Die Autoren möchten die Freiwilligen für ihre Teilnahme an diesen Studien und das OP-Personal an der Boston Medical Center für die Bereitstellung von Fettgewebe Biopsien zu danken. Dr. Gökce wird unterstützt von der National Institutes of Health (NIH) Zuschüsse, HL081587, HL114675 und HL126141. Dr. Farb stützt sich auf NIH K23 HL135394 zu gewähren.

das Protokoll und die hier beschriebenen Beispiele wurden von Boston Universität Schule von Medizin Institutional Review Board (IRB, Protokoll #H-25644) genehmigt und wurden im Einklang mit der Deklaration von Helsinki. Alle Themen zur Verfügung gestellt schriftliche Einwilligungserklärung vor Teilnahme.
 1. Vorbereitung der Lösungen und Mikro-Glas Kanülen <ol><li>Vorbereitung der 4-2-Hydrosyethyl-1-Piperazineethanesulfonic sauer (HEPES) Kochsalzlösung. Für 1 L auflösen 8,059 g NaCl, 0,298 g KCl, 0,296 g MgSO 4 &#8226; 7 H 2 O, 0,235 g CaCl 2 &#8226; 2 H 2 O, 0,16 g KH 2 PO 4, 0,01 g EDTA, 1,081 g D-Glucose und 2,383 g HEPES Säure in 950 mL entionisiertem Wasser. Stellen Sie die Lautstärke bis 1 L mit entionisiertem Wasser. Einstellen Sie pH auf 7,4 mit NaOH. HEPES-Puffer kann bis zu 7 Tage im 4 gelagert werden ° C.</li>
	<li>Bereiten die 20 x Salz Ausgleichslager. Für 1 L, Hinzufügen von 143,8 g NaCl, 7,0 g KCl, 5,9 g MgSO 4 und 7,4 g CaCl 2 &#8226; 2 H 2 O in 900 mL destilliertem Wasser. Volumen bis 1 L mit entionisiertem Wasser bilden. Speichern-Stammlösung bei 4 ° c</li>
	<li>Bereiten die 20 x Ausgleichslager. Fügen Sie für 1 L 26,8 g Nahco3 3 und 0,2 g EDTA·2H 2 O in 900 mL entionisiertem Wasser hinzu. Volumen bis 1 L mit entionisiertem Wasser bilden. Speichern-Stammlösung bei 4 ° c</li>
	<li>Bereiten Sie die KREBS-Lösung während der physiologischen Experimente verwendet werden. Fügen Sie für 1 L 900 mL entionisiertem Wasser, 50 mL 20 x Ausgleichslager und 50 mL 20 x Salz Pufferlösung, 0,99 g D-Glucose und 0,16 g KH 2 PO 4 hinzu. Stellen Sie pH auf 7,4 mit HCl. Um pH des Puffers zu erhalten, ständig rühren und bedecken Sie mit Paraffin oder Blase kontinuierlich.
	<ol><li>Check der pH-Wert alle 20 min. die KREBS-Lösung machen täglich frisch.</li>
	</ol></li> <li>Mikro-Glas Kanülen mit einem Innendurchmesser von 40-240 µm mit einem handelsüblichen Nadel/Pipette Abzieher zu machen. Die Größe der Glas-Kanülen richtet sich nach der Größe des Innendurchmessers der isolierten Blutgefäße (50-350 µm). Alternativ kaufen Mikro-Glas Kanülen von der vorgegebenen Größe.</li>
</ol> 2. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li>bereiten das Acetylcholin (Ach, 10 -2 M, Stammlösung). 18,29 g in 10 mL entionisiertem Wasser auflösen. Speichern Sie Aliquote 1 mL der Stammlösung (10 -2 M) bei-80 ° C. Am Tag des Experiments seriell verdünnt, um die folgenden Arbeiten-Konzentrationen zu erhalten: 10 -5, 10 -9 10 -6, 10 -7, 10 -8 M.</li>
	<li>Bereiten die Papaverine (2 x 10 -2 M, Stammlösung). 0,07517 g in 10 mL entionisiertem Wasser auflösen. Vorbereitung 10 µL-Aliquots der Stammlösung und bei-80 ° c seriell zu verdünnen, um 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7 10 -8 M am Tag des Experiments zu erhalten.</li>
	<li>Vorbereitung der Endothelin-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, Stammlösung). Auflösen von 50 µg Endothelin-1 in 1 mL 1 % BSA/PBS. Speichern Sie Aliquote 1 mL der Stammlösung (2 x 10 -5 M) bei-80 ° C. Am Tag des Experiments verdünnen, eine arbeiten-Konzentration von 10 -10 M am Tag des Experiments zu erhalten.</li>
	<li>Speichern von Reagenzien in entweder-20 ° C oder bis-80 ° C je nach Art der Gefrierschrank zur Verfügung, aber nicht länger als 6 Monate.</li>
</ol> 3. Fettgewebe Sammlung und Schiff Vorbereitung <ol><li>Recruit übergewichtige Männer und Frauen (Body-mass-Index (BMI) &#8805; 35 kg/m ², Alter &#8805; 18 Jahre) in der Adipositaschirurgie Programm Boston Medical Center (BMC) eingeschrieben. Insgesamt 40 Personen nahmen an diesen Experimenten.</li>
	<li>Subkutane und viszeralen Fettgewebe Proben während der geplanten bariatrischen Operationen durch den Chirurgen die Operation sammeln.
	<ol><li>Ernte das subkutane Fettgewebe von der unteren Bauchwand und viszerale Fett aus den großen Omentum, beziehungsweise. Typische fettes Gewebe-Stichprobenumfang variiert von 3 bis 10 mg Gewebe.</li>
		<li>Ort-Gewebe sofort in kaltes HEPES-Puffer Lösung mit einem pH-Wert von 7,4 und Store bei 4 ° C für bis zu 24 h 
		Hinweis: Darüber hinaus adipöse Arteriolen erhalten Sie bei schlanken Personen als auch bei anderen Arten von Operationen wie Leistenbruch Reparaturen oder plastische Chirurgie, und kann auch aus dem subkutanen Depot via Trans-kutanen Abdominal-Fettlappen Biopsie biopsiert werden 6.</li>
	</ol></li> <li>Mit einem Gewebe Dissektion Mikroskop, Mikro-Schere und Mikro-Pinzetten, vorsichtig umgebenden Fett- und Bindegewebe aus der kleinen adipösen Arteriolen (50-350 µm Intraluminal Durchmesser, Länge ca. 2-3 mm).</li>
	<li>Tie alle Äste auf der Arteriolen mit winzigen Nylon oder Seide Nähte, bevor auf die Kapillare Glaspipetten Metallspirale. Sorgfältig die Arteriolen zu sezieren, da auch kleinere Schäden der Arteriola Wand erhebliche Funktionsänderungen verursacht.
	<ol><li>Minimieren Schiff Einwirkung von Licht und Wärme als es kann Vasodilatation führen. Da es manchmal schwer, Arteriolen Venolen unterscheiden lässt, identifizieren Sie die Größe und glatten Muskulatur Ton der Schiffe durch Schneiden die Spitzen der Schiffe. Arteriolen sind in der Regel kleiner und zeigen mehr Ton im Vergleich zu Venolen.</li>
	</ol></li> <li>Bereiten die Orgel-Kammer. Füllen Sie langsam die Kapillare Glaspipetten und Gummischlauch mit KREBS Lösung mit einer 10 mL Spritze.</li>
	<li>Gummischlauch wird befüllt und Kapillare Glaspipetten in KREBS-Lösung innerhalb der Organ-Kammer eingetaucht sind, cannulate die Arteriolen sicher auf der gesicherten Pipetten und binden Sie beide Enden der Arteriola mit Nylon oder Seide Naht Knoten sorgfältig.</li>
	<li>Füllen Sie die Orgel-Kammer mit KREBS-Lösung bis zu 2 mL.</li>
	<li>Sichern die Orgel Kammer auf eine Bühne mit der inversen Mikroskop (Vergrößerung 10 X / 0,25 Ziel) und Videokamera.</li>
	<li>Schalten Sie die Rand-Erkennungssoftware, die in gestreamt wird in Echtzeit auf einer Sampling-Rate von 1 kHz (1 Frame/s).</li>
	<li>Verbinden einseitig des unter Druck stehenden Schläuche zur KREBS-Lösung gefüllten Druck Stauseen von Mikroblasen, frei wie Luftblasen experimentellen Fehler einführen können. Schließen Sie jenseits des unter Druck stehenden Leitungen an der Orgel Kammer.</li>
	<li>Die KREBS Lösung gefüllt Druck Stauseen an der Drucksensor mit sauberen Schlauch anschließen.</li>
	<li>Steuern, Intra-luminalen fließen durch die Regelung der Höhe dieser beiden Lagerstätten; also wenn Stauseen auf der gleichen Höhe platziert sind Intra-luminalen Stromstille erfolgt.</li>
	<li>Nach Abschluss all dieser Prozesse, schalten Sie Block und Software Heizprogramm, Temperatur bei 37 ° c kontinuierlich Durchspülen des Schiffes mit KREBS-Lösung und belüften mit einem Gasgemisch von 5 % CO 2, 21 % O 2 und 74 % N 2 7 , 8 während des gesamten experimentellen Verfahrens.</li>
	<li>Zum gewünschten Druck Insi zu erreichende das Lumen der isolierten Behälter schrittweise Erhöhung den Intraluminal Druck (5 MmHg, alle 5 min.) über die Druck-Steuerung im Bedienfeld "Myo-Schnittstelle" dabei mit einer niedrigen Übertragungsrate endotheliale Schicht beschädigen. 
	Hinweis: Sobald der Druck 60 MmHg erreicht, ist höchstens 20-30 min Gleichgewichtherstellung erforderlich, um das Schiff zu stabilisieren. Alle Gefäßfunktion Studien sind bei 60 MmHg und 37 ° C bei pH 7.4 durchgeführt. 7</li></ol> 4. Bewertung der adipösen mikrovaskuläre Funktion Hinweis: im Allgemeinen kann adipöse Arteriola Endothel-abhängige Vasodilatation in Reaktion auf physiologische (strömungsinduzierte) hervorgerufen werden und pharmakologische Stimuli (Ach-induzierten).
<ol><li>Flow-vermittelten, Endothel-abhängige Vasodilatation <ol><li>nach Druckbeaufschlagung, aufzeichnen den Durchmesser der adipösen Arteriola im Ruhezustand (Di). Dies nennt man den ruhenden Grundlinie Durchmesser.</li>
		<li>Pre verengen sich die Blutgefäße, ~ 55 % des ruhenden Grundlinie Durchmessers (Dp) durch Zugabe von 1 µL des Endothelin-1 (ET-1, 10 &#8722; 10 M) direkt an der Badewanne und 5 min warten Effekt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis erreichen der gewünschten ~ 55 % Zustand Pre eingeschnürt.</li>
		<li>Nach Pre-Verengung, induzieren kontinuierlichen Fluss in den Intraluminal Raum des Fettgewebes Arteriolen, in gleiche und entgegengesetzte Richtungen, damit eine Druckdifferenz über das Schiff entwickelt werden kann, ohne Veränderung des mittleren Intraluminal Drucks von 60 MmHg. 
		Hinweis: zum Beispiel wenn ein Behälter von 10 cm in der Höhe nach oben bewegt, muss dem andern nach unten verschoben werden, um 10 cm verändern Druckgradienten und damit Intraluminal Durchflussmenge ändern. Wenn genauere Durchflussmessungen Tarif gewünscht werden, kann eine quantitative Durchflussmesser-System auf den Versuchsaufbau angewendet werden.</li>
		<li>Messen Fluss-vermittelte Dilatation 3-5 min nach der Einleitung der Fluss Induktion. Die Niveaus des Intraluminal Strömung (Druckgradienten) sein können im Bereich von 0 - 100 CmH 2 O. erhöhen jedes Inkrement des Druckgradienten durch Δ10 CmH 2 O alle 5-6 Minuten, bis zu einem Maximum von 100 CmH 2 O. 
		Hinweis: Um stabile laminare Strömung in das Lumen zu induzieren, müssen beide micro Glas Kanüle Tipp Größen, ganz nah an Innendurchmesser der Arteriolen; Andernfalls wird turbulente Strömung innerhalb des Lumen zu produzieren und verursachen unerwünschte Messfehlern.</li>
		<li>Anschluss an den Fluss-vermittelte Dilatation Bewertung zurück Druck Stauseen auf die gleiche Höhe (60 MmHg).</li>
		<li>Dann Arteriola und Kammer zu waschen, indem Sie sofort Lösung aus Kammer und mit frischen KREBS-Lösung zu ersetzen. Dies geschieht mit Vorsicht hinsichtlich der abgehängten Arteriola innerhalb der Kammer nicht zu stören.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-4 Mal für 20-30 Minuten, oder bis der ruhenden Grundlinie Durchmesser der isolierte Behälter wieder.</li>
	</ol></li> <li>Acetylcholin-vermittelte, Endothel-abhängige, Vasodilatation <ol><li>Wenn die adipösen Arteriola dem ruhenden Grundlinie Durchmesser zurückgekehrt ist, vorab zu verengen Schiff ~ 55 % durch die Gabe von Endothelin-1 (ET-1, 10 &#8722; 10 M) direkt an der Badewanne, wie oben beschrieben in Abschnitt 4.1.2.</li>
		<li>Nach Pre-Verengung, sequenziell verwalten steigenden Dosen (2 µL) von Acetylcholin ist ein Rezeptor-vermittelte, Stickoxid-Agonist (Ach, 10 -9 bis 10 -5 M) direkt zum Bad. Notieren Sie die Änderung in Arteriolen Durchmesser 5 min nach Verabreichung einer einzelnen Dosis.</li>
		<li>Das Schiff angekommen ein Plateau nach Verabreichung der letzten Dosis Ach, waschen das Schiff 3-4 Mal mit KREBS-Lösung. Lassen Sie 20-30 min für Schiff zu erholen und zurück zur Grundlinie Durchmesser ruhen. Wechseln Sie zur Aufrechterhaltung der pH-Wert in der Orgel-Sturz KREBS Lösung alle 15 min.</li>
	</ol></li> <li>Inkubieren der Arteriola mit N w - Nitro - l-Arginin-Methylester (L-NAME, 10 -4 M), ein Inhibitor der Stickoxid-Synthase für 30 min, und dann wiederholen 4.2.1 und 4.2.2 zur Charakterisierung der relative Anteil der Stickstoffmonoxid, Ach-vermittelten Vasodilatation.</li>
	<li>Bewerten Endothel-unabhängige Vasodilatation (vaskuläre Glattmuskel-Funktion) und Schiff Lebensfähigkeit durch eine sequentielle Gabe von steigenden Dosen von Papaverine (10 -8 bis 10 -4 M) direkt zum Bad. Wenn die Gefäß-Durchmesser nicht wieder auf, oder den ruhenden Grundlinie (Di) Durchmesser als Reaktion auf Papaverine (d.h. entsprechende Vasodilatation überschreiten), betrachten das Schiff nicht lebensfähig und verwerfen Datenpunkte.</li>
</ol> 5. Datenanalyse und Berechnung <ol><li>berechnen die vaskuläre Reaktivität. Verwenden Sie Prozent Vasodilatation für Datenausdruck Grundlinie Unterschiede Schiffs Durchmesser berücksichtigen und unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnen: % Vasodilatation (DT-Dp/Di-Dp) × 100 = wo DT ist der aufgezeichneten Durchmesser zu einem bestimmten Zeitpunkt (maximal Durchmesser), Dp ist der Durchmesser aufgezeichnet nach der Zugabe der Vasokonstriktion Agent (i.e. ET-1 verursachte Verengung Durchmesser), und Di ist der Durchmesser, die unmittelbar vor der Zugabe des Agenten Vasokonstriktion (ruhende Grundlinie Durchmesser) aufgezeichnet. 9</li> <li>definieren Vasodilatation und Vasokonstriktion Empfindlichkeit (Dosis-Wirkungs-) um ein Agonist als die Konzentration von Ach, Papaverine oder ET-1, die 50 % der maximalen Antwort (EG 50) entlockt definiert durch eine sigmoidale Parameter und geplottet, wie zuvor beschrieben. 10 Hinweis: die Inter Beobachter Reproduzierbarkeit Studien der Vasodilatation der adipösen Mikrogefäßen hat einen hohe Korrelationskoeffizienten (CC) von 0,99 (n = 10 Schiff Experimente) in unserem Labor.</li></ol>
 6. statistische Analyse <ol><li>Express kontinuierliche Messungen als ± SEM bedeuten Diese tendenziell normalverteilt sind. Vaskuläre Reaktivität in adipösen Arteriolen durch wiederholte Maßnahmen zwei-Wege-ANOVA analysieren.</li>
	<li>Vergleichen alternativ die Fläche unter der Kurve (AUC) der Handlung für kumulative Vasodilatation zu Dosis-Reaktionen zwischen den Behandlungsgruppen. In allen Fällen erwägen, P &#60; 0,05 statistisch signifikante.</li>
</ol>

<ol>
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Autoren haben keine Angaben oder Interessenkonflikte zu berichten.

Die Dissektion und Isolierung von adipösen Arteriolen aus den umliegenden Geweben können ein Zeit- und arbeitsintensiver Prozess mit viel Liebe zum Detail und technisches Protokoll sein. Das Mikrodissektion Verfahren erfordert sorgfältige Fähigkeiten und spezialisierte Dissektion Utensilien um mögliche Schäden zu vermeiden, der glatten Muskulatur oder endothelialen Schichten von den Microvasculature Zelle. Selbst kleinste versehentliche Einstiche in der Arteriolen Wand können Intraluminal Druckbeaufschlagung und Ergebnisse in einem erfolglosen Versuch verhindern. Darüber hinaus ist Kanülierung der Arteriolen mit Nahtmaterial entscheidend für die Arteriolen zwischen den Glas-Kapillare Pipettenspitzen an jedem Ende des Schiffes zu sichern.
Menschlichen isolierende Mikrogefäßen können spontane myogen Ton nach 30-40 min Druckbeaufschlagung bei 60 MmHg entwickeln. Allerdings haben wir festgestellt, dass menschliche Fettgewebe Arteriolen Größe in der Regel 50-350 µm der luminalen Innendurchmesser sind relativ klein mit geringer Dichte Schichten von vaskulären glatten Muskelzellen und neigen nicht zu signifikanten myogen Ton im Vergleich zu Skelettmuskeln Arteriolen zu entwickeln. Somit haben wir die Pre-Verengung der diese kleinen Arteriolen mit ET-1 vor der Exposition gegenüber Vasodilatatoren auslösen. Wir finden, dass ET-1 eine zuverlässigere Vasokonstriktor Antwort ausübt, während in einigen Fällen möglicherweise Variabilität in Antworten auf alpha-Rezeptor-Agonisten wie Phenylephrin. Es ist unbedingt erforderlich, die entsprechende Agonisten induzieren eine gewünschte ~ 55 % Pre Einschnürung zu wählen; Allerdings ist es auch wichtig, wählen die richtige Menge an Pre einengenden Agent über Dosierung und toxische Schäden des Schiffes zu verhindern. Dies erreichen wir mit der unteren Reihe Dosis beginnen und bis titrieren, wie in Abschnitt 4.1.2 beschrieben zu bewirken.
Arteriolen im Fettgewebe reagieren empfindlich auf Veränderungen im pH-Wert und Temperatur; 14 ist es daher entscheidend zur Überwachung und Kontrolle der entsprechenden pH-Wert (7,4) und Temperatur (37 ° C) während der experimentellen Verfahren. Während Videomicroscopy ein streng regulierte Temperatur gesteuert ist, ist es unerlässlich, den pH-Wert der Lösung in das Experiment um Verschiebungen zu vermeiden, die die Ergebnisse verzerren kann KREBS zu überwachen. Kontinuierliche sprudelt der KREBS Lösung und Ersatz-Lösung alle 15 Minuten während der Druckbeaufschlagung und Waschschritte werden pH-Schwankungen im Laufe der Zeit verringern.
Videomicroscopy ist eine nützliche Technik, um die funktionellen Eigenschaften von Mikrogefäßen untersuchen, die Technik hat eine erhebliche Lernkurve und möglicherweise arbeitsintensiv besonders während des Prozesses der vaskulären Isolation. Abhängig von der Art des Gewebes, das biopsiert, hat unsere Erfahrung mit Fettgewebe Mikrogefäßen gezeigt, dass die Kanülierung Verfahren erhebliche Menge an Zeit und Geduld nehmen kann. Darüber hinaus gibt es inhärente Zeit Empfindlichkeit zu den Experimenten als Schiffe außerhalb des Körpers neigen dazu, ihre physiologischen und funktionellen Eigenschaften im Laufe der Zeit zu verlieren. Die Experimente müssen also innerhalb der lebensfähigen Fenster der Schiffe von Minuten bis Stunden nach chirurgischen Biopsie vor eventuellen Gewebe Verfall durchgeführt werden.
Die klinische Relevanz sowie die Begründung für dieses Versuchsmodell mit Hilfe Videomicroscopy für Studium der Arteriolen durch unsere Fähigkeit, direkt Pathophysiologie in intakten ganze Segmente der menschlichen Blutgefäße entfernt von lebendigen Subjekten, Sonde unterstützt wird, kann durch nicht-invasive Bildgebung repliziert werden. In der Tat, unsere Fähigkeit, direkt zugreifen und untersuchen dysfunktionalen menschlichen Blutgefäße im Körper zum Beispiel eines fettleibig, bieten uns Gelegenheit, Einblick in die Wege, die sind differentiell in Erkrankungen verändert und entdecken Sie Roman therapeutische Ziele. Darüber hinaus veröffentlichte Daten aus unserem Labor und andere zeigen, dass ex-Vivo -Bewertung der adipösen Arteriolen Funktion korreliert mit in Vivo systemische Endothelfunktion Antworten in anderen vaskulären Betten innerhalb eines Individuums und zuordnen mit Herz-Kreislauf-Risikofaktoren wie Bluthochdruck, Rauchen, Diabetes und Entzündungen. 12 , 15 , 16 haben wir auch Daten, die zeigen einer signifikanten Korrelation zwischen immunhistochemische Ergebnisse relevant für Stickoxid-Biologie im viszeralen Fettgewebe Endothelzellen und brachial arterielle Flow-vermittelten Vasodilatation schlägt veröffentlicht parallele Anomalien in Fettgewebe und systemischer Zirkulationen. 17 da den systemischen Charakter der endothelialen Dysfunktion, glauben wir, dass diese Technik einen pragmatischen Ansatz stellt zu studieren nicht nur menschliche Gefäßgewebe aber auch potenziell nutzen diese Methode bei Tieren und klinischen Langzeitstudien Behandlungseffekte zu untersuchen. Daneben gibt es andere Techniken, um den Microvasculature untersuchen wie Draht Myographie, die tendenziell weniger technisch schwierig durchzuführen und Maßnahmen von isometrischer Anspannung der isolierten Schiffe, die verschiedenen Agonisten mit einem Kraftaufnehmer ermöglicht. Während diese Methode auch Informationen zu physiologischen Eigenschaften von Mikrogefäßen bietet, nutzen die Einrichtung keine Intra-luminalen Druck System wodurch es weniger geneigt, in Vivo Bedingungen rekapitulieren kann. Ein Vorteil des Videomicroscopy ist die Fähigkeit, einen relativ konstanten Intraluminal Druck minimieren Änderungen in Scherung in das Lumen zu induzieren. Die Methode kann auf ähnliche Größe Mikrogefäßen bei Mensch und Tier angewendet werden. 9 , 12 , 18 schließlich ist anzumerken, dass eine Reihe von im Handel erhältlichen Videomicroscopy Systeme für Kauf und Einrichtung zur Verfügung stehen; jedoch sind die insgesamt physiologische Konzepte ziemlich einheitlich über alle Plattformen hinweg. 2 , 6 , 18

Videomicroscopy ist eine nützliche Technik genutzt, um die vasomotorische Funktion der kleinen Arteriolen entfernt lebenden menschlichen Probanden ex Vivozu untersuchen. Unser Labor konzentriert sich auf sezieren, winzige Mikrogefäßen aus verschiedenen Fettgewebe Fächer, die Auswirkungen der verschiedenen adipösen Mikroumgebungen auf den Microvasculature zu charakterisieren. Ein großer Vorteil dieser Technik ist, dass Blutgefäße aus dem menschlichen Körper entfernt funktionsfähig bleiben und können leicht innerhalb von Minuten bis Stunden nach der Biopsie untersucht werden. Physiologische Bedingungen werden nachgeahmt und stetig Transmural Druck beibehalten im Bereich Intraluminal über Mikro-Glas-Kanülen, die viele in Vivo Eigenschaften zu rekapitulieren. 1 , 2 ermöglicht darüber hinaus eine zuverlässige Videomicroscopy Einrichtung mit automatisierten Rand Erkennungssoftware für qualitative und quantitative Beurteilung der Endothel-abhängigen und -unabhängige gefäßerweiternde und Vasokonstriktor Kapazität von isolierten Schiffe in Echtzeit, Genehmigungsverfahren physiologischen Schnellbewertung in Reaktion auf physikalische und pharmakologische Stimuli. 3 andere mikrovaskulären Techniken zur Verfügung stehen wie Draht Myographie, die tendenziell weniger zeitaufwendig sein und Spannung Antworten auf verschiedene Agonisten durch ein Kraftaufnehmer messen.
Unser Labor bewirbt sich Videomicroscopy um die Beziehung zwischen Adipositas und vaskuläre Dysfunktion, mit Schwerpunkt auf die Auswirkungen der verschiedenen Fettgewebe Domänen auf das Gefäßsystem zu untersuchen. Zentrale Adipositas mit Anhäufung von intra-abdominalen viszeralen Fett hat am ehesten Adipocytokine Produktion, Stoffwechselstörungen und kardiometabolischen Risiko verbunden. Es hat postuliert worden, dass Fettgewebe Dysfunktion mit Überproduktion von Pro-atherogenen Zytokine und Adipokine Dysregulation sind stark in diese Prozesse involviert, aber bestimmte regulatorische Moleküle und Behandlungsziele weitgehend bleiben unentdeckt. 4 im übrigen auf die lokale Fettgewebe Ebene Kapillare Verdünnung und beeinträchtigte Durchblutung haben Fettgewebe Pseudohypoxia und metabolische Dysregulation in Verbindung gebracht worden. Die Hypothese, dass Herz-Kreislauf-Krankheit möglicherweise die Folge von Fettgewebe Dysfunktion entwickelt. Pro-atherogenen Mediatoren aus Fett, besonders in Verbindung mit Mittel-/viszerale Adipositas, wahrscheinlich entlassen fördern endothelialen Dysfunktion und Pathogene Gefäßveränderungen, die sein können vor Ort in das Fettgewebe Gefäßsystem manifestieren und Erkennung anhand der hier beschriebenen Methodik. 5
Die funktionale Bewertung von isolierten Fettgewebe Arteriolen ist ein sinnvoller Ansatz zum Verständnis der Pathophysiologie und molekularen Mechanismen, die vaskuläre Dysfunktion in menschlichen Adipositas beitragen. Um Mechanismen zu untersuchen, die zu Fett Depot-spezifische Dysfunktion beitragen, haben wir Methoden zur Prüfung der Endothel-abhängigen und - unabhängige gefäßerweiternde Antworten von den Microvasculature und Werten den Ausdruck der verschiedenen regulatorischen Kandidaten in gekoppelten viszeralen und subkutanen (SC) Fettgewebe Proben von übergewichtigen Probanden zum Zeitpunkt der bariatrischen Chirurgie erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Chemical Name</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acetylcholine</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A6625</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:352px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">G5767</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Endothelin-1</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">E7764</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetra acetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">E3889</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">E9884</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">HEPES</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">H3784</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:352px;">Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">N5751</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:352px;">Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">M7506</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Potassium chloride (KCL)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P3911</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:352px;">Potassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P5655</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Papaverine</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P3510</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:352px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3 )</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">S6014</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">S7653</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:132px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:127px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Finescience tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted microscope</td>
			<td>Zeiss Achromat</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laboratory tubing</td>
			<td>Euro-Pharm</td>
			<td>250100306F999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle/pippette puller</td>
			<td>David kopf instruments</td>
			<td>720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ophthalmic monofilament nylon suture</td>
			<td>Surgical specialties</td>
			<td>A7756N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Finescience tools</td>
			<td>150000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vessel Chamber</td>
			<td>DMT</td>
			<td>VAS v.2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of human adipose tissue microvascular function using videomicroscopy

Während Fettleibigkeit zur Entwicklung von Stoffwechsel- und Herz-Kreislauf-Krankheit eng verknüpft ist, ist wenig bekannt über Mechanismen, die diese Prozesse steuern. Es wird vermutet, dass Pro-atherogenen Mediatoren aus dem Fettgewebe vor allem in Verbindung mit Mittel-/viszerale Adipositas entlassen Pathogene Gefäßveränderungen, lokal und systemisch fördern können, und die Vorstellung, dass Herz-Kreislauf-Krankheit möglicherweise die Folge der Fettgewebe Dysfunktion entwickelt sich ständig weiter. Hier beschreiben wir eine einzigartige Methode der Videomicroscopy, die Analyse der gefäßerweiternde und Vasokonstriktor Antworten von intakten kleinen menschlichen Arteriolen entfernt aus dem Fettgewebe Depot des lebenden menschlichen Themen beinhaltet. Videomicroscopy wird verwendet, um die funktionelle Eigenschaften der isolierten Mikrogefäßen in Reaktion auf physiologische oder pharmakologische Stimuli mit einem unter Druck stehenden System, die in Vivo -Bedingungen imitiert zu untersuchen. Die Technik ist ein sinnvoller Ansatz zum Verständnis der Pathophysiologie und molekularen Mechanismen, die vaskuläre Dysfunktion lokal in das Fettgewebe Milieu beitragen. Anomalien im Fettgewebe Microvasculature sind darüber hinaus auch mit systemischen Erkrankungen verbunden worden. Wir wandte diese Technik um Depot-spezifische vaskuläre Reaktionen bei übergewichtigen Probanden zu untersuchen. Wir beurteilen die Endothel-abhängige Vasodilatation, erhöhte Fließfähigkeit und Acetylcholin im Fettgewebe Arteriolen (50-350 µm Innendurchmesser, Länge von ca. 2-3 mm) isoliert aus zwei verschiedenen adipose Depots während der bariatrischen Chirurgie von der gleichen Person. Wir bewiesen, dass Arteriolen von viszeralem Fett beeinträchtigt Endothel-abhängige Vasodilatation im Vergleich zu isoliert aus dem subkutanen Depot Schiffe aufweisen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die viszerale Mikroumgebung vaskulären endothelialen Dysfunktion zugeordnet ist möglicherweise relevante klinische Beobachtung Systemerkrankung Mechanismen erhöhte viszerale Adipositas verlinken. Die Videomicroscopy-Technik lässt sich prüfen, vaskuläre Phänotypen aus verschiedenen Fettdepots sowie Erkenntnisse über Personen mit verschiedenen Graden von Übergewicht und Stoffwechselstörungen zu vergleichen. Die Methode kann auch verwendet werden, vaskuläre Reaktionen längs in Reaktion auf klinischer Interventionen zu untersuchen.

Unser Labor hat Videomicroscopy verwendet, um die Endothel-abhängige zu prüfen und - unabhängige Vasodilatation sowie Vasocontractile Funktion des Fettgewebes Arteriolen von subkutanen und viszeralen Fettgewebe von übergewichtigen Menschen isoliert. Die charakteristischen Versuchsanordnung ist in Abbildung 1Aangezeigt. Fettgewebe Arteriolen sind zwischen zwei Kapillare Glaspipetten ausgesetzt und gesichert mit Fäden innerhalb der Organ-Kammer, wie in Abbildung 1 bgezeigt. Wie oben in Abschnitt 5.1 beschrieben, können Arteriolen Antworten dann beurteilt werden durch die Untersuchung des Schiffes zu Studienbeginn (Abbildung 2A), gefolgt von Pre-Verengung mit ET-1 ~ 55 % der Grundlinie Durchmesser (Abb. 2 b) und dann Agonist-induzierte Vasodilatation und Entspannung von der vaskulären Lumen wie in Abbildung 2dargestellt.
Wir und andere haben festgestellt, dass die Endothel-abhängige Vasodilatation Antworten zu erhöhtem Durchfluss (Schubspannung)11 und Ach12 deutlich in viszeralen abgestumpft wurden im Vergleich zur subkutanen Fettgewebe Arteriolen (Abbildung 3A, 3 b ) in menschliche Fettleibigkeit. Endothel-unabhängige Vasodilatation als Reaktion auf Papaverine änderte jedoch nicht differentiell zwischen zwei Depots (Abbildung 3). Zusammen, diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass vaskuläre Dysfunktion in viszeralen Domänen ist weitgehend eine Folge der Dysfunktion auf der Ebene des Endothels, zumindest in frühen Stadien der Erkrankung. Diese Technik ermöglicht die systematische Analyse von gefäßerweiternden Reaktionen der intakten kleinen menschlichen Arteriolen und kann auch auf anderen zugänglichen Regionen des menschlichen Gefäßsystems angewendet werden. Der ex-Vivo -System kann manipuliert werden, mit zahlreichen pharmakologischen Methoden wie Reaktionen auf Insulin als Index der vaskulären endothelialen Insulin Resistenz6oder Dosis-Antworten Studien zur Nitroglycerin, vaskulären glatten Muskelzellen zu testen Layer-Funktion. 12 biologischen Methoden wie RNA silencing eingeführten13 kann auch potenziell entwickeln mechanistische Rahmenbedingungen für das Verständnis wichtiger Regulators, die vaskuläre Dysfunktion unter spezifischer Erkrankungen zu verleihen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56079/56079fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Aufbau der Videomicroscopy. (A) Bild der Darstellung der Komponenten der Videomicroscopy Orgel Kammer. (B) Bild von einem menschlichen Fettgewebe Arteriola zwischen zwei Glaspipetten Kapillare in der Orgel-Kammer montiert. Schiffs Durchmesser ändert sich in Reaktion auf physiologische und pharmakologische Stimuli, die untersucht werden können und quantifizierte mit Analyse-Software und eine invertierte Kamera-Anlage im System spezialisiert. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56079/56079fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56079/56079fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Darstellung der mikrovaskuläre Vasodilatation mit Druck-Videomicroscopy. (A) ruhenden Grundlinie Arteriolen Durchmesser (Post-Druckbeaufschlagung Durchmesser, kein Agonist oder Stimulation: Di) (B) bereits verengte Durchmesser (nach ET-1 verengte Durchmesser induzierte: Dp), (C) Agonist-induzierte verringern Durchmesser (nach Ach wurde hinzugefügt: DT). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56079/56079fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56079/56079fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Endothel-abhängigen und -unabhängige Vasodilatation im subkutanen vs. viszeralen Fettgewebe Arteriolen bei übergewichtigen Menschen. Endothel-abhängige Vasodilatation war deutlich gedämpft in viszeralen verglichen mit subkutanem Fettgewebe Arteriolen durch (A) Beurteilung erhöht Durchfluss (gepaart subkutane und viszerale Gefäße, n = 20), oder (B) Acetylcholin-Dosis-Antwort mit/ohne L-NAME (gepaart subkutane und viszerale Gefäße, n = 16). (C) Endothel-unabhängige Vasodilatation änderte nicht differentiell zwischen viszeralen und subkutanen Arteriolen wenn Papaverine Dosis Antwort bewertet (gepaart subkutane und viszerale Gefäße, n = 8). * Kennzeichnet Gruppenunterschiede zwischen Depots; †Denotes Depot-spezifische Unterschiede zwischen Acetylcholin mit L-NAME im Vergleich zu Acetylcholin allein; NS: nicht signifikant. Daten werden als Mean± SEM, p präsentiert &#60; 0,05. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56079/56079fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Bewertung der menschlichen Fettgewebe mikrovaskuläre Funktion mit Videomicroscopy

Videomicroscopy Systeme werden verwendet, um die funktionelle Eigenschaften der isolierten Fettgewebe Arteriolen in Reaktion auf physiologische und pharmakologische Stimuli zu untersuchen. Diese Technik kann verwendet werden, zu prüfen, mikrovaskuläre Phänotypen in verschiedenen Fettgewebe Domänen bei übergewichtigen Menschen.

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

7.4K Aufrufe.  Boston University School of Medicine. Videomicroscopy Systeme werden verwendet, um die funktionelle Eigenschaften der isolierten Fettgewebe Arteriolen in Reaktion auf physiologische und pharmakologische Stimuli zu untersuchen. Diese Technik kann verwendet werden, zu prüfen, mikrovaskuläre Phänotypen in verschiedenen Fettgewebe Domänen bei übergewichtigen Menschen.

Serie: Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of cardiovascular disease. Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. Percent capillary recruitment is assessed by dividing the increase in capillary density induced by postocclusive reactive hyperemia (postocclusive reactive hyperemia capillary density minus baseline capillary density), by the maximal capillary density (observed during passive venous occlusion). Percent perfused capillaries represents the proportion of all capillaries present that are perfused (functionally active), and is calculated by dividing postocclusive reactive hyperemia capillary density by the maximal capillary density. Both percent capillary recruitment and percent perfused capillaries reflect the number of functional capillaries. The forearm blood flow (FBF) technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function: The ratio FBFmax/FBFbase is computed as an estimate of vasodilation, by dividing the mean of the four FBFmax values by the mean of the four FBFbase values. Forearm vascular resistance at maximal vasodilation (FVRmax) is calculated as the mean arterial pressure (MAP) divided by FBFmax. Both the capillaroscopy and forearm techniques are readily acceptable to patients and can be learned quickly.
The microvascular and endothelial function measures obtained using the methodologies described in this paper may have future utility in clinical patient cardiovascular risk-reduction strategies. As we have published reports demonstrating that microvascular and endothelial dysfunction are found in initial stages of hypertension including prehypertension, microvascular and endothelial function measures may eventually aid in early identification, risk-stratification and prevention of end-stage vascular pathology, with its potentially fatal consequences.

Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. The forearm blood flow technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function.

Non-invasive Beurteilung der mikrovaskulären und Endothelfunktion

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

Forschung

Medizin

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely related to metabolism and energy expenditure, and its dysfunction is one important contributor for obesity and diabetes. Contrary to previous belief, recent PET/CT imaging studies indicated the BAT depots are still present in human adults. PET imaging clearly shows that BAT has considerably high uptake of 18F-FDG under certain conditions. In this video report, we demonstrate that Cerenkov luminescence imaging (CLI) with 18F-FDG can be used to optically image BAT in small animals. BAT activation is observed after intraperitoneal injection of norepinephrine (NE) and cold treatment, and depression of BAT is induced by long anesthesia. Using multiple-filter Cerenkov luminescence imaging, spectral unmixing and 3D imaging reconstruction are demonstrated. Our results suggest that CLI with 18F-FDG is a practical technique for imaging BAT in small animals, and this technique can be used as a cheap, fast, and alternative imaging tool for BAT research.

In this video report, we show the application of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for interscapular brown adipose tissue in mice under activated and depressed conditions.

Cerenkov Lumineszenz-Imaging von interskapulären braunes Fettgewebe

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Transkutane Beurteilung der Nierenfunktion in Conscious Nagetiere

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to expend energy has made it a potential target for novel therapies to ameliorate obesity and associated metabolic disorders in humans. Though this tissue has been well studied in small animals, BAT&#39;s thermogenic capacity in humans remains largely unknown due to the difficulties of measuring its volume, activity, and distribution. Identifying and quantifying active human BAT is commonly performed using 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography and computed tomography (PET/CT) scans following cold-exposure or pharmacological activation. Here we describe a detailed image-analysis approach to quantify total-body human BAT from 18F-FDG PET/CT scans using an open-source software. We demonstrate the drawing of user-specified regions of interest to identify metabolically active adipose tissue while avoiding common non-BAT tissues, to measure BAT volume and activity, and to further characterize its anatomical distribution. Although this rigorous approach is time-consuming, we believe it will ultimately provide a foundation to develop future automated BAT quantification algorithms.

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Using free, open-source software, we have developed an analytical approach to quantify total and regional brown adipose tissue (BAT) volume and metabolic activity of BAT using 18F-FDG PET/CT.

Ganzen Körper und regionale Quantifizierung der aktiven Menschen braune Fettgewebe mit 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

A Computerized Functional Skills Assessment and Training Program Targeting Technology Based Everyday Functional Skills

Today, many functional skills are technology-based, so development of a technology-based training program has broad importance. Here we present a computerized functional skills training program that was paired in half of the participants with a commercially available cognitive training (CCT) program.
Non-impaired older individuals (NC) aged 60+ (n=45) and similarly aged individuals with mild cognitive impairment (MCI; n=50) were randomized to receive 12 weeks of twice-weekly computerized functional skills training (CFST) or 12 weeks of twice-weekly sessions split between CCT and CFST. Skills trained were use of an ATM; internet banking; ticket kiosk; telephone and internet prescription refill; medication management; and internet shopping. As with previous functional capacity assessments, we focus on completion time for each simulation.
51 participants completed the training program, either by mastering all 6 tasks (34) or completing 12 weeks of training. 44 more participants completed 4 or more training sessions so they were also analyzed for improvement up to their last training session. Completion time for all 6 tests significantly improved from the baseline assessment to the final training session in both groups of participants (all p&#60;0.001 with an average improvement in task completion time of 45%). Further, there was no differential improvement in MCI and NC in the 6 tests from baseline to end of training (all t&#60;1.66, all p&#62;0.12). Finally, combined CCT plus CFST did not differ from CSFT alone on any of the percent-change score measures (all t&#60;1.64, all p&#62;0.11).
Both NC and MCI groups evidenced substantial improvements in performance. CCT supplementation led to similar functional gains with half as many training sessions. The NC participants proceeded through the training fairly rapidly even without CCT supplementation; MCI participants required more training but learned equivalently. These findings suggest that even in cases with memory impairments, functional skills can be efficiently learned with training.

This training protocol uses computerized training to teach technology-related everyday functional skills. These skills include financial skills, travel and transit, as well as medication management.

Ein computergestütztes Functional Skills Assessment and Training Program Targeting Technology Based Everyday Functional Skills

Today, many functional skills are technology-based, so development of a technology-based training program has broad importance. Here we present a ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this procedure. However, intraperitoneal islet transplantation has some limitations, including poor transplant efficacy, difficult graft detection ability, and a lack of graftectomy capability for post-transplant analysis. In this paper, "fat-covered islet transplantation", an intraperitoneal islet transplantation method that utilizes epididymal white adipose tissue, is used to assess the therapeutic effects of bioengineered islets. The simplicity of the method lies in the seeding of islets onto epididymal white adipose tissue and using the tissue to cover the islets. While this method can be categorized as an intraperitoneal islet transplantation technique, it shares characteristics with intra-adipose tissue islet transplantation. The fat-covered islet transplantation method demonstrates more robust therapeutic effects than intra-adipose tissue islet transplantation, however, including the improvement of blood glucose and plasma insulin levels and the potential for graft removal. We recommend the adoption of this method for assessing the mechanisms of islet engraftment into white adipose tissue and the therapeutic effects of bioengineered islets.

This fat-covered islet transplantation method is suitable for the detection of engrafted islets in the intraperitoneal cavity. Notably, it does not require the use of biobinding agents or suturing.

Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...