Diese Arbeit wurde durch Mittel von der Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant, verliehen an EEH und Midwestern University Office of Research und Sponsored Programme Intramural Grant, an KJL vergeben unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde von angeschlossenen Laboratorien und angeschlossenen Dermatologie zur Verfügung gestellt. Wir danken Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel und Ali Zaidi für ihre technische Unterstützung.

Alle Experimente an menschlichen Gewebeproben wurden von Western IRB (WIRB-Protokoll Nr. 20142461) genehmigt. Das einzige Kriterium für die Sammlung von Geweben für diese Verfahren ist eine Biopsie-bewährte Diagnose von SCC. Es wurden keine Ausschlusskriterien im ursprünglichen IRB-Protokoll skizziert, aber Proben von Patienten mit bekannter blutübertragbarer Krankheit wurden nicht verwendet. Informierte Zustimmung wurde vor der Sammlung von Hautgewebe, Blut und Speichel erhalten. Midwestern Institutional Review Board genehmigte die Validierungsarbeit mit klinikbasierten Biorepository-Proben an der Midwestern University (AZ # 807). 1. Kutane Tumor-Gewebe-Verarbeitung HINWEIS: Dies wird von einem Mohs Histotechnologen durchgeführt. <ol><li> Verarbeitung von frischem Plattenepithelkarzinom (SCC) Gewebe für RNA und Explant Culture <ol><li> Nachdem das Gewebe vom Mohs-Chirurgen herausgeschnitten worden ist, ernten Sie 10 bis 50 mg (≥ 10 mm 3 </sup&gt;) Gewebeprobe aus der Mitte der apikalen Seite des Gewebes während der Entspannung (was der Prozess der Manipulation des Gewebes ist, um es zu erlauben, flach auf dem Objektträger zu liegen) vor der zusätzlichen Verarbeitung. HINWEIS: Dies ist nur möglich, wenn der Tumor groß genug ist, um eine Probe von 10-50 mg (≥10 mm 2 ) vor der histologischen Beurteilung, die Teil des Mohs-Verfahrens ist, zu entfernen. Wenn der Tumor nicht groß genug ist, um ein Minimum von 2 mm 3 zu entfernen, gehen Sie nicht mit der Verarbeitung für RNA vor (Schritt 5 überspringen). </li><li> Übertragen Sie das lebensfähige Gewebe auf ein markiertes 1,5 mL Röhrchen, das Kulturmedium enthält (1: 1 Mischung von DMEM: Ham F-12, 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin) mit Pinzetten und stellen Sie sicher, dass die Gewebe wird vollständig in das Medium eingetaucht. Lagern Sie diese Röhre bei 4 ° C vor der zusätzlichen Verarbeitung. </li><li> Verwenden Sie das Gewebe für die RNA-Isolierung und Expressionsanalyse (siehe Schritt 5) und / oder die etablierungEnt einer Kulturpflanze (siehe Schritt 6) innerhalb von 24 Stunden. </li><li> Legen Sie den Rest der Tumorprobe, die vom Patienten entfernt wurde (Schritt 1.1.1), auf einem Kryostat-Gewebehalter (oder &quot;Chuck&quot;). Das Gewebe in eine optimale Schneidetemperatur (OCT) -Verbindung einbinden, das Gewebe innerhalb des Halters einfrieren, um die Fertigstellung der Mohs-Histologie und die Vorbereitung zusätzlicher histologischer Dias für die experimentelle Analyse zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Vorbereitung von histologischen Folien <ol><li> Schneiden Sie Gewebeabschnitte 7 μm dick mit einem Kryostaten und erstellen Sie zwei (oder mehrere) Objektträger für jede Tumorprobe. Stellen Sie sicher, dass jede Folie bis zu drei Abschnitte des gesamten Tumors enthält. HINWEIS: Einer der beiden Folien wird mit H &amp; E vom Mohs-Histotechniker gefärbt und die zusätzlichen Folien können mit IF-, IHC- oder FISH-Analyse verarbeitet werden. </li><li> Legen Sie die Folien in Aceton für 1-2 s, um das Gewebe zu fixieren. Setzen Sie diese Rutschen zur Seite. Nicht h &amp; eFlecken oder Deckel die Folie für zukünftige Immunfluoreszenz (IF), Immunhistochemie (IHC) oder Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Analyse, abhängig von der experimentellen Protokoll verwendet werden. </li></ol></li><li> Verarbeitung von Post-Mohs-Gewebe <ol><li> Sobald die Mohs-Verarbeitung abgeschlossen ist (Schritte 1.1-1.2), arbeiten Sie in der Kryostatkammer und entlasten die Probe aus dem Kryo-Einbettungsmedium und legen das Gewebe in ein markiertes Kryo-Röhrchen. </li><li> Legen Sie die markierte Ampulle in flüssigen Stickstoff, bevor das Gewebe aufgetaut hat. Wenn Proben für die Protein- und / oder DNA-Analyse verwendet werden sollen, können sie innerhalb weniger Minuten in einen flüssigen Stickstoff oder ein Gefäß mit -80 ° C überführt werden, um für die zukünftige Proteinexpression und DNA-Mutationsanalyse gelagert zu werden (siehe Schritte 4-5) . HINWEIS: Wenn aus der Post-Mohs-Probe eine intakte RNA gewünscht wird, ist es unerlässlich, die Probe während der Entfernung aus dem Kryo-Einbettungsmedium gefroren zu halten. Wenn äußerste Sorgfalt nicht ausgeübt wirdIn diesem Schritt sollte die Post-Mohs-Probe für die Protein- und / oder DNA-Analyse reserviert werden. </li></ol></li><li> Verarbeitung von frischem ANT <ol><li> Zur Zeit der Mohs-Schließung, erhalten ANT vom Mohs-Chirurgen. </li><li> Entfernen Sie eine gleich große oder größere Menge an ANT, wie sie aus der SCC-Probe (siehe oben) von der apikalen Seite des normalen Gewebes geerntet wurde, und überführen sie auf ein markiertes 1,5 ml-Röhrchen, das Kulturmedium enthält (1: 1-Gemisch von DMEM: Hams F- 12, ergänzt mit 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 &amp; mgr; g / ml Streptomycin) unter Verwendung einer Pinzette. </li><li> Vollständig das Gewebe in das gleiche Kulturmedium eintauchen und bei 4 ° C bis zur nachfolgenden Verarbeitung aufbewahren (siehe Schritte 4-6). </li></ol></li></ol> 2. Blut-, Speichel- und Bukkal-Tupferverarbeitung <ol><li> Erhalten Sie ca. 10 ml Blut in EDTA Sammelröhrchen über Venenpunktion. </li><li> Übertragen Sie das Blut aus den Sammelröhrchen in ein steriles 15- oder 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie ca. 200 μl in ein 1,5 mL Kryo-Röhrchen, um Blasen zu vermeiden; Speichern Sie diese Vollblutprobe bei -80 ° C, um für zukünftige Genotypisierung und Gewebeanpassung verwendet zu werden, falls nötig. <ol><li> Das restliche Blut bei 1000 xg für 30 min drehen und den Standardverfahren folgen, um die Plasmafraktion zu sammeln. </li><li> Aliquotieren Sie das Plasma in 1-ml-Schritten in 1,5 ml Kryo-Röhrchen und lagern bei -80 ° C für den Einsatz bei zukünftigen Flüssigbiopsie-Analysen. </li></ol></li><li> Verwenden Sie einen sterilen Tupfer, um eine bukkale Tupferprobe zu erhalten und den Tupfer in einem sterilen Röhrchen bei Raumtemperatur zu lagern. </li><li> Falls erforderlich, eine Speichelprobe erhalten und bei Raumtemperatur in einem sterilen Röhrchen aufbewahren. HINWEIS: Diese Proben können für zukünftige Genotypisierung und Gewebeanpassung verwendet werden, falls erforderlich. </li></ol> 3. Aufzeichnung der Proben <ol><li> Übertragen von Informationen aus der Checkliste der Patientenproben in die Biorepository-Datenbank. Patienteninformation und diag einbeziehenNosis aus der Patientendiagramm. </li><li> Drucken Sie Etiketten mit einem Barcode für jede Probe und notieren Sie jede in der Datenbank, um jede gesammelte Probe mit Patientendaten zu verknüpfen. </li><li> Notieren Sie die Verteilung der de-identifizierten Proben in der Biorepository-Datenbank vor der Übertragung der Proben in das Forschungslabor. </li></ol> 4. Protein-Isolierung und Western-Blot-Analyse <ol><li> Legen Sie jede Gewebeprobe (SCC und / oder ANT) in eine Durchstechflasche, die 500 μl Zelllysepuffer enthält, der Protease-Inhibitoren pro 100 mg Gewebe enthält, um das Gewebe zu lysieren. HINWEIS: Wir verwendeten einen Radioimmunopräzipitationstest (RIPA) -Puffer, bestehend aus 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% Natriumdeoxycholat, 1,0% NP-40 und 0,1% SDS. Andere Zelllysepuffer können verwendet werden. </li><li> Homogenisieren des Gewebes unter Verwendung eines Gewebehomogenisators für 5 min in 20-s-Intervallen bei 4 ° C. Spin die Proben bei 21.000 xg und 4 ° C für 20 min und sammle den überstehenden Protein in eine frische tuSein. Den Überstand unter den gleichen Bedingungen nachspülen und den Endüberstand in ein frisches Röhrchen sammeln. </li><li> Elektrophorese 30-50 μg Protein aus jeder Probe unter Verwendung eines 4-20% SDS-Polyacrylamid-Gradientengels. Färben Sie das Gel mit Coomassie Blue, um Proteinbanden zu visualisieren, falls gewünscht. </li><li> Wenn eine Western-Blot-Analyse von exprimierten Proteinen erforderlich ist, übertragen Sie die Proteine ​​aus dem Gel zu einer Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran nach Standardprotokollen. Nach der Übertragung färben Ponceau die PVDF-Membran, um Proteinbanden zu visualisieren, falls gewünscht. </li><li> Blockieren Sie die PVDF-Membran und die Sonde, um Proteine ​​von Interesse nach Standardprotokollen zu erkennen. Verwenden Sie primäre Antikörper, die spezifisch für das / die Protein (e) von Interesse sind, zusammen mit entsprechenden sekundären Antikörpern, die für die primären Antikörper spezifisch sind, in Konzentrationen, die vom Hersteller für Western-Blot-Analyse empfohlen werden. </li><li> Die untersuchte Membran unter Verwendung eines chemolumineszierenden Substrats freisetzen und die Membran mit einem imagi aufbildenSystem. </li></ol> 5. RNA-Isolierung und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) <ol><li> Stellen Sie sofort frische Gewebeproben (SCC und / oder ANT) in ein 1,5 ml-Röhrchen, das eine RNA-Stabilisierungslösung enthält, und platzieren Sie nach dem Mohs-Gewebeproben in ein 1,5 ml-Röhrchen, das eine gefrorene Gewebeübergangslösung enthält, nach den Empfehlungen des Herstellers. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig eingetaucht ist. Diese Proben bei -80 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren. </li><li> Entfernen Sie die RNA-Proben von -80 ° C und tauen Sie auf Eis. Übertragen Sie das Gewebe auf ein neues 1,5 ml-Röhrchen, das 1 ml RNA-Extraktionspuffer (Phenol / Guanidin-Thiocyanat) pro 50-100 mg Gewebe enthält. </li><li> Lyse die Gewebe mit einem Gewebe-Homogenisator. Führen Sie sechs Zyklen der Homogenisierung durch, gefolgt von einer Periode der Probenkühlung; Jeder Zyklus besteht aus 20 s Homogenisierung bei 4 ° C und einer 40 s Kühlung. Nach der Homogenisierung die Probe 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Füge 0,2 hinzuMl Chloroform pro 1 ml RNA-Extraktionspuffer und schüttelt das Röhrchen kräftig von Hand für 15 s. Inkubieren für 2-3 min bei Raumtemperatur. </li><li> Die Proben bei 12.000 xg und 4 ° C für 15 min drehen. Entfernen Sie die wässrige Phase der Probe und legen Sie sie in ein neues 1,5 mL Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 0,5 ml von 100% Isopropanol pro 1 ml des in Schritt 5.2 verwendeten RNA-Extraktionspuffers in die wässrige Phase hinzu und inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Wenn die RNA-Ausbeuten niedrig sind ( dh das Ausgangsgewebevolumen beträgt weniger als 10 mg), können die Proben über Nacht bei -80 ° C ausgefällt werden. Zusätzlich können 5 &amp; mgr; g RNase-freies Glykogen pro 500 &amp; mgr; l RNA-Extraktionspuffer während des Isopropanol-Präzipitationsschrittes zugegeben werden, um die RNA-Ausbeuten zu verbessern. </li><li> Die Probe bei 12.000 xg bei 4 ° C für 10 min drehen. Den Überstand entfernen und das Pellet mit 1 ml 75% igem Ethanol waschen. </li><li> Vortex die Probe kurz und dann drehen Sie es bei 7.500 xg und 4 °C für 5 min. Verwerfen Sie die Wäsche und lufttrocknen Sie das Pellet für 5-10 min. </li><li> Das RNA-Pellet wird in 20 μl RNase-freiem Wasser resuspendiert. <ol><li> Falls gewünscht, reinige jede RNA-Probe mit einem RNA-Cleanup-Kit nach den Empfehlungen des Herstellers. HINWEIS: Kleine RNAs werden aus der Probe verloren, wenn dieser Schritt durchgeführt wird. </li></ol></li><li> Elektrophorese eine 1 &amp; mgr; g Probe unter Verwendung eines 1,2% Formaldehyd-MOPS-Agarosegels, um die Qualität der RNA zu analysieren. HINWEIS: Als Alternative analysieren Sie Proben mit einem Bioanalysator, um eine RIN-Nummer 13 zu erhalten. </li><li> Reverse-transkribieren der RNA an cDNA unter Verwendung eines reversen Transkriptionsprotokolls für die qPCR-Analyse von Ziel-mRNAs (oder miRNAs) von Interesse. </li></ol> 6. Gewebe-Explant-Kulturen <ol><li> Sterilisieren des ausgeschnittenen Gewebes vor der Kultur durch Eintauchen des Gewebes in 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie das Gewebe auf eine Folie oder Schale und fügen Sie genug Kultur Medium (1: 1 Mischung aus DMEM: Ham &amp; #39; s F-12, ergänzt mit 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin), um das Gewebe zu bedecken (um das Gewebe vor dem Trocknen zu verhindern). Das Gewebe sorgfältig in Fragmente (&lt;1 mm 3 ) mit einem Skalpellblatt schneiden. </li><li> Übertragen Sie die Gewebefragmente auf eine 35-mm-Gewebekulturschale und fügen Sie etwa 20 μl fötales Rinderserum (FBS) auf jedes Fragment hinzu. </li><li> Lassen Sie das Gericht in einer Kulturhaube für 20-30 min oder bis fast trocken. </li><li> Fügen Sie 1 ml Kulturmedium (1: 1 Mischung aus DMEM: Schinken F-12, ergänzt mit 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin) zu jeder Schale und inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 . Subkultur oder Sub-Klon die Kulturen, wenn nötig. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Nach dem Wissen des Autors ist dieses Protokoll das erste seiner Art, das sich auf die klinische Beschaffung von Hautgewebeproben sowohl in einem kostengünstigen als auch in einem schnellen Ansatz konzentriert. Patienten, die sich einer Mohs-Mikrochirurgie unterziehen, sind typischerweise während bestimmter Zeitblöcke geplant, und die Sammlung ist auf diese Zeiträume beschränkt. Die Probenahme beinhaltet die Anstrengung des medizinischen Assistenten, der an der Patientenversorgung beteiligt ist, der Mohs-Histotechnologe, der die Tumorproben verarbeitet, und ein designiertes Laborpersonal, das den Stichprobeneintrag und die Blutverarbeitung behandelt. Mit sorgfältiger Koordination zwischen den drei Mitgliedern des Kollektionsteams ( dh dem medizinischen Assistenten, dem Mohs-Histotechnologen und dem Labortechniker) haben wir festgestellt, dass die vorhandenen medizinischen Hilfskräfte die zusätzlichen Aufgaben im Zusammenhang mit der Sammlung von 3-5 Gewebeproben vervollständigen können Pro Tag ohne offensichtliche Verzögerung im Klinikbetrieb. Gewährleistung der Zustimmung des Patienten<html> Und das Sammeln von bukkalen Tupfern und Blut sind während der normalen Wartezeiten abgeschlossen, die mit dem Mohs-Mikrochirurgieverfahren verbunden sind. Anders als die Entscheidungsfindung darüber, wie eine Probe verarbeitet werden soll, werden die Aufgaben, für die der Mohs-Histotechnologe verantwortlich ist, am Ende der Mohs-Verarbeitung von Patientenproben abgeschlossen und werden in der Regel etwa 30 Minuten zum Tagesablauf hinzufügen. Typischerweise ist ein Mitglied des Klinikpersonals für die Etikettierung und Verarbeitung der Blutproben und für die Durchführung von Transfer und Eintragung von Proben in die Datenbank verantwortlich. Abhängig von der Anzahl der verarbeiteten Proben können diese Pflichten erhebliche Zeit von den bestehenden Pflichten verlangen. So sollte die Probenahme nur dann durchgeführt werden, wenn genügend Laborpersonal vorhanden ist. Genauer gesagt, wenn mehr als 5 Proben an einem einzigen Tag gesammelt werden oder wenn mehrere Blutproben von Patienten gesammelt werden, werden mehrere Stunden zusätzlicher Aufwand vom Labortechniker benötigt. Jove_content &quot;&gt; An den Sammeltagen erhalten die medizinischen Assistenten (MA) die Zustimmung der Patienten für Spenden von Gewebe, die MA erhält anschließend einen bukkalen Tupfer (und Speichel, falls nötig) und sammelt Blut für die Verarbeitung durch Laborpersonal Patientenbeteiligung nach der Erhebung dieser Proben, also aus der Perspektive des Patienten, ist der Rest des Klinikbesuchs unverändert (obwohl sie gebeten werden, Blut während eines Folgebesuchs zu spenden). Derzeit können wir abschätzen, dass 70% der Patienten zustimmen Um das Gewebe zu spenden, mit ~ 30% der Patienten, die auch Blut spenden, 30% Rückgang zur Teilnahme. Derzeit sind nur Patienten mit einer Biopsie-bewährten Diagnose von Krebs im Biorepository enthalten. Patienten mit bekannter blutübertragbarer Krankheit sind ausgeschlossen . Der Laborpersonal ist für die Koordinierung mit den beiden anderen Mitgliedern des Sammlungsteams verantwortlich und zeichnet die gesammelten Proben auf (Tabelle 1). Nach einerN Erstmusterprobe, die ausgefüllte Einwilligungsform, das Blut und die bukkalen Tupfer werden an den Laborpersonal übertragen, und die Initialen, Geburtsdaten und andere relevante Informationen des Spenders, wie zB der Mustertyp, werden aufgezeichnet. Dies ermöglicht die Aufzeichnung der Zahlen und Arten von Proben, die bei jedem Patienten während des Sammelvorgangs gesammelt wurden. Die Flussdiagramme, die die Verarbeitung von SCC-Gewebe (Abbildung 6 ) und ANT (Abbildung 7) zusammenfassen, sind nützliche Werkzeuge für die Ausbildung von neuen Mitarbeitern in Sammelverfahren. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig6.jpg" /> Abbildung 6: Flussdiagramm zur Abgrenzung der Verarbeitung von SCC-Samples. Bei der Tumor-Exzision wird die Größe der Probe beurteilt. Wenn die Probe ≤2 mm 3 ist, wird die gesamte Probe für die Mohs-Verarbeitung verwendet, da die Beurteilung der sauberen Margen (die IndikatorenAtion der vollständigen Tumorentfernung) ist oberste Priorität. Nach der Mohs-Verarbeitung wird jedes verbleibende Gewebe in flüssigem Stickstoff eingefroren und in das Biorepository transferiert. Wenn die Probe groß genug ist, so dass ein&gt; 2 mm 3- Teil des Gewebes entfernt werden kann, wird dieser Teil gesammelt und in ein Röhrchen enthalten, das Zellkulturmedium enthält, während der verbleibende Teil für die Mohs-Verarbeitung verwendet und wie oben gespeichert gelagert wird. Der zu Zellkulturmedium entfernte Teil der Probe wird weiter segmentiert, wobei ein ~ 0,5 mm 3 -Fragment entfernt und für die Herstellung einer Zellkulturlinie verwendet wird; Wird das verbleibende Gewebefragment auf das Biorepository für die nachgeschaltete Protein- und Genexpressionsanalyse übertragen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55583/55583fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Er.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig7.jpg" /> Abbildung 7: Flussdiagramm zur Abgrenzung der Verarbeitung von ANT-Samples. Zum Zeitpunkt des Mohs-Verschlusses wird ein Teil des angrenzenden normalen Gewebes (ANT) entfernt und vom Mohs-Chirurgen gesammelt. Wenn die Probengröße ≤2 mm 3 beträgt, wird die gesamte Probe in ein Kryo-Rohr gegeben und in flüssigem Stickstoff vor dem Transfer zum Biorepository eingefroren. Wenn die Probe&gt; 2 mm 3 ist , wird die gesamte Probe zuerst in ein Röhrchen gegeben, das Zellkulturmedium enthält. Die Probe wird dann weiter in ein ~ 0,5 mm 3- Fragment geschnitten, um für die Etablierung von Zellkulturlinien verwendet zu werden. Der verbleibende Gewebeabschnitt wird in das Biorepository übertragen, um für die nachgeschaltete Protein- und Genexpressionsanalyse gespeichert zu werden.55583 / 55583fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Dieses Protokoll soll die Variation zwischen den Proben im Biorepository minimieren. Die Koordination und die effektive Kommunikation zwischen den Klinikmitarbeitern und zwischen der Klinik und allen Labormitarbeitern ist von wesentlicher Bedeutung, um die Variabilität zu minimieren und das Erreichen von hochwertiger DNA, RNA und Protein aus den Geweben zu maximieren. Während die DNA und das Protein innerhalb der Gewebe robust sind, wenn RNA erwünscht ist, ist es entscheidend, die Gewebe während des Sammelns, des Transports und der Verarbeitung kalt und in dem geeigneten Medium zu halten, um die RNA-Integrität aufrechtzuerhalten. Eine genaue Aufzeichnung ist auch wichtig, um die Patientenproben mit ihrer Geschichte und Diagnose zu verknüpfen, da diese Informationen häufig bei der Analyse von Ergebnissen aus nachgeschalteten Anwendungen benötigt werden. Mit dem zunehmenden Interesse an personalisierter Medizin und BioMarkerforschung wurde vor kurzem eine Reihe von Biorepositorien etabliert. Diese sind typischerweise mit klinikbasierten Kliniken in großen akademischen Zentren verbunden und haben erhebliche Kosten bei der Einrichtung und dem Betrieb 2 , 8 , 19 . Die Entwicklung eines klinikbasierten Biorepositorys für kutane Krebsproben, die als Teil der täglichen Praxis entstanden sind, hat gegenüber anderen Biorepositorien mehrere wesentliche Vorteile. Zuerst werden mit einer einzigen Sammel- und Probenverarbeitungsstelle Variationen in der Probenhandhabung, die nachgeschaltete Anwendungen kompromittieren können, minimiert. Zweitens, da diese gespendeten Proben aus einer stabilen Patientenpopulation gezogen werden, ist der Zugang zu de-identifizierten medizinischen Aufzeichnungen und Patienten-Ergebnisdaten unvergleichlich. Diese Daten können anonymisiert und aus der Patientendiagramm in die Biorepository-Datenbank zum Zeitpunkt der Probenahme oder bei einem Folgebesuch übertragen werden. Drittens, mit einer loyalen Patientenbasis, die clInic-basierte Biorepository ist in der Lage, mehrere Proben aus dem gleichen Patienten zu sammeln, ein Sample-Set nicht oft in anderen Einstellungen erhalten. Eine der Einschränkungen dieses Protokolls ist, dass es für kutane Proben optimiert wurde, die durch Mohs-mikrographische Chirurgie erhalten wurden und möglicherweise für andere Gewebetypen oder klinische Verfahren modifiziert werden müssen. Insgesamt ist eines der Hauptziele des Biorepositorys, ein breites Spektrum von Proben von demselben Spender bereitzustellen, um es Forschern zu ermöglichen, eine breite Palette von Fragen zu stellen, insbesondere für die Entwicklung von Flüssigbiopsien und Krebsmarkern. Insbesondere die Fähigkeit, die Tumorhistologie und die Expression von Biomarkern an den mRNA- und Protein-Niveaus zu Plasmaproben zu korrelieren, sowie die Fähigkeit, Patienten-Ergebnisdaten zu verweisen, erzeugt einen einzigartig leistungsfähigen Datensatz. Wir hoffen, dass das klinikbasierte Biorepository-Modell genutzt werden kann, um den Mangel an Patientenproben in der biomedizinischen Forschung zu lindern.

Krebs- und Biomarkerforschung beruht auf einer Versorgung mit hochwertigen menschlichen Gewebeproben, und begrenztes Angebot hat die Forschung behindert 1 , 2 . Viele dermatologische Studien sind durch die unzureichende Versorgung, die variable Qualität und die Kosten im Zusammenhang mit der Verwendung von menschlichem Gewebe begrenzt. Die Kosten für die Gründung einer großen, dedizierten Biobank wurde auf etwa zwei Millionen Dollar 3 geschätzt, und diese Kosten legen die Verwendung von menschlichem Gewebe aus der Reichweite vieler Forscher. Darüber hinaus stellt der Prozess der Erzeugung und Speicherung von Forschungsproben das Risiko dar, klinische Operationen zu beeinträchtigen und die Patientenversorgung zu verzögern, wenn sie nicht sorgfältig durchgeführt wird. Es wurde ein kostengünstiges, klinikbasiertes Biorepository etabliert, das sich auf Hautkrebsproben nach empfohlenen Best Practices und Probenvalidierung 4 , 5 , 6 konzentriert. <pEnglisch: www.tab.fzk.de/en/projekt/zusammenf...ng/ab117.htm Dieses Protokoll wurde in einer Dermatologie-Klinik entwickelt, die ein großes Volumen an Mohs-mikrographischen Operationen durchführt, um Plattenepithelkarzinome (SCC), Basalzellkarzinom (BCC) und Melanom-Hautkrebs zu entfernen. Freiwillige Spender können von dieser Patientenpopulation rekrutiert werden. Es ist wichtig, das Biorepository an der Stelle der Sammlung zu etablieren, um schnell Gewebe und Blut von assoziierten Patienten ohne Verzögerung der Behandlung zu erfassen. Das Sammeln von Proben aus der gleichen Klinik minimiert Variationen in der Sammlungstechniken und minimiert Variationen in der Qualität der Proben, was für die nachgeschalteten Anwendungen problematisch sein kann 7 , 8 . Das Ziel der Mohs mikrographischen Chirurgie Technik ist, um sicherzustellen, dass alle Krebs Gewebe entfernt wird, während die Erhaltung so viel gesundes Gewebe wie möglich. Das Verfahren beinhaltet die fortschreitende Entfernung von dünnen Schichten von Tumorgewebe. Jede aufeinanderfolgende Schicht ist seineTologisch untersucht (nach der Kryosektion des Tumorgewebes und Durchführung von H &amp; E-Färbung) durch einen Dermatologen, um festzustellen, ob alle Krebsgewebe entfernt worden sind. Die Exzision und Untersuchung der nachfolgenden Gewebeschichten erfolgt, während der Patient im Büro bleibt. Diese Technik gilt als die beste Behandlungsoption für SCC 9 . An diesem Punkt wird die Wunde geschlossen und zur Verbesserung der Heilung und des kosmetischen Erscheinungsbildes wird neben normalem Gewebe (ANT) häufig herausgeschnitten. So ist dieses chirurgische Verfahren zur Entfernung eines Tumors ideal geeignet, um histologisch charakterisiertes Gewebe für zukünftige Studien zu sammeln. Das Beschaffungsverfahren zur Gewinnung von Tumorgewebe, angrenzend an normalem Gewebe, Speichel und Blutproben wurde so entworfen, dass es minimale Auswirkungen auf die normalen Personalaufgaben hat (Abbildung 1 ). Medizinische Assistenten führen das Blut zieht bei der Vorbereitung des Patienten für das Verfahren. Nach Beendigung des Mohs-Verfahrens ist das M<html> Ohs Histotechnologe bereitet zusätzliche histologische Folien der Probe vor und überträgt das Gewebe auf das Biorepository. Die Kosten für die Errichtung des Biorepositorys beinhalten den Kauf von Kryokonservierungsgefriergeräten, die Schaffung eines bescheidenen klinischen Laborraums und die Entwicklung eines Inventarverfolgungsprogramms. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig1.jpg" /> Abbildung 1: Reihenfolge der Probenahme und verantwortungsbewusstes Personal Nach dem Check-in des Patienten und dem Erreichen der Zustimmung des Patienten sammelt der medizinische Assistent einen bukkalen Tupfer und führt einen Blutentnahme durch. Der Dermatologe und der medizinische Assistent überholen dann den Tumor und schließen die Wunde, während welcher Zeit SCC- und ANT-Proben gesammelt werden. Ein engagierter Labortechniker verarbeitet das Blut und deckt die SCC- und ANT-Proben für die Gewebekultur, die Konservierung und den Eintritt in das Biorepository ab.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Die Vielfalt der gesammelten Proben ermöglicht eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen (Abbildung 2 ). Proben, die vom Patienten gesammelt wurden, sind bukkale Tupfer (Speichel kann auch gesammelt werden, wenn nötig), Vollblut und ausgeschnittenes Gewebe. Die bukkalen Tupfer und eine Probe aus dem Vollblut werden ohne Verarbeitung für die Genotypisierung und Gewebeanpassung gerettet. Vollblut wird in weiße Blutkörperchen (WBC) und Plasmafraktionen für zukünftige Analysen getrennt. Nach der Mohs-Verarbeitung wird der gefrorene Tumor direkt in flüssigen Stickstoff gegeben und auf einen Gefrierschrank von -80 ° C übertragen. Frisches, lebensfähiges Tumorgewebe und ANT-Proben werden unter Verwendung von Modifikationen der vorherigen Techniken 10 , 11 kultiviert und dann kryokonserviert. Während der Erhebung wird die Anzahl der einzelnen Sample-Typen auf einer Kalkulationstabelle vor dem Eintritt aufgezeichnet<html> Das Inventar-Tracking-Programm zur Erleichterung der genauen Verarbeitung ( Tabelle 1 ). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig2.jpg" /> Abbildung 2: Überblick über die Klinik-basierte Biorepository Probenahme und -verarbeitung. Ein bukkaler Tupfer und eine Blutprobe werden vom Patienten gesammelt und für die nachgeschaltete Genotypisierung und Gewebeanpassung gespeichert. Vollblut wird für die Isolierung der weißen Blutkörperchen (WBC) und die CTC-Analyse sowie für die Plasmasammlung und die Flüssigbiopsieanalyse weiterverarbeitet. Gewebe, das während des Mohs-Verfahrens ausgeschnitten wird, wird für diagnostische Zwecke histologisch verarbeitet, wonach die histologischen Folien experimentell für weitere immunhistochemische Analysen eingesetzt werden können. Unter der Voraussetzung, dass die exzidierte Gewebeprobe groß genug ist, wird ein Teil des frischen Gewebes entfernt und für die Protein- und RNA-Isolierung geschnitten und für die Herstellung von kultivierten Zelllinien.55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Abholtermin: </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Patient 1 </td><td> Patient 2 </td><td> Patient 3 </td><td> Patient 4 </td><td> Patient 5 </td></tr><tr><td> Initialen und Geburtsdatum </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Augenfarbe </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beispielstyp </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beispiel Ort </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Speichel </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> WLoch Blut </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plasma </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tumor lebensfähig </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gewebe Normal lebensfähig </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tumor Mohs Flüssiger Stickstoff </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tissue Normal Liquid Stickstoff </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rutschen </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Checkliste zum Aufnehmen von Sample-Sammlungen. Daten, die mit jeder gesammelten Probe verfolgt und aufgezeichnet wurden, beinhalten Patienteninitialen, Geburtsdatum und Augenfarbe (für die Hauttypisierung) sowie die locatiAuf Probenentfernung Die Anzahl der Speichelproben, die Blutentnahmevolumina und die Anzahl der lebensfähigen und konservierten Gewebeproben, die gesammelt wurden, werden auch als Referenzen für Zuweisungen zu späteren Verwendungen aufgezeichnet. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55583/Table1.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> Um die Probenahmeverfahren zu validieren, wurde jeder Sample-Typ in nachgeschalteten Anwendungen getestet. Unter Verwendung von Modifikationen von früheren Techniken 12 wurden Tumor und ANT erfolgreich in der Protein- und RNA-Isolierung verwendet und können möglicherweise für die DNA-Isolierung verwendet werden. Lebensfähige Explantate aus den Gewebeschnitten wurden durch Mikroskopie ausgewertet, während gespeicherte histologische Objektträger für die Immunhistochemie und Immunfluoreszenz verwendet wurden. Durch das hier beschriebene Protokoll ist es möglich, dieses Modell auf andere Dermatologiekliniken, andere Tumortypen (wie Melanom) zu erweitern,, Und andere chirurgische Spezialitäten und Praktiken, um menschliche Gewebe Proben für vielfältige Forschung in menschlichen Krebs zu liefern. Leichte Modifikationen dieses Protokolls sind wahrscheinlich für andere Praktiken notwendig, aber grundsätzlich ist dieses Protokoll auf jede chirurgische Praxis anwendbar, die routinemäßig Patientenproben, die im Laufe der Patientenbehandlung gesammelt wurden, verwischt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-685-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-949-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Medium Point General Purpose Forceps</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC9791321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-363-579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1950 Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047743909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Rapid-Chrome H&#38;E Frozen Section Staining Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>99-900-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>03-337-7X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boca Scientific BuccalT-Swab&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC9679349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50-195-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-401-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet Morter Cordless Homogenizer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-141-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Free Pellet Pestle</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>121-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma SteriCycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-998-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>SH30071.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco 1M Hepes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15-630-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell Culture 35 mm with Vent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1256591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24</td>
			<td>Abnova</td>
			<td>MAB12583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p40 (p63 delta) antibody</td>
			<td>Abnova</td>
			<td>ABX-144A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti MUC-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-7313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Snail + Slug (phospho S246)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab63568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Phallodin</td>
			<td>Molecular Probes&#160;</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Molecular Probes&#160;</td>
			<td>P36941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4300009901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX511F3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a clinic-based biorepository

Die Inzidenz von Hautkrebs ( z. B. Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom und Melanom) hat in den vergangenen Jahren zugenommen. Es wird erwartet, dass es eine parallele Nachfrage nach kutanen Tumorproben für biomedizinische Forschungsstudien gibt. Die Verfügbarkeit der Gewebe ist jedoch aufgrund der Kosten für die Etablierung eines Biorepositorys und des Mangels an Protokollen, die für die Erlangung von klinischen Proben zur Verfügung stehen, die die klinischen Operationen nicht beeinträchtigen, begrenzt. Es wurde ein Protokoll erstellt, um kutane Tumor und assoziierte Blut- und Speichelproben zu sammeln und zu verarbeiten, die minimale Auswirkungen auf routinemäßige klinische Verfahren am Tag einer Mohs-Chirurgie haben. Tumorproben werden gesammelt und verarbeitet von Patienten, die sich ihrer ersten Schicht der Mohs-Chirurgie für biopsie-bewährte Hautmalignitäten durch den Mohs-Histotechnologen unterziehen. Angrenzendes normales Gewebe wird zum Zeitpunkt des chirurgischen Verschlusses gesammelt. Zusätzliche Proben, die gesammelt werden können, sind Vollblut und bukkale Tupfer. Durch die Verwendung von Gewebeproben, die normalerweise verworfen werden, wurde ein Biorepository erzeugt, das mehrere wesentliche Vorteile bietet, indem es in der Klinik gegenüber der Laborumgebung basiert. Dazu gehören eine breite Palette von gesammelten Proben; Zugang zu erkannten Patientenakten, einschließlich Pathologieberichten; Und, für den typischen Spender, Zugang zu zusätzlichen Proben bei Folgebesuchen.

Tumor und ANT wurden erfolgreich in der Proteinisolation eingesetzt und durch Western Blotting getestet. Wie in Abbildung 3 gezeigt , können kutane Plattenepithelkarzinommarker (Muc1 14 , FHL-1 15 und p40 16 , 17 ) bei Patientenproben nachgewiesen und in unserem klinikbasierten Biorepository gespeichert werden. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig3.jpg" /> Abbildung 3: Analyse von aus ANT und SCC extrahierten Proteinen. Gesamtprotein wurde aus ANT- und SCC-Proben isoliert und die Expression bekannter Marker für SCC wurde durch Western-Blot untersucht. Repräsentative Western-Blots von Mucin 1 (MUC1), Faktor H Like-1 (FHL-1) und p40 (Panel B) sind gezeigt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55583/55583fig3large.jpg" target="_blank">Plädoyer</a>Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Die unter Verwendung der obigen Techniken isolierte RNA wurde durch Gelelektrophorese, qPCR und RNA-Integritätsanalyse getestet. Abbildung 4 zeigt zwei Patientenproben, aus denen hochqualitative, intakte RNA isoliert wurde. Die RNA eignet sich für alle nachgeschalteten Anwendungen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig4.jpg" /> Abbildung 4: RNA-Integritätsanalyse mittels Bioanalyse Beurteilung der RNA-Größe und Integrität durch Gelelektrophorese (Panel A). Eine RNA-Integritätszahl (RIN) wurde für jede Probe auf der Grundlage der elektrophoretischen Spur der RNA-Probe, einschließlich des Verhältnisses der ribosomalen RNA und der Anwesenheit oder Abwesenheit von Abbauprodukten (Tafel B), erzeugt. Eine RIN von &quot;10&quot; stellt eine perfekte RNA-Probe ohne jegliche Abbauprodukte dar, während &quot;1&quot; eine vollständig abgebaute Sa darstelltMatt Densitometrieprofile der Banden sind als Fluoreszenzeinheiten (FU) gegenüber Nukleotiden (nt) (Panel C) für repräsentative RNA-Proben aus SCC- und ANT-Patientengewebe aufgetragen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55583/55583fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Lebensfähige Explantate aus den Gewebeschnitten wurden durch Mikroskopie ausgewertet (Abbildung 5A ). Diese aus Tumor- und ANT-Proben erzeugten Explantkulturen sind gemischte Keratinozyten- und Fibroblasten-Kulturen. Diese Kulturen können subkultiviert oder für zukünftige Zelllinienentwicklung verwendet werden. Gespeicherte histologische Dias wurden für Immunhistochemie und Immunfluoreszenz verwendet. In Fig. 5B gezeigt , zeigt eine SCC-Probe eine positive Färbung für einen epithelial-zu-mesenchymalen Übergangsmarker in SCC 18 . Abbildung 5: Explantierte Kultur und IF-Färbung von SCC-Abschnitten Phasenkontrastbild eines Plattenepithelkarzinom-Gewebe-Explantats (Tafel A, Scale-Bar = 50 &amp; mgr; m) und Gewebeabschnitte, die als Teil der Mohs-mikrographischen Chirurgie gesammelt wurden, gefärbt mit einem anti-pSnail / Slug-Primärantikörper (Tafel B, Scale-Bar = 25 &amp; mgr; m) ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55583/55583fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Wir haben experimentell festgestellt, dass das Gewebe bei 4 ° C für 24-48 h vor der RNA-Isolierung (Schritt 5) oder der Explantokultur (Schritt 6) gelagert werden kann, ohne die Ergebnisse zu beeinflussen. RNA-Ausbeute oder Integrität, wie durch Gelelektrophorese oder Bioanalyzer und RIN-Zahl beurteilt, sind nicht beeinträchtigt. Zusätzlich werden Explantkulturen leicht unter Verwendung von Gewebe, das bei 4 ° C für thi gespeichert ist, erhaltenS Zeitdauer. Dies bietet eine erhöhte Flexibilität bei der Übertragung von Proben zwischen der Klinik und dem Forschungslabor. Da die RNA-Isolierung und die Explantokultur im Forschungslabor und nicht in der Klinik durchgeführt werden, macht diese Funktion das klinikbasierte Biorepository zu einem robusteren Modell als wir es vorher erwartet hatten.

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Establishment of a Clinic-based Biorepository

Kutane Tumoren werden oft nach Mohs mikrographischen Chirurgie verworfen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das es dem klinischen Hilfspersonal ermöglicht, kutane Tumor- ( zB Plattenepithelkarzinom-, Basalzellkarzinom- und Melanom-) Proben für nachgeschaltete Laboranwendungen effektiv zu verarbeiten und zu speichern, ohne die klinischen Operationen zu beeinträchtigen.

Errichtung eines klinischen Biorepositorys

The incidence of skin cancer (e.g., squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, and melanoma) has been increasing over the past several years. It is ...

establishment-of-a-clinic-based-biorepository

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

6.4K Aufrufe.  Midwestern University.  Kutane Tumoren werden oft nach Mohs mikrographischen Chirurgie verworfen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das es dem klinischen Hilfspersonal ermöglicht, kutane Tumor- ( zB Plattenepithelkarzinom-, Basalzellkarzinom- und Melanom-) Proben für nachgeschaltete Laboranwendungen effektiv zu verarbeiten und zu speichern, ohne die klinischen Operationen zu beeinträchtigen. 

Serie: Establishment of a Clinic-based Biorepository

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Forschung

Medizin

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable cell lines are inoculated either by intravesical instillation (model of nonmuscle invasive growth) or intramural injection into the bladder wall (model of invasive growth). Both procedures are complex and highly time-consuming. Additionally, the superficial model has its shortcomings due to the lack of cell lines that are tumorigenic following instillation. Intramural injection, on the other hand, is marred by the invasiveness of the procedure and the associated morbidity for the host mouse.
With these shortcomings in mind, we modified previous methods to develop a minimally invasive approach for creating orthotopic bladder cancer xenografts. Using ultrasound guidance we have successfully performed percutaneous inoculation of the bladder cancer cell lines UM-UC1, UM-UC3 and UM-UC13 into 50 athymic nude. We have been able to demonstrate that this approach is time efficient, precise and safe. With this technique, initially a space is created under the bladder mucosa with PBS, and tumor cells are then injected into this space in a second step. Tumor growth is monitored at regular intervals with bioluminescence imaging and ultrasound. The average tumor volumes increased steadily in in all but one of our 50 mice over the study period.
In our institution, this novel approach, which allows bladder cancer xenograft inoculation in a minimally-invasive, rapid and highly precise way, has replaced the traditional model.

The established technique to inoculate primary invasive orthotopic bladder cancer xenografts requires laparotomy and mobilization of the bladder. This procedure inflicts significant morbidity on the mice, is technically challenging and time-consuming. We therefore developed a high-precision, percutaneous approach utilizing ultrasound guidance.

Minimal Invasive Gründung von murinen orthotopen Blasen Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. Females are disproportionately afflicted by UTI: 50% of all women will have a UTI in their lifetime. Additionally, 20-40% of these women who have an initial UTI will suffer a recurrence with some suffering frequent recurrences with serious deterioration in the quality of life, pain and discomfort, disruption of daily activities, increased healthcare costs, and few treatment options other than long-term antibiotic prophylaxis. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the primary causative agent of community acquired UTI. Catheter-associated UTI (CAUTI) is the most common hospital acquired infection accounting for a million occurrences in the US annually and dramatic healthcare costs. While UPEC is also the primary cause of CAUTI, other causative agents are of increased significance including Enterococcus faecalis. Here we utilize two well-established mouse models that recapitulate many of the clinical characteristics of these human diseases. For UTI, a C3H/HeN model recapitulates many of the features of UPEC virulence observed in humans including host responses, IBC formation and filamentation. For CAUTI, a model using C57BL/6 mice, which retain catheter bladder implants, has been shown to be susceptible to E. faecalis bladder infection. These representative models are being used to gain striking new insights into the pathogenesis of UTI disease, which is leading to the development of novel therapeutics and management or prevention strategies.

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Aufbau und Charakterisierung von UTI und CAUTI in einem Mausmodell

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Einrichtung eines segmentalen Femoral Critical-size Defektmodell in Mäusen durch Plattenosteosynthese Stabilisierte

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Etablierung eines schweren Trockenauges modell mit vollständiger Dakryoadenektomie bei Kaninchen

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Establishment of a Mouse Severe Acute Pancreatitis Model using Retrograde Injection of Sodium Taurocholate into the Biliopancreatic Duct

The prevalence of acute pancreatitis (AP), especially severe acute pancreatitis (SAP), is increasing in younger age groups annually. However, there is a lack of effective treatments in the current clinical practice. With the easy accessibility of transgenic and knockout strains and their small size, which allows minimal doses of drugs required for in vivo evaluation, a well-established experimental model in mice is preferred for AP research. Moreover, SAP induced through sodium taurocholate (TC) is currently one of the most widely used and best characterized models. This model has been investigated for novel therapies and possible molecular events during the process of AP. Here, we present the generation of an AP mouse model using sodium taurocholate and a simple homemade microsyringe. Moreover, we also provide the methodology for the subsequent histology and serological testing.

A mouse model of severe acute pancreatitis is described herein. The procedure presented here is very rapid, simple, and accessible, thereby potentially allowing the study of the molecular mechanisms and different therapeutic interventions in acute pancreatitis in a convenient way.

Etablierung eines Mausmodells für schwere akute Pankreatitis mittels retrograder Injektion von Natriumtaurocholat in den Gallengang

The prevalence of acute pancreatitis (AP), especially severe acute pancreatitis (SAP), is increasing in younger age groups annually. However, there is a ...

Establishment and Evaluation of a Porcine Vein Graft Disease Model

Venous graft disease (VGD) is the leading cause of coronary artery bypass graft (CABG) failure. Large animal models of CABG-VGD are needed for the investigation of disease mechanisms and the development of therapeutic strategies. 
To perform the surgery, we enter the cardiac chamber through the third intercostal space and carefully dissect the internal mammary vein and immerse it in normal saline. The right main coronary artery is then treated for ischemia. The target vessel is incised, a shunt plug is placed, and the distal end of the graft vein is anastomosed. The ascending aorta is partially blocked, and the proximal end of the graft vein is anastomosed after perforation. The graft vein is checked for patency, and the proximal right coronary artery is ligated. 
CABG surgery is performed in minipigs to harvest the left internal mammary vein for its use as a vascular graft. Serum biochemical tests are used to evaluate the physiological status of the animals after surgery. Ultrasound examination shows that the proximal, middle, and distal end of the graft vessel are unobstructed. In the surgical model, turbulent blood flow in the graft is observed upon histological examination after the CABG surgery, and venous graft stenosis associated with intimal hyperplasia is observed in the graft. The study here provides detailed surgical procedures for the establishment of a repeatable CABG-induced VGD model.

In this protocol, novel pig vein bypass grafting was performed through a small incision in the left chest wall without cardiopulmonary bypass. A postoperative pathology study was done, which showed intimal thickening.

Etablierung und Evaluierung eines Porcine Vent Graft Disease Modells

Venous graft disease (VGD) is the leading cause of coronary artery bypass graft (CABG) failure. Large animal models of CABG-VGD are needed for the ...

Establishment of a Simple and Effective Rat Model for Intraoperative Parathyroid Gland Imaging

Parathyroid gland (PG) identification is a critical unmet need in thyroidectomy. The identification of the PG is challenging in thyroid surgery as it is similar in color to the thyroid gland. The lack of effective animal models in preclinical research is a severe limitation for the development of PG identification techniques. This protocol allows for the establishment of a simple and effective rat model for PG identification. In this model, black iron oxide nanoparticles (IONPs) are injected locally in the thyroid gland and rapidly diffuse within the thyroid gland but not the PG. A negatively stained PG and a positively stained thyroid gland can be easily identified by the naked eye without requiring external microscopes. The position of the PG can be identified by increasing the color contrast between the thyroid gland and the PG, based on the color of the black IONPs. This rat model is low-cost and convenient for PG identification, and the IONPs are a novel PG contrast agent.

To date, the development of parathyroid gland (PG) identification methods is limited by the lack of animal models in preclinical research. Here, we establish a simple and effective rat model for intraoperative PG imaging and evaluate its effectiveness by using iron oxide nanoparticles as a novel PG contrast agent.

Etablierung eines einfachen und effektiven Rattenmodells für die intraoperative Bildgebung der Nebenschilddrüse

Parathyroid gland (PG) identification is a critical unmet need in thyroidectomy. The identification of the PG is challenging in thyroid surgery as it is ...

Modifizierte arteriovenöse Fistelchirurgie zur Etablierung des RV-Volumenüberlastungs-Mausmodells

Establishment and Confirmation of a Postnatal Right Ventricular Volume Overload Mouse Model

Right ventricular (RV) volume overload (VO) is common in children with congenital heart disease. In view of distinct developmental stages,the RV myocardium may respond differently to VO in children compared to adults. The present study aims to establish a postnatal RV VO model in mice using a modified abdominal arteriovenous fistula. To confirm the creation of VO and the following morphological and hemodynamic changes of the RV, abdominal ultrasound, echocardiography, and histochemical staining were performed for 3 months. As a result, the procedure in postnatal mice showed an acceptable survival and fistula success rate. In VO mice, the RV cavity was enlarged with a thickened free wall, and the stroke volume was increased by about 30%-40% within 2 months after surgery. Thereafter, the RV systolic pressure increased, corresponding pulmonary valve regurgitation was observed, and small pulmonary artery remodeling appeared. In conclusion, modified arteriovenous fistula (AVF) surgery is feasible to establish the RV VO model in postnatal mice. Considering the probability of fistula closure and elevated pulmonary artery resistance, abdominal ultrasound and echocardiography must be performed to confirm the model status before application.

Autor im Rampenlicht: Etablierung und Bestätigung eines postnatalen Mausmodells für rechtsventrikuläre Volumenüberlastung  

This protocol presents the establishment and confirmation of a postnatal right ventricular volume overload (VO) model in mice with abdominal arteriovenous fistula (AVF), which can be applied to investigate how VO contributes to postnatal heart development.