(5) Isolierung von Target Splenocyten zur Beschriftung mit CFSE
Hinweis: Zelle isoliert aus der Milz muss auf sterile Weise durchgeführt werden.
<ol><li>Einschläfern der C57BL/6 Mäusen nach genehmigten CO2 Erstickung Methode. Spleen(s) wie in Schritt 2.1.1 zu entfernen. Disaggregieren der Milz und Splenocyten wie in den Schritten 2.2.1 - 2.2.3 zu waschen. Lyse der roten Blutkörperchen wie in den Schritten 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Zellen für die Zählung mit einem Hemocytometer zu entfernen und für eine Endkonzentration von Zellen bei 106 Zellen/mL in CFSE--Kennzeichnung Lösung (in Schritt 7 beschrieben) zu berechnen. Drehen Sie die verbleibende Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 x g. Aspirat überstand.</li>
</ol>(6) Peptid Pulsieren des Target Splenocyten
Hinweis: Peptid pulsieren muss auf sterile Weise durchgeführt werden.
<ol><li>Aufschwemmen Zellen 106 Zellen/ml in komplette Medien (RPMI 1640 Medien mit 10 % FBS, 1 % L-Glutamin (L-Gln), 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)). Teilen Sie die Zellen in 2 Röhren (15 mL Conicals). Beschriften Sie jedes Rohr als gepulste oder ungepulsten.</li>
	<li>
Fügen Sie Peptid, das Rohr mit der Bezeichnung gepulst. Fügen Sie für OVA257–264 pulsieren 1 µg/mL und für hgp10025–33 pulsieren, fügen Sie 2 µg/mL. Hinweis: Die ungepulsten Zellen durchlaufen die gleichen Inkubation wie die gepulsten Zellen nur ohne den Zusatz des Peptids.<ol>
<li>Inkubieren Sie Zellen + Peptid bei 37 ° C für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 10 mL komplette Medien (RPMI 1640 Medien mit 10 % FBS, 1 % L-Glutamin (L-Gln), 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)) auf jedes Rohr zu waschen beide gepulsten und ungepulsten Zielzellen. Drehen Sie die verbleibende Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 x g. Aspirat überstand.</li>
</ol>7. Vorbereitung der CFSE zur Kennzeichnung Ziel Splenocyten
<ol><li>
Bereiten Sie CFSE--Kennzeichnung Lösung, während die Zelle im Schritt 6.3 waschen; Die gepulsten Zellen werden als CFSE-Hallo und die ungepulsten als CFSE-lobeschriftet werden. 106 Zellen 1 mL CFSE--Kennzeichnung Lösung vorbereiten. Hinweis: CFSE ist lichtempfindlich und sollte zu allen Zeiten vor Licht geschützt werden.<ol>
<li>Bereiten CFSE-Hallo -kennzeichnen Medien durch Zugabe von 1 uL/mL CFSE (5 mM Stammlösung) für eine Endkonzentration von 5 µM/mL RPMI Medien 1640 mit 2 % FBS.</li>
		<li>Bereiten CFSE-lo -kennzeichnen Medien durch Zugabe von 1 uL/mL CFSE (0,5 mM Stammlösung) für eine Endkonzentration von 0,5 µM/mL RPMI Medien 1640 mit 2 % FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Kennzeichnung der Ziel-Splenocyten mit CFSE-
Hinweis: CFSE-Kennzeichnung muss auf sterile Weise durchgeführt werden.
<ol><li>Aufschwemmen der gepulsten und ungepulsten Zielzellen (aus Schritt 6.3) bei 106 Zellen/mL CFSE--Kennzeichnung Media. Aufschwemmen der gepulsten Zellen mit vorbereiteten CFSE-Hallo-Kennzeichnung, Medien und die ungepulsten Zellen mit vorbereitet CFSE-lo-kennzeichnen Medien.</li>
	<li>Mischen Sie Zellen und CFSE--Kennzeichnung Medien durch sanfte Umkehrung oder wirbeln. Verwechseln Sie nicht durch aufschütteln. Brüten Zellen und CFSE--Kennzeichnung Medien bei 37 ° C für 15 min. Remix den Zellen alle 5 Minuten.</li>
	<li>Jede Zelle Aussetzung und Spin-Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 X g 10 mL komplette Medien hinzufügen.</li>
	<li>Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Zellen in 10 mL kaltem PBS. Spin-Zellen bei 4 ° C für 5 min bei 475 X g.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 8.4.</li>
	<li>Zählen der Zellen und Mix Peptid-gepulste CFSE-Hallo-beschriftet mit ungepulsten, CFSE-lo-Zellen im Verhältnis 1:1 für die Injektion in Empfänger Mäuse beschriftet. Halten Sie eine Aliquote von 1 x 106 gemischte Zellen für einen Flow Cytometry Basisbewertung (Abschnitt 11) zu verwenden. Hinweis: Das Endvolumen Injektionslösung ist 100 µL pro Maus. Die endgültige Zellenzahl ist 10e6 Zellen. Verlust von Volumen in der Spritze und Nadel muss Rechnung getragen werden und sollte bei 500 µL abgeschätzt werden.</li>
</ol>(9) Injektion von Zielzellen
Hinweis: Halten Sie CFSE--markierte Zellen vor Licht vor und während der Injektion so weit wie möglich geschützt.
<ol><li>Legen Sie Empfänger C57BL/6 Mäusen in eine einschränkende mit der dorsalen Seite nach oben. Sprühen Sie Injektion Schweif Grundfläche mit 70 % Isopropylalkohol. Verabreichen Sie 100 µL der einzelnen Zellsuspension intravenös mit der abgeschrägten Seite nach oben in die Rute Vene.</li>
</ol>10. erneute Isolation der Zielzellen
Hinweis: Der Zeitpunkt für diesen Schritt ist kritisch und abhängig von der CTL Zytotoxizität und die Stärke des Antigens zur Stimulation. Zur Beurteilung einer OVA257–264 gepulste Ziel zu töten müssen die Zellen geernteten 4-6 h nach der Injektion. Da CFSE--markierte Zellen Licht empfindlich, Prozess Milz im Dunkeln.
<ol><li>Die Empfänger C57BL/6 Mäusen nach der genehmigten CO2 Erstickung Methode einschläfern.</li>
	<li>Spleen(s) wie in Schritt 2.1.1 zu entfernen. Disaggregieren der Milz und Splenocyten wie in den Schritten 2.2.1 - 2.2.3 zu waschen. Lyse der roten Blutkörperchen wie in den Schritten 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie Zellen in 1 mL Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACs) Puffer (1 % BSA + PBS) für die Bewertung von Durchflusszytometrie.</li>
</ol>11. gating Logik CTL-Aktivität durch Durchflusszytometrie bestimmen
<ol><li>
Führen Sie Beurteilung der CTL-Aktivität mit einem standard Flow Cytometry Protokoll. Zellen mit der FITC-Kanal auf einem Durchflusszytometer mit 488 nm Laser für Erregung11zu erwerben.
	<ol>
<li>Tor auf live Lymphozyten mit den forward Scatter (FSC) Vs Side Scatter (SSC) Parametern. Subgate innerhalb des live Lymphozyten-Gates für die Gesamtbevölkerung CFSE--positiv. Hinweis: Die injizierten CFSE--markierten Zellen werden eine kleine Teilmenge der gesamten Lymphozyten vorhanden in der Milz bilden. Die CSFE-positiven Zellen sollte als zwei verschiedene Populationen auf der logarithmischen Skala angezeigt werden.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Histogramm-Format um zu bestimmen, den Prozentsatz der ungepulsten (linke Spitze, CFSE-lo) und gepulste (richtige Spitze, CFSE-Hallo) Bevölkerungen. Verlust der CFSE-Hallo Zellen zeigt die Antigen-spezifische CTL Aktivität.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates.">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets.">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells.">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo.">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627 (2014).</li><li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li><li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8(+)+T+cell+sequestration,+dysfunction+and+deletion.">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li><li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8++T+cells.">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li><li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects.">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li><li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy.">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells.">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während dieses Protokolls sehr einfach ist, gibt es ein paar wichtige Schritte, die sorgfältig durchgeführt werden müssen. Die Covax Grundierung nach Injektion von antigenspezifischen T-Zellen getestet ist notwendig, um jegliches Töten der gepulsten Ziele zu sehen. Es ist zwar möglich, dass die wässrige Covax Impfung eine akute entzündliche Erkrankung, für die chronischen entzündlichen Phase schafft kann anstelle der kurzlebigen wasserbasierte Formulierung mit einem langsam-Antigen Version Öl basierenden Ansatz eine bessere produzieren Ergebnis7,12.
Darüber hinaus ist die CFSE-Kennzeichnung von den Zielzellen nach Antigen pulsierende muss einheitlich für eine ideale Flow Cytometry auslesen. Die Kennzeichnung der CFSE-Hallo mit 5 µM und die CFSE-lo mit 0,5 µM erwies sich als ideal in diesem System um eine Log-Unterschied in der Bevölkerung zur Verfügung zu stellen, die leicht zu unterscheiden sein.
Dieses Protokoll ist einfach zu ändern, für die spezifische Antigen-System getestet. Erstens sollte die Konzentration des Peptids verabreicht als Bestandteil der Covax bestätigt werden. Eine einfache Möglichkeit, diese entsprechenden Konzentration zu bestimmen ist zu impfen und die Erweiterung der injizierten, Antigen-spezifische T-Zellen im Blut zu verfolgen. In diesem Fall erfordert eine schwache Antigen (hgp10025-33) doppelt soviel Peptid als eine starke Antigen (OVA257–264). Die validierten Konzentrationen, die in diesem Protokoll verwendeten wäre ein vernünftiger Ausgangspunkt zum Testen andere Antigene, basierend auf der Stärke der Stimulation. Ein Punkt der Änderung wäre einfach die Wildtyp Maus mit einem Antigen des Interesses, gefolgt von Peptid immunisieren Ziele für die Beurteilung der CTL-Funktion gepulst. Aber diese Änderung würde verlassen sich auf die Aktivierung und den Ausbau der endogenen Antigen-spezifische Antworten und das Timing der Ziel-Zelle-Übertragung würde wahrscheinlich müssen also 7-14 Tage nach der Impfung auftreten. Darüber hinaus kann das Niveau der Antigen-spezifische Tötung stark im Vergleich zu reduziert werden, die bei der Übertragung von transgenen T-Zellen beobachtet. Eine Einschränkung mit dieser Änderung ist, dass das Niveau der CTL-Antwort auf das Ziel möglicherweise zu niedrig, um erkannt zu werden.
Zusätzlich zu der Menge des Antigens für T-Zell-Grundierung erforderlich muss der Zeitpunkt für die erneute Isolation von den CFSE--markierten Zielzellen für eine bestimmte Hypothese optimiert werden. Änderungen an der T-Zelle wird getestet, die sich ergeben im Differential Tötung Fähigkeiten erfordern Anpassungen im Zeitpunkt der erneuten Isolation. Eine T-Zelle mit einer verstärkten Tötung Funktion müssen Ziele viel schneller als das Wildtyp Pendant bewertet haben. Dieses kinetische Profil sollte sorgfältig geprüft werden, ermitteln die optimale Timepoint geprüfte Hypothese anzusprechen. Im Allgemeinen fanden wir dies variiert zwischen 4 und 24 h nach Injektion von den Zielzellen.
Eine Einschränkung des Tests ist, dass die Effektorzellen nicht induzieren einen erschöpften Zustand chronisch stimuliert haben. CTL-Funktion beschränkt sich daher auf zuletzt aktivierten Effektorzellen. Es ist möglich, dass diese Methode verändert werden könnte, um Recall-Funktion von einer Speicherfähigkeit Bevölkerung oder Tötung einer chronisch aktivierten antigenspezifischen T-Zell-Untergruppe zu bewerten, die für zukünftige Anwendungen interessant sein würde.
Diese Methode der CTL-Funktion in Vivo Tests ermöglicht schnelle Erkennung von in Vivo töten, die einige der Einschränkungen für ein in-vitro- Einstellung überwindet. Ein intaktes Immunsystem ist vorhanden und die Grundierung der übertragenen T-Zellen über die Covax Methode stützt sich auf Peptid Präsentation und Co Stimulation durch endogene Antigen-präsentierenden Zellen. Im Gegensatz zu anderen in-Vivo Tests zu töten ist diese Methode keine Infektion oder das Vorhandensein eines Tumors Ziels erforderlich. Jedoch der Zusatz eines Tumor-Ziels böte eine zusätzliche Komparator und der Test vor der Injektion von antigenspezifischen T-Zellen und Covax Verwaltung für zukünftige Anwendungen dieser Methode hinzugefügt werden.

Mehrere Protokolle gibt es zur Beurteilung der Zytolyse (CTL) Potenzials eine CD8+ oder CD4+ T-Zellen. Diese Einschätzung kann ohne weiteres in Vitro unter kontrollierten Bedingungen1,2,3erfolgen. Darüber hinaus haben Infektionskrankheit Modelle, wie z. B. LCM, CTL-Funktion durch den Einsatz von differentiell CFSE-(5-(and 6)-Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester) mit der Bezeichnung Zielzellen klassisch geprüft wo die CFSE-Hallo-markierte Zellen sind gepulst mit einem Peptid und CFSE-lo-ungepulsten beschrifteten Ziel Zellen sind links. Die Zellen sind dann im Verhältnis 1:1 gespritzt und bewertet für den Verlust von den CFSE-Hallo-gepulste Ziele von Flow Cytometry4beschriftet. Impfstoff und Ablehnung Modelle haben auch ähnliche Strategien zur Beurteilung der in Vivo zu töten, indem beide CD8 verwendet+ und CD4-Zellen sowie NK Zellen5,6+ T. Dies ist ein leistungsfähiges Assay, sondern erfordert die Verwendung von Infektionserregern, die das Immunsystem vor der Ziel-Injektion prime.
Dieses Protokoll auf der anderen Seite erfordert keine vorherige Infektion des Wirtes und nutzt stattdessen eine Impfstrategie um das Immunsystem vor der Ziel-Injektion prime. Diese Impfung ist eine wasserbasierte Formulierung der Peptid-Impfstoff, der Bereitstellung von einer immunstimulierenden cocktail namens Covax7, bestehend aus einem Toll-Like Rezeptor 7 (TLR7) erfordert bestehend Agonist (Imiquimod-Creme), eine agonistische Anti-CD40 Antikörper und Interleukin-2 (IL-2) führt zu synergistische Kombination von immunstimulierenden Agenten für die Erhebung von Peptid-spezifische Grundierung und robuste Immunantwort. Als solches bietet dieser Assay eine schnellere Auslesen der CTL-Funktion, da der Impfstoff nur drei Tage vor der Injektion von den Zielzellen zusammen mit den Zellen zur Beurteilung der Funktion verwaltet wird. Darüber hinaus ist die Covax Grundierung stark genug, dass die Tötung Kapazität des grundiert antigenspezifischen T-Zellen zwischen 4 und 24 h nach der Injektion gesehen werden kann.
Die größte Beschränkung dieses Protokolls ist die Zeitachse in Vivo für den Nachweis von Ziel Tötung identifizieren, die angebracht ist, das Antigen und die Hypothese getestet. Sorgfältige Bewertung durchgeführt werden muss, als Variationen in Antigen Stärke sowie genetische Veränderungen in T-Zellen getestet Differenzial CTL-Funktion führen, die eine Erkennung von unterschiedlichem Timing Ziel töten erfordern würde. Darüber hinaus zwar die entsprechende Konzentration des Peptids für Impfung für menschlichen Melanom Antigen Glycopeptide 100 (hgp10025-33) optimiert wurde und Ovalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , Verwendung eines anderen Antigen-Modells, die möglicherweise besser geeignet, eine gegebene Studie würde weitere Validierung erfordern. Optimierung der IL-2 Dosis Konzentration und Dosis Frequenz möglicherweise aufgrund erwarteten Unterschiede in einem Ziel-Antigene Kapazität, CTL-Effektor-Funktion in Kombination mit der Covax als Adjuvans zu stimulieren muss das gewünschte Ziel zu erreichen. Insgesamt ist dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Funktion in Vivo zu töten und kann an jedem bestimmten Antigen angepasst werden.

<table style="border-collapse:collapse;width:523pt" width="697">
	<colgroup>
		<col style="width:199pt" width="265" />
		<col style="width:110pt" width="146" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">6- to 12-week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:110pt" width="146">Charles River</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">027</td>
			<td style="width:125pt" width="167">C57 Black 6 mice</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">OT-1 6-12-week old female mice&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Jackson Labs</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">hgp10025&#8211;33&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">834139</td>
			<td>KVPRNQDWL</td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">OVA 257&#8211;264&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">MISC-012</td>
			<td>SIINFEKL</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">Imiquimod cream 5%&#160;</td>
			<td class="xl69">Fougera</td>
			<td class="xl73">51672-4145-6</td>
			<td>Aldara Cream</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">CD40-specific mAb&#160;</td>
			<td class="xl69">BioXcell</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">BE0016-2</td>
			<td>clone FGK4.5</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">rhIL-2 protein&#160;</td>
			<td class="xl69">Hoffman LaRoche Inc</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">136</td>
			<td>Recombinant human IL-2 protein</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">70% isopropyl alcohol Prep&#160;</td>
			<td class="xl69">Kendall</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">S-17474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">PBS</td>
			<td class="xl69">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010-023</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">FBS</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140-079</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RBC lysis buffer&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A10492-01</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RPMI 1640 Media</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">L-Glutamine&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Pen/Strep</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">CFSE</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">C34554</td>
			<td>5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Sigma&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1.5 mL MCT graduated natural&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">05-408-129</td>
			<td>microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">70% ethanol</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl73">BP8201500</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Trypan blue solution, 0.4%&#160;&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Hemocytometer</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">27 gauge needle</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1 mL syringe</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assay for detection of antigen-specific t-cell cytolytic function using a vaccination model

Aktuelle Methoden zur antigenspezifischen Tötung sind beschränkt auf in-vitro- Verwendung oder bei Infektionskrankheiten Modelle verwendet. Allerdings gibt es kein Protokoll speziell antigenspezifischen töten ohne eine Infektion zu messen. Dieses Protokoll dient und beschreibt Methoden, um diese Einschränkungen zu überwinden, indem es ermöglicht für den Nachweis von Antigen-spezifische Tötung von einer Zielzelle durch CD8+ T-Zellen in Vivo. Dies geschieht durch eine Impfung-Modell mit einem traditionellen CFSE--markierten Ziel töten Assay zusammenführen. Diese Kombination erlaubt es den Forscher, die Antigen-spezifische CTL Potenzial zu bewerten, direkt und schnell, da der Test nicht Tumorwachstum oder Infektion abhängig ist. Darüber hinaus das Auslesen basiert auf Durchflusszytometrie und so die meisten Forscher leicht zugänglich sein sollten. Die große Einschränkung der Studie ist die Zeitachse in Vivo identifizieren, die die Hypothese getestet werden. Variationen in Antigen Stärke und Mutationen in T-Zellen, die im Differenzial Zytolyse-Funktion ergeben müssen sorgfältig geprüft werden, um den optimalen Zeitpunkt für die Zellernte und Bewertung zu bestimmen. Die entsprechende Konzentration des Peptids für die Impfung wurde optimiert für hgp10025-33 und OVA257-264, aber weitere Validierung für andere Peptide, die möglicherweise besser geeignet, eine gegebene Studie benötigt werden würde. Insgesamt dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Funktion in Vivo zu töten und kann an jedem bestimmten Antigen angepasst werden.

Vor der Injektion des CFSE--markierten Zielzellen läuft die Zelle 1:1-Mischung auf einem Durchflusszytometer bestimmen die Grundlinie Frequenzen CFSE-Hallo sowohl des CFSE-lo Zielzellen. Abbildung 1 A zeigt die gating Strategie zum Erkennen von Änderungen in der CFSE-Bevölkerung, eine erste Tor erfolgt über FSC und SSC-Parameter. Die gesamte CFSE--positiven Zellen sind dann vor der Bewertung der Änderungen in der Frequenz, subgated, wie dieser Population relativ klein im Vergleich zu den unbeschrifteten endogenen Splenocyten ist. Die relative Häufigkeit der CFSE-Hallo und CFSE-lo Bevölkerungen ist die berechnete durch Festlegen der Gesamtbevölkerung CFSE--positiv bei 100 %. Diese Analyse kann erfolgen mit einem Histogramm oder Dot-Plot-Format. Abbildung 1Bzeigt ein Beispiel für die relative Häufigkeit der CFSE-Bevölkerung vor der Injektion. Dieses Verhältnis wird selten exakt 1:1 aber sollte einigermaßen schließen. Die Notwendigkeit, die Covax Grundierung ist in Abbildung 1C wo keine Tötung des Antigens gepulst, CFSE-Hallo Zielzellen wird 24 h Post Injektion beobachtet dargestellt. Abbildung 1 D zeigt die effektive Tötung des Antigens gepulst, CFSE-Hallo-Zielzellen bezeichnet, da der Gipfel, die vor der Injektion beobachtet wurde fast unentdeckt ist und das Verhältnis dramatisch von 50 % auf 1 % Erkennung verschoben ist. Die Abbildung zeigt auch die Kinetik des Antigens gepulst, CFSE-Hallo-Ziel Zelle Tötung durch die Beurteilung der Verlust dieser Population bei 6 h und 24 h Post Injektion bezeichnet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56255/56255fig1.jpg"> Abbildung 1: Vergleich der markierten Zellen an Grundlinie und nach Injektion von CFSE--markierten Zielzellen. (A) die gating-Strategie für die Bewertung der CTL-Funktion wird angezeigt. Kurz gesagt, werden live Lymphozyten angespritzt mit forward Scatter (FSC) Vs Side Scatter (SSC) Parametern. Insgesamt CSFE-positiven Zellen sind innerhalb der live Zelle Tor subgated. Das Verhältnis von CFSE-Hallo und CFSE-lo basiert auf ihrer jeweiligen Häufigkeit innerhalb der Gesamtbevölkerung CFSE--positiv. (B) folgende CFSE-beschriften, sind Zielzellen 1:1 gemischt und für das Verhältnis von CFSE-Hallo und CFSE-lo Zellen durch Durchflusszytometrie bewertet. Die Zahlen geben die Häufigkeit der jeweiligen Gipfel auf ein Histogramm (links) und CFSE-Vs SSC Dot Plot (rechts) Formate. (C) Dies zeigt den Mangel an Zielzellen ohne vorherige Impfung mit Covax Regime zu töten. Splenocyten wurden geerntet 24 h nach der Injektion. (D) Dies zeigt die Tötung von den Antigen-gepulste CFSE-Hallo Zielzellen 6 h (oberen Graphen) und 24 h (untere Kurven) nach Injektion. Die Zahlen geben die Häufigkeit der CFSE--markierten Gipfel auf einem Histogramm (links) und CFSE-Vs SSC Dot Plot (rechts) Format. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56255/56255fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Das Ziel dieses Protokolls ist es, für die Erkennung von in Vivo Antigen-spezifische Tötung einer Ziel-Zelle in einem Mausmodell ermöglichen.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

9.8K Aufrufe.  University of Texas MD Anderson Cancer Center. Das Ziel dieses Protokolls ist es, für die Erkennung von in Vivo Antigen-spezifische Tötung einer Ziel-Zelle in einem Mausmodell ermöglichen.

Serie: In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Antigen-spezifische In Vivo Killing-Assay mit CFSE markierten Zielzellen

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Trans-vivo Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ Assay für Antigen-spezifische Verordnung

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...