Diese Arbeit wurde durch das deutsche Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) finanziert.

<ol>
	<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Weidner, C., Steinfath, M., Opitz, E., Oelgeschl&#228;ger, M., Sch&#246;nfelder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+optimal+animal+model+for+translational+research+using+gene+set+enrichment+analysis.">Defining the optimal animal model for translational research using gene set enrichment analysis.</a> EMBO Mol Med. 8 (8), 831-838 (2016).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Kanehisa, M., Sato, Y., Kawashima, M., Furumichi, M., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KEGG+as+a+reference+resource+for+gene+and+protein+annotation.">KEGG as a reference resource for gene and protein annotation.</a> Nucleic Acids Res. 44 (D1), D457-D462 (2016).</li><li>Kanehisa, M., Goto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KEGG:+kyoto+encyclopedia+of+genes+and+genomes.">KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).</li><li>Fabregat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reactome+pathway+Knowledgebase.">The Reactome pathway Knowledgebase.</a> Nucleic Acids Res. 44 (D1), D481-D487 (2016).</li><li>Croft, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reactome+pathway+knowledgebase.">The Reactome pathway knowledgebase.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D472-D477 (2014).</li><li>Nishimura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioCarta.">BioCarta.</a> Biotech Software &amp; Internet Report. 2 (3), 117-120 (2001).</li><li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).</li><li>Kolesnikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArrayExpress+update--simplifying+data+submissions.">ArrayExpress update--simplifying data submissions.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D1113-D1116 (2015).</li><li>Cohen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis:+a+roadmap+for+future+research.">Sepsis: a roadmap for future research.</a> Lancet Infect Dis. 15 (5), 581-614 (2015).</li><li>Spinelli, L., Carpentier, S., Montanana Sanchis, F., Dalod, M., Vu Manh, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BubbleGUM:+automatic+extraction+of+phenotype+molecular+signatures+and+comprehensive+visualization+of+multiple+Gene+Set+Enrichment+Analyses.">BubbleGUM: automatic extraction of phenotype molecular signatures and comprehensive visualization of multiple Gene Set Enrichment Analyses.</a> BMC Genomics. 16 (1), 814 (2015).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Tiermodelle wurden lange für die Erforschung von Krankheitsmechanismen und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien angewendet. Skepsis gegenüber der Prädiktivität von Tiermodellen begann jedoch nach Versagen der klinischen Studien12zu verbreiten. Darüber hinaus wurden Kontroverse Diskussionen über geeignete Strategien zur Analyse und Interpretation der großen Omics Daten aus präklinischen Studien von entgegengesetzten Schlussfolgerungen aus den gleichen Daten nach Anwendung von unterschiedlichen Daten-Analyse-Strategien1 angesprochen. ,2. Infolgedessen gibt es eine hohe Nachfrage für weitere robuste Bioinformatik Techniken für die Analyse von komplexen Omics Daten, systematisch die optimale Tiermodell für eine gegebene menschliche Krankheit zu definieren. Translationalen Forschung verbessert nicht nur das beste verfügbare Modell anwenden sondern weiter trägt zum Wohlergehen der Tiere durch die Vermeidung von Tierversuchen, die nicht mit der menschlichen Situation korrelieren können.
Die vorgestellte Protokoll beschreibt einen standardisierten Ansatz, um systematisch Omics Datenvergleich verschiedener Arten mit dem Ziel, die optimale Tiermodelle und Behandlungsprotokolle für eine gegebene menschliche Störung zu ermitteln. Durch die Verwendung von GSEA anstelle von einzelnen Genanalyse umgeht dieses Protokolls alle Probleme im Zusammenhang mit subjektiven Einstellung der gen-Expression-Schwellenwerte und gen filtern. Die Fokussierung auf ausgewählte Wege weiter ermöglicht speziell Adresse den (Patho) physiologische Prozess der betreffenden Störung/Erkrankung (z.B. Entzündung). Natürlich hängt die Genauigkeit der GSEA Ergebnisse auf die Qualität der aktuellen gen Set Anmerkungen und ob Regulationsmechanismen zwischen Arten konserviert werden. Allerdings vermuten wir, dass im Allgemeinen die Erhaltung Ebene Weg als auf einzelne gen-Ebene höher ist. Darüber hinaus sind Set Bereicherung Ansätze für Vergleiche von transkriptomischen Daten zwischen verschiedenen Plattformen und experimentelle Modelle oder klinischer Kohorten robuster als Single-gen13analysiert.
Anstelle von vordefinierten Gen Sets wie Wege, ermöglicht der vorgestellte Ansatz auch benutzerdefinierte Gen-Sets definieren. Insbesondere können experimentelle Daten, relevante Gene zu identifizieren, die aktiviert oder gehemmt in einer Bedingung (z.B. Überlappung der regulierten menschliche Gene in klinischer Kohorten) verwendet werden. Die de Novo definiert gen Sätze dann zum Testen für die Anreicherung von Daten aus verschiedenen Tiermodellen verwendet werden. Diese alternative Ansatz vermeidet den "Umweg" kommentierte Wege zu verwenden. Darüber hinaus das Protokoll beschränkt sich nicht auf den Vergleich der transkriptomischen Daten, sondern ist übertragbar auf alle Omics-Daten einschließlich der Proteomik und Metabolomik. Dennoch muss man im Hinterkopf behalten, die dieser Ansatz beschränkt sich auf bestehende Omics Daten von Mäusen und Menschen, und das es zeigt nicht, wie man neue Tiermodelle entwickelt. Es stellt jedoch einen wirksamen Ansatz für die einheitliche Auslegung der vorhandenen Daten, die möglicherweise erleichtern die sorgfältige Auswahl der optimalen Tiermodell und vermeiden so unnötige und irreführende translationale Studien.

Tiermodelle sind am meisten benutzt, um menschliche Krankheiten wegen ihrer vermeintlichen Ähnlichkeit zu den Menschen in Bezug auf die Genetik, Anatomie und Physiologie zu studieren. Darüber hinaus Tiermodellen oft dienen als Pförtner, Therapien und haben einen großen Einfluss auf den Erfolg der translationalen Forschung. Sorgfältige Auswahl der optimalen Tiermodell reduzieren die Zahl der Tierversuche irreführend. Vor kurzem hat die Relevanz von Tiermodellen für die translationale Forschung kontrovers diskutiert, vor allem, weil die Analyse der gleichen Datasets gewonnenen menschlichen entzündliche Erkrankungen und damit verbundene Mausmodellen zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen geführt, 1,2. Diese Diskussion zeigte ein grundlegendes Problem während der Omics Datenanalyse: standardisierte Ansätze zur systematischen Datenanalyse sind erforderlich, um einseitige Genselektion zu senken und die Robustheit der Interspezies Vergleiche 3erhöhen.
Traditionell, die Analyse der Transkriptom (und andere Omics-Daten) erfolgt auf der Single-gen-Ebene und enthält einen ersten Schritt der Genselektion basierend auf strengen Cut-off-Parametern (z.B., Falte Änderung &#62; 2.0, p-Wert &#60; 0,05). Allerdings die Einstellung der ersten Cut-off Parameter oft ist subjektiv, willkürlich und nicht biologisch begründete, und sogar zu anderen Schlussfolgerungen1,2führen kann. Darüber hinaus erste Genselektion in der Regel schränkt die Analyse auf ein paar sehr up- und herunterreguliert Gene und ist somit nicht empfindlich genug, um die Mehrzahl der Gene enthalten, die differentiell in geringerem Maße zum Ausdruck gebracht wurden.
Mit dem Aufstieg der Genomik-Ära in den frühen 2000er Jahren und die zunehmende Kenntnis der biologischer Signalwege und Kontexte wurden alternative statistische Ansätze entwickelt, die erlaubt, die Grenzen der einzelnen Level Genanalysen zu umgehen. Gen gesetzt Bereicherung Analyse (GSEA)4, das ist eine der weithin akzeptierten Methoden für die Analyse von Transkriptom Daten, nutzt a Priori definierte Gruppen von Genen (z. B.Signalwege, proximalen Ort auf einem Chromosom etc..). GSEA Karten zuerst alle erkannten ungefilterte Gene auf die beabsichtigte Gen-Sets (z.B. Wege), unabhängig von ihren individuellen Ausdruck. Dieser Ansatz beinhaltet somit auch mäßig regulierten Gene, die sonst mit Single-Level-Genanalysen verloren wären. Die additive Veränderung Ausdruck in Gen-Sets erfolgt anschließend über laufende Summe Statistiken.
Trotz seiner breite Verwendung in der medizinischen Forschung sind GSEA und verwandte Set Bereicherung Ansätze nicht selbstverständlich für die Analyse von komplexen Omics Daten berücksichtigt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Vergleich von Omics Daten aus humanen Proben mit denen von Mausmodellen um das ideale Modell für Translationale Studien zu identifizieren. Wir zeigen die Anwendbarkeit des Protokolls basiert auf einer Sammlung von Maus-Modellen, die für die Nachahmung menschlicher entzündlicher Erkrankungen verwendet werden. Allerdings diese Pipeline Analyse beschränkt sich nicht auf Mensch-Maus-Vergleiche und ist amendable zur weiteren Forschungsfragen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td class="xl63" height="42" style="height:31.5pt;width:162pt" width="216">Excel</td>
			<td class="xl63" style="width:98pt" width="130">Microsoft Corporation</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl64" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for using gene set enrichment analysis to identify the appropriate animal model for translational research

Neuere Studien, die transkriptomischen-Datasets von menschlichen Krankheiten mit Datensätzen von Mausmodellen mit traditionellen gen-gen-Vergleich Techniken verglichen führten zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen bezüglich der Relevanz von Tiermodellen für Translationale Forschung. Ein wesentlicher Grund für die Unterschiede zwischen den verschiedenen Genexpressionsanalysen ist die willkürliche Filterung differentiell exprimierten Gene. Außerdem ist der Vergleich einzelner Gene zwischen verschiedenen Arten und Plattformen oft durch technische Varianz, was zu Fehlinterpretationen der Con/Discordance zwischen Daten aus menschlichen und tierischen Modelle beschränkt. Daher sind standardisierte Ansätze zur systematischen Analyse erforderlich. Um subjektive gen filtern und unwirksam gen-gen-Vergleiche zu überwinden, wir kürzlich gezeigt, dass Set Bereicherung Genanalyse (GSEA) das Potenzial hat, diese Probleme zu vermeiden. Daher entwickelten wir ein standardisiertes Protokoll für die Verwendung von GSEA zu passenden und unpassenden Tiermodelle für die translationale Forschung unterscheiden. Dieses Protokoll eignet sich nicht, wie neue Modellsysteme–von vornherein, design vorherzusagen, da es bestehende experimentelle Omics Daten erfordert. Jedoch beschreibt das Protokoll die vorhandene Daten in einer standardisierten Weise zu interpretieren, um die am besten geeigneten Tiermodell, damit unnötige Tierversuche zu vermeiden und irreführende translationale Studien zu wählen.

Die GSEA Workflow und Screenshots von beispielhaften Daten werden vorgeführt. Abbildung 1 zeigt die gen-Ausdruck-Datendatei, die die transkriptomischen relevanten Daten enthält. Für jede Studie eine beschreibende Phänotyp-Datei erforderlich ist, die in Abbildung 2dargestellt. Kommentierte Gen-Sets (z.B. Wege) sind in der gen-Set Datenbank-Datei (Abbildung 3) definiert. Abbildung 4 zeigt eine Schritt für Schritt-Protokoll für die Verwendung des Werkzeugs GSEA Software. Eine beispielhafte Ergebnisbericht ist in Abbildung 5gegeben. Detaillierte GSEA Bereicherung Ergebnisse sind in Abbildung 6zusammengefasst. Für den Vergleich der verschiedenen Genexpressionsstudien, insbesondere menschliche vs. Studien an Mäusen, eine Kontingenztafel ist erforderlich (Abbildung 7). Abbildung 8 zeigt für die Visualisierung der Ergebnisse eine Korrelationsmatrix Weg Vergleiche zwischen Mensch und Maus-Studien.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55768/55768fig1v2.jpg"> 
Abbildung 1: GSEA-Gen-Expression-Daten-Datei. Die Datei enthält Ausdruckswerte für alle nachweisbaren Gene (oder Sonden), auch für Gene, die nicht differenziell ausgedrückt werden könnte. Die Datei umfasst daher in der Regel viele Tausende von Genen. (A) die gen-Ausdruck-Daten-Datei enthält Daten für jede einzelne Probe. Die erste Zeile enthält den Namen des Labels (hier: Sonde ID) gefolgt von einer optionalen Beschreibung und individuelle Beispielnamen (hier: GSM515585, GSM515586, etc.). Der Rest der Datei enthält Ausdruckswerte für jedes der Gene und für jede Probe in das Dataset. (B) Alternative gen Ausdruck Datenformat. Extern Gruppe Kennzahlen berechnet (hier: mittlere Verhältnis) kann für das GSEA preranked Werkzeug verwendet werden, wenn einzelne Sample-Daten nicht verfügbar sind. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55768/55768fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55768/55768fig2.jpg"> 
Abbildung 2: GSEA Phänotyp Datei. Die Datei verbindet einzelne Samples für Gruppen und Etiketten die Gruppen entsprechend. Die erste Zeile enthält die Gesamtzahl der Proben und die Anzahl der Gruppen weiter. Das dritte Feld der ersten Zeile ist immer "1". Die zweite Zeile enthält den Namen für jede Gruppe. Die Zeile beginnt mit einem Nummernzeichen (#), gefolgt von einem Leerzeichen. Die dritte Zeile enthält eine Gruppenbezeichnung für jede Probe (hier: 0 oder 1). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55768/55768fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55768/55768fig3.jpg"> 
Abbildung 3: GSEA gen Set Datenbankdatei. Die Datei definiert Gruppen von Genen, die bestimmte biologische Prozesse oder Kategorien zugeordnet sind (hier: entzündliche Wege). Im GMT-Format stellt jede Zeile eine gen-Reihe, die durch einen Namen, eine Beschreibung und die enthalten Gene (offizielle HUGO gen Symbole) definiert wird. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55768/55768fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55768/55768fig4v2.jpg"> 
Abbildung 4: GSEA Softwareeinstellungen. Das GSEA-Software-Tool wurde als Java-desktop-Anwendung von der Broad Institute Website heruntergeladen. (A) Menü "Start". Die linke Seite enthält das Navigationsmenü, während der Rechte Teil (nach Hause) eine kurze Zusammenfassung des GSEA Workflows gibt. Klicken auf die Schaltfläche " Daten laden " öffnet sich eine neue Registerkarte für den Import der Dateien. (B) Daten laden Abschnitt vor dem Datenimport. Benötigten Dateien können importierte über den Dateibrowser. (C) Load Data Abschnitt nach dem Importieren von Daten. Importierte Dateien werden im Objektcache aufgeführt und werden organisiert, um Datensätze (obligatorische Datei), Phänotypen (obligatorische Datei), gen Datensatz Datenbanken (optional, sofern eine Internetverbindung) und Chip-Dateien (optional, sofern eine Internetverbindung). Klicken auf die Schaltfläche " Ausführen GSEA " öffnet sich eine neue Registerkarte für die Parametrierung der Analyse. (D) Laufen GSEA Abschnitt. Die Registerkarte für die Parametrierung der Analyse gliedert sich in die Pflichtfelder, grundlegende und erweiterte Felder. Klicken die Schaltfläche " Ausführen " auf den am unteren rechten Rand des Fensters startet die Analyse. Der Fortschritt der Analyse wird in Abschnitt GSEA "Berichte" auf der linken unteren Rand des Fensters angezeigt. Nach Abschluss der Analysis der Status "Erfolg" erscheint in der GSEA berichtet Abschnitt. (E) GSEA preranked Werkzeug. Gen-Expression, die Datendateien, die extern berechneten Gruppe Metriken anstelle von einzelnen Beispieldaten enthalten sein können analysiert über die Hauptnavigation. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55768/55768fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55768/55768fig5.jpg"> 
Abbildung 5: GSEA Bericht. Der GSEA Bericht wird in einem Browserfenster geöffnet, die alle Ergebnisse und ausgewählte Parameter zusammenfasst. Die oberen zwei Abschnitte des Navigationsmenüs umfassen gen Set Bereicherung Ergebnisse für die definierten Gruppen (z.B. Bereicherung in S. Aureus behandelt Proben oder gesunde Kontrollproben). In diesem Beispiel sind 42 65 gen-Sets (Pathways) bei S. Aureus behandelt Mäusen aktiviert, während 14 davon mit einer FDR unter 25 % wesentlich bereichert werden. Ebenso sind 23 65 gen-Sets (Pathways) bei S. Aureus behandelt Mäusen gehemmt, während 18 von ihnen mit einer FDR unter 25 % wesentlich bereichert werden. Klicken Sie auf die detaillierte Bereicherung Ergebnisse öffnet einen html oder excel-Datei für den Export der Analysedaten für einen Vergleich der verschiedenen Genexpressionsstudien erforderlich. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55768/55768fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55768/55768fig6v2.jpg"> 
Abbildung 6: detaillierte Bereicherung Ergebnisse. (A) exportierte Tabellenkalkulationsdatei mit detaillierten Analyseergebnisse für Gen-Sets (Pathways), die in S. Aureus aktiviert wurden behandelten Mäuse. Die Kalkulationstabellendatei enthält riesige Daten für jede der untersuchten gen-Set, einschließlich des Namens des eingestellten gen, seine Größe, seine normalisierte Bereicherung Partitur, seine nominale (unkorrigiert) p-Wert und Nutzwert FDR. (B) vereinfachte Tabelle Datei, dassenthält nur Informationen, die für den Vergleich von verschiedenen Genexpressionsstudien erforderlich. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55768/55768fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55768/55768fig7.jpg"> 
Abbildung 7:3 x 3 Kontingenztabelle GSEA Ergebnisse. (A) gemeinsame Kontingenztabelle Format für den Vergleich von 2 Studien. (B) beispielhafte Zahlen der geregelten Bahnen für den Vergleich einer menschlichen Sepsis-Studie (GSE9960) mit einem Murine S. Aureus -Injektion-Modell (GSE20524). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55768/55768fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55768/55768fig8.jpg"> 
Abbildung 8: Korrelationsmatrix Pathway Vergleiche zwischen Mensch und Maus Studien. Die Überlappung der Weg Verordnung erscheint als der Zugewinn an Information, die von einer (Maus) Studie für die Vorhersage der Effekte in einer anderen (menschlichen) Studie (blau, Abnahme, geringe Korrelation; rot, Erhöhung, hohe Korrelation) gewonnen werden können. In diesem Beispiel ergab der Vergleich des menschlichen mit murinen Datasets eine Untergruppe der murinen Versuchsmodelle hoch korrelativen, menschliche klinische Studien (10 und 11, gepunktete Linie) darauf hinweist wurden, dass diese Maus-Modellen am besten geeignet für die Nachahmung die menschliche Situation. Im Gegensatz dazu zeigten die Studien 7, 8 und 9 keine Korrelation zu den Studien der menschlichen Krankheit. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55768/55768fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Wir bieten ein standardisiertes Protokoll für die Nutzung der Genanalyse Set Anreicherung von transkriptomischen Daten, um eine ideale Maus-Modell für die translationale Forschung zu identifizieren. Dieses Protokoll kann mit DNA-Microarray und RNA Sequenzierungsdaten verwendet werden und kann weiter mit anderen Daten der Omics verlängert werden, wenn Daten vorhanden sind.

Ein Protokoll für die Verwendung von Gen Set Anreicherung Analyse zur Ermittlung von geeigneten Tiermodell für die translationale Forschung

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

a-protocol-for-using-gene-set-enrichment-analysis-to-identify

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K Aufrufe.  German Federal Institute for Risk Assessment (BfR). Wir bieten ein standardisiertes Protokoll für die Nutzung der Genanalyse Set Anreicherung von transkriptomischen Daten, um eine ideale Maus-Modell für die translationale Forschung zu identifizieren.Dieses Protokoll kann mit DNA-Microarray und RNA Sequenzierungsdaten verwendet werden und kann weiter mit anderen Daten der Omics verlängert werden, wenn Daten vorhanden sind.

Serie: A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Computer-Generated-Tiermodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and endothelial cells, provide an ideal platform for an updated status on the immune condition of an individual. The microfluidic protocol allows for enrichment of CNCs without selective cell loss and sample preparation variability due to user-mediated steps. Briefly, the protocol includes device fabrication, sample collection, device setup, and running blood through the microfluidic chamber. Within the device whole blood is rapidly mixed with deionized water for approximately 10 seconds in a 50 micron x 150 micron microfluidic channel. In this time span erythrocytes are lysed due to hypotonic conditions. Herringbone structures on the bottom of the channel ensure thorough mixing and exposure of cells to a constant environment. Remaining cells are returned to isotonic conditions at the exit of the device, fixed using 2% paraformaldehyde, centrifuged to separate erythrocyte debris from CNCs, and suspended in flow buffer for staining and analysis by flow cytometry. Results show clean flow cytometry scatter plots with CNC populations saved. Significance of this device and protocol comes in the study and understanding of disease pathogenesis by analysis of CNC populations. Hence, automation, effectiveness, and simplicity of the microfluidic protocol are demonstrated.

An automated microfluidic device was developed for circulating nucleated cell enrichment from peripheral blood via erythrocyte lysis that ensures isolation of high quality sample without cell loss.

Automatisierte Microfluidic Blut Lysis-Protokoll zur Anreicherung von zirkulierenden Zellen mit Zellkern

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...