Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt.

1. Vorbereitung von elektrokompetenten V. parahaemolyticus- Zellen und Elektroporation von Plasmid-DNA in Schwimmerzellen HINWEIS: Der folgende Abschnitt des Protokolls ermöglicht die Herstellung von elektrokompetenten Zellen und die anschließende Elektroporation von Plasmid-DNA in Schwimmerzellen. Dieser Schritt ist wichtig, wenn fluoreszierende Proteine ​​aus einem Plasmid ektopisch exprimiert werden. <ol><li> Streifen Sie V. parahaemolyticus Zellen aus einem -80 ° C Glycerin-Stamm auf eine frische LB-Agar-Platte, die 100 μg / ml Ampicillin enthält, und inkubieren über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Am folgenden Tag werden 200 ml LB-Medium mit einer einzigen Kolonie von V. parahaemolyticus inokuliert und bei 37 ° C unter Schüttelbedingungen inkubiert, bis eine OD 600 von 1,0 erreicht ist. Es dauert gewöhnlich 5-6 h Inkubation für die Zellkultur, um die gewünschte optische Dichte zu erreichen. </li><li> Sofort die Zellen auf Eis und perf übertragenOrm alle weiteren Schritte auf Eis und in 4 ° C vorgekühlten Zentrifugen. </li><li> Die Zellen bei 4 ° C für 10 min bei 2.000 x g ernten. </li><li> Den Überstand durch Dekantieren verwerfen und das Zellpellet in 25 ml eiskalter 273 mM Saccharose-Lösung (pH 7,4, gepuffert mit KOH) wieder suspendieren. </li><li> Die Zellen erneut bei 4 ° C für 10 min bei 2000 x g ernten. Wiederholen Sie zwei weitere Zeiten. </li><li> Das gewaschene Zellpellet in 400 μl eiskalter 273 mM Saccharoselösung erneut suspendieren. Anschließend wird Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 15% vol / vol zugegeben. Die Zellen sind nun zur Elektroporation bereit, können aber auch in Aliquoten von 70 μl bei -80 ° C für spätere Verwendung eingefroren werden. </li><li> Für die Elektroporation wird ein 70 μl Aliquot von elektrokompetenten Zellen mit 100 - 1000 ng Plasmid-DNA vermischt und die Mischung in eine eiskalte Elektroporationsküvette (0,2 cm Elektrodenspalt) überführt. Führen Sie die Elektroporation mit folgenden Einstellungen durch: 25 μF, 2400 V und 200 Ω. </li><li> SuspendierenZellen in der Elektroporationsküvette in 600 μl LB-Brühe, überführen in ein 2-ml-Röhrchen und inkubieren unter Schütteln bei 37 ° C für 3 h. </li><li> Die Zellen bei 2000 xg für 5 min abreiben und das Pellet in 100 &amp; mgr; l LB-Brühe erneut suspendieren. Verbreiten Sie die Zellsuspension auf selektive LB-Agarplatten, die die notwendigen Antibiotika enthalten und bei 37 ° C über Nacht inkubieren. </li><li> Am nächsten Tag, überprüfen Sie die Platten für Koloniebildung. Kolonien, die wachsen, tragen das korrekte Antibiotikaresistenzgen, das auf dem Plasmid codiert ist, und kann nun für weitere Experimente verwendet werden. </li></ol> 2. Induktion der Swarmer-Zelldifferenzierung HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben, wie man die Differenzierung von V. parahaemolyticus in seinen schnelleren Zelllebenszyklus induziert und wie man die Proliferation auf festen Oberflächen stimuliert. <ol><li> 4 g Herzinfusion (HI) Agar in 100 ml ddH 2 O suspendieren, um die schwärmenden Platten vorzubereiten. </li><li>Die HI-Agar-Lösung vorsichtig in der Mikrowelle kochen und die Flasche von Zeit zu Zeit schütteln, bis das Pulver aufgelöst ist. Autoklav bei 121 ° C für 20 min. </li><li> Nach dem Autoklavieren den HI-Agar auf 60-65 ° C abkühlen lassen. Addieren Sie 2,2&#39;-Bipyridyl zu einer Endkonzentration von 50 μM (Stammlösung von 50 mM in 100% Ethanol). Füge CaCl 2 zu einer Endkonzentration von 4 mM (Stammlösung von 4 M in ddH 2 O) hinzu. Wenn nötig, fügen Sie Antibiotika in die Lösung, um Plasmide zu erhalten. HINWEIS: Wenn man plant, ein induzierbares Plasmid zu verwenden, füge das induzierende Mittel zu seiner Endkonzentration hinzu. ACHTUNG: 2,2&#39;-Bipyridyl: Akute Toxizität (oral, dermal, inhalation). Bei der Handhabung dieser Chemikalie Handschuhe und Schutzbrille verwenden. </li><li> 40 - 35 ml der endgültigen HI-Agar-Lösung in eine runde 150 mm Petrischale geben und den Agar verfestigen lassen. </li><li> Vor dem Auftragen der Zellkultur, trocknen Sie die Agarplatte bei 37 ° C für mindestens 10 min (oder bis irgendwelche flüssigen Rückstände disaPpeared, aber nicht mehr) rechts oben mit offenem Deckel. HINWEIS: Die Trockenzeiten hängen stark von dem verwendeten Inkubator ab und schwer getrocknete Platten erlauben keine Schwärme von V. parahaemolyticus . (Dieser Schritt ist sehr wichtig!) Platten müssen frisch verwendet werden und sollten nicht älter als 2 - 3 h sein. Alte Platten werden zu trocken sein, um das Schwärmen zu stimulieren. </li><li> Inokulieren Sie eine kleine Menge von Zellen aus dem Rand einer einzelnen Kolonie in 5 ml LB-Brühe. Inkubieren Sie das Kulturschütteln bei 37 ° C bis OD 600 = 0,8 erreicht ist, dauert es normalerweise ca. 2-3 Stunden. Danach sind die Zellen bereit, auf HI Swarming Agar Platten entdeckt zu werden. </li><li> Spot 1 μl Zellkultur in der Mitte einer HI-Agar-Swarming-Platte ( Abbildung 1A ). </li><li> Lassen Sie den Fleck trocken ( Abbildung 1B ). </li><li> Die Platte mit klarem Plastikband abdichten und darauf achten, dass sie fest befestigt ist, sonst könnte sie sich während der Inkubation über Nacht lösen (Abbildung 1C ). HINWEIS: Es istSehr wichtig, dass das Siegel perfekt ist. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen und Falten auf das Band, wenn es angewendet wird. </li><li> Die Platte bei 24 ° C über Nacht inkubieren. Dies führt zur Bildung einer V. parahaemolyticus - Schwarmkolonie mit Schwarm-Fackeln, die sich von der Peripherie der Schwarmkolonie erstrecken (Abbildung 2 ). </li></ol> 3. Vorbereitung von V. parahaemolyticus Swarmer Zellen zur Fluoreszenzmikroskopie HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt, wie man mikroskopische Agarose-Objektträger und die anschließende Prägung von schwärmenden Fackeln auf ein Agarose-Pad vorbereitet, um einzelne Swarmer-Zellen für die Mikroskopie zu erhalten. <ol><li> Zur Herstellung von Agarose-Objektträgern für die Mikroskopie werden 1 g Agarose zu 100 ml einer 20% vol / vol PBS und 10% vol / vol LB-Brühe-Lösung gegeben. Die Lösung in der Mikrowelle sorgfältig abkochen, um die Agarose aufzulösen und unter Mischen mit einem Magnetrührer auf 65-70 ° C abkühlen zu lassen. </li><li> Platz acMageres Mikroskop auf einen perfekt ebenen Abschnitt einer Arbeitsbank schieben. Decken Sie beide Enden der Folie mit zwei Schichten von Allzweck-Laborbeschriftungsband, Befestigung der Folie auf die Arbeitsbank. Der Abstand zwischen den beiden Bandstücken sollte etwa 3 cm betragen. HINWEIS: Die beiden Schichten des Bandes schaffen eine sehr kleine Höhe, die die Höhe des Agarose-Pad bestimmen wird. Es ist wichtig, dass der Arbeitsraum eben ist, um sicherzustellen, dass Zellen in der gleichen Ebene für die Mikroskopie-Analyse sein werden. </li><li> Pipet ~ 250 μl der zuvor hergestellten Agaroselösung auf die nicht überzogene Glasoberfläche pipettieren. </li><li> Legen Sie nun einen zweiten Mikroskop-Objektträger in die gleiche Ausrichtung wie die untere auf die Oberseite und drücken Sie ihn leicht nach unten, so dass Rest-Agarose an den Seiten fließen kann. </li><li> Lassen Sie die Agarose 1-2 min verfestigen und ziehen Sie dann langsam die obere Glasrutsche von der Unterseite in einer horizontalen Bewegung. </li><li> Mit einem Skalpell, schneiden Sie alle restlichen Agarose, die an derSeiten des Mikroskops gleiten und entfernen Sie langsam das Band von den Enden des Objektträgers. HINWEIS: Die Agarose-Folie ist nun fertig und sollte so schnell wie möglich verwendet werden, da sie langsam anfängt zu trocknen. </li><li> Um eine Mikroskopie auf schwärmeren Zellen durchzuführen, schneide ein ~ 3 mm x 10 mm Stück des schwärmenden Agars von der äußersten Kante einer schwärmenden Kolonie aus (Abbildung 1D ). Es ist sehr wichtig, die Banddichtung der Schwarmplatte erst unmittelbar vor dem Transfer von Swarmer-Zellen zum Mikroskop-Objektträger zu brechen. Sobald das Band entfernt ist, beginnen schwärmende V. parahaemolyticus Zellen die Differenzierung in Schwimmerzellen. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Schnitte von der Außenseite des schwärmenden Kolonierandes bis zur Innenseite der Kolonie zu lenken ( Abbildung 1D ). Auf diese Weise können Sie &quot;Schwimmer-Kontamination&quot; in den Rand der schwärmenden Kolonie verhindern. </li><li> Übertragen Sie das Stück des schwärmenden Agars auf eine Mikroskop-Agarose-Folie mit den Zellen, die der Agarose pa zugewandt sindD ( Abbildung 1E ). Dies drückt die schwärmenden Zellen auf die Agarose-Auflage. </li><li> Nach dem Warten von ~ 30 s, entfernen Sie das Agar-Stück vorsichtig aus dem Agarose-Pad (Abbildung 1F ). </li><li> Legen Sie ein Glasdeckel auf das Agarose-Pad, wo die Zellen eingeprägt wurden. Die Zellen sind nun bereit für die Mikroskopie. ANMERKUNG: Es ist wichtig, sofortere Zellen sofort zu untersuchen, da Swarmerzellen langsam eine Differenzierung zum Schwimmerzustand einleiten. </li></ol> 4. Vorbereitung von V. parahaemolyticus Schwimmer Zellkulturen für die Fluoreszenzmikroskopie ANMERKUNG: Dieser Abschnitt des Protokolls beschreibt, wie man eine Kultur von V. parahaemolyticus zur Durchführung einer Fluoreszenzmikroskopie auf dem Schwimmerzelltyp vorbereitet. <ol><li> Inokulieren Sie eine kleine Menge von Zellen aus dem Rand einer einzelnen Kolonie in 5 ml LB-Brühe. Inkubieren Sie das Kulturschütteln bei 37 ° C für 1 h oder bis das leichte Zellwachstum sichtbar wird. </li><li> BeimIn diesem Stadium, wenn nötig, fügen Sie induzierenden Mittel für die Expression von Proteinen von Interesse. In diesem Beispiel wurde L-Arabinose zu einer Endkonzentration von 0,2% (w / vol) zugegeben, um die Expression von YFP-CheW 9 zu induzieren. </li><li> Inkubieren Sie das Kulturschütteln für weitere 2 h bei 37 ° C. </li><li> Befolgen Sie die Schritte 3.1-3.7, um mikroskopische Agarose-Folien herzustellen. </li><li> 1 &amp; mgr; l Zellkultur in der Mitte des Agarosekissens auflösen und den Fleck inkubieren lassen, bis er trocken ist. </li><li> Legen Sie ein Glas Deckglas auf die Agarose-Pad, wo die Zellen wurden entdeckt. Die Zellen sind nun bereit, unter dem Fluoreszenzmikroskop abgebildet zu werden. </li></ol> 5. Bildanalyse Dieser Teil des Protokolls beschreibt einen Workflow für die Bildanalyse, insbesondere, wie man Fluoreszenzdaten einzelner Zellen für die demographische Analyse extrahiert. <ol><li> Bevor Sie mit der Bildanalyse beginnen, stellen Sie sicher, dass alle Mikroskopiebilder im 16-Bit-TIF-Format gespeichert sind. </li><li> Laden Sie den DIC (oder Phasenkontrast) und die entsprechenden Fluoreszenzkanalbilder in die Software. </li><li> Erstellen Sie ein Overlay-Bild beider Kanäle, indem Sie &quot;Display / Overlay-Bilder&quot; auswählen. Setzen Sie die Anzahl der Bilder (&quot;# Bilder:&quot;) auf zwei, und wählen Sie das DIC-Bild im ersten Kanal und das Fluoreszenzbild im zweiten Kanal. </li><li> Wählen Sie das Werkzeug &quot;Multi-Line&quot; aus der Symbolleiste und markieren Sie Zellen von einem Pol zum anderen durch die Mitte der Zelle. Um eine Liste aller generierten Linien (Linienobjekte) zu erhalten, öffnen Sie &quot;Messen / Region Messungen&quot;. Konfigurieren Sie die Bereichsmessungen, um nur die Länderbeschriftung, die Distanz und die durchschnittliche Intensität anzuzeigen. </li><li> Kalibrieren Sie die Pixelgröße unter &quot;Messen / Kalibrieren von Entfernungen&quot; auf die Pixelgröße, die für Ihr Mikroskop-Setup spezifisch ist, und klicken Sie auf &quot;Auf alle offenen Bilder anwenden&quot;. </li><li> Übertragen Sie alle Regionen (Linienobjekte) auf das Fluoreszenzkanalbild. Unter &quot;Regionen / TransfEr Regions &quot;wählen Sie das Quellbild (das Overlay-Bild) und das Zielbild (das Fluoreszenz-Kanal-Bild). Wählen Sie&quot; Alle Regionen &quot;und drücken Sie&quot; OK &quot;. HINWEIS: Um die genauen Linien (Linienobjekte, Regionen, ROI) später wieder herzustellen, öffnen Sie &quot;Regionen / Regionen speichern&quot; und speichern Sie die Regionen. </li><li> Exportieren Sie alle Bereichsmessungen in eine Tabellenkalkulation, indem Sie &quot;Messen / Region Messungen&quot; öffnen und &quot;Open Log&quot; drücken. Bestätigen, um die Daten zu öffnen und zu exportieren. Sobald die Kalkulationstabelle im Hintergrund geöffnet ist, exportieren Sie schließlich die Daten mit &quot;F9: Log Data&quot;. </li><li> Um die Position der fluoreszierenden Brennpunkte entlang der Zelle zu bestimmen, öffnen Sie &quot;Measure / Linescan&quot;. Setzen Sie &quot;Linescan Width&quot; auf einen Wert, so dass die gesamte Breite einer Zelle von der Region abgedeckt wird, die Sie zuvor erstellt haben. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Zeilendiagramm und wählen Sie &quot;Grafikdaten anzeigen&quot;. Durch Linksklick und Ziehen der Maus-Courser entlang der Linie-Scan auf dieInteressante, das Fenster &quot;Graph Data&quot; zeigt das entsprechende Pixel / Abstand zwischen den beiden Punkten an. Markieren Sie die blau markierte Zeile und kopieren Sie den Inhalt. HINWEIS: Das gesamte Zeilen-Scan-Intensitätsprofil kann in einer Tabelle durch Drücken von &quot;Log Data&quot; im Fenster &quot;Linescan&quot; protokolliert werden. Die extrahierten Daten können nun zur Visualisierung in Graphen oder zur weiteren statistischen Analyse verwendet werden. Lokalisierungsmuster über den Zellzyklus lassen sich leicht in einer demographischen Darstellung der Zelllänge und der Fluoreszenzintensitäten entlang des Zellkörpers visualisieren. Diese Darstellungen können mit dem zuvor gewählten ROI erhalten werden. Die folgenden Schritte geben ein Beispiel dafür, wie man Demographie ähnlich den in den Fig. 3C und 4C gezeigten erzeugt. <ol><li> In Fiji / ImageJ Ladebereich Markierungen (.rgn) zuvor in der Software erstellt (Schritt 5.6) mit dem &quot;Metamorph nd &amp; ROI-Dateien Importeur&quot;. Alternativ können die interessierenden Regionen (ROIs) der zu analysierenden Zellen direkt in Fidschi / ImageJ mit dem eingebauten &quot;Segmented Line&quot; -Tool erstellt werden. </li><li> Öffnen Sie &quot;Analysieren / Werkzeuge / ROI-Manager&quot; und markieren Sie alle aktiven Listeneinträge &quot;. </li><li> Danach klicken Sie auf &quot;Mehr / Multi Plot&quot; und wählen Sie dann &quot;List&quot; im neuen Fenster &quot;Multi Plot&quot;. Klicken Sie auf einen Tabelleneintrag und wählen Sie dann &quot;Alle kopieren&quot;. Anschließend in eine neue Kalkulationstabelle einfügen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Daten der längsten Zelle (zwei entsprechende X- und Y-Spalten mit der meisten Zeilenanzahl) die letzte in der Kalkulationstabelle sind. </li><li> Speichern Sie die Kalkulationstabelle als &quot;CSV (Comma delimited) (* .csv)&quot;. </li><li> Laden Sie die R-Skripte von hier aus &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; 10. Die Scripts sortieren Zellen nach Länge und normalisieren die Fluoreszenzintensitätsprofile aller Zellen als Durchschnitt der einzelnen Fluoreszenz jeder ZelleE. </li><li> Führen Sie das gesamte Skript &quot;Zellprofile function.R&quot; in R [Version 3.0.1; 11 ]. </li><li> Bearbeiten Sie das Skript &quot;Beispiel plots.R&quot; in Zeile 30, so dass sich der Dateipfad auf den Ordner bezieht, in dem die zuvor erzeugte .csv-Datei gespeichert ist. Ändern Sie außerdem den Dateinamen &quot;profile.csv&quot; in Zeile 31 auf den Dateinamen, der für die in Schritt 5.9.4 generierte .csv-Datei ausgewählt wurde. Danach führen Sie &quot;example plots.R&quot; und folgen Sie der Dokumentation von &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; sowie den Kommentaren aus der Skriptdatei, um demografische Analyse zu generieren. </li></ol></li></ol>

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	<li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+dynamometer+controls+swarmer+cell+differentiation+of+V.+parahaemolyticus.">Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li><li>Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sodium-driven+polar+flagellar+motor+of+marine+Vibrio+as+the+mechanosensor+that+regulates+lateral+flagellar+expression.">The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression.</a> Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).</li><li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+swarming+in+Vibrio+parahaemolyticus.">Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus.</a> Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).</li><li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+temperature,+salts,+pH,+and+other+factors+on+the+development+of+peritrichous+flagella+in+Vibrio+alginolyticus.">Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus.</a> Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).</li><li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+swarming+of+Vibrio+alginolyticus.">The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus.</a> Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).</li><li>Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+iron+regulate+swarming+and+type+III+secretion+in+Vibrio+parahaemolyticus.">Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).</li><li>McCarter, L., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+regulation+of+swarmer+cell+differentiation+of+Vibrio+parahaemolyticus.">Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).</li><li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence.">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li><li>Heering, J., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Localization+of+Chemotactic+Signaling+Arrays+during+the+Lifecycle+of+Vibrio+parahaemolyticus.">Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus.</a> Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).</li><li>Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+synthesis+machinery+in+Agrobacterium+tumefaciens+during+unipolar+growth+and+cell+division.">Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Development Core Team, R. F. F. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R:+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing.">R: A Language and Environment for Statistical Computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).</li><li>Ringgaard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParP+prevents+dissociation+of+CheA+from+chemotactic+signaling+arrays+and+tethers+them+to+a+polar+anchor.">ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).</li><li>Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+ParA-like+ATPases+promotes+cell+pole+maturation+by+facilitating+polar+localization+of+chemotaxis+proteins.">A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins.</a> Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).</li><li>Vischer, N. O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+age+dependent+concentration+of+Escherichia+coli+divisome+proteins+analyzed+with+ImageJ+and+ObjectJ.">Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ.</a> Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).</li><li>Schneider, C. a., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+Imaging,+and+Quantification+of+Bacterial+Surface+Motility+Assays.">Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays.</a> J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+Automated+Time-lapse+Microscopy.">Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).</li></ol>

Keine Interessenkonflikte deklariert.

Dieses Papier berichtet über eine Methode zur mikroskopischen Bildgebung von V. parahaemolyticus swarmer Zellen, gefolgt von nachgeschalteten Analysen, die dazu bestimmt sind, die subzelluläre Lokalisation und andere Merkmale der untersuchten fluoreszenzmarkierten Proteine ​​zu lösen und zu quantifizieren. Obwohl für die Mikroskopie-Bildverarbeitung und -analyse 14 , 15 , 16 , 17 , 18 mehrere Werkzeuge existieren , bleibt die Analyse von V. parahaemolyticus-Swarming- Zellen meist schwierig, weil sie normalerweise in einer dichten Zellgemeinschaft existieren und eine hohe Variation der Zelllänge ( Abbildung 2 ). Daher ist die automatisierte Zellenerkennung manchmal fehlerhaft und damit die Ergebnisse etwas unzuverlässig. Dieses Protokoll skizziert eine Pipeline, die entworfen ist, um zu wachsen, zu bild und zu analysieren , schwärmende Zellen von V. parahaemolyticus , die auf die Spezifikation zugeschnitten istDass eine kontrollierte Wachstumsumgebung auf einer Oberfläche und nachgeschalteten Bildanalysen, die das Vorhandensein von Zellen mit variablen Längen aufnehmen, die in unmittelbarer Nähe wachsen. Die Fähigkeit, ein Protein von Interesse aus einem Plasmid exprimieren zu können, kann für mehrere Experimente wichtig sein, zB Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen für Mikroskopie-Studien oder Komplementierung von Gen-Deletionen. Hier wird auch das Verfahren zur Herstellung von chemisch kompetenten Zellen und die Elektroporation von Plasmid-DNA in V. parahaemolyticus beschrieben. Der Vorteil der Elektroporation über die Konjugation, die oft für V. parahaemolyticus verwendet wird , besteht darin, dass das Plasmidrückgrat nicht modifiziert werden muss, um eine Konjugation zu ermöglichen. Trotzdem sollten einige Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden; Wie in Schritt 1.2 beschrieben, ist es sehr wichtig, eine Zelldichte von OD 600 = 1,0 zu erreichen. Bei niedrigeren optischen Dichten werden die Zellen auf Elektroporati lysierenBei und bei höheren Dichten wird das Plasmid nicht von den Zellen aufgenommen. Darüber hinaus wird eine zu harte Zentrifugation von V. parahaemolyticus- Zellen (Schritte 1.4-1.6) drastisch die Elektroporationseffizienz verringern. Es ist auch wichtig, das Zellpellet während der Waschschritte sorgfältig zu suspendieren, um elektrokompetente Zellen zu erzeugen. Obwohl die Vorbereitung einer Zellkultur trivial klingt, ist die Kulturdichte für die schwärmende Leistung sehr wichtig. Im Allgemeinen wird eine Zellkultur in der frühen exponentiellen Wachstumsphase (OD 600 &lt;0,5) eine größere schwärmende Kolonie während der Inkubation über Nacht erzeugen als eine Kultur in einer späten exponentiellen oder frühen stationären Phase. Je nach Experiment könnte eine größere schwärmende Kolonie von Vorteil sein. Um jedoch die Kolonieexpansion und die Morphologie zwischen verschiedenen Stämmen, die auf der gleichen HI-Agar-Schwarmplatte gezüchtet wurden, zu vergleichen, ist es wichtig, genügend Platz zwischen einzelnen schwärmenden Kolonien zu haben. Das kann ach seinDh durch Spotting einer Zellkultur mit höherer optischer Dichte, die in der Regel zu kleineren schwärmenden Kolonien führen wird. Die Induktion des schwärmenden Phänotyps variiert signifikant zwischen den Bakterienarten und die Reproduzierbarkeit hiervon wird stark von Faktoren wie Agar- und Nährstoffzusammensetzung, der Umgebungstemperatur und dem Feuchtigkeitsgehalt von Umgebung und Wachstumsmedium beeinflusst. Folglich beeinflussen kleinere Änderungen im Protokoll und in der äußeren Umgebung die Schwarm-Assay-Ergebnisse und die Induktion der Swarmer-Differenzierung. Es wurden Protokolle zur Induktion von Schwärmen anderer Bakterienarten wie Pseudomonas aeruginosa und Bacillus subtilis gemeldet. Die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte werden zuverlässig die Swarmer-Zelle-Art von V. parahaemolyticus produzieren und sie in Form von schwärmenden Kolonien aufrechterhalten , die einschichtige schwärmende Fackeln am Rande der Kolonie erzeugen. Stabile undReproduzierbare Experimente an der Swarmer-Zelle-Art von V. parahaemolyticus , die Vorbereitung der HI-Swarming-Agar-Platten ist der wichtigste Teil dieses Protokolls. Insbesondere kann der Trocknungsschritt eine Optimierung erfordern, da jeder Inkubator anders ausführen wird. Ein weiterer Faktor, der das Schwärmeverhalten beeinflussen kann, ist die Art der in den Petrischalen verwendeten Kunststoffe. Die typischen Petrischalen, die in unserem Labor verwendet werden, um schwärmende Experimente durchzuführen, werden aus Polystyrol (PS) hergestellt. Allerdings, mit Petrischalen aus Low-Density-Polyethylen (PE LD) produziert gemischte Ergebnisse in schwärmenden Assays. Es ist entscheidend, den beschriebenen Schritten zu folgen, denn nur dann werden reproduzierbare schwärmende Kolonien, die eine deutliche periphere Aufflackernbildung aufweisen, bilden, die eine einzelne Swarmer-Zellmikroskopie ermöglichen. Zweifellos können verschiedene Ansätze genommen werden, um die Ergebnisse zu zeigen, die durch Fluoreszenzmikroskopie-Untersuchungen von V. parahaemolyticus-schwärmenden Zellen wiedergegeben werden. Für instancE, das weit verbreitete Programm MicrobeTracker 16 stellt eine plausible Alternative dar. Die kürzlich verfügbare MicrobeTracker Applikation Oufti 20 , die MATLAB nicht benötigt, ist ebenfalls eine andere Alternative. Allerdings ist die Verwendung von Differentialschnittstellenkontrast- (DIC-) Bildern bei Oufti nicht möglich, und die Phasenkontrast-Bildgebung ist nicht geeignet, die Zellsegmentierung in schwärmeren Zellen zu unterscheiden. Darüber hinaus sind nicht alle Mikroskope für die Phasenkontrast-Bildgebung ausgerüstet und wiederum ist die Phasenkontrast-Bildgebung nicht für alle Arten von Mikroskopie-Analysen geeignet. Ein weiteres vielversprechendes Werkzeug, das frei und ImageJ-basiert ist, ist MicrobeJ 17 , aber nochmals können nur Phasenkontrast und fluoreszierende Bilder verwendet werden. Darüber hinaus erlaubt dieses Protokoll nur die Abbildung und Analyse von Zellen zu bestimmten Zeitpunkten ihres Lebenszyklus. Allerdings ist ein ausgezeichnetes Protokoll, das die Zeitraffer-Bildgebung beschreibt, und die anschließende Bildanalyse,Zelltrajektorien und Proteindynamik 21 können wahrscheinlich auch auf V. parahaemolyticus angewendet werden . Nach den in diesem Protokoll beschriebenen Schritten können die Wissenschaftler eine zuverlässige und reproduzierbare Einzelzell-Fluoreszenzmikroskopie sowohl am Schwimmer als auch im Swarmer-Zelle-Typ von V. parahaemolyticus durchführen . Dieses Protokoll beschreibt einen robusten Weg, um V. parahaemolyticus von seinem Schwimmer in seinen schwärmeren Zelltyp zu verwandeln. Durch die Prägung der Monolayer von Swarmer-Zellen aus den peripheren Fackeln der schwärmenden Kolonien auf ein Agarose-Pad kann die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen beobachtet werden, die Pipeline für die Bildanalyse kann wahrscheinlich auf andere Bakterienarten angewendet werden, die in Bakteriengemeinschaften vorhanden sind, in denen Zellen wachsen Sehr enge Nähe und Situationen, in denen die automatisierte Bildanalyse nicht von Vorteil sein könnte.

Bakterien erleben ständig Veränderungen in ihrer äußeren Umgebung und haben mehrere Techniken entwickelt, um ihr Verhalten entsprechend zu verändern und anzupassen. Ein solcher Mechanismus beinhaltet die Differenzierung in verschiedene Zelltypen, die die veränderte Umgebung besser ergänzen. Die Differenzierung beinhaltet oft große Veränderungen in der Regulation des Zellzyklus, der Zellmorphologie und der räumlich-zeitlichen Organisation der Zellen. Ein Organismus, der sich einer Differenzierung unterziehen kann, ist Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus gehört zu den Vibrionaceae , die eine Familie von Proteobakterien ist, die in der Regel frisches oder Salzwasser bewohnen. Vibrionaceae sind weit verbreitet in der Umwelt und umfassen mehrere Arten, die Darmtrakt-Infektionen beim Menschen verursachen, auch einschließlich Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus ist ein dimorpher Organismus und ist in der Lage, in zwei verschiedene Zelltypen als eine Antwort zu differenzieren, um Änderungen an seinem zu unterscheidenExternes milieu In wässrigen Umgebungen existiert es als eine kurze stabförmige Schwimmerzelle mit einem einzigen polaren Flagellum, das am alten Zellpfosten positioniert ist. Bei Oberflächenkontakt wird die Differenzierung in eine schwärmer Zelle ausgelöst. Die Swarmerzelldifferenzierung beinhaltet zwei wesentliche Veränderungen: die Swarmerzellmorphogenese durch Hemmung der Zellteilung und die Induktion eines zweiten Flagella-Systems. Dies führt zur Bildung einer peritrichen und stark verlängerten stabförmigen Swarmerzelle, die entweder den schwärmeren Lebensstil fortsetzen kann, wo Divisionsereignisse zu Nachkommen-Swarmer-Zellen führen oder alternativ zurück in Schwimmerzellen differenzieren. Es wurde berichtet, dass mehrere Faktoren die Swarmer-Differenzierung induzieren oder beeinflussen. Der primäre Stimulus scheint durch Mechanosensation angetrieben zu werden, wo V. parahaemolyticus das polare Flagellum als einen taktilen Sensor verwendet, der die Hemmung der Rotation auf den Oberflächenkontakt erkennt, aber einige andere Faktoren sind beteiligtGut 1 Im Labor kann die Rotation des polaren Flagellum künstlich durch Zugabe von Phenamilie gehemmt werden, welches die natriumkanalgetriebene Flagellarrotation blockiert, wodurch die Swarmerdifferenzierung 2 induziert wird. Darüber hinaus wurde in einer früheren Studie Vibrio alginolyticus induziert , um auf festen Medien zu schwärmen, wenn Zellen auf Wachstumsmedium in einer Petrischale, die mit einem klaren Plastikband versiegelt wurde, vermehrt wurden. Alkali-gesättigtes Filterpapier verhinderte, unter diesen Bedingungen zu schwärmen, was darauf hindeutet, dass eine oder mehrere flüchtige Säuren an der Induktion von Schwärmen beteiligt sein könnten. So versiegelte die Versiegelung der Petrischale mit Plastikband wahrscheinlich die Ansammlung von flüchtigen Säuren, die als Nebenprodukte des Zellstoffwechsels gebildet wurden, innerhalb des Kopfraums der Platte. Der gleiche Effekt wurde erreicht, wenn H 2 O 2 dem Wachstumsmedium in nicht versiegelten Petrischalen zugesetzt wurde, um künstlich flüchtige Säuren durch Hydrolyse von Medienkomponenten herzustellen <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 3 , 4 , 5 . Dennoch bleibt die Identität solcher flüchtigen Säuren unbekannt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine übermäßige Verfügbarkeit von Calcium 6 und Eisen-Begrenzung 7 sowohl die Swarmer-Differenzierung als auch die Proliferation über feste Oberflächen verstärkt. Die Zellen können für Eisen durch Zugabe der Verbindung 2,2&#39;-Bipyridyl zum Wachstumsmedium verhungert werden, von dem gezeigt wurde, dass sie die Swarmer-Differenzierung beeinflussen 8 Die Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie die Differenzierung regulieren, werden nun in der Gestaltung eines Protokolls implementiert, das reproduzierbar die V. parahaemolyticus- Differenzierung in schwärmeren Zellen und deren Proliferation auf festen Agaroberflächen induziert. V. parahaemolyticus Differenzierung beinhaltet große Änderungen in der Regulierung der Zellteilung, zelluläre Morphologie und die Positionierung von makromolekularen Maschinen wie FlagellA und Chemotaxis Apparate - Prozesse, die alle die spezifische Lokalisierung von Proteinen nach dem Zellzyklus erfordern. Somit ist die Fähigkeit, die intrazelluläre Lokalisation solcher Proteine ​​zu untersuchen, für das Verständnis der vorgenannten zellulären Prozesse wesentlich. Um solche Studien durchzuführen, ist eine Fluoreszenzmikroskopie an einzelnen Zellen erforderlich. Dies kann bei der Bildgebung von Zellen, die in dichten Bakterienpopulationen existieren, besonders herausfordernd sein, wie dies bei Swarmer-Zellen der Fall ist. Es gab Versuche, eine schwächere Differenzierung in flüssigen Medien zu induzieren, die potentiell einzelne Zellen für Mikroskopie-Studien erzeugen könnten. Und obwohl auf einer Transkriptionsstufe diese Zellen das Swarmer-Differenzierungs-Programm teilweise induziert haben, unterliegen sie nicht denselben deutlichen morphologischen Veränderungen, wie voll differenzierte, auf festem Medium gewachsene Zellen Dieses Papier bietet ein robustes und reproduzierbares Protokoll einer Methode, um Swarmer ce zu induzierenDie Differenzierung auf einer Agarfläche. Das Protokoll erzeugt eine Population von leicht zugänglichen Swarmer-Zellen, die für die Einzelzellmikroskopie und die anschließende Analyse verfügbar sind. Darüber hinaus ermöglicht das Protokoll die Lokalisierungsstudien von fluoreszenzmarkierten Proteinen sowohl im Schwimmer als auch in den Swarmer-Zelltypen (Abschnitte 1, 2, 3, 4). Darüber hinaus beschreibt das Protokoll den nachfolgenden Workflow, wie man die erzeugten Daten aus Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten verarbeitet und analysiert, was eine demographische Analyse von Bakteriengesellschaften ermöglicht (Abschnitt 5).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Media components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X968.3</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulated</td><td>BD</td><td>214510</td><td>For preparation of LB agar with LB medium</td></tr><tr><td>Difco Heart Infusion Agar</td><td>BD</td><td>244400</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Agarose NEEO, ultra quality</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td>For preparation of microscopy agarose pads</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Roth</td><td>5118.3</td><td>Used to induce pBAD derivatives</td></tr><tr><td>2,2`-Bipyridyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305-25G</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Roth</td><td>5239.1</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Roth</td><td>K029.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer</td><td>-</td><td>-</td><td>Standard recipe for Phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>D(+) Sucrose</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>For preparation of electrocompetent cells</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth</td><td>3783.5</td><td>For preparation of electrocompetent cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hardware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 mm x 20 mm with cams</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>kelvitron t (B 6420)</td><td>Heraeus</td><td>-</td><td>Used for drying HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Microbial System</td><td>BioRad</td><td>1652662</td><td>Used for elctroporation of plasmid DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td>Used for microscopy image analysis</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td>Used for microscopy data analsis</td></tr></tbody></table>

induction of cellular differentiation and single cell imaging of vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells

Die Fähigkeit, die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen zu untersuchen, ist für das Verständnis vieler zellulärer Prozesse unerlässlich. Im Gegenzug erfordert dies die Fähigkeit, einzelne Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie zu erhalten, was bei der Bildgebung von Zellen, die in Bakteriengemeinschaften existieren, besonders schwierig sein kann. Zum Beispiel existiert der menschliche Pathogen Vibrio parahaemolyticus als kurze stabförmige Schwimmerzellen in flüssigen Zuständen, die bei der Oberflächenkontaktdifferenzierung zu einer Subpopulation von stark verlängerten, auf wässerigen Oberflächen spezialisierten Swarmerzellen differenzieren. Dieses Papier stellt eine Methode zur Durchführung einer Einzelzell-Fluoreszenzmikroskopie-Analyse von V. parahaemolyticus in seinen zwei Differentialzuständen vor. Dieses Protokoll induziert sehr reproduzierbar die Differenzierung von V. parahaemolyticus in einen schnelleren Zelllebenszyklus und erleichtert deren Proliferation über feste Oberflächen. Die Methode erzeugt Fackeln von differenzierten Swarmer Zellen, die sich von t erstreckenEr Rand der Schwarmkolonie. Bemerkenswert, an der Spitze der Schwarm-Fackeln befinden sich Swarmer-Zellen in einer einzigen Schicht von Zellen, die ihre leichte Übertragung auf einen Objektträger und die anschließende Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung einzelner Zellen ermöglicht. Darüber hinaus wird der Workflow der Bildanalyse zur demographischen Darstellung von Bakteriengesellschaften vorgestellt. Als prinzipielle prüfung wird die Analyse der intrazellulären Lokalisation von Chemotaxisignalisierungsarrays in Schwimmer und Swarmerzellen von V. parahaemolyticus beschrieben.

Induktion der Differenzierung und Erzeugung von schwärmenden Kolonien Abbildung 1 zeigt ein Schema der wichtigen Schritte bei der Herstellung von schwärmenden Kolonien von V. parahaemolyticus ( Abbildung 1A-C ). Eine Schwimmerkultur wurde auf Schwarm-Agar entdeckt und bei 24 ° C inkubiert, wodurch eine stärkere Differenzierung und Proliferation über die feste Agaroberfläche induziert wurde. Ein repräsentatives Stereomikroskopiebild einer schwärmenden Kolonie ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Stereomikroskopie-Bildgebung zeigt deutlich Schwärme-Fackeln, die sich außerhalb der Schwarmkolonieperipherie erstrecken. Höhere Vergrößerung zeigt, dass in den Schwarm-Fackeln Zellen nur in Mono- oder Bi-Schichten gruppiert sind, während in der Mitte der Schwarm-Kolonie Zellen in mehreren Schichten gestapelt werden (Abbildung 2A ). Schwarmfackeln können leicht übertragen werden (wie in den Schritten 3.8-3.11 beschrieben, <stronG&gt; Abbildung 1) zu einem Objektträger. Wichtig ist, dass die Fackeln nur aus einer vollständig differenzierten Population von Swarmer-Zellen bestehen (Abbildung 2B ). Dies steht im Gegensatz zu Zellen aus der Mitte der Schwarmkolonie, die deutlich kürzer sind und wahrscheinlich eine Mischung aus Schwimmer und Swarmer-Zellen darstellen (Abbildung 2B ) 9 . Darüber hinaus verlässt die sorgfältige Übertragung der Fackel auf den Mikroskop-Slide die Gesamtstruktur und die Schwarmkante des Schwarm-Flackers intakt, was zu einer Mono-Schicht von Swarmer-Zellen führt, die für die Einzelzellmikroskopie zugänglich sind. Bei der Prägung der Schwarmfackeln auf dem Mikroskop-Objektträger ist es sehr wichtig, den Transfer so sanft wie möglich zu machen und nicht zu viel Druck hinzuzufügen - ansonsten werden sich Zellen aus Schwarm-Fackeln über die Folienmischung mit nicht-schwärmeren Zellen aus dem Die Mitte der Schwarmkolonie. Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse <pEnglisch: www.tab.fzk.de/en/projekt/zusammenf...ng/ab117.htm Als Beweis für das Prinzip der Einzelzellmikroskopie von unterschiedlich unterschiedlichen V. parahaemolyticus Schwimmer und Swarmerzellen wurde eine detaillierte Analyse von ektopisch ausgedrücktem YFP-CheW durchgeführt. CheW ist ein essentielles Chemotaxisprotein und kann als Marker für die intrazelluläre Lokalisation von chemotaktischen Signalisierungsarrays 9 , 12 verwendet werden. Ein Plasmid, das für YFP-CheW unter einem L-Arabinose-induzierbaren Promotor kodiert, wurde in V. parahaemolyticus, wie in Abschnitt 1 des Protokolls beschrieben , elektroporiert. Für die Mikroskopie wurden Schwimmer und Swarmerzellen wie in den Abschnitten 4 und 3 beschrieben hergestellt. Wie bereits beschrieben, wurde YFP-CheW in einem unipolaren ( Fig. 3A , roten Pfeilen) und einer bipolaren Weise lokalisiert ( Fig. 3A , gelbe Pfeile) 12 , 13 . Dementsprechend ist die Identifizierung des Zellpols undD die Variation der YFP-Protein-Lokalisation in verschiedenen Längen bietet einen großen Einblick in, wie sich das Lokalisierungsmuster entwickelt, wenn der Zellzyklus fortschreitet. Diese Daten können dann in Streudiagrammen angezeigt werden, die die Variablen &quot;Zelllänge&quot; und &quot;Abstand der Brennpunkte zum Zellpol&quot; korrelieren (Abbildung 3B). Um Ungenauigkeiten bei der Konturerkennung zu vermeiden, die bei der Verwendung von automatischen Zellenerkennungswerkzeugen üblich sind, werden die Zellen durch manuelles Ziehen einer Linie von einem Pol zum anderen mit der Option &quot;Mehrzeilig&quot; in MetaMorph oder &quot;Segmentierte Linie&quot; im Open-Source-Plattform ImageJ. Anschließend können die Intensitätsprofile des ausgewählten Bereichs von Interesse (ROI) gesammelt werden, was die Identifizierung des Punktes ermöglicht, in dem YFP-Protein seine höchste Intensität und auch die Gesamtlänge der Zelle zeigte. Die Fluoreszenzprofile einzelner Zellen wurden wie in Abschnitt 5 beschrieben analysiert und wurden durch Auftragen der Entfernung von Foki auf die Zellpole dargestelltAls Funktion der Zelllänge ( Abbildung 3B ). Diese Analyse zeigt deutlich, dass kurze Zellen nur ein unipolares Lokalisierungsmuster von YFP-CheW aufweisen, während bei längeren Zellen YFP-CheW bi-polar lokalisiert ist. Weiterhin können Lokalisierungsmuster über den Zellzyklus in einer demographischen Darstellung der Zelllänge und den Fluoreszenzintensitäten entlang des Zellkörpers leicht visualisiert werden. Diese Darstellungen können unter Verwendung der gleichen ROIs erhalten werden, die zuvor bei der Vorbereitung der Streudiagramme ausgewählt wurden. Daher wurde eine demographische Analyse des gesamten zellulären Fluoreszenzprofils, wie in Schritt 5.9 ( Fig. 3C ) beschrieben, durchgeführt. Diese Analyse zeigt ein ähnliches Muster der YFP-CheW-Lokalisation, wobei YFP-CheW in kurzen Zellen uni-polarly lokalisiert ist und in längeren Zellen bi-polarly lokalisiert ist. Wenn also ein zellzyklusabhängiges Lokalisierungsmuster angedeutet wird, wobei YFP-CheW in kürzlich geteilten Zellen (kurz) uni-polarisiert lokalisiert ist und dann r erhältBis zu dem entgegengesetzten Pol später im Zellzyklus (lange Zellen), was zu einer bipolaren Lokalisierung führt. Eine analoge Analyse wurde an Swarmer-Zellen durchgeführt (Abbildung 4 ). Eine Populationsbasierte Analyse zeigt große Unterschiede in der Lokalisation von YFP-CheW in schwärmeren Zellen im Vergleich zu der des Schwimmerzelltyps. YFP-CheW ist immer bi-polar lokalisiert (Abbildung 4A , gelbe Pfeile) und vor allem YFP-CheW bildet auch Cluster, die zufällig entlang der Zelllänge positioniert sind (Abbildung 4A , orange Pfeile). Somit gibt es wesentliche Änderungen in der intrazellulären Lokalisation von Chemotaxisignalisierungsarrays während der Differenzierung von V. parahaemolyticus . Dieses Beispiel zeigt, dass die beschriebene Methode die Herstellung einer Swarmer-Zell-Population ermöglicht, die für eine Einzelzell-Fluoreszenzmikroskopie leicht verfügbar ist. Weiterhin zeigt es, dass die für die Bildanalyse beschriebene Pipeline die demographische Analyse der intrazellulären Organisa ermöglichtVon V. parahaemolyticus swarmer Zellen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55842/55842fig1.jpg" /> Abbildung 1: Induktion der Swarmer-Differenzierung und Vorbereitung von Zellen für die Mikroskopie-Bildgebung. Vereinfachte Visualisierung des Arbeitsablaufs zur Herstellung von V. parahaemolyticus swarmer Zellen und zur Herstellung von Objektträgern zur Mikroskopieanalyse einzelner Swarmerzellen. ( A ) Spot 1 &amp; mgr; l einer OD 600 = 0,8 Zellkultur von V. parahaemolyticus in der Mitte einer HI-Agar- Schwarmplatte . ( B ) Inkubieren Sie den Fleck, bis er getrocknet ist und die Zellen an der Agaroberfläche befestigt sind. ( C ) Die Petrischale mit klarem Band abdichten Inkubieren Sie die Platte bei 24 ° C für 16 h. ( D ) Tragen Sie sorgfältig ein kleines Stück HI-Agar aus dem äußeren Rand der schwärmenden Kolonie aus. ( E ) Übertragen Sie die Exzision auf ein MikrOscopy-Agarose-Pad mit den Swarmer-Zellen, die dem Agarose-Pad zugewandt sind. Nach einer kurzen Inkubationszeit von 30 s werden die Swarmer-Zellen auf das Agarose-Pad aufgeprägt. ( F ) Ausgeschnittenen Agar vorsichtig aus dem Agarose-Pad entfernen und ein Mikroskop-Deckglas aufsetzen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55842/55842fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55842/55842fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Organisation der Zellen in einem V. parahaemolyticus Swarming Colony. ( A ) Stereomikroskopie einer V. parahaemolyticus Swarmer Kolonie. Die oberen Tafeln zeigen die äußere Kante einer schwärmenden Kolonie in zunehmender Vergrößerung. Die unteren Tafeln zeigen eine Fläche der schwärmenden Kolonie zwischen dem Zentrum und dem Rand bei zunehmender Vergrößerung. Schwarmfackeln erstrecken sich von der Peripherie vonDie Schwarmkolonie. ( B ) Repräsentative DIC-Mikroskopiebilder der schwärmeren Koloniekante (oberer Tafel) und einer Fläche zwischen dem Zentrum und dem Rand (Bodenplatte) nach der Übertragung von Zellen von den jeweiligen angezeigten Stellen der schwärmenden Kolonie. Die Schwarmfackeln wurden direkt auf eine Mikroskopie-Agarose-Auflage geprägt, wie in den Schritten 3.8-3.11 beschrieben. Zellen aus dem Bereich zwischen dem Zentrum und der Peripherie wurden zuerst von der Schwarmkolonie abgeschabt und in LB-Brühe wieder suspendiert, bevor sie auf eine Mikroskopie-Agarose-Auflage gesichtet wurden. Maßstab = 7,5 μm <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55842/55842fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55842/55842fig3.jpg" /> Abbildung 3: Lokalisierung von Chemotaxis-Arrays in Schwimmerzellen von V. parahaemolyticus. ( A ) DIC und fluoreszierende mikroskopische Bilder von Wildtyp- V. parahaemolyticus Schwimmerzellen, die ectopisch YFP-CheW exprimieren. ( B ) Graph, der die YFP-CheW-Foci-Verteilung zeigt, indem man den Abstand der Brennpunkte aus den Zellpole als Funktion der Zelllänge in Schwimmerzellen aufzeichnet. ( C ) Demographische Analyse von Fluoreszenzintensitätsprofilen von V. parahaemolyticus- Schwimmerzellen, die YFP-CheW exprimieren. Die Zellen werden nach Zelllänge sortiert und zeigen eine relative Fluoreszenzintensität an. Maßstab = 5 μm. Panel B und C sind aus Referenz 9 angepasst. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55842/55842fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55842/55842fig4.jpg" /> Abbildung 4: Lokalisierung von Chemotaxis-Arrays in Swarmer-Zellen von V. parahaemolyticus. </strOng&gt; ( A ) DIC und fluoreszierende mikroskopische Bilder von Wildtyp- V. parahaemolyticus swarmer Zellen, die ectopisch YFP-CheW exprimieren. ( B ) Graph, der die YFP-CheW-Foci-Verteilung anzeigt, indem man den Abstand der Brennpunkte aus den Zellpole als Funktion der Zelllänge in schwärmeren Zellen aufzeichnet. ( C ) Demographische Analyse von Fluoreszenzintensitätsprofilen von V. parahaemolyticus swarmer Zellen, die YFP-CheW exprimieren. Die Zellen werden nach Zelllänge sortiert und zeigen die relative Fluoreszenzintensität an. Maßstab = 5 μm. Die Felder B und C sind von der Referenz 9 angepasst. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55842/55842fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Dieses Protokoll ermöglicht die Einzelzellmikroskopie der unterschiedlich unterschiedlichen Vibrio parahaemolyticus Schwimmer und Swarmer Zellen. Das Verfahren erzeugt eine Population von Swarmer-Zellen, die für die Einzelzellanalyse leicht verfügbar sind, und umfasst die Herstellung von Zellkulturen, die Induktion von Swarmer-Differenzierung, Probenvorbereitung und Bildanalyse.

Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzell - Bildgebung von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Schwimmer und Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

induction-cellular-differentiation-single-cell-imaging-vibrio

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

9.3K Aufrufe.  Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology.  Dieses Protokoll ermöglicht die Einzelzellmikroskopie der unterschiedlich unterschiedlichen Vibrio parahaemolyticus Schwimmer und Swarmer Zellen. Das Verfahren erzeugt eine Population von Swarmer-Zellen, die für die Einzelzellanalyse leicht verfügbar sind, und umfasst die Herstellung von Zellkulturen, die Induktion von Swarmer-Differenzierung, Probenvorbereitung und Bildanalyse. 

Serie: Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

Überwachung räumliche Trennung in Oberflächen Colonizing mikrobiellen Populationen

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Forschung

Genetik

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Immunologie und Infektion

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Biochemie

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Mikroskopie zur Echtzeitbestimmung der einzelzelligen Morphologie in Bioprozessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Biotechnik

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biologie

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do not allow for accurate interpretation of this interplay. Using a quantitative imaging-based approach, we present a high-content protocol for characterizing the dynamic phenotypic responses (i.e. morphology changes, proliferation, apoptosis) of heterogeneous cell populations to changes in environmental stimuli. We highlight our ability to distinguish between cell types based upon either fluorescence intensity or inherent morphology features depending on the application. This platform allows for a more comprehensive characterization of subpopulation response to perturbation while utilizing shorter time, smaller amounts of reagents, and lower likelihood of error than traditional cell biology assays. However, in some cases, cell populations may be difficult to identify and quantitate based on complex cellular features and will require additional troubleshooting; we highlight some of these circumstances in the protocol. We demonstrate this application using response to drug in a cancer model; however, it can easily be applied more broadly to other physiological processes. This protocol allows one to identify subpopulations within a co-culture system and characterize the particular response of each to external stimuli.

We have developed a novel protocol for studying heterocellular population dynamics in response to perturbations. This manuscript describes an imaging-based platform that produces quantitative datasets for simultaneous characterization of multiple cellular phenotypes of heterocellular populations in a robust manner.

Diskriminierung und Charakterisierung von Heterocellular Populationen mit quantitativen Imaging-Techniken

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzell - Bildgebung von

Zusammenfassung

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