Diese Arbeit wurde von einem Pilotstipendium unter NIH P20 GM109005 (ARA) und dem Zentrum für Translational Neuroscience IDeA Programmpreis P30 GM110702 unterstützt.

Experimente wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee bei UAMS genehmigt wurden. 1. Tiere und 5-Fu Einspritzung Paradigma <ol><li> Kaufen Sie 6 Monate alte männliche C57Bl6 / J Wildtyp Mäuse und beherbergen sie unter einem konstanten 12 h Licht / Dunkel Zyklus bis sie 1 Jahr alt sind. </li><li> Verdünnen Sie die 5-Fu in 0,9% steriler Kochsalzlösung. Verwenden Sie 60 mg / kg als benötigte Dosis pro Maus. </li><li> Geben Sie die intraperitonealen Injektionen der 5-Fu (einmal pro Woche für drei Wochen). <ol><li> Geben Sie die intraperitonealen Injektionen um die gleiche Zeit an jedem Tag. Zum Beispiel zwischen 0900-1200 h. </li></ol></li><li> Euthanisieren Sie die Tiere und extrahieren Sie die Gehirne 30 Tage nach der letzten Injektion. </li></ol> 2. Euthanasie-Verfahren und Hirn-Extraktion <ol><li> Das Nagetier zurückhalten und die Schwanzbasis greifen Mit der anderen Hand, legen Sie den Daumen oder den ersten Finger auf thE Grund des Nagetieres. Schnell den Druck auf den Nagetier stellen und nach vorne drücken, während die andere Hand, die den Schwanz hält, nach hinten zieht. </li><li> Halten Sie das Nagetier mit einer Hand und die große chirurgische Schere mit dem anderen. Setzen Sie den Nagetier Hals zwischen die beiden Klingen und schnell enthaupten den Kopf. </li><li> Nimm den abgetrennten Mauskopf und benutze die feine Schere, um das Fell über dem Schädel zu schneiden, bis zu den Augen. Als nächstes legen Sie die Spitzen der Schere in jede Augenhöhle und schließen Sie die Schere mit leichter Kraft. </li><li> Verwenden Sie die Frühjahrsschere, um den Schädel nach links und rechts vom Kleinhirn zu schneiden. </li><li> Verwenden Sie Pinzette, um den Teil des Schädels, der das Kleinhirn umgibt, direkt auf und ab zu heben. </li><li> Benutze die Frühlingsschere, um die midsagittale Linie des Schädels zu schneiden. </li><li> Benutze die Pinzette, um den restlichen Teil des Schädels vom Gehirn zu heben. </li><li> Verwenden Sie einen Spatel und eine Sonde, um das Gehirn in den gewünschten Behälter zu schöpfen. Mit rostfreiem sTeel Klinge, schneiden Sie jedes Gehirn entlang der midsagittalen Ebene. Führen Sie die folgenden Golgi-Cox-Methode auf den rechten Halbkugeln durch. </li></ol> 3. Golgi-Färbung und Gewebevorbereitung <ol><li> Tauchen Sie die frisch geernteten Halbhirne in eine 5-ml-Quecksilberchlorid-basierte Lösung (Lösung A aus dem Kit) in ein 10 ml konisches Röhrchen ein. Die Quecksilberchloridlösung ist lichtempfindlich; Den Schlauch mit Folie bedecken. Die Probe im Raum bei Raumtemperatur aufbewahren. HINWEIS: Die Lösung A ist im Kit enthalten, das in der Werkstoffliste aufgeführt ist. Vorsicht! Lösung A (auch Quecksilberchloridlösung genannt) enthält toxische Reagenzien wie Kaliumdichromat, Quecksilberchlorid und Kaliumchromat. Schutzhandschuhe tragen und in einer Dunstabzugshaube arbeiten. </li><li> Nach 1 Tag langsam dekantieren die Lösung in einen temporären Container (wie ein großes Wägeboot), und entsorgen Sie es in einem biohazard Abfallbehälter. Tauchen Sie die Gehirne (noch in den ursprünglichen 10 ml konischen Röhrchen) mit 5 mlDie Quecksilberchloridlösung, und die Probe bei Raumtemperatur für 13 weitere Tage zur Dunkelheit zurückkehren. </li><li> Füge 30 g Nachimprägnierungspuffer zu 90 ml destilliertem oder deionisiertem Wasser (dH 2 O) hinzu. Füllen Sie jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 6,5 ml des Nachimprägnierungspuffers, einer gut pro Gehirn HINWEIS: Der Nachimprägnierungspuffer ist im Kit enthalten, der in der Materialliste aufgeführt ist. <ol><li> Nach 14 Tagen (insgesamt) in der Quecksilberchloridlösung das Gewebe mit dH 2 O ausspülen und dann mit Nachimprägnierungspuffer in 6-Well-Platten überführen. Die Platten mit Folie bedecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahren. </li></ol></li><li> Den Nachimprägnierungspuffer nach 1 Tag Eintauchen ausspülen und mit frischem Nachimprägnierungspuffer erneuern; 1 Tag im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahren. Falls erforderlich, bei 4 ° C bis zu 1 Monat 22 lagern. </li></ol> 4. Schnitt <ol><li> Etikettieren Sie die 12-Well-Platten auf ihren Deckeln mit Zahlen in aufsteigender Reihenfolge von links nach rechts und up-to-down. </li><li> Bereiten Sie zwei oder drei 12-Well-Platten pro Gehirn vor, wenn Sie das gesamte Gehirn schneiden. <ol><li> Beschriften Sie die Oberseite jedes 12-Well-Plattendeckels mit der Identifikationsnummer des Gehirns. </li><li> Pipette 2 ml von 1x PBS in jede Vertiefung jeder Platte. </li></ol></li><li> Richten Sie die Bühne ein und schalten Sie das Vibratom ein. Sicherstellen, dass genügend 1x PBS im Behälter vorhanden ist, um das Gewebe zu bedecken. <ol><li> Schneiden Sie zwei Stücke von Plastik-Paraffin-Film und falten Sie sie über zweimal. Legen Sie sie über die Löcher für die Probenhalterknöpfe, um zu verhindern, dass 1x PBS auf den Zähler austritt. </li><li> Legen Sie das Band auf den Gewebeblock des Probenhalters und legen Sie dann Cyanacrylat-Klebstoff (siehe Materialtabelle) darauf ein. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Gehirn aus der 6-Well-Platte und legen Sie es auf eine Plastik- oder Glasschale. Verwenden Sie den rostfreienStahl-Doppelklinge, um etwa die Hälfte des Kleinhirns abzuschneiden. <ol><li> Schneiden Sie den Kleinhirn kaudal. Vergewissern Sie sich, dass der noch verbleibende Teil des Zerebellums gerade ist. </li></ol></li><li> Sofort die flache Oberfläche des verbleibenden Kleinhirns auf den Leim legen. HINWEIS: Der dorsale Teil des Gewebes (der Hirnrinde) sollte gegenüber der Klinge nach links oder rechts liegen Das rostrale Ende, das zuvor die beigefügte olfaktorische Glühbirne enthielt, sollte nach oben zeigen. <ol><li> Warten Sie mindestens ein paar Minuten, um sicherzustellen, dass der Leim voll trocknet. </li></ol></li><li> Während der Leim, der das Gehirn an Ort und Stelle hält, trocknet, gießt 1x PBS in das Probenbad. Nachdem der Kleber trocken ist, legen Sie den Probenhalter mit dem Gewebe in das Probenbad. <ol><li> Wenn die Gewebeprobe nicht vollständig bedeckt ist, gießen Sie mehr 1x PBS in das Probenbad. </li></ol></li><li> Befestigen Sie die Klinge am Klingenhalter des Vibratoms und langsam lDie Klinge in das Probenbad schieben, bis sie vollständig in 1x PBS untergetaucht ist. Setzen Sie die Klinge fort, bis sie etwas unter der Oberseite des Gewebes liegt. </li><li> Setzen Sie die Vibrationsgeschwindigkeit auf 7, die Amplitude auf 6 und den Schneidwinkel auf 12 ° (siehe Tabelle der Materialien für Vibratom-Modell). Starten Sie die Vibration und schneiden Sie 200 μm Abschnitte 23 . <ol><li> Verwenden Sie einen großen Pinsel, um die Gewebeabschnitte aus dem Probenbad in jede ausgewiesene Vertiefung der 12-Well-Platten zu bewegen. </li></ol></li><li> Weiter, um das Gewebe zu schneiden, bis die gewünschte Anzahl von Gewebeschnitten erreicht ist. </li></ol> 5. Nachfärbung <ol><li> Für jede der folgenden Färbungsschritte und Spülungen 2 ml der angegebenen Lösung pro Vertiefung verwenden. Verwenden Sie einen motorisierten Pipettenfüller (siehe Materialtabelle), um die Lösungen in die Vertiefungen zu übertragen. Verwenden Sie eine Transferpipette (siehe Materialtabelle), um Lösungen aus den Brunnen und in den richtigen Abfall zu transportierenBehälter. </li><li> Spülen Sie die Sektionen in einer 30 min Waschung von 0,01 M PBS-T (fügen Sie 3,0 ml Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien) auf 1.000 mL 0,01 M PBS). </li><li> Verdünnung der Ammoniumhydroxidlösung (Achtung) 3: 5 nach Volumen mit dH 2 O unmittelbar vor Gebrauch. Färben Sie die Abschnitte in der verdünnten Ammoniumhydroxidlösung für 19-21 min. <ol><li> Schützen Sie die lichtempfindliche Ammoniumhydroxidlösung mit Folie. HINWEIS: Ammoniumhydroxid in Lösung hat eine Konzentration von ~ 10% und wird als &quot;gefährlich&quot; eingestuft. Ammoniumhydroxidlösung kann Verbrennungen hervorrufen, wenn sie die Haut berühren. Bei Atemstillstand kann es zu Reizungen der Atemwege kommen. Schutzhandschuhe tragen und in einer Dunstabzugshaube arbeiten. </li></ol></li><li> Färben Sie die Abschnitte in den Nachfärbepuffer (fügen Sie 90 g Reagenz D in 500 ml dH 2 O) für 19-21 min hinzu. Der Nachfärbepuffer ist lichtempfindlich; Schütze es mit Folie 22 . </li><li> Spülen Sie die Abschnitte in drei, 5-10 min Wäschen von 0,01 M PBS-T. </li></ol> 6. Montage, Reinigung und Abdeckung <ol><li> Montieren Sie die Abschnitte auf 1% mit Gelatine beschichtete Folien mit dem großen Pinsel. Lassen Sie sie für 20-30 min bei Raumtemperatur trocknen, und legen Sie sie dann über Nacht in ein Coplin-Glas. </li><li> Entfernen Sie die Folien mit Handschuhen aus dem Coplin-Gefäß und legen Sie sie in ein Plastikgestell (siehe Materialtabelle). Legen Sie das Plastikgestell in die Färbeplatte (siehe Materialtabelle) mit 100% Ethanol. Dehydrieren Sie sie mit drei 5 min Wäschen. </li><li> Die Folien zweimal für jeweils 5 min in 99% Xylol waschen. Legen Sie die Objektträger in ein Glasgestell und senken Sie das Gestell in eine Glasfärbeplatte, die Xylol mit einem Metallgriff enthält (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Vorsicht, Xylol ist schädlich bei Einatmen und verursacht Reizungen, wenn es die Haut berührt. Es ist leicht entflammbar in flüssigen und Dampfzuständen. Schutzhandschuhe tragen und in einer Dunstabzugshaube arbeiten. </li><li> Entfernen Sie die Folien aus dem XylEne eins zu einer Zeit und schnell decken das Gewebe mit ~ 0,25 mL Montagemedien (siehe Material Tabelle). Als nächstes nehmen Sie die Rutschenabdeckungen und legen sie über die Medien. <ol><li> Schieben Sie alle eingeschlossenen Luftblasen unter die Schiebeabdeckungen an den Rand mit einem stumpfen Gegenstand, wie das Ende eines Pinsels. </li></ol></li><li> Legen Sie die Objektträger in einen Bereich weg von Sonnenlicht und lassen Sie sie für 2-3 Tage trocknen. </li><li> Fahren Sie mit dem Aufnehmen von Bildern mit einem Mikroskop und analysieren Sie mit der entsprechenden Software. </li></ol> 7. Bildstapel erwerben <ol><li> Öffnen Sie das Imaging-Programm (siehe Materialtabelle ). Legen Sie die Folie auf die Bühne des Mikroskops. Klicken Sie im Menü oben auf dem Programm auf &quot;Akquisition&quot; und dann auf &quot;Livebild&quot;. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop auf 10X. Identifizieren Sie das Neuron der Präferenz und bringen Sie dann den Cursor, der wie ein rotes X erscheint, auf die Mitte des Somas. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um den Referenzpunkt zu setzen. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop auf 40X. Klicken Sie auf &quot;Verschieben&quot; aus dem Menü am oberen Rand des Programms und klicken Sie dann auf &quot;Zum Referenzpunkt&quot;. </li><li> Beginnen Sie mit dem Erstellen des Bildstapels, indem Sie manuell mit dem feinen Objektiv über dem Gewebe scrollen, bis es etwas unscharf ist. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Set Top&quot; in der rechten unteren Ecke des Programms unter der Überschrift &quot;Image Acquisition&quot;. </li><li> Blättern Sie leicht unter das Gewebe, bis es etwas unscharf ist und klicken Sie dann unter &quot;Bildaufnahme&quot; auf &quot;Set Bottom&quot;. Klicken Sie anschließend auf &quot;Image Stack erwerben&quot;. </li></ol></li><li> Nachdem der Bildstapel erfasst wurde, geben Sie den gewünschten Namen für die Bilddatei in das angezeigte Fenster ein. Speichern als &quot;MBF-Ascii-Datei&quot;. <ol><li> Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie den Dateityp als &quot;MBF JPEG2000 Stack-Datei&quot; und klicken Sie dann auf &quot;Speichern&quot;. </li></ol></li></ol> 8. Neuronale Verfolgung <ol><li> In der toolbaR unter dem Menü, klicken Sie auf das Feld mit dem Titel &quot;Konturname&quot;. Wählen Sie &quot;Soma&quot; aus dem Dropdown-Menü. </li><li> Manchmal das Soma verfolgen. Dann klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie &quot;Finish Cell Body&quot;, wenn die Ablaufverfolgung abgeschlossen ist. </li><li> Wählen Sie &quot;AutoNeuron&quot;, um einen weiteren Tab mit dem Titel &quot;AutoNeuron Workflow&quot; aufzurufen. </li><li> Wählen Sie unter &quot;Konfigurationstyp&quot; die Option &quot;Neu&quot;. Setzen Sie die Parameter und klicken Sie dann auf &quot;Next Step&quot;, um die Unterposition &quot;Soma Detection&quot; aufzurufen. <ol><li> Um die Parameter einzustellen, wählen Sie &quot;Hellfeld&quot;. Als nächstes klicken Sie unter &quot;Max. Prozessdurchmesser&quot; auf &quot;Messvorgang starten&quot;. Mit dem Cursor auf die Basis des Dendrits gehen und den Durchmesser manuell einstellen. </li></ol></li><li> Klicken Sie auf &quot;Ja&quot; im Fenster, das den Benutzer auffordert, das gesamte Bild zu verfolgen. Manchmal das Soma verfolgen. Unclick und dann auf &quot;Next step&quot; klicken, um die Unterposition &quot;Seed Placement&quot; aufzurufen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Samen überprüfen&quot;S &quot;und klicken Sie dann auf&quot; Next Step &quot;, um die Unterposition&quot; Neuron Reconstruction &quot;aufzurufen. </li><li> Unter &quot;Neuron&quot; klicken Sie auf &quot;Interaktiv&quot;. Führen Sie eine interaktive Verfolgung durch, indem Sie der Richtung aus dem Programm der Dendriten folgen und mit der rechten Maustaste klicken, um den hervorgehobenen Bereich des Programms zu vervollständigen. Nach dem Tracing alle Dendriten, klicken Sie auf &quot;Next Step&quot;. </li><li> Nachdem ein neues Fenster erscheint, speichern Sie die neue Konfiguration mit einem gewünschten Titel. Klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li></ol> 9. Analyse <ol><li> Öffnen Sie das Analyseprogramm (siehe Tabelle der Materialien). </li><li> Klicken Sie im oberen Menü auf &quot;Datei&quot; und dann auf &quot;Datei öffnen&quot;. Wählen Sie die interessante Datei aus. </li><li> Wählen Sie unter der Unterkategorie &quot;Sholl-Analyse&quot;. </li><li> Im Fenster &quot;Sholl-Analyse&quot; den Startradius auf 10 μm einstellen. Klicken Sie unter &quot;Analyse&quot; auf die Felder &quot;Dendrites&quot; und &quot;Branch Orders&quot;. </li><li> Rechts clIck die neu geöffneten Fenster und klicken Sie auf &quot;Excel Export.&quot; Klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Klicken Sie unter der Analyse auf &quot;Verzweigte Strukturanalysen&quot;. Wählen Sie &quot;Alle möglichen Analysen&quot;. </li><li> Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das neu geöffnete Fenster und klicken Sie auf &quot;Excel Export&quot; 24 . </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+tree+and+brain+disorders.">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Im Vergleich zu moderneren Techniken hat die Golgi-Cox-Methode mehrere Vorteile, die es zur bevorzugten Methode zur Untersuchung der Wirbelsäulenmorphologie machen: 1) Die Färbung kann für im Wesentlichen jedes Gewebe verwendet werden, 2) Ein Grundlichtmikroskop-Setup ist alles, was benötigt wird Erwerben Golgi-basierte Bilder, 3) Die Golgi-Cox-Bildgebung ist schneller als konfokale Bildgebung und 4) Golgi-gefärbte Abschnitte sind für mehrere Monate bis Jahre länger als Proben, die fluoreszenzmarkiert sind, lebensfähig. Auch bei diesen Vorteilen hat die Golgi-Cox-Methode noch gewisse Einschränkungen. Zuerst ist der gesamte Prozess sehr zeitaufwendig und erfordert mehrere Wochen der Färbung, gefolgt von der Analyse der Bilder. Wie es bei diesem Protokoll zu sehen ist, dauert es 14 Tage in Lösung A und 1 Tag in Lösung B, bevor der Schnitt beginnen kann. Darüber hinaus wird die Durchführung von Schnitt, Nachfärbung und Montage 2-3 Stunden pro Gehirn. Jede Rutsche muss 1 Tag vor dem Reinigen trocknen und bedecken. Danach die ZeitdauerEs wird dauern, um zu bild und analysieren die abschnitte werden von der individuellen abhängen. Zweitens gibt es Probleme der Konsistenz zwischen den Daten von Analysten aufgrund von Unterschieden in der Kategorisierung von Stacheln 30 . Aus diesem Grund empfiehlt es sich, dass eine Person den Bild- und Analyseabschnitt jedes Experiments durchführt, der den Zeitaufwand für die Fertigstellung des Projekts weiter verlängert. Es gibt mehrere kritische Schritte der Golgi-Cox-Methode, die genaue Timing und Aufmerksamkeit erfordern. Beim Färben der Abschnitte mit der Ammoniumhydroxidlösung ist es zwingend erforderlich, dass die Abschnitte für mindestens 19 min, aber nicht über 21 min in der Lösung verbleiben. Wenn die Abschnitte nicht in der Ammoniumhydroxidlösung für genügend Zeit sind, werden sie nicht ordnungsgemäß gefärbt, was bedeutet, dass die Neuronen bei der Bildgebung weniger definitiv aussehen, wodurch es schwieriger wird, sie zu analysieren. Wenn die Abschnitte in der Ammoniumhydroxidlösung für über 21 min vorliegen, können sie ov werdenEr-gefärbt, so dass es schwierig, die einzelnen Neuronen zu identifizieren. Deshalb, beim Ausschalten der Lösungen, muss sich der Forscher schnell bewegen. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Übertragung der Abschnitte auf Folien. Bevor Sie die Abschnitte mit dem großen Pinsel bewegen, ist es am besten, zuerst eine kleine Menge PBS-T auf die Folie zu legen. Dadurch können die Abschnitte einfach auf die Folie gelegt und manövriert werden, ohne dass sie auseinanderbrechen müssen. Ein weiterer kritischer Schritt ist der Trocknungsschritt, nachdem die Abschnitte auf eine Folie gelegt wurden. Wenn die Folien nicht mindestens 20 min bei Raumtemperatur trocknen, werden bestimmte Abschnitte höchstwahrscheinlich während der Entwässerungsschritte abfallen. Wenn die Objektträger länger als 30 min trocknen, werden sie höchstwahrscheinlich brüchig und brechen auseinander während der Entwässerungsschritte. Bei der Durchführung dieses Verfahrens gibt es bestimmte Schritte, die möglicherweise lästig sind. Zum Beispiel, wenn das gesamte Cerebellum abgeschnitten wird, bevor man das Gehirn auf die Spezifikation setztImen-Halter und Schnitt, kann das Gehirn auseinander knacken, bevor die DG vollständig geschnitten ist, was weitere Abschnitte unbrauchbar macht. Daher ist es wichtig, nur caudal durch etwa die Hälfte des Kleinhirns zu schneiden. Ein weiterer Schritt, der die Abschnitte negativ beeinflussen kann, ist die Vibrationsgeschwindigkeit und die Amplitude. Während die empfohlenen Einstellungen für 7 und 6 sind, können beim Schneiden bestimmte Abschnitte im PBS zerfallen oder uneben erscheinen. Um dies zu korrigieren, stellen Sie entweder die Vibrationsgeschwindigkeit oder die Amplitude ein einzeln ein, bis die Abschnitte in-takt sind und sogar zwischen den Einstellungen von 6-8. Auch wenn kommerzielle Kits für Golgi-Färbung zur Verfügung stehen, fehlen ihnen oft genaue Details für jeden einzelnen Schritt. Mit diesem Protokoll berichten wir im Detail über alle Schritte, die verwendet wurden, um anderen Labors zu erlauben, Gewebe in einer hohen Qualität mit minimaler Fehlersuche zuverlässig zu färben. Die verwendeten Materialien stehen den meisten Neurowissenschaften zur Verfügung. Aberrationen in dendrit morpHologie und Veränderungen in der Zahl der dendritischen Stacheln sind mit einer Vielzahl von neurologischen Störungen verbunden 31 . Darüber hinaus könnten diese Störungen der dendritischen Arborisierung ein bedeutendes morphologisches Merkmal der durch Chemotherapie verursachten Verletzung im Gehirn darstellen 32 . In Zukunft werden wir untersuchen, wie sich die von 5-Fu induzierten strukturellen Veränderungen auf die Verhaltens-, Zell- und Molekularveränderungen beziehen können.

<html> Dendriten sind der größte Teil der Neuronen, die den präsynaptischen Eingang empfangen und verarbeiten 1 . Ihre dendritischen Prozesse haben eine komplexe Geometrie, wo die proximalen Zweige einen größeren Durchmesser haben als die distalen Zweige. Da Dendriten sich entwickeln, bilden sie mehrere Verbindungen mit anderen Neuronen in einem Prozess, der als dendritische Arborisierung bezeichnet wird. Das Ausmaß und Muster dieser Verzweigung bestimmt die Menge der synaptischen Eingaben, die ein Dendrit adäquat verarbeiten kann 2 . Dendritische Arborisierung ist ein notwendiger Prozess für die aktivitätsabhängige Plastizität und die richtige Entwicklung von neuronalen Schaltungen. Extension, Retraktion, Verzweigung und Synaptogenese sind komplizierte Prozesse, die intrinsische genetische Programme und Einflüsse aus extrinsischen Faktoren beinhalten. Die morphologischen und verzweigten Variationen der neuronalen Dendriten innerhalb des Hippocampus sind in die Erkenntnis- und Gedächtnisbildung verwickeltF &quot;&gt; 3 , 4. Die Veränderungen der dendritischen Komplexität sind mit pathophysiologischen und Verhaltensänderungen verbunden 5. Anomalien beziehen sich auf mehrere Krankheitszustände, darunter zerbrechliches X-Syndrom und Down-Syndrom 6 . Dendritische Stacheln sind die spezialisierten subzellulären Kompartimente der dendritischen Dorn, die exzitatorische Eingaben im zentralen Nervensystem erhalten. Es gibt drei morphologische Klassen von dendritischen Stacheln, wobei der Name jeder Klasse auf ihrer Größe und Form basiert: 1) Pilzstacheln, die komplexe postsynaptische Dichten mit mehr Glutamatrezeptoren haben als andere Stacheln 7 ; 2) Stubby Stacheln, denen ein Stamm fehlt; Und 3) dünne Stacheln, die aus einem langwierigen, schmalen Stamm und einem Kugelkopf bestehen 8 . Das dendritische Wirbelsäulenvolumen wird teilweise verwendet, um sie zu definieren, wobei dünne Stacheln im allgemeinen kleiner sind (0,01 μm 3 </sup&gt;) Im Vergleich zu Pilzstacheln (0,8 μm 3 ) 9 , 10 . Die Stacheln stabilisieren sich mit Reifung. Zum Beispiel ziehen sich die dünnen Stacheln nach einigen Tagen zurück oder entwickeln sich zu Pilzstacheln. Alternativ sind die Pilzstacheln relativ stabil und können über einen längeren Zeitraum überleben. Die Stärke der neuronalen Verbindungen beruht auf der Anzahl der Stacheln und / oder deren Volumen 11 , 12 , 13 . Die klassische Golgi-Färbemethode und ihre moderneren Variationen sind alle für die Untersuchung der dendritischen Wirbelsäulenmorphologie und -dichte nützlich gewesen. Ein einzigartiger Aspekt der Golgi-Färbung ist, dass es zufällig etwa 5% der gesamten Neuronen, die für die Verfolgung der einzelnen Neuronen 14 , 15 erlaubt. Obwohl der genaue Mechanismus, in dem die Golgi MethOd stains einzelne Neuronen ist noch unbekannt, das Prinzip des Verfahrens basiert auf der Kristallisation von Silberchromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Es gibt drei Haupttypen der Golgi-Methode: den schnellen Golgi, den Golgi-Cox und den Golgi-Kopsch 18 , 19 . Alle drei Methoden beginnen mit einer anfänglichen Inkubationsphase in Chromsalzen für mehrere Tage bis Monate, aber es gibt bestimmte wichtige Unterschiede zwischen ihnen. Der schnelle Golgi nutzt Osmiumtetroxid im ersten Schritt, während der Golgi-Kopsch Paraformaldehyd enthält. Die Färbung sowohl im Rapid-Golgi als auch im Golgi-Kopsch folgt eine Inkubation in einer 1-2% Silbernitratlösung für etwa 7 Tage. Die Golgi-Cox-Methode verwendet Quecksilberchlorid und Kaliumdichromat anstelle von Silbernitrat und hat eine Imprägnierungszeit von 2-4 Wochen. Die Gewebe werden dann geschnitten und schnell in ein verdünntes Ammoniak gegebenLösung, gefolgt von einem fotografischen Fixierer, um Salze zu entfernen. Von den drei Typen wird die Golgi-Cox-Methode als am besten angesehen, um die dendritischen Dorn ohne große Hintergrundinterferenz zu färben, zum Teil weil die Kristallartefakte nicht auf der Oberfläche des Gewebes auftreten (anders als bei der schnellen Golgi-Methode) 17 , 20 , 21 . Die vorliegende Methode ist eine leichte Variation des Protokolls, das mit einem kommerziellen Golgi-Färbe-Kit versehen ist, und wurde entworfen, um zu beurteilen, wie eine relativ niedrige Dosis des 5-Fu die dendritischen morphologischen Eigenschaften und die Wirbelsäuredichte beeinflussen würde. Alle gewonnenen Daten könnten einen weiteren Einblick geben, wie sich die chemotherapeutische Behandlung auf die neuronale Schaltung auswirkt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">superGolgi Kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Bioenno Lifesciences</td>
			<td style="width:119px;">30100</td>
			<td style="width:216px;">&#160;Contains hazardous materials.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 10X powder concentrate</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Permount&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SP 15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slide cover&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12-546-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7mL Transfer pipette&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Globe Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 mL Falcon tubes&#160;</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foil&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">01-213-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">12-well plate&#160;</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 proof Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Pharmco-AAPER</td>
			<td style="width:119px;">111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Acros Organics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1330-20-7</td>
			<td>Hazardous.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Permabond 200</td>
			<td style="width:207px;">Permabond LLC</td>
			<td style="width:119px;">GF2492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25 mL serological pipette</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">SIAL1489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:207px;">Midsci</td>
			<td style="width:119px;">HS234526C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vibratome&#160;</td>
			<td style="width:207px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NVSLM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57Bl/6 Male Mice&#160;</td>
			<td style="width:207px;">The Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:119px;">000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Axio Imager 2</td>
			<td style="width:207px;">ZEISS</td>
			<td style="width:119px;">Multiple components, see website for details.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AxioCam MRc Camera</td>
			<td style="width:207px;">ZEISS</td>
			<td style="width:119px;">426508-9902-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish , Green</td>
			<td style="width:207px;">Tissue-Tek</td>
			<td>62541-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish Set&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>70312-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Motorized Pipet Filler&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">03-692-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurolucida&#160;</td>
			<td style="width:207px;">mbf Bioscience&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurolucida Explorer&#160;</td>
			<td style="width:207px;">mbf Bioscience&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prism&#160;</td>
			<td style="width:207px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of hippocampal dendritic complexity in aged mice using the golgi-cox method

Dendritische Stacheln sind die Ausstülpungen aus den neuronalen dendritischen Schächten, die exzitatorische Synapsen enthalten. Die morphologischen und verzweigten Variationen der neuronalen Dendriten innerhalb des Hippocampus sind in die Erkenntnis- und Gedächtnisbildung verwickelt. Es gibt mehrere Ansätze zur Golgi-Färbung, die alle für die Bestimmung der morphologischen Eigenschaften der dendritischen Lauben nützlich waren und einen klaren Hintergrund hervorbringen. Die vorliegende Golgi-Cox-Methode (eine leichte Variation des Protokolls, die mit einem kommerziellen Golgi-Färbe-Kit versehen ist) wurde entworfen, um zu beurteilen, wie eine relativ niedrige Dosis des chemotherapeutischen Arzneimittels 5-Flurouracil (5-Fu) die dendritische Morphologie beeinflussen würde , Die Anzahl der Stacheln und die Komplexität der Arborisierung im Hippocampus. Die 5-Fu modulierten die dendritische Komplexität signifikant und reduzierten die Wirbelsäulendichte im gesamten Hippocampus regionalspezifisch. Die dargestellten Daten zeigen, dass die Golgi-Färbemethode efDie fälligen Neuronen in der CA1, dem CA3 und dem Dentat Gyrus (DG) des Hippocampus fungiert. Dieses Protokoll berichtet die Details für jeden Schritt, so dass andere Forscher können zuverlässig Flecken Gewebe im gesamten Gehirn mit qualitativ hochwertigen Ergebnissen und minimale Fehlersuche.

Die Effekte der 5-Fu-Behandlung auf die dendritische Arborisierung und Komplexität im Hippocampus von Golgi-gefärbten Gehirnabschnitten wurden mit einer handelsüblichen Imaging-Software quantifiziert und verfolgt. Nach der Verfolgung wurden die dendritische Arborisierung, die Wirbelsäulendichte und die Wirbelsäulenmorphologie unter Verwendung der Sholl-Analyse und des dendritischen Komplexitätsindex (DCI) analysiert. Sholl-Analyse ist eine quantitative analytische Methode, die verwendet werden kann, um die dendritische Arbor-Morphologie zu bestimmen 25 . Ausgehend von der soma, Kreise 10 μm voneinander getrennt überlagern die dendritischen Spuren. Die Länge der Dendriten wird durch die Anzahl der Kreise bestimmt, die die Dendriten kreuzen. Die Verzweigungspunktanalyse, eine Methode zur Ermittlung der Komplexität eines dendritischen Ladens, basiert auf der Gesamtzahl und der Reihenfolge der Verzweigungspunkte. Ein Verzweigungspunkt ist definiert als wenn aZweig spaltet sich in zwei Unterzweige. Die Zweigreihenfolge ist ein Maß für die Komplexität, die auf, wie oft die Zweige sich teilen. Beispielsweise wäre ein Verzweigungspunkt erster Ordnung der ursprüngliche Dendrit, der sich von dem Soma erstreckt, während ein Zweigpunkt zweiter Ordnung der Punkt wäre, an dem der Zweig in zwei Unterzweige teilt. Durch die Betrachtung sowohl der Verzweigungspunkte als auch der Zweigordnung wird die Komplexität des dendritischen Dorns (basierend auf der Anzahl der Verzweigungspunkte) und an welchen Punkten die Verzweigung auftritt (eine kleinere Zweigordnung ist näher an dem Soma, während eine größere Zweigreihenfolge ist Weiter von der soma) bestimmt werden kann. Diese Parameter wurden auf das DCI angewendet. Die CA1 und CA3 wurden in apikale und basale Teile aufgeteilt und unabhängig voneinander analysiert 26 , 27 . Die Dendriten der CA1- und CA3-Pyramidenneuronen und Granulatneuronen im DG wurden analysiert. Alle Neuronen ausgewählt ausR jede experimentelle Gruppe erfüllte die folgenden Kriterien: 1) die Dendriten hatten eine dunkle und konsistente Golgi-Färbung über ihre gesamte Länge, 2) die Dendriten waren sichtbar in-takt, und 3) jedes Neuron hatte genug Platz zwischen ihnen, um Interferenz während der Analyse zu verhindern 28 Abbildung 1 zeigt ein Neuron, das die oben genannten Kriterien erfüllt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Um die statistischen Unterschiede zwischen den Schein- und den 5-Fu-Gruppen zu bestimmen, wurde ein gepaartes Zwei-tailed- t- test verwendet. Alle statistischen Analysen wurden mit analytischer Software (siehe Tabelle der Materialien) durchgeführt und p &lt;0,5 wurde als signifikant angesehen. Zur Bewertung der Effekte der 5-Fu-Behandlung und des Sholl-Radius wurde eine Varianzanalyse der Varianz (ANOVA) verwendet. Fisher LSD Post-hoc-Tests wurden nach ANOVA nach Bedarf verwendet 29 . In beiden CA<html> 1 ( t = 7,68, p &lt;0,01, Abbildung 2 A ) und CA3 ( t = 7,54, p &lt;0,01, Abbildung 3 A ) apikale pyramidale Dendriten, eine signifikante Gesamtreduktion der Stacheln nach der 5-Fu-Behandlung. Während die 5-Fu-Behandlung die Basal-Wirbelsäulen-Dichte von CA1 nicht signifikant beeinflusste ( t = 1,79, p = 0,15, Abbildung 2 B ), verringerte sie signifikante CA3-basale pyramidale dendritische Stacheln ( t = 5,57, p &lt;0,05; B ). Darüber hinaus zeigten die Fisher-LSD-post-hoc-Tests eine Abnahme der dendritischen Wölbung der CA1 apikalen pyramidalen Dendriten bei 40-100 μm (Fisher&#39;s LSD, p &lt;0,001, Abbildung 2 C ) und 130-160 μm (Fisher&#39;s LSD, p &lt; 0,05;Ein ähnliches Phänomen wurde in den CA1 basalen apikalen Dendriten bei 30-60 μm (Fisher&#39;s LSD, p &lt;0,001, Abbildung 2 D ) und 70-110 gesehen Μm (Fisher&#39;s LSD, p &lt;0,05, Abbildung 2 D ) weg von der Soma 29 . In Bezug auf die CA3 apikalen pyramidalen Dendriten gab es keinen signifikanten Unterschied in der segmentalen dendritischen Länge nach der 5-Fu-Behandlung im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen ( F (28,87) = 0,91, p = 0,59, Fig. 3 C ). Für die CA3-Basalpyramiden-Dendriten gab es jedoch einen signifikanten Unterschied zwischen der 5-Fu-Behandlung und den mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen in der segmentalen dendritischen Länge ( F (25, 78) =1,85; P &lt;0,05; Abbildung 3 D ). Die LSD von Fisher ergab, dass die 5-Fu-Behandlung die dendritische Dornierung bei 90-100 μm ( p &lt;0,01, Abbildung 3 D ), 70-80 μm und 110-120 μm verringerte (Fisher&#39;s LSD, p &lt;0,05, Abbildung 3 D ) Weg von der soma 29 . Um die dendritische Komplexität zu bestimmen, wurde eine Zweigreihenanalyse verwendet, um die 5-Fu-behandelten und die mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppen zu vergleichen. Innerhalb der DG zeigte die Zweigordnungsanalyse einen signifikanten Unterschied zwischen jeder Behandlungs- und Verzweigungsreihenfolge ( F (8, 36) = 25,61, p &lt;0,001, Fig. 4 ). Dies wurde weiter analysiert mit dem Fisher&#39;s LSD, was darauf hindeutete, dass es eine verminderte Länge am 4. und 6.Reihenfolge nach der 5-Fu-Behandlung ( p &lt;0,001; Abbildung 4 ) 29 . <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig1.jpg" /> Abbildung 1 : Golgi-gefärbtes Neuron, das die Kriterien für die Bildgebung und die weitere Analyse darstellt. Alle drei Wirbelsäulentypen sind nach der Golgi-Färbung leicht zu sehen. Die Färbung ist über die gesamte Länge des Dendrits konsistent und der Dendrit wird von anderen Neuronen isoliert. Maßstab, 5 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55696/55696fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig2.jpg" /> Abbildung 2 : Golgi gefärbt n<html> Euronen zeigten signifikante Unterschiede in der Wirbeldichte zwischen den 5-Fu-behandelten und den mit Salzlösung behandelten Gruppen im apikalen CA1, aber nicht im basalen CA1. Es gab einen signifikanten Unterschied in der Wirbelsäulenlänge zwischen 5-Fu-behandelten und mit Salzlösung behandelten Gruppen sowohl im apikalen als auch im basalen CA1. ( A ) In den apy-pyramidenförmigen Dendriten von CA1 verringerte 5-Fu die Wirbelsäule signifikant. ( B ) In den basalen Dendriten gab es keine signifikanten Veränderungen in der Gesamtdichte der Stacheln. ( C ) Die Sholl-Analyse ergab, dass die 5-Fu-Behandlung die dendritische Wurzelung bei 40-100 μm und 130-160 μm von dem Soma in den apikalen pyramidalen Dendriten von CA1 signifikant verringerte. ( D ) In den basalen Dendriten verringerte die 5-Fu-Behandlung die dendritische Arborisierung bei 30-60 μm und 70-110 μm von dem Soma. Durchschnitt ± SEM (n = 6). * P &lt;0,05; ** p &lt;0,01, ANOVA 29 .= &quot;Http://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig3.jpg" /> Abbildung 3 : Golgi-gefärbte Neuronen zeigten signifikante Unterschiede in der Wirbelsäuredichte zwischen 5-Fu-behandelten und mit Salzlösung behandelten Gruppen sowohl im apikalen als auch im basalen CA3. Es gab einen signifikanten Unterschied in der Wirbelsäulenlänge zwischen 5-Fu-behandelten und mit Kochsalzlösung behandelten Gruppen in apikalen CA3, aber nicht basalen CA3. ( A ) In den CA3 apikalen pyramidalen Dendriten verringerte 5-Fu die Wirbelsäule deutlich. ( B ) In den basalen Dendriten verringerte 5-Fu die Gesamtdichte der Stacheln erheblich. ( C ) Es gab keinen signifikanten Effekt der 5-Fu-Behandlung im CA 3 apikalen Bereich. ( D ) In den basalen Dendriten, 5-Fu treaTung verringerte dendritische Arborisierung 70-120 μm weg von der soma. Durchschnitt ± SEM (n = 6). *, P &lt;0,05; **, p &lt;0,01, ANOVA 29 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55696/55696fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig4.jpg" /> Abbildung 4 : Golgi-gefärbte Neuronen innerhalb der DG zeigten eine verminderte Länge bei der 4. und 6. Ordnung nach 5-Fu-Behandlung im Vergleich zu der mit Salzlösung behandelten Gruppe. Länge pro Zweigordnung in pyramidenförmigen Neuronen der CA1 Hippocampalregion. Durchschnitt ± SEM (n = 6). * P &lt;0,05; ** p &lt;0,01, ANOVA 29 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55696/55696fig4large.jpg" target="_blank">Plädoyer</a>Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Hier stellen wir ein Golgi-Cox-Protokoll ausführlich vor. Diese zuverlässige Gewebe-Fleck-Methode ermöglicht eine qualitativ hochwertige Beurteilung der Cytoarchitektur im Hippocampus und im gesamten Gehirn mit minimaler Fehlersuche.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Serie: Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

Beurteilung der Motor Balance und Koordination in Mäuse mit dem Schwebebalken

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Beurteilung der Gefäß Regeneration im ZNS Verwenden der Maus Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...