ASR geplante Experimente, Protokolle entwickelt und analysiert Daten. SC und PS durchgeführt Zelle Größe Experimente. ASR und OC schrieb das Manuskript. Die Autoren möchten die Unterstützung von Prof. David R. Klug dankbar anerkennen, für den Zugriff auf Geräte. Die Autoren danken der Imperial College Advanced Hackspace für den Zugriff auf Fertigung und Prototyping Anlagen.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Adressierbare Tröpfchen Microarrays sind eine sensible und erweiterbare Methode für quantitativ bestimmen die absolute Kopienzahl des Proteins innerhalb einer einzelnen Zelle.
Begrenzung der Höhe der unspezifischen Bindung ist (NSB) im Rahmen des Protokolls zur Erreichung möglichst geringen maximal Erkennung wie möglich. Proteine und andere biochemische Arten können unspezifisch binden an eine Reihe von Schnittstellen in die Tröpfchen-Deckglas Oberfläche, der Antikörper vor Ort und der Öl/Wasser-Grenzfläche. Proteine können verloren gehen, durch die Partitionierung in die Schnittstelle oder das Öl selbst. Wir haben gezeigt, dass 4 % BSA im wäßrigen Tröpfchen in der Lage, Begrenzung der NSB von Proteinen mit den Antikörpern im Protokoll angegeben. Alternative Protein-Targets und die Antikörper verwendet, um sie zu erkennen erfordern alternative blockierende Methoden, solche nichtionischen Detergentien oder kompatibel Tenside. Fluorierte Öle können auch auf ihre Eignung im Dienst als die Deckelung Öl geprüft werden. In solchen Fällen müssen weitere Überlegungen wie die kritischen Micelle-Konzentration und die Dichte der Deckelung Öl erfolgen.
Die ungewaschenen Drucken Puffer, der an jedem Ort nach Anordnung Aids ausgerichtet bleibt. Bei der zunächst die Tröpfchen Hinterlegung, muss darauf geachtet werden, nicht zerkratzen oder beschädigen der Antikörper-Spot durch die Spitze der Düse konzentrischen Rohren. Die Methode weiter zu entwickeln, kann ein Fluoreszenzfarbstoff in den Antikörper Drucken Puffer dotiert werden, die neben der Erfassung Antikörper immobilisiert wird. Dies würde es ermöglichen für Wasch- und blockieren Schritte vor Tröpfchen Anordnung durchgeführt werden; jedoch wäre ein solchen Schritt nicht unbedingt erforderlich, wenn automatisierte Methoden der Tröpfchen anordnen, die wie Inkjet-Druckverfahren.
Die Oberfläche der kommerziell sourced Deckgläsern, auf denen Tröpfchen gebildet werden, ist beschichtet mit ein hydrophiles Polymer und die wässrigen Tröpfchen produziert auf sie mit einem Volumen von 10 nL haben einen Durchmesser von 751 ± 42 mm. Gibt es ein Limit, wieviel der hinterlegte Tropfen sollte die Oberfläche nass oder breitet sich durch das Gewicht der Deckelung Öl da unten eine Mindeststärke gibt es erhöhte optische Streuung vom Laser TIRF Erregung. Die Streuung steigt das durchschnittliche Niveau der Hintergrund und kann Signal übertönen, wenn einzelne Moleküle zu erkennen. Der Antikörper-Spot muss auch der Tröpfchen Schneide gefunden werden, da das Anregungslicht Laser kann teilweise oder vollständig schlagen einen Bereich außerhalb der wässrige Tropfen. Der Grenzwinkel Bedingung wird nicht mehr für die Glas-Öl-Oberfläche im Gegensatz zu Glas-Wasser-Grenzfläche fällt Licht erfüllt sein.
Um die Fülle des Proteins die Anzahl der einzelne Moleküle gebunden an eine Stelle quantitativ zu bestimmen müssen durch Bildanalyse ermittelt werden. Um zu bestimmen, die gesamte Menge an Protein in Lösung von der Einzelmolekül-Zählung einer Kalibrationskurve ist erforderlich und ermöglicht die Technik absolut quantitative sein.
Zur Minimierung von Immunofluoreszenz Flecken werden nicht kontinuierlich abgebildet und die TIRF Laser Quelle erregerleistung wird minimiert. Das Protokoll wie vorgestellt hat seit photostabilen Fluorophore erfolgreich eingesetzt, wie z. B. die Alexa Fluor Farbstoffe. Alternative Fluorophore verwendet werden aber Immunofluoreszenz beurteilt werden muss und das Image Protokoll gegebenenfalls anzupassen. Die Gesamtzahl der einzelnen Moleküle pro Frame kann geplottet werden, gegen die Zeit, die verbindliche Kurve zu reproduzieren, obwohl dies sicherlich nicht notwendig wenn verbindliche Kinetik nicht gesucht und imaging sind genügt ein Einzelbild im Gleichgewicht ist.
Zwar gibt es eine Anforderung von zwei hohe Affinität Antikörpern, führt dies in einem hochsensiblen und hochspezifische Assay für Messungen auf der Ebene der einzelnen Zelle von entscheidender Bedeutung. Die p53-Antikörper, die in diesem Protokoll verwendeten sind gut bei der Aufdeckung von freien p53 aus einzelnen Zellen optimiert. Das Zielprotein wird bestimmt durch die Wahl von Antikörpern und können in verschiedener Weise geändert werden: 1, die Erfassung und Erkennung Antikörper können ersetzt werden, um alternative Ziele; binden 2, den detektionsantikörper kann Proteinprotein Interaktionen Sonde ersetzt werden oder Post-translationalen Modifikationen an das Protein gebunden an den Capture-Antikörper, z.B. bestimmen die Phosphorylierung Status der erfassten p53; 3, Multiplex-Assays können erzielt werden, indem Sie drucken mehrere Capture Antikörper-Spots in der Nähe – Drucken ein 3 × 3 vor Ort Array innerhalb 10nL Tröpfchen möglich ist. Natürlich müssen für jede Änderung des Zielproteins eine Reihe von Antikörper-Bildschirme, Steuerelemente und Optimierungen vorgenommen werden.
Mehrere Methoden zur Lyse Einzelzellen sind berichtet worden. 33 optische Lyse ist eine chemiefreie Ansatz zu schnell einzelne Zellen lysiert ohne Änderung der Inhalt der Zellen und Aufrechterhaltung der Integrität der Proteine und ihre komplexe. Chemische Reinigungsmittel Lyse stellt ein Problem für die Integrität der Tropfen bei der Verwendung von Mineralöl und kann Wechselwirkungen zwischen Molekülen stören. 34 Ansatz ist jedoch für Assays, wo chemische Lyse kompatibel ist, es attraktiv, da es nicht auf Geräte wie Laser oder Micropatterned Elektroden angewiesen ist. 35
Die Tröpfchen zeigen vergleichbaren Leistung mit alternativen Einzelzelle Methoden. In der aktuellen Generation von Tröpfchen, die mit der vorgeschlagenen p53-Antikörper ist das Niveau der NSB 187 ± 60 Moleküle pro Spot. Die Einzelmolekül-Grafen zeigen starke Linearität (R2 = 0,99) in der Region 105 –108 rekombinantem p53 Protein pro Tropfen. Dies deutet darauf hin, während niedrigere Niveaus des Proteins in den Zellen erkannt werden können, gibt es eine Begrenzung der Quantifizierung von 105 p53 Proteine; Dies entspricht einen Einzelmolekül-Zähler auf den Flecken der 901 ± 83. Dies ist vor allem durch das Volumen der Tröpfchen und Adsorption an der Oberfläche begrenzt. Die Leistung des p53-Assays ist so, dass wenn durchgeführt in einem 10 nL Volumen nur 1,1 ± 0,2 % der gesamten Zielprotein aus Lösung erfasst wird; Dies erhöht auf 85 ± 9 %, wenn die Analyse-Lautstärke auf 0,2 reduzieren nL. 36 durch die Verringerung des Volumens der Tröpfchen zu unter 1nL und Verringerung der Adsorption, besteht die Möglichkeit mit Hilfe der angegebenen Antikörper gegen p53 bei der Verbesserung der Nachweisgrenze zu < 50 Proteine pro Zelle. Adressierbare Tröpfchen haben daher das Potenzial, verwendet werden, um sehr niedrige Fülle Proteine aus einzelnen Zellen zu messen.
Die Adressierbarkeit der Tropfen durch den leicht durchlässig Öldeckel gewährte erlaubt das Zellvolumen Analyse sequenziell herausgefordert zu werden. Die Verwendung einer Mikropipette ermöglicht die Injektion von einer gewünschten Anzahl von Zellen in jedem Tropfen in einem Stecker von 10-20 pL, die nicht signifikant erhöht die Lautstärke. Für der Chip, dargestellt in Abbildung 1 b mit 100 Brunnen, Tröpfchen bilden und laden Sie sie mit einzelnen Zellen in der Regel dauert 75-90 min. Laden Zellen auch erreicht werden kann, durch die Adressierung des tröpfchens mit dem konzentrischen Düse anstelle der Mikropipette Schläuche oder mit einem Lösung, die Zellen enthält, wenn zunächst die Tröpfchen bilden. Letzteres wäre sinnvoll begrenzen Sie die Anzahl der Schritte im Protokoll aber in beiden Fällen, würde die Belegung pro Tröpfchen eine Poisson-Verteilung folgen. Dies würde den Anteil der einzelnen Zellendaten pro Chip begrenzen; jedoch würde die Tröpfchen mit NULL oder mehrere Zellen als Kontrollen dienen. Eine weitere Einschränkung bei der Verwendung der konzentrischen Düse zu Adresse Tröpfchen ist das Tröpfchen im 10nL Schritten steigern würde. Mit die vorgeschlagenen Änderungen über das könnte verbessert werden. Auf dem Chip Tröpfchen Mikrofluidik produzieren Tröpfchen mit hoher Frequenz und Potenzial in werden automatisch kombiniert mit ADM-Dateien zu erzeugen und manipulieren Tröpfchen und nacheinander in einer planaren Anordnung zu hinterlegen. Dies würde sicherlich Überwindung der Grenzen in der Produktion von ADMs Einzelmolekül Auslesen der Tröpfchen ermöglicht.
Die Fähigkeit, jeden einzelnen Tropfen zu bewältigen hat eine Reihe von Einsatzmöglichkeiten. Wir haben die Fähigkeit, einzelne Zellen nacheinander laden gezeigt. Es erlaubt auch Entfernung der Lyse ungebunden zellulärer materiellen Post und Post-Analyse mit Pipette für die Analyse, die mit anderen Methoden. Beispiele für nachfolgende Analyse sind quantitative Real-Time PCR oder Massenspektrometrie.
Die aktuelle Engpässe für Labore wollen in einzelne Zelle Protein-Analyse einen quantitativen Ansatz gehört die hohe technische Barriere und die Notwendigkeit für spezielle Ausrüstung. Mit ADMs, miniaturisierte können hohe Sensitivitätsanalysen ohne die Notwendigkeit für Reinraumanlagen, mikrofluidischen Lab-on-a-Chip-Geräte zu fabrizieren erreicht werden. Experimente sind nicht begrenzt durch die Gestaltung des Chips und ihre Lautstärke und die Position können geändert werden, ohne die Notwendigkeit für die Herstellung von neuen Meister. Natürlich gibt es Raum für Verbesserungen bei der Vereinfachung der Technik und senken die Einstiegsschwelle für einzelne Zelle Analyse, nur eine Microarrayer, Antikörper und Tröpfchen Microarrays sowohl ein Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser, Bild drucken.
Eine Reihe von klinischen Anwendungen der einzelnen Zelle Analyse entstehen, insbesondere bei der Behandlung von Krebs. Tumor-Heterogenität ist eine große Herausforderung für wirksame Chemotherapie. In Tumorentwicklung, Mutationen entstehen mit zunehmender Häufigkeit und Heterogenität kann dazu führen, morphologische, genetische, und Proteomic Variabilität. Einzelne Zelle Analyse kann lösen zellulären Heterogenität innerhalb eines Tumors und bieten eine Plattform, um zu helfen, besser zu verstehen und vorherzusagen, Widerstand und Guide Arzneimitteltherapie.

Das Ziel dieser Methode ist die Variation in Hülle und Fülle an ein Zielprotein in einer Zellpopulation mit einzelligen Auflösung bestimmen. Einzelne Zelle Analyse liefert eine Reihe von Vorteilen, die nicht mit traditionellen Ensemble biochemischen Methoden zur Verfügung stehen. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Erstens kann arbeiten auf der Ebene der einzelnen Zelle die reiche Heterogenität einer Zellpopulation, die sonst durch die Mittelwertbildung verloren gehen würde zu erfassen, die mit traditionellen Ensemble biochemischen Techniken auftritt. Die meisten Arbeitspferd biochemischen Methoden arbeiten mit der Masse erfordern, wie sie oft tun, Millionen von Zellen, um ein Ergebnis zu erzielen. Natürlich die Folgen ganze Zellpopulationen zu bewerten hängt eine Reihe von Faktoren, beispielsweise die Heterogenität in Protein-Expression, wo einige wichtigen Funktionen des Vertriebs von Protein Fülle ausgelassen werden können. Aus praktischer Sicht die Empfindlichkeit der einzelnen Zelle Techniken erforderlich machen sie in der Lage, arbeiten mit Mengen von biologischem Material, das für noch empfindlicheren Bulk-Techniken funktionieren nicht ausreicht. Ein wichtiges Beispiel hierfür ist das Studium der seltene Zelltypen wie zirkulierende Tumorzellen (CTC) wo auch für Patienten mit einer schlechten prognostischen Aussichten ziehen weniger als 10 CTCs in einem einzigen 7,5 mL Blut vorhanden sein könnte. 6 hier präsentieren wir Ihnen die Methodik erforderlich, um einzelne Zelle Protein Messungen mit einem reduzierten Volumen Antikörpern basierende Assays mit Öl-capped Tröpfchen auf ein Antikörper Microarray gedruckt.
Mikrofluidische Tröpfchen Plattformen sind hohen Durchsatz in der Lage, Tausende von Tröpfchen pro Sekunde und in der Lage zu isolieren, und sogar züchten, einzelner Zellen in einzelne Tröpfchen eine Vielzahl von biochemischen Tests durchführen zu erzeugen. Tröpfchen-basierte Techniken eignen sich gut für einzelne Zellanalyse,7,8,9 mit den letzten Beispiele einschließlich DropSeq10 und InDrop11, die stark durch die Kraft des unterstützt worden Verstärkung-Techniken. Die begrenzte Menge an Material und keine Methoden der Verstärkung für Proteine machen einzelne Zelle Proteomics besonders herausfordernd.
Tröpfchen können durch eine Reihe von Methoden analysiert werden und Fluoreszenz-Mikroskopie ist weit verbreitet. Einzelmolekül-Techniken wie Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) können fluoreszierende Moleküle mit unvergleichlicher Signal-Rausch-Verhältnis visualisiert werden. 12 aufgrund der exponentiellen Zerfall der evaneszenten Feldes sind nur Fluorophore in hohen Nähe an die Oberfläche (Reihenfolge der 100nm) begeistert machen TIRF eine gute Strategie bei der Aufdeckung von kleinen Mengen eines Zielmoleküls in einer komplexen Mischung. Die optische Stationspunkte Eigenfestigkeit des TIRF hilft auch waschen Schritte zu vermeiden und Grenzen bestimmen Dauer und Komplexität. Jedoch, TIRF erfordert planare Flächen und Beispiele für TIRF-Mikroskopie auf Tropfen im Fluss angewendet beinhalten die Bildung einer planaren Fläche davon zu Bild. 13 zu diesem Zweck design-Einzelzelle Proteomic Techniken oft mikrofluidischen Chips Oberfläche immobilisiert Capture-Agenten in einem Microarray-Format. 4 , 14
Die Tröpfchen, selbst können in Arrays auf planaren Flächen, sogenannte Tröpfchen Microarrays ausgebildet sein. 15 , 16 , 17 räumlich organisieren Tröpfchen in Arrays ermöglicht es ihnen, bequem indiziert, leicht im Laufe der Zeit überwacht, individuell angesprochen und bei Bedarf abgerufen. Droplet Microarrays erreichen eine hohe Dichte von Mikroreaktoren mit Tausenden von Elementen pro Chip sind freistehend oder von Microwell Strukturen unterstützt. 18 , 19 , 20 sie können gebildet werden durch sequentielle Abscheidung von liquid Handling-Roboter, Inkjet-Spotter, wenden Sie sich an Microarrayers21,22,23,24,25, 26 , oder sie können selbst-zusammenbauen auf Oberflächen wie Superhydrophillic Flecken gemustert auf einer superhydrophob Oberfläche. 27 , 28 , 29
Mit diesen Überlegungen im Auge wurden adressierbare Tröpfchen Microarrays (ADMs) entwickelt, um die Vielseitigkeit, räumliche Adressierbarkeit und reduzierten Volumina von Tröpfchen Microarrays quantitativ mit der Empfindlichkeit der Einzelmolekül-TIRF-Mikroskopie zu kombinieren Protein-Fülle zu messen. 5 ADMs ermöglichen Einzelzelle Analyse bildet ein Tröpfchen Microarray mit einzelnen Zellen über einen Antikörper Microarray, die dann mit Öl, um Verdunstung zu verhindern begrenzt ist. Die Bände der Tröpfchen sind diskrete Probenverlust, zu verhindern, die sonst durch Ventile auf dem Chip im kontinuierlichen Fluss Mikrofluidik erreicht werden würde. 30 die absolute Menge an Zielprotein aus einer einzigen Zelle ist äußerst gering; Allerdings ermöglicht das geringere Volumen der Tröpfchen für relativ hohe lokale Konzentration, so dass sie erkannt werden, mit einem Sandwich-Antikörper-Assay - Antikörper immobilisiert ist, in eine eigenständige Region oder vor Ort, auf eine Oberfläche, die Protein fängt die wiederum bindet um ein eindringmittel gekennzeichneten detektionsantikörper in Tröpfchen Volumen vorhanden. Als markierungsfreie Ansatz (d.h. Protein Ziele müssen nicht direkt gekennzeichnet werden), ADM-Dateien sind generell für die Analyse von Zellen aus Primärquellen, wie z. B. verarbeitete Blut, gut brauchen Aspiraten und dissoziierten Tumor Biopsien sowie Zellen von Kultur und Ihre Lysaten.
Messung der Variation in Hülle und Fülle Protein in einer Zellpopulation ist wichtig bei der Bestimmung der Heterogenität, z. B. als Reaktion auf ein Medikament und hilft bei bietet Einblick in die Zellfunktionen und Wege, Bewertung von Subpopulationen und ihre Verhalten sowie seltene Ereignisse zu identifizieren, die sonst durch lose Methoden maskiert werden würde. Dieses Protokoll beschreibt, wie zu produzieren und adressierbare Tröpfchen Microarrays verwenden, um die Fülle der Transkription Faktor p53 in menschlichen Krebszellen quantitativ zu bestimmen und kann verwendet werden, um die Rolle von p53 in Reaktion auf Chemotherapeutika zu untersuchen. Das Zielprotein wird bestimmt durch die Wahl der Erfassung und Erkennung Antikörper und kann geändert werden, um mehr oder andere Ziele enthalten. Anleitung zum Erstellen einer einfachen Apparatur unter Einbeziehung einer konzentrischen Düse aus allgemeinen Labor Verbrauchsmaterial manuell Array 10 nL Tröpfchen mit Öl bedeckt. Die vollen experimentelle Verfahren ist beschrieben, wobei jedes Tröpfchen dann geladen wird, mit einer einzelnen Zelle, die dann lysiert ist und der Ausdruck des Proteins bestimmt mit Einzelmolekül-Auflösung mit TIRF-Mikroskopie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SIAL0639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontact Arrayer</td>
			<td>DigiLab, UK</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontact pin</td>
			<td>ArrayIt, USA</td>
			<td>946MP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (Nexterion)</td>
			<td>Schott, Europe</td>
			<td>1098523</td>
			<td>Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 capture antibody</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ADI-960-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>stock concentration 200&#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15557-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>61962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate (low volume)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas cylinder</td>
			<td>BOC</td>
			<td>Industrial grade, oxygen-free</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Patchman NP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Origio, Denmark</td>
			<td>MBB-FP-L-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS-210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81020</td>
			<td>Gas tight, PTFE Luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81327</td>
			<td>Gas tight, PTFE Luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone isolator</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>JTR24R-A-0.5</td>
			<td>6x4 well silicone isolator with adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter</td>
			<td>VersaLASE</td>
			<td>VLS2.30 CO2 Laser 3W</td>
			<td>for laser cutting of custom isolators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mm thick acrylic sheet</td>
			<td>Weatherall-UK</td>
			<td>Clarex Precision Sheet 001</td>
			<td>for laser cutting of custom isolators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>LOCPFG3T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 &#956;m ID/360 &#956;m OD fused silica tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>FS-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm ID/1/16&#8221; OD PFA tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.014&#8221; ID/0.062&#8221; OD PTFE tubing</td>
			<td>Kinesis</td>
			<td>008T16-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumen (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9700100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td>Millipore, Germany</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy &#38; Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF microscope with encoded XY stage</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>Nikon Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD</td>
			<td>Andor Technologies, Ireland</td>
			<td>IXON DU-897E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser excitation source</td>
			<td>Vortran, USA</td>
			<td>Stradus 488-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lysis laser source</td>
			<td>Continuum, USA</td>
			<td>Surelite SLI-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube for TIRF</td>
			<td>Chroma, USA</td>
			<td>z488bp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube for Optical Lysis</td>
			<td>Laser 2000, UK</td>
			<td>LPD01-532R-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open Source</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>version 7.14 or higher</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

counting proteins in single cells with addressable droplet microarrays

Oft zellulären Verhalten und zelluläre Reaktionen auf Bevölkerungsebene analysiert, wo die Antworten aus vielen Zellen als ein durchschnittliches Ergebnis Maskierung der reichen einzelne Zelle Verhalten innerhalb einer komplexen Population zusammengefasst sind. Einzelne Zelle Protein Erkennung und Quantifizierung Technologien haben in den letzten Jahren einen bemerkenswerten Einfluss gemacht. Hier beschreiben wir eine praktische und flexible Einzelzelle Analyse-Plattform basierend auf adressierbaren Tröpfchen Microarrays. Diese Studie beschreibt, wie die absolute heftnummern Zielproteine mit einzelligen Auflösung gemessen werden können. Der Tumorsuppressor p53 ist das am häufigsten mutierte Gen im menschlichen Krebs, mit mehr als 50 % der insgesamt Krebsfälle Ausstellen eines nicht gesunden p53 Expressionsmuster. Das Protokoll beschreibt die Schritte zum Erstellen von 10 nL Tröpfchen in dem einzigen menschlichen Krebszellen sind isoliert und die Kopienzahl des p53-Protein wird gemessen mit Einzelmolekül-Auflösung, die Variabilität der Ausdruck genau zu bestimmen. Die Methode kann auf jeden Zelltyp einschließlich Primärmaterial zu bestimmen, die absolute Kopienzahl jedes Ziel interessierender Proteine angewendet werden.

Die absoluten basalen Protein Kopienzahl des p53 wurde mit einer Einzelzelle Auflösung in eine menschlichen Dickdarm-Krebs-Zell-Linie, BE-Zellen bestimmt. Wir zeigen, wie p53 Ausdruck über mehrere Größenordnungen variieren kann und zeigen eine schwache positive Korrelation zwischen Größe und Protein Kopie Zellzahl innerhalb der ruhenden BE-Zell-Population.
Adressierbare Tröpfchen Microarrays werden gebildet, wenn wässrige Tröpfchen an Antikörper vor Ort Standorten verzichtet und mit Öl bedeckt. Hier unterstützen die Tröpfchen einen sensiblen p53 Protein Assay. Deckgläsern sind mit Capture Antikörper Flecken mit einem Kontakt Microarrayer und eine Pin angeordnet. Der Anti-p53-Capture-Antikörper stammt von einem kommerziellen ELISA-Test-Kit. Die Druckbedingungen waren so, dass Capture Flecken etwa 100 µm im Durchmesser mit einer maximalen Aufnahme-Kapazität von 6,2 ± 0,5 x 105 Proteine pro Spot waren. 32
Die Verwendung eines Isolators, gebunden an das Deckglas ermöglicht eine höhere Dichte von Tröpfchen gebildet werden, da es die Ausbreitung des Öls zu erfassen-Spots in der Nähe Antikörper begrenzt. In jede Vertiefung des Isolators sind Tröpfchen gebildet, durch den Verzicht auf einer wässrigen Lösung, die dann mit Öl gegen Verdunstung (Abbildung 1A) begrenzt ist. Eine minimale Menge an Öl kann verzichtet werden, um das Droplet Kappe; jedoch ist es sinnvoll, einem Betrag zu verzichten, füllt jeden Isolator nun genau so, dass die Öl-Oberfläche flach für die Bildgebung ist. Isolatoren sind entweder im Handel bezogen oder durch Laser schneiden Acrylplatten. Silikon-Isolatoren sind verfügbar vorgeschnittenen Brunnen in einem 4 x 6-Array (n = 24) aber in ein 4 x 11-Array geändert werden können (n = 44) mit Hilfe einen Biopsie oder Multi-Loch Leder Punch. Die lasergeschnittenen Isolator in Bild 1 b zeigt ein Array von 100 sechseckige Brunnen mit einem maximalen Durchmesser von 2,89 mm, eine Mitte-Mitte-Trennung von 3,9 mm und einer Höhe von 0,5 mm. Die Tropfen können gespeichert werden und für längere Zeit (bis zu 3 Monaten zu beobachten) stabil bleiben.
Tröpfchen entstehen manuell mit einer selbstgebauten Apparatur, übersetzt eine konzentrische Schläuche Düse (Abbildung 1), die mit zwei Spritzenpumpen (Abbildung 1A) verbunden ist. Die konzentrischen Rohren Düse besteht aus einer Fused-Silica Kapillaren, die verzichtet die wässrige Phase, gespeist durch ein kurzes Stück PEEK Rohre, die die Ölphase verzichtet. Unter Verwendung eines Mikroskops, die Düse zu einem Antikörper Ort ausgerichtet ist und die Pumpen würde zuerst die wässrige Lösung, sofort gefolgt von Öl (Abb. 1E, Schritte 1 bis 4) verzichten. Sobald alle Tröpfchen in die ADM gebildet werden, sind ein Microinjector und Mikromanipulator (siehe Tabelle Material) verwendet, um jedes Tröpfchen mit einer einzelnen Zelle (Abbildung 1) zu laden. Die Mikropipette eine Zelle aus einem Reservoir von Zellen erfassen würde, verzichtet in einer der Brunnen auf dem Chip, übersetzt werden, um ein Tropfen gut und dann durchdringen den Öldeckel um die Zelle in das wässrige Tröpfchen (Abbildung 1, Schritte 5-8) zu liefern.
Alle Punkte innerhalb der Tröpfchen werden vor der Lyse abgebildet und werden verwendet, um den Grad der unspezifischen Bindung zu den Spots (Abbildung 2A) bestimmen. Einzelzellen sind vollständig lysiert (einschließlich Zellkern) mit optischen Methoden. 31 optische Lyse stützt sich auf die Scherkraft eine expandierende Laser Puls-induzierten Kavitation Blase, die Zellen zu stören. Betreuung erfolgen, dass die Öl-Wasser-Grenzfläche durch diese Prozesse nicht gestört werden, durch eine Begrenzung der Pulsenergien und Hinterlegung Zellen Weg von der Öl/Wasser-Grenzfläche. Sobald Zellen lysiert werden, wird das Array von TIRF-Mikroskopie mit einem automatisierten Mikroskop abgebildet; Bilder werden alle 10 Minuten erworben für 30 min und dann alle 20 min für weitere 60 min. Die Bedingungen, wie Antikörper-Affinität, Protein Diffusion und Tröpfchen Volumen, sind verbindliche Gleichgewicht innerhalb der 90 min Übernahme erreicht ist. Abbildung 2Azeigt eine typische Einzelzelle Pulldown.
Das Verfahren der Bildanalyse zu bestimmen, dass die einzelnen Moleküls zählt ist schematisch in Abbildung 2 bdargestellt. Bilder der Orte gelten entweder als nicht überlastet, wo Ziel Proteinkonzentration ist so, dass einzelne Moleküle sind gut getrennt und leicht zu unterscheiden, oder überlastet, wo Zielkonzentration Protein ist höher und einzelne Molekül Bilder Überschneidungen und sind nicht mehr individuell unterscheidbar. Da die TIRF Anregung Profil uneben ist, ist es wichtig, dass alle Bilder erworben Wohnung-Feld korrigiert werden. Eine Gaußsche Unschärfe wird zu einem Frame nicht überlastet angewendet, wirkt wie ein Glättungsfilter Details und Rauschen entfernen und erzeugen Sie ein Bild mit dem durchschnittlichen Profil des Profils TIRF Erregung. Das bearbeitete Bild kann verwendet werden, um das Originalbild "flatten". Für nicht überlastet Bilder, wo auch im Gleichgewicht, gibt es nur wenige einzelne Moleküle, kann ein Rahmen verarbeitet werden, um sich selbst zu korrigieren. Dieser Ansatz gilt nicht für einen überlasteten Fleck, wo einzelne Moleküle dicht die Stelle besetzen und erfordert ein Hintergrundbild für Abflachung erworben werden. Abgeflachte Rahmen sind dann thresholded für Pixel mit Intensitäten mindestens 3 Mal die Hintergrund-Standardabweichung sowie der Mittelwert. Einzelne Moleküle werden dann automatisch erkannt, durch die Identifizierung von 4-9 gruppierten Pixel mit Zirkularität größer als 0,5 die Partikelanalyse Funktionen der Fidschi-Inseln. Aus den Ergebnissen kann die durchschnittliche Intensität eines einzelnen Moleküls berechnet werden. Hiermit wird die Anzahl der Einzelmoleküle auf einen verstopften Stelle bestimmen, indem man die Antikörper erkennen Gesamtintensität durch die bekannten durchschnittliche Intensität eines einzelnen Moleküls. Diese Schritte können mit Fidschis Skripteditor automatisiert werden.
Eine Konzentrationsreihe wird durchgeführt, um festzustellen, die Anzahl der einzelnen Moleküls im Gleichgewicht in den Tröpfchen mit bekannten Konzentrationen von rekombinantem p53 Protein (Abb. 3A). Die Bedingungen sind, so dass die Erfassung Antikörper stellen einen Bruchteil des gesamten Zielproteins, ca. 1 % in der Region der Linearität zu erfassen (für 105-108 Proteine pro Tropfen R2 = 0,99). Das Niveau der unspezifischen Bindung in den Tröpfchen ist 187 ± 60 Moleküle. Die Ergebnisse der einzelnen Zelle Pulldowns können dann umgewandelt werden, um Verteilungen der absolute Protein Kopienzahl pro Zelle zu erreichen. Abbildung 3 b zeigt die Verteilung der absolute p53-Protein-Expression in BE Einzelzellen mit ADM-Dateien. P53-Protein-Expression in den BE-Zellen, die genetisch identisch oder sehr ähnlich zu ausgegangen werden kann, ist ein stochastischer Prozess. Die Verteilung ist Gamma-ähnliche - asymmetrisch und unimodalen mit einem langen Schweif. Infolgedessen der Mittelwert (1,82 × 106 Proteine) kann überschätzen die modale Protein Fülle (bin 0 - 5,0 × 105 Proteine) und die Standardabweichung (1,88 × 106 Proteine) nicht vollständig erfassen die Funktionen der Verteilung. Diese Verteilung ist ein Beispiel für die Bedeutung der einzelnen Zelle Messungen, die Heterogenität der Proteinexpression in der Zellpopulation, die andernfalls verloren wären, wenn mit loser Schüttung Messungen durchschnittlich zu erfassen. Zusätzliche Parameter für jede Zelle können gemessen werden. Hier dürfte das Zellvolumen durch Messung jeder Zelle Durchmesser vor der Lyse in den Tropfen und vorausgesetzt, dass die Zelle etwa kugelförmig ist. Abbildung 3 zeigt einen Vergleich der p53 absolute Protein Kopienzahl in Einzelzellen BE als Funktion der Zellengröße. Es gibt eine Tendenz zu größeren Zellen eine höhere Summe p53 Kopienzahl haben. Interessanterweise ist es möglich von der Verteilung gibt es Koordination zwischen p53 Ausdruck und Zellengröße, da scheint es eine minimale p53 Kopienzahl pro Zelle zu sein; jedoch die Mechanismen, mit denen diese entsteht, bedarf weiterer Untersuchungen.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56110/56110fig1v2.jpg"> Abbildung 1: adressierbare Tröpfchen Microarray Apparat und Chip. (ein) Tröpfchen entfallen manuell über einen 3-Achsen-Manipulator, um eine konzentrische Schläuche Düse zu übersetzen. Das wässrige Tröpfchen wird an bestimmten Stellen in einem Antikörper Microarray gefolgt von Kappung Öl verzichtet. (b) der Isolator ermöglicht eine höhere Dichte von adressierbaren Tröpfchen auf das Substrat durch Begrenzung der Ausbreitung des Öls. Isolatoren können durch Laser schneiden 0,5 mm Acrylplatten hergestellt werden. Zugunsten der Visualisierung der Tröpfchen, blaue Lebensmittelfarbe färben ist hinterlegt mit den Apparat in einem). 10 mm Einschub-Skala Skala bar 1 mm. (c) konzentrische Schläuche Düse adressierbare Tröpfchen ermöglicht gebildet werden, wie in Schritt 1.2 des Protokolls montiert. (d) eine Microinjector und Mikromanipulator werden verwendet, um Zellen in einzelne adressierbare Tröpfchen, zubereitet wie in Schritt 1.3 des Protokolls zu isolieren. (e) die grundlegende Schritte erstellen und Laden der adressierbare Tröpfchen wird angezeigt. Eine Antikörper-Stelle befindet sich mit einem codierten Übersetzung Stadium (1) Soweit die Spitze der Kapillare Schläuche ausgerichtet ist (2) und die wässrigen (3) dann Öl (4) Komponenten entfallen. Einzelne Zellen können mit einem Glas Microcapillary (5-8) kann immer wieder das wässrige Tröpfchen (7) und Hinterlegung eine Zelle (8) geladen werden. Skalieren Sie Bars 100 µm. Der rote Pfeil (5) und (8) isolierten Einzelzelle und der Inset (8) zeigt die isolierten Einzelzelle bei hoher Vergrößerung (Skala bar 10 µm). Teile dieser Figur verändert wurde, vom Verweis12, reproduziert mit Erlaubnis von The Royal Society of Chemistry. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56110/56110fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56110/56110fig2.jpg"> Abbildung 2: Bild Analyseschritte. Jede Stelle im Array wird in regelmäßigen Abständen durch TIRF-Mikroskopie abgebildet, bis Gleichgewicht (tEq) (90 min für p53-Assay) erreicht ist. Die Gleichgewichtszeit hängt von t in Lösung als auch die Affinitäten der Antikörper-Paares für das gezielte Protein. (a) Beispiel Einzelmolekül TIRF-Mikroskopie Bilder Hintergrund sowie ein Beispiel Einzelzelle Pulldown (Skala Bars 20 μm). Einschub-Bild zeigt einen vergrößerten Teil des Hintergrundbildes mit einigen Einzelmoleküle hervorgehoben durch rote Pfeile (Skala bar 5 μm). (b) Gliederung der in Schritt 3 des Protokolls detaillierte Bildanalyse. Kurz gesagt, gibt es zwei breiten Regime, wo die Spots gelten darf, sind nicht verstopft, einzelne Moleküle spärlich und überlasteten, wo die Dichte der einzelnen Moleküle ist derart, dass es erhebliche Überschneidungen und kann nicht mehr einzeln identifizierbar sein. Ein entscheidender Schritt in der Bildanalyse ist Feld Abflachung um den Effekt des Profils ungleichmäßige Intensität der Erregung Laser entfernen. In der digitalen Zählwerk Regime werden einzelne Moleküle direkt identifiziert anhand ihrer Form und Intensität Parameter. In der analogen zählen Regime errechnet sich die Anzahl der einzelnen Moleküle durch die Messung vor Ort Gesamtintensität im Gleichgewicht und dividiert durch die durchschnittliche Intensität eines einzelnen Moleküls, die aus dem digitalen zählen Regime bekannt ist. Schritte können unkompliziert in ImageJ zum Analysieren der Daten automatisiert werden. Die unteren Panel Bildsequenz zeigt Ansammlung von Zielprotein auf die Antikörper-Erfassung vor Ort; Flecken sind zunächst nicht überlastet (t1), während als Zielprotein Antikörper vor Ort ansammelt, die einzelnen Moleküle zunehmend werden können (tn) verstopft, bis Gleichgewicht (tEq) erreicht ist. Beachten Sie, dass ein Ort, nicht überlastet bleibt oder überlastet hängt eine Reihe von Faktoren ab, insbesondere die Fülle des Zielproteins in der Analyse-Volumen. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56110/56110fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56110/56110fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Single Zellendaten. Absolute Quantifizierung erfolgt über eine Kalibrierungskurve. (ein) einzelne Molekül zählt erfolgt über bekannte Konzentrationen des rekombinanten Proteins. Dies ist eine Kalibrationskurve und wird verwendet, um Einzelmolekül gezählt auf jede Stelle, Anzahl der Zielproteine in der Analyse Volumen umwandeln und daher einzelne Kopie Handynummer. Der horizontale rote gestrichelte Linie gibt die unspezifische Bindung von 187 ± 60 Molekülen. Die Fehlerbalken sind eine Standardabweichung des Mittelwerts 3 experimentelle läuft. Die gestrichelte Linie repräsentiert 100 % Erkennung von Protein. (b) eine Verteilung von der einzelnen Zelle basale p53-Protein-Expression in BE Krebszellen zeigt einer Long-tailed Gamma-ähnliche Verteilung zeigen, wo p53-Protein-Expression in einigen Zellen deutlich höher als der Modalwert ist. (c) Scatter Plot von p53 Protein Kopienzahl pro Zelle als eine Funktion des Zellvolumens zeigt, wie Protein-Expression in Abhängigkeit von der Zellgröße variiert. Teile dieser Figur wurden von 12 geändert und mit Erlaubnis reproduziert. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56110/56110fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Hier präsentieren wir Ihnen adressierbare Tröpfchen Microarrays (ADM-Dateien), ein Tröpfchen Array-basierte Methode absolute Protein Fülle in einzelnen Zellen zu bestimmen. Wir zeigen die Fähigkeit der ADM-Dateien, die Heterogenität im Ausdruck der Tumorsuppressor Protein p53 in einem menschlichen Krebs-Zell-Linie zu charakterisieren.

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

counting-proteins-in-single-cells-with-addressable-droplet-microarrays

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.4K Aufrufe.  Imperial College London. Hier präsentieren wir Ihnen adressierbare Tröpfchen Microarrays (ADM-Dateien), ein Tröpfchen Array-basierte Methode absolute Protein Fülle in einzelnen Zellen zu bestimmen. Wir zeigen die Fähigkeit der ADM-Dateien, die Heterogenität im Ausdruck der Tumorsuppressor Protein p53 in einem menschlichen Krebs-Zell-Linie zu charakterisieren.

Serie: Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Forschung

Krebsforschung

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly indicate that aneuploidy triggers genome instability, ultimately generating cells with complex karyotypes that arrest their proliferation. Isolation and characterization of cells harboring complex karyotypes are crucial to study the impact of an imbalanced chromosome number on cell physiology. To date, no methods have been established to reliably isolate such aneuploid cells. This paper provides a protocol for the enrichment and analysis of aneuploid cells with complex karyotypes utilizing standard, inexpensive tissue culture techniques. This protocol can be used to analyze several features of aneuploid cells with complex karyotypes including their induced senescence-associated secretory phenotype, pro-inflammatory properties, and ability to interact with immune cells. Because cancer cells often harbor imbalances in chromosome number, it is crucial to decipher how aneuploidy impacts cell physiology in normal cells, with the ultimate goal of uncovering both its pro- and anti-tumorigenic effects.

Aneuploidy leads to genome instability, which eventually produces cell cycle-arrested cells with complex karyotypes. This paper provides a simple and convenient method to isolate aneuploid cells with complex karyotypes that cease to divide.

Generation und Isolierung des Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotyp

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and protein functions, and cell signaling aberrations may therefore serve as biomarkers to indicate personalized treatment options. As opposed to DNA and RNA analyses, changes in protein activity can more efficiently evaluate the mechanisms underlying drug sensitivity and resistance. Phospho flow cytometry is a powerful technique that measures protein phosphorylation events at the cellular level, an important feature that distinguishes this method from other antibody-based approaches. The method allows for simultaneous analysis of multiple signaling proteins. In combination with fluorescent cell barcoding, larger medium- to high-throughput data-sets can be acquired by standard cytometer hardware in short time. Phospho flow cytometry has applications both in studies of basic biology and in clinical research, including signaling analysis, biomarker discovery and assessment of pharmacodynamics. Here, a detailed experimental protocol is provided for phospho flow analysis of purified peripheral blood mononuclear cells, using chronic lymphocytic leukemia cells as an example.

Here, a protocol for medium- to high-throughput analysis of protein phosphorylation events at the cellular level is presented. Phospho flow cytometry is a powerful approach to characterize signaling aberrations, identify and validate biomarkers, and assess pharmacodynamics.

Phospho-Durchflusszytometrie mit fluoreszierenden Zelle Barcoding für einzelne Zelle Signalisierung Analyse und Entdeckung von Biomarkern

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth factors and matrix-associated proteins in the microenvironment in vivo. Furthermore, readily available reagents for the modeling of microenvironments in vitro typically utilize complex mixtures of proteins that are incompletely defined and suffer from batch to batch variability. The microenvironment microarray (MEMA) platform allows for the assessment of thousands of simple combinations of microenvironment proteins for their impact on cellular phenotypes in a single assay. The MEMAs are prepared in well plates, which allows the addition of individual ligands to separate wells containing arrayed extracellular matrix (ECM) proteins. The combination of the soluble ligand with each printed ECM forms a unique combination. A typical MEMA assay contains greater than 2,500 unique combinatorial microenvironments that cells are exposed to in a single assay. As a test case, the breast cancer cell line MCF7 was plated on the MEMA platform. Analysis of this assay identified factors that both enhance and inhibit the growth and proliferation of these cells. The MEMA platform is highly flexible and can be extended for use with other biological questions beyond cancer research.

The purpose of the method presented here is to show how microenvironment microarrays (MEMA) can be fabricated and used to interrogate the impact of thousands of simple combinatorial microenvironments on the phenotype of cultured cells.

Verwendung von Mikroarrays zur Vernehmung von Mikroumweltauswirkungen auf zelluläre Phänotypen bei Krebs

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or without adjuvant therapy depending on lymph node involvement as determined by lymphadenectomy. Lymphadenectomy is a morbid procedure, which has not been shown to have a therapeutic benefit in many patients, and thus a new method to diagnose lymph node metastases is required. To test novel imaging agents, a reliable model of endometrial cancer with retroperitoneal lymph node metastases is needed. The VX2 endometrial cancer model has been described frequently in the literature; however, significant variation exists with respect to the method of model establishment. Furthermore, no studies have reported on the use of cultured VX2 cells to create this model as only cells propagated in vivo have been previously used. Herein, we present a standardized surgical method and post-operative monitoring method for the establishment of the VX2 endometrial cancer model and report on the first use of cultured VX2 cells to create this model.

This protocol presents a standardized method to grow VX2 cells in culture and to create an orthotopic VX2 model of endometrial cancer with retroperitoneal lymph node metastases in rabbits. Orthotopic endometrial cancer models are important for the pre-clinical study of novel imaging modalities for the diagnosis of lymph node metastases.

Ein orthotopisches Endometriumkrebs-Modell mit retroperitonealer Lymphadenopathie made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase chain reaction (PCR)-based method allows for robust measurements of enzyme activity from most cell lysates. The gel-based TRAP with fluorescently labeled primers limits sample throughput, and the ability to detect differences in samples is restricted to two fold or greater changes in enzyme activity. The droplet digital TRAP, ddTRAP, is a highly sensitive approach that has been modified from the traditional TRAP assay, enabling the user to perform a robust analysis on 96 samples per run and obtain absolute quantification of the DNA (telomerase extension products) input within each PCR. Therefore, the newly developed ddTRAP assay overcomes the limitations of the traditional gel-based TRAP assay and provides a more efficient, accurate, and quantitative approach to measuring telomerase activity within laboratory and clinical settings.

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We successfully converted the standard telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay to be employed in droplet digital polymerase chain reactions. This new assay, called ddTRAP, is more sensitive and quantitative, allowing for better detection and statistical analysis of telomerase activity within various human cells.

Tröpfchendigital TRAP (ddTRAP): Anpassung des Telomere Repeat Amplification Protocol an die Reaktion auf die digitale Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal models are required for bridging the nanotechnology to its biomedical application. The mouse represents the traditional animal model for preclinical testing; however, mice are relatively expensive to keep and have long experimental cycles due to the limited progeny from each mother. The zebrafish has emerged as a powerful model system for developmental and biomedical research, including cancer research. In particular, due to its optical transparency and rapid development, zebrafish embryos are well suited for real-time in vivo monitoring of the behavior of cancer cells and their interactions with their microenvironment. This method was developed to sequentially introduce human cancer cells and functionalized nanoparticles in transparent Casper zebrafish embryos and monitor in vivo recognition and targeting of the cancer cells by nanoparticles in real time. This optimized protocol shows that fluorescently labeled nanoparticles, which are functionalized with folate groups, can specifically recognize and target metastatic human cervical epithelial cancer cells labeled with a different fluorochrome. The recognition and targeting process can occur as early as 30 min postinjection of the nanoparticles tested. The whole experiment only requires the breeding of a few pairs of adult fish and takes less than 4 days to complete. Moreover, zebrafish embryos lack a functional adaptive immune system, allowing the engraftment of a wide range of human cancer cells. Hence, the utility of the protocol described here enables the testing of nanoparticles on various types of human cancer cells, facilitating the selection of optimal nanoparticles in each specific cancer context for future testing in mammals and the clinic.

Described here is a method for utilizing zebrafish embryos to study the ability of functionalized nanoparticles to target human cancer cells in vivo. This method allows for the evaluation and selection of optimal nanoparticles for future testing in large animals and in clinical trials.

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

Multiparametrisches Tumor-Organoid-Wirkstoff-Screening mit Weitfeld-Live-Cell-Imaging für die Bulk- und Einzelorganoid-Analyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...