Y. T. Y. möchte anerkennen, finanzielle Unterstützung vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie unter Grantnummern am 105-2221-E-007-MY3 und an der National Tsing Hua University unter Zuschuss Zahlen 105N518CE1 und 106N518CE1.

1. optische Aufbau Hinweis: das Prinzip der optischen Aufbau in Abbildung 1 dargestellt ist.
<ol><li>Satz, der optischen Pinzette kit (siehe die Tabelle der Materialien) und die Fluoreszenz-Modul (siehe Tabelle der Materialien) wie pro ihre Handbücher. Schließen Sie eine 470 nm blaue Licht emittierende Diode (LED) Licht-Quelle an das fluoreszierende Modul.</li>
	<li>Hohen numerischen Apertur (NA) zu ersetzen (NA = 1,25, Vergrößerung 100 X) Öl eintauchen Ziel durch eine lange funktionierende distanzieren (WD) Mikroskopobjektiv (Brennweite 3,6 mm, WD = 10,6 mm, NA = 0.5).</li>
	<li>Entfernen Sie die Linse in der Balkenquerschnitt Ausbau des montierten Kit, lose Fokussierung des Laserstrahls zu erreichen.</li>
	<li>Wendung auf die Stromversorgung und den Strom für die Laser-Diode Wellenlänge 980 nm und Nutzung der geladenen gekoppelt (CCD) Kamera um sicherzustellen, dass der Laserstrahl korrekt ausgerichtet ist. 
	Hinweis: Wenn der Laserstrahl gut ausgerichtet ist, die CCD-Kamera liest einen Gaußschen Platz.</li>
</ol> 2. Nanofabrikation <ol><li>Marker Fabrication. 
	Hinweis: Markierungen helfen, um das Nanoplasmonic-Array während des Fertigungsprozesses und anschließende Trapping Experiment zu positionieren. Das genaue Verfahren ist in ergänzende Abbildung1 dargestellt.
	<ol><li>Anzahlung 40 nm Indium-Zinn-Oxid (ITO) Film auf einem Deckgläschen Dicke 0,17 mm mit Sputtern. 
		Hinweis: Der ITO-Film hilft Elektronen bei der anschließenden e-Beam Lithografie entladen.</li>
		<li>Spin Mantel eine 8 µm Schicht von positiven Photoresist mit Spin speed 4000 u/min und 30 sec mit einem Spin Coater.</li>
		<li>Weich backen die Probe bei 90 ° C für 5 min und richten Sie die Probe mit der Fotomaske für Markierung und setzen die Probe mit UV-Licht für 80 s in der Mask Aligner.</li>
		<li>Einweichen die Probe im Fotolack Entwickler für 130 s.</li>
		<li>Einzahlen ein 2 nm Schicht aus Chrom und einer 40 nm-Schicht aus Gold auf die Probe mit thermischen Verdampfung. 18</li> <li>die Probe in Aceton einweichen und legen Sie es in ein Ultraschall sauberer Betrieb bei 43 kHz und 150 W für 5 min für Lift-off</li>
	</ol></li> <li>Herstellung von Nanoplasmonic Array <ol><li>Spin Mantel eine Schicht der Elektronenstrahl widerstehen PMMA 120K mit Schleuderdrehzahl 5000 u/min für 30 s auf einem Spin Coater. Backen Sie die Probe bei 160 ° C für 3 min auf einer heißen Platte.</li>
		<li>Spin Mantel eine weitere Schicht von Elektronenstrahl widerstehen PMMA 960K mit Schleuderdrehzahl 5000 u/min für 30 s auf einem Spin Coater. Backen Sie die Probe bei 160 ° C für 3 min auf einer heißen Platte.</li>
		<li>Einsatz Elektronenstrahl Schriftsteller, den e-Beam aussetzen zu widerstehen, mit Beschleunigung Spannung 30 kV und Dosierung 400 C/cm 2.</li>
		<li>Hinterlegen einer 40 nm-Schicht aus Gold in einem thermischen Verdampfer.</li>
		<li>Genießen Sie die Probe in Aceton und legen Sie sie in einem Ultraschallreiniger für 5 min für Lift-off</li>
	</ol></li></ol> 3. Kühlsystem und seine Temperatur-Kalibrierung Probe Hinweis: die Probe Kühlung Bühnenbild zeigt sich in ergänzenden Abbildung2.
<ol><li>Macht der Treiberschaltung für Probe Kühlung <ol><li>legen Sie die Widerstände, Transistoren bipolar Junction und macht Metalloxid-Feldeffekttransistoren auf der benutzerdefinierten Platine durch nach dem Schaltplan in ergänzende Abbildung 3 . All diese Komponenten mit Lötkolben Löten.</li>
		<li>Connect-Kabel zwischen den Steueranschluss der Leiterplatte und die elektronische Steuerkarte. Verbinden Sie die Kabel zwischen dem Ausgangs-Port der Leiterplatte und thermoelektrischen Kühlelement (TEC). Platzieren Sie das TEC-Element auf der Probe-Bühne mit Wärme versinken. 
		&#8203; Hinweis: die TEC-Element hat ein Loch in der Mitte, um den Laserstrahl zu durchlaufen lassen.</li>
		<li>Connect-Kabel von der Platine bis 5 V Stromversorgung. Verwenden die zukunftsweisenden Infrarot-Kamera zur Überwachung der Temperatur zu überprüfen, ob die thermoelektrischen Kühlung richtig abkühlt.</li>
	</ol></li> <li>Kalibrierung der gemessene Temperatur in der zukunftsweisenden Infrarot-Kamera und Widerstand Temperatur-Detektor (RTD) Thermometer.
	<ol><li>Das FTE-Thermometer auf einem leeren Deckgläschen platzieren und eine kleine Menge Wärmeleitpaste auf um sicherzustellen, dass angemessene thermischen Kontakt zwischen den FTE-Thermometer und Deckglas.</li>
		<li>Einstellung der Ausgabe-Leistung von der elektronischen Steuerschaltung TEC Element ändern, indem das Tastverhältnis des Impulsschalter breite Modulation und warten Sie 3 Minuten, um sicherzustellen, dass die Steady-State-Temperatur erreicht ist. Lesen Sie die Temperatur mit der RTD Thermometer.</li>
		<li>Wiederum auf Vorwärts schauende Infrarot-Kamera und Monitor die Temperatur. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei verschiedenen Ausgabeeinstellungen macht die Kalibrierung Temperaturkurve zu erhalten. Eine repräsentative Temperatur Kalibrierkurve in ergänzende Abbildung 4 dargestellt ist. 
		Hinweis: Es ist entscheidend für die Kalibrierung zwischen FTE Thermometer und zukunftsorientierte Infrarot-Kamera zu tun, denn die gemessene Temperatur der zukunftsweisenden Infrarot-Kamera muss genau, um sicherzustellen, die richtige Temperatur erreicht ist.</li>
	</ol></li></ol> 4. Abfangen von Mikropartikeln <ol><li>verdünnt Polystyrol Mikropartikel von Durchmesser 2 µm in entionisiertem Wasser in ein Microcentrifugetube mit richtigen Volumenverhältnis. 
	Hinweis: Die Konzentration von Mikropartikeln kann gemäß dem Ziel des Experiments angepasst werden. Während niedriger Konzentration einer Probe Zeitintervall zwischen Einzelkorn Trapping Ereignissen ermöglicht, wird höherer Konzentration die Zeit für mehrere Partikel abfangen verkürzen. Für einzelne Partikel abfangen, ist eine typische Konzentration ~0.05% (w/V).</li>
	<li>Legen Sie die Probe mit Nanoplasmonic Array auf der Bühne und schalten Sie ein 470 nm LED als Lichtquelle Fluoreszenz und legen Sie manuell die Macht bis 5 mW für Hellfeld Imaging.</li>
	<li>Verwenden die Markierung zu finden das Nanoplasmonic-Array, richten Sie die Probe und die CCD-Kamera um sicherzustellen, dass das Array ist in der Mitte der Region des Interesses auf dem Computerbildschirm.</li>
	<li>Verzichten, 10 µL verdünnter Mikropartikel von Durchmesser 2 µm auf die Probe mit einem Mikro Pipette.</li>
	<li>Schalten Sie die Stromversorgung für die Laserdiode der Wellenlänge 980 nm, begeistern die plasmonische Resonanz des Arrays mit einer Leistung im Bereich von ~ 1 mW bis 10 mW.</li>
	<li>Manuell schalten Sie die Stromversorgung für die elektronische Steuerkarte Abkühlen der Probe auf eine Steady-State Temperatur ~ 4 ° C.</li>
	<li>In die Viewer-Software, klicken Sie auf den &#34; Video aufzeichnen &#34; Sequenz, öffnen Sie das Dialogfeld "Aufnahme". Klicken Sie auf die &#34; Platte &#34; Taste, um die Videoaufnahme 1,5 der Bewegung des Mikro-Partikeln mit einer Bildrate von 10 Bildern/s über die Probe unter dem Einfluss der Laserstrahl mit der CCD-Kamera. Klicken Sie auf die &#34; nicht mehr &#34;-Taste, um die Aufnahme zu beenden. Sehen Sie Video 1.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Opt.Lett. 11, 288-290 (1986).</li><li>Grier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revolution+in+optical+manipulation.">A revolution in optical manipulation.</a> Nature. 424, 21-27 (2003).</li><li>Wright, W. H., Sonek, G. J., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+on+trapping+forces+with+optical+tweezers.">Radiation on trapping forces with optical tweezers.</a> Appl. Phys. Lett. 63, 715-717 (1993).</li><li>Kawata, S., Tani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optically+driven+Mie+particles+in+an+evanescent+field+along+a+channel+waveguide.">Optically driven Mie particles in an evanescent field along a channel waveguide.</a> Opt. Lett. 21, 1768-1770 (1996).</li><li>Yang, A. H. J., Moore, S. D., Schmit, B. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+and+trapping+in+two-dimensional+nanoscale+plasmonic+optical+lattice.">Transport and trapping in two-dimensional nanoscale plasmonic optical lattice.</a> Nano Lett. 13, 4118-4122 (2013).</li><li>Cuche, A., Stein, B., Canguier-Durand, A., Devaux, E., Genet, C., Ebbesen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brownian+motion+in+a+designer+force+field:+Dynamical+effects+of+negative+refraction+on+nanoparticles.">Brownian motion in a designer force field: Dynamical effects of negative refraction on nanoparticles.</a> Nano Lett. 12, 4329-4332 (2012).</li><li>Baffou, G., Berto, P., Urena, E. B., Quidant, R., Monnert, S. J., Polleux, J., Righeault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+heating+of+nanoparticle+arrays.">Photoinduced heating of nanoparticle arrays.</a> ACS Nano. 8, 6478-6488 (2013).</li><li>Roxworthy, B. J., Bhuiya, A. M., Vanka, S. P., Toussant, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+controlling+plasmon-induced+convection.">Understanding and controlling plasmon-induced convection.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li><li>Yang, T. P., Yossifon, G., Yang, Y. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+near-field+and+convectional+transport+behavior+of+micro+and+nano+particles+in+nanoscale+plasmonic+optical+lattice.">Characterization of the near-field and convectional transport behavior of micro and nano particles in nanoscale plasmonic optical lattice.</a> Biomicrofluidics. 10, 034102 (2016).</li><li>Chen, Y. -. C., Yossifon, G., Yang, Y. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supression+of+phtothermal+convection+of+micro+particles+in+two+dimensional+nanoplamonic+optical+lattice.">Supression of phtothermal convection of micro particles in two dimensional nanoplamonic optical lattice.</a> Appl. Phys. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+and+sensing+10+nm+metal+nanoparticles+using+plasmonic+dipole+antennas.">Trapping and sensing 10 nm metal nanoparticles using plasmonic dipole antennas.</a> Nano Lett. 10, 1006-1011 (2010).</li><li>Pang, Y., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+of+12+nm+dielectric+spheres+using+double-nanoholes+in+a+gold+film.">Optical trapping of 12 nm dielectric spheres using double-nanoholes in a gold film.</a> Nano Lett. 2011 (11), 3763-3767 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier beschriebene Vorgehensweise ermöglicht dem Leser zuverlässig abfangen auf einer täglichen Basis zu reproduzieren. Eine allgemeine empirische Richtlinie, ein nutzbare optische Gitter zu entwerfen ist eine vergleichbare Größe für plasmonische Nanoarray, interdisc Abstand zu verwenden und Partikelgröße gefangen. Im Vergleich zu einem einzelnen, isolierten plasmonische Nanostruktur, verbessert das optische Gitter-Design in Verbindung mit der hohen optischen Leistung durch die Kühlung der Probe auf ~ 4 ° C verwendet hier stark die Trapping-Wahrscheinlichkeit. Wenn auch getrennte, plasmonische Nanostrukturen wie Trapping Websites verwendet werden, muss man warten, bis eine lange Zeit für die Migration von Mikropartikeln in das wirksame Trapping-Volumen in der Nähe der plasmonische Nanostrukturen. Erhöhen den Abstand zwischen Scheibe kritisch verringert auch die Wahrscheinlichkeit der Partikel Akkumulation. Hinweis, dass man auch das Trapping-Experiment mit plasmonische optischen Gitter bei Raumtemperatur, aber die nutzbare optische Leistung durchführen kann, wird sehr begrenzt sein. Auch bei geringen optischen Leistung, muss man für eine lange Zeit warten (~ 1 h) für die Mikropartikel-Trapping-Veranstaltung. In der Regel wenden wir uns an der CCD-Kamera aufzeichnen die Partikelbewegung und abholen der Trapping-Veranstaltung in wenigen Minuten. Die geltenden Laserleistung ist so hoch wie 10 mW. Bei einer hohen optischen Leistung kann eine große Ansammlung von Mikropartikeln beobachtet werden.
Die entscheidende Schritt für Erfolg in dieser Arbeit zu kühlen ist unten plasmonische auf einem fragilen Deckglas und gleichzeitig überwachen die Temperatur der Probe. Wir haben uns entschieden die zukunftsorientierte Infrarotkamera, die Temperatur zu messen, weil solch eine berührungslose Messung die Chance der Bruch der Probe reduziert. Alternativ kann man wählen, kleben Sie auf eine kleine Größe Thermometer und es verwenden, um die Temperatur in Echtzeit zu messen. Das Kühlsystem mit berührungslosen Temperaturmessung ist allgemeingültig für optische Mikroskopie bei niedrigen Temperaturen.
Obwohl hier die Demonstration mit Mikron-Partikel fertig ist, kann man Nanopartikel Falle, durch Verkleinerung der Größe und Abstand der gold Nanodiscs. So weit, Abfangen von Nanopartikeln mit Durchmesser so klein wie 100 nm wurde demonstriert19. Dies ist jedoch nicht die ultimative Grenze plasmonische optischen Gitter. Wir haben auch eine lange arbeiten Abstand Mikroskopobjektiv, das mechanische Design der Probe-Bühne zu erleichtern. Besserer Auflösung in der Bildgebung kann erreicht werden, indem er es mit einem Mikroskopobjektiv Öl eintauchen. Durch Verkleinerung der Abmessungen der plasmonische Nanostrukturen, sollte das fangen von noch kleineren Nanopartikel auch machbar sein. 20 , 21

Die optische fallen Mikromaßstab Teilchen wurde ursprünglich von Arthur Askin in den frühen 1970er Jahren entwickelt. Seit seiner Erfindung entwickelte sich die Technik als ein vielseitiges Werkzeug für Mikro- und Nanomanipulation1,2. Konventionelle optische trapping basierend auf das Fernfeld mit Schwerpunkt Prinzip ist von Natur aus begrenzt durch die Beugung in seine räumliche Beengtheit, wobei die Fallenjagd Kraft dramatisch sinkt (folgende eine ~3 -Gesetz für ein Teilchen mit dem Radius ein) 3. um solche Beugung Grenzen zu überwinden, Forscher entwickelten optischen Nahfeld-Trapping Techniken basierend auf dem evaneszenten optische Feld mit plasmonische metallischen Nanostrukturen und darüber hinaus das fangen von nanoskaligen Objekten auf einzelne Proteinmoleküle wurde demonstriert4,5,6,7,8,9,10,11. Darüber hinaus entsteht plasmonische optische Gitter aus Arrays von periodischen plasmonische Nanostrukturen Langstrecken-Transport von Mikro- und Nanopartikel und mehrere Teilchen Stapeln11,12zu verleihen. Ein Haupthindernis für die Fallenjagd in einem optischen Gitter zu stören ist photothermische Konvektion und Anstrengungen unternommen durch mehrere Gruppen14,15,16,17, deren Auswirkungen aufzuklären. Mit Green-Funktion, haben Baffou Et Al. ein Temperaturprofil durch Modellierung jeder plasmonische Nanostruktur als Punkt Heizung berechnet und dann experimentell validiert ihre Modell-14. Toussant Gruppe hat auch der Plasmon-induzierten Konvektion mit Partikel Velocimetry15gemessen. Die Autorengruppe hat auch gekennzeichnet Nahfeld- und konvektiven Transport und demonstriert eine engineering-Strategie um photothermische Konvektion16,17zu unterdrücken.
Hier präsentieren wir das Design eine optische Aufbau und ein detailliertes Verfahren speziell für Überfüllung Experimente mit plasmonische optischen Gitter. Das optische Potenzial entstand durch ein Array von gold Nanodiscs mit einem lose fokussierten "glockenförmig" Lichtstrahl beleuchtet. Ein Schema, photothermische Konvektion zu unterdrücken durch die Abkühlung der Probe auf eine niedrige Temperatur (~ 4 ° C) für optimale Trapping ist auch hier17beschreiben. Unter Boussinesq Näherungswert, ergibt sich eine Schätzung der Größenordnung für die natürliche Konvektion Geschwindigkeit u aus u ~L2 GβΔT / V, wo L die Längenskala der Wärmequelle und Δ ist T wird der Temperaturanstieg im Vergleich zu den Verweis wegen der Heizung.  g und β sind die Gravitationsbeschleunigung und thermischen Ausdehnungskoeffizienten. Bei Temperaturen in der Nähe von 4 ° C die Dichte des Mediums Wasser Exponate anomale Temperaturabhängigkeit und dies führt zu einer thermischen Ausdehnungskoeffizienten von nahe Null und somit eine verschwindend kleine photothermische Konvektion.

<table style="border-collapse:collapse;width:629pt" width="839">
	<colgroup>
		<col style="width:207pt" width="276" />
		<col style="width:131pt" width="174" />
		<col style="width:122pt" width="162" />
		<col style="width:170pt" width="227" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">Thermoelectric cooling element</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Thorlabs</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">TEC 1.4-6</td>
			<td class="xl70" style="width:170pt" width="227">TEC element for sample cooling</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl69" height="42" style="width:207pt;height:31.5pt" width="276">RTD thermometer</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Omega Engineering</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">RTD Thermometer 969C</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">Forward looking infrared camera</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">FLIR&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">FLIR One</td>
			<td class="xl70">IR camera for temperature monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="46" style="height:34.5pt">
			<td class="xl69" height="46" style="width:207pt;height:34.5pt" width="276">light emitting diode light source</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Touchbright</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162"></td>
			<td class="xl69" style="width:170pt" width="227">Light source for illumination for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">Long working distance objective</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Olympus</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">LMPLFLN</td>
			<td class="xl70">For illuminating the sample and imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">Optical trap kit</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Thorlabs</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">OTKB/M</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl71" height="21" style="height:15.75pt">Cover slip</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174"></td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162"></td>
			<td class="xl69" style="width:170pt" width="227">thickness 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl71" height="21" style="height:15.75pt">Scanning electron microscope</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Hitachi</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">SEM-Hitachi S3400N</td>
			<td class="xl69" style="width:170pt" width="227"></td>
		</tr>
		<tr height="44" style="height:33.0pt">
			<td class="xl71" height="44" style="height:33.0pt">Electron beam blanker</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">DEBEN</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">PCD beam blanker</td>
			<td class="xl69" style="width:170pt" width="227">the blanker is added to the scanning electron microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl71" height="21" style="height:15.75pt">Thermal evaporator</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">SYSKEY Technology</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162"></td>
			<td class="xl69" style="width:170pt" width="227"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl71" height="21" style="height:15.75pt">Mask aligner</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Karl Suss</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">MJB 3</td>
			<td class="xl69" style="width:170pt" width="227">For marker fabrication</td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td class="xl69" height="24" style="width:207pt;height:18.0pt" width="276">Electron beam resist</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Sigma Alrich</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">PMMA 120K</td>
			<td class="xl69" style="width:170pt" width="227">For e-beam lithography</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">Electron beam resist</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Sigma Alrich</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">PMMA 960K</td>
			<td class="xl70">For e-beam lithography</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl69" height="42" style="width:207pt;height:31.5pt" width="276">Fluoresent labeled polystyrene microspheres</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Polyscience</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162"></td>
			<td class="xl70">2 um diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">Bipolar transistor</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Mouser</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">2N3904</td>
			<td class="xl70">quantity 2 for TEC driver circuit</td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl69" height="28" style="width:207pt;height:21.0pt" width="276">Bipolar transistor</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Mouser</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">2N3906</td>
			<td class="xl70">quantity 2 for TEC driver circuit</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">MOSFET power transistor</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Mouser</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">IRF5305</td>
			<td class="xl70">quantity 2 for TEC driver circuit</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">MOSFET power transistor</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Mouser</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">IRF131ON</td>
			<td class="xl70">quantity 2 for TEC driver circuit</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">10 kOhm resistor</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Mouser</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162"></td>
			<td class="xl70">quantity 6 for TEC driver circuit</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">910 Ohm resistor</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Mouser</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162"></td>
			<td class="xl70">quantity 2 for TEC driver circuit</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">Photoresist</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Microchemicals</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">AZ4620</td>
			<td class="xl70">For marker fabrication</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:207pt;height:15.75pt" width="276">Acetone</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Sigma Alrich</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162"></td>
			<td class="xl70">For marker fabrication</td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl69" height="41" style="width:207pt;height:30.75pt" width="276">Fluorescence Module for the OTKB/M, Metric Threads</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Thorlabs</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">OTKB-FL/M</td>
			<td class="xl69" style="width:170pt" width="227"></td>
		</tr>
		<tr height="49" style="height:36.75pt">
			<td class="xl69" height="49" style="width:207pt;height:36.75pt" width="276">Fluorescent filter set</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Thorlabs</td>
			<td class="xl69" style="width:122pt" width="162">MDF-FITC</td>
			<td class="xl70">For Fluorescein Isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl70" height="21" style="height:15.75pt">Ultrasonic cleaner</td>
			<td class="xl69" style="width:131pt" width="174">Delta</td>
			<td class="xl70">DC150H</td>
			<td class="xl70">For the lift off step</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trapping of micro particles in nanoplasmonic optical lattice

Die plasmonische optische Pinzette wurde entwickelt, um die Beugung Grenzen der konventionellen Fernfeld optische Pinzette zu überwinden. Plasmonische optischen Gitter besteht aus einem Array von Nanostrukturen, die eine Vielzahl von Fang und Transport Verhalten aufweisen. Wir berichten über die experimentellen Verfahren, die Mikro-Partikel in einem einfachen quadratischen Nanoplasmonic optischen Gitter. Wir beschreiben auch der optische Aufbau und Nanofabrikation eines Nanoplasmonic-Arrays. Das optische Potenzial entsteht durch die Beleuchtung ein Array von gold Nanodiscs mit einem "glockenförmig" Strahl von 980 nm Wellenlänge und spannende Plasmon-Resonanz. Die Bewegung der Partikel wird durch Fluoreszenz-Bildgebung überwacht. Ein Schema, photothermische Konvektion zu unterdrücken wird auch beschrieben, um nutzbare optische Leistung für optimale Fang zu erhöhen. Unterdrückung der Konvektion wird durch Kühlung der Probe auf eine niedrige Temperatur und unter Verwendung der in der Nähe von Null thermische Ausdehnungskoeffizient des Mediums Wasser erreicht. Einzelkorn Transport- und mehrere Partikel abfangen werden hier gemeldet.

Einzelkorn Flugbahnen von einer CCD-Kamera in unserem Experiment aufgenommen wurden und die Bilder wurden dann mit einem benutzerdefinierten Programm zum Entpacken von jedes Partikels Flugbahn16verarbeitet. Repräsentative Ergebnisse werden in Abbildung 3 und 1 Video für Mikro-Kugeln mit einem Durchmesser von 2 µm. mehrere Teilchen drumherum innerhalb der optischen Gitter beobachtet wurden. Aufeinanderfolgende Bilder extrahiert aus einem repräsentativen Motion Video des Teilchens sind in Abbildung 4dargestellt. Für Mikropartikel von Durchmesser 2 µm sieht man das clustering von Mikropartikeln dicht gepackt (Hcp) Struktur eine sechseckige gebildet. Die Probe kann auch durch das Ausschalten der TEC-Element erwärmt; die beobachteten eingeschlossene Cluster würde wegen photothermische Konvektion zerstreuen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56151/56151fig1.jpg"> 
Abbildung 1 . Schematische Darstellung der optische Aufbau. Ein "glockenförmig" Strahl mit Wellenlänge von 980 nm wird verwendet, um plasmonische optischen Gitter Probe Trapping schaffen begeistern. Eine fasergekoppelte Laser-Diode des Wellenlänge 980 nm durchläuft Spiegel (M1) wird lose durch eine lange konzentriert arbeiten Abstand Mikroskopobjektiv, und regt die plasmonische Probe. Der fluoreszierende Aufnahme mit demselben Ziel in Verbindung mit dichroitischen Spiegel (DM) und Emission Filter (EF) unter der fluoreszierenden Anregung bei 470 nm von Licht emittierende Diode Lichtquelle. Das Anregungslicht bei 980 nm für die plasmonische Resonanz ist Farbe codiert "Rosa" und die Anregung und Emission Licht für Fluoreszenz-Bildgebung sind farbcodiert 'blau' und 'grün',. Die Bewegung wird mit der CCD-Kamera aufgezeichnet. Thermoelektrischen Kühlung (TEC) wird verwendet, um die Probe abkühlen. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56151/56151fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56151/56151fig2.jpg"> 
Abbildung 2 . Nano plasmonische Array hergestellt durch E-Beam Lithografie. (ein) Marker Design zu finden und richten Sie die Probe in den Elektronenstrahl-Writer verwendet. Die Abmessungen des äußeren weißen Quadrats sind 22 mm x 22 mm, und die ringförmige Markierung im Einschub hat einen Außendurchmesser von 150 µm und Innendurchmesser von 50 µm. (b) A Rasterelektronenmikroskop (REM) Image eines Nanoplasmonic-Arrays. Eine einfache quadratische Palette von 22 x 22 Nanodiscs dient und jede Elementarzelle enthält eine Nanodisc der Dicke 40 nm und Durchmesser 550 nm mit Inter Scheibe Abstand 750 nm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56151/56151fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56151/56151fig3.jpg"> 
Abbildung 3 . Einzelne Partikel Flugbahnen. Die Flugbahnen der Mikropartikel extrahiert mittels Bildverarbeitung werden zusammengestellt, mit dem Schwerpunkt Algorithmus16 und hier angezeigt. Die optische Leistung verwendet für plasmonische Resonanzanregung bei 980 nm beträgt 5 mW. Eine Maßstabsleiste von 2 µm wird angezeigt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56151/56151fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56151/56151fig4.jpg"> 
Abbildung 4 . Bild aus einem Cluster von Mikropartikeln in plasmonische gefangen, optische Gitter und Akkumulation von Mikropartikeln im Laufe der Zeit mit einer optischen Leistung von 5 mW. (ein) aufeinanderfolgenden Fluoreszenz Bilder zeigen die Anhäufung von eingeschlossenen Mikropartikel bilden Cluster. Eine weiße Skala von 4 µm wird angezeigt. (b) Anzahl der eingeschlossenen Mikropartikel im Vergleich zur Zeit, (ein) entnommen. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56151/56151fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Movie" src="/files/ftp_upload/56151/56151video.jpg"> 
Video 1. Optische fallen und Partikel Ansammlung von 2 µm Partikel. Die optische Leistung verwendet für plasmonische Resonanzanregung bei 980 nm beträgt 5 mW. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56151/2uM_5_mW.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/56151/56151supfig1.jpg"> 
Zusätzliche Abbildung 1. Prozess-Fluss der Nanofabrikation Nanoplasmonic Arrays. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56151/56151supfig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/56151/56151supfig2.jpg"> 
Zusätzliche Abbildung 2. Probe Kühlung Bühnenbild. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56151/56151supfig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplementary Figure 3" src="/files/ftp_upload/56151/56151supfig3.jpg"> 
Zusätzliche Abbildung 3. Treiberschaltung zur Kühlung der Probe. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56151/56151supfig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplementary Figure 4" src="/files/ftp_upload/56151/56151supfig4.jpg"> 
Zusätzliche Abbildung 4. Kalibrierung der Temperatur zwischen einem FTE Thermometer und Forward-Looking Infrarot-Kamera. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56151/56151supfig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Trapping of Micro Particles in Nanoplasmonic Optical Lattice

Wir beschreiben eine Prozedur, um optisch Mikropartikel in Nanoplasmonic optischen Gitter einzuschließen.

Trapping von Mikropartikeln in Nanoplasmonic optischen Gitter

The plasmonic optical tweezer has been developed to overcome the diffraction limits of the conventional far field optical tweezer. Plasmonic optical ...

trapping-of-micro-particles-in-nanoplasmonic-optical-lattice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.5K Aufrufe.  National Tsing Hua University. Wir beschreiben eine Prozedur, um optisch Mikropartikel in Nanoplasmonic optischen Gitter einzuschließen.

Serie: Trapping of Micro Particles in Nanoplasmonic Optical Lattice

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Ein Cre-Lox P Rekombination Ansatz für den Nachweis von Cell Fusion In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-Particle Image Velocimetry für Velocity Micro Profil Messungen der Blut fließt

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these foreign molecules to T and B lymphocytes. Lymph nodes have thus become critical targets for new vaccines and immunotherapies. A recent strategy for targeting these tissues is direct lymph node injection of soluble vaccine components, and clinical trials involving this technique have been promising. Several biomaterial strategies have also been investigated to improve lymph node targeting, for example, tuning particle size for optimal drainage of biomaterial vaccine particles. In this paper we present a new method that combines direct lymph node injection with biodegradable polymer particles that can be laden with antigen, adjuvant, or other vaccine components. In this method polymeric microparticles or nanoparticles are synthesized by a modified double emulsion protocol incorporating lipid stabilizers. Particle properties (e.g.&#160;size, cargo loading) are confirmed by laser diffraction and fluorescent microscopy, respectively. Mouse lymph nodes are then identified by peripheral injection of a nontoxic tracer dye that allows visualization of the target injection site and subsequent deposition of polymer particles in lymph nodes. This technique allows direct control over the doses and combinations of biomaterials and vaccine components delivered to lymph nodes and could be harnessed in the development of new biomaterial-based vaccines.

Lymph nodes are the immunological tissues that orchestrate immune response and are a critical target for vaccines. Biomaterials have been employed to better target lymph nodes and to control delivery of antigens or adjuvants. This paper describes a technique combining these ideas to inject biocompatible polymer particles into lymph nodes.

Intra-Lymphknoten-Injektion von biologisch abbaubaren Polymerpartikeln

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.