(; U54GM104942 MNR), NIA (MNR; R15AG045812), Alzheimer-Gesellschaft Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences unterstützt (MNR; NIRG-12-242187), WVU Fakultät Forschungs Senat Grant (MNR) und WVU PSCOR Grants (MNR).

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GG ist der alleinige Inhaber von Quanteon, LLC, die das FAST-16-Aufzeichnungssystem für die Glutamat-Messungen in dieser Studie verwendete machen. JEQ ist ein bezahlter Berater für Quanteon.

Die MEA - Technik ermöglicht die Messung von schnellen Kinetik der Freisetzung von Neurotransmittern und die Aufnahme in vitro und in vivo. Daher erzeugt die Technologie, um eine Vielzahl von Datenausgabe einschließlich tonisch Neurotransmitter Ebenen, evozierte Freisetzung von Neurotransmittern und Neurotransmitter-Clearance. Da jedoch die Verwendung von MEAs ein relativ komplexer Vorgang ist, gibt es zahlreiche Faktoren, die für den erfolgreichen Einsatz optimiert müssen werden. Beispielsweise während der Kalibrierung, kann man feststellen, dass es keine Signalwellenformen (Oszilloskop-Bildschirm) oder dass die Antworten auf die Stimulation sind minimal oder nicht vorhanden. Wahrscheinlich aufgrund einer Fehlfunktion des Systems, das Aufzeichnungssystem neu zu starten, oder Computer, kann das Problem beheben. Darüber hinaus könnte das Problem ein Verbindungsfehler sein. Vor der Kalibrierung ist es sachdienlich überprüfen doppelt zu, dass die MEA und die Referenzelektrode Verbindungen richtig angeschlossen sind. Der Austausch des DIP-Buchse auf der heads kann MEA-Verbindungsprobleme beheben.Wenn die MEA nicht vollständig in Lösung ist, oder eine schlecht gewartete Referenzelektrode verwendet wird, können diese auch mit der Aufzeichnung während der Kalibrierung stört. Verlangsamten Signalantworten bei der Kalibrierung ist ein weiteres häufiges Problem, das von einer stärker als nötig BSA / Glutaraldehyd-Mischung oder einem sich langsam Spinn Rührstab führen. Im Fall , dass Störstoffe ein Signal während der Kalibrierung gibt, ist es möglich , dass ein Fehler in der Galvanotechnik war (zB galvanisieren nicht lange genug) MPD Ausschlussschicht. In einem solchen Fall ist die Galvanik Vorgang wiederholen notwendig. Während der Operation kann eine Anästhetikum Ebene nicht für alle Mäuse ausreichend sein; Einige Mäuse können höhere Anästhesie erfordern „untergehen“ und einige Mäuse können weniger erfordern. Es ist wichtig, auf einem niedrigen Niveau der Narkose zu beginnen und langsam zu erhöhen, bis die Maus unter leichter Anästhesie ist. Tiefe Narkose kann getestet werden, sobald die Maus in der stereotaktischen Gerät durch aSchwanz oder Zeh kneifen. Wenn Koordinaten zum Implantieren der MEA wählt, ist es auch wichtig zu beachten und zu korrigieren mögliche Gehirnatrophie , die in vielen neurodegenerativen Tiermodellen 36, 37, 38 auftreten können. Darüber hinaus ist es zwingend notwendig, während der Operation, dass das Blut auf der MEA nicht ansammelt, da dies die Aufzeichnungseigenschaften der MEA beeinflussen können und in langsamen zeitlichen Auflösung oder stark minimiert Signalantworten führen. Wenn Blutgerinnsel um die Elektrode, entfernen einfach die MEA und Spülen mit Kochsalzlösung. Während der Aufnahme eines der häufigsten Probleme, die auftreten kann, ist, dass von einem verrauschten Signal. Interferenzen von anderen elektronischen Geräten, wie zum Beispiel Zusatzbeleuchtung, zusätzliche Instrumente und Bohrer sind die meist wahrscheinlich Schuldigen, so ist es am besten zu vermeiden, dass sie in den gleichen Stromkreis und / oder Steckdose wie das Aufzeichnungssystem anschließen. Wenn darüber hinaus die Aufnahme system nicht richtig geerdet ist, wird man Schwingungen auf dem Oszilloskop des Aufzeichnungssystems beobachten sowie Lärm von allen Standorten stammen, und nicht nur die Aufnahme Websites. Die empfohlene Erdungsmatte unter dem Aufzeichnungssystem muss mit einem geerdeten Rohr verbunden werden, um diese Probleme zu vermeiden. Wenn festgestellt wird, dass keine von diesen die Fehler sind, liegen die Fehler kann mit der Referenzelektrode oder der MEA selbst. Wenn Probleme mit Lärm zu begegnen, eine neue, ungebrauchte MEA mit dem Betrieb des Systems zu überprüfen, kann ein nützliche Fehlersuche Ansatz. Wenn trennen oder die Referenzelektrode führt zu wenig bis gar keine Veränderung ersetzen, die Referenzelektrode oder Halbzelle kann eine Fehlfunktion hat. die Referenzelektrode Änderung kann die einzige Möglichkeit, das Problem zu lösen. Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, ist ein letzter Vorteil der MEA die Fähigkeit, sie zu reinigen und wieder verwenden. MEAs kann etwa dreimal so lange wiederverwendet werden, da die MEA ausreichend während der Kalibrierung durchführen wird fortgesetzt. <p class = „jove_content“&gt; Zum Schluss, obwohl Fehlerbehebung gelegentlich erforderlich sein kann, die Verwendung der MEA-Technik für die Prüfung des schnellen Freisetzung und Clearance von Neurotransmittern innerhalb gewünschter Subregionen des Gehirns vorteilhaft. Die aktuellen Studien über die Verwendung der MEA-Technologie spezialisiert in anästhesiert TauP301L Mäusen zur Untersuchung von Glutamatfreisetzung und die Aufnahme in den Teilregionen des Hippocampus-trisynaptic Weges Vorteil der MEA Methodik zu nehmen. Zukünftige Studien werden zusätzliche tonische und phasische Probleme in wach Mäusen adressieren, da dies für die Verknüpfung von Verhaltensereignissen auf die dynamischen Maßnahmen von Tonika und phasische Glutamat in wach Ratten sehr vorteilhaft war und in jüngerer Zeit wach nicht-menschlichen Primaten. Während diese Technologie für die Grundlagenforschung Studien entwickelt wurde, hält die Zukunft Versprechen für die Umsetzung der Aufnahmetechnik für die klinische Forschung und intraoperative neurochemischen Überwachung für die Behandlung und Auswertung von Hirnerkrankungen wie Parkinson-Krankheit einernd Epilepsie.

Mess Neurotransmitter Veränderungen im Gehirn ist ein wichtiges Instrument für Neurowissenschaftler Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), die oft gekennzeichnet durch Neurotransmitter Dysregulation studieren. Obwohl die Mikrodialyse in Verbindung mit Hochdruck - Flüssigkeitschromatographie (HPLC / EC) die am weitesten verbreitete Methode zur Messung der Veränderungen in der extrazellulären Neurotransmitter Stufen 1, 2 war, 3, 4, kann die räumliche und zeitliche Auflösung von Mikrodialysesonden nicht ideal für Neurotransmitter , wie Glutamat, die 6 in dem extrazellulären Raum 5, streng reguliert werden. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Genetik und Bildgebung, gibt es weitere Verfahren , die verwendet werden können , Glutamat in vivo abzubilden. Verwendung von genetisch kodierten Glutamat fluoreszierende Reporter (iGluSnFR) eind Zwei-Photonen - Bildgebung, die Forscher in der Lage , Glutamat - Freisetzung sowohl von Neuronen und Astrocyten in vitro zu visualisieren und in vivo 7, 8, 9. Bemerkenswert ist, ermöglicht dies aus einem größeren Sichtfeld der Aufnahme und nicht die inneren Verbindungen des Gehirns stören. Während diese neuen optischen Techniken zur Visualisierung von Glutamat Kinetik und Messung von sensorisch evozierte Reaktionen und neuronale Aktivität ermöglichen, fehlt ihnen die Fähigkeit, die Menge an Glutamat in den extrazellulären Raum in diskreten Gehirnregionen zu quantifizieren. Ein alternatives Verfahren ist die Enzym-gebundenen Mikroelektroden-Anordnung (MEA), die selektiv extrazellulärem Neurotransmitter Ebene, wie Glutamat, durch die Verwendung eines selbst referenzierten Aufzeichnungsschemas messen kann. Die MEA-Technik wird verwendet, um Veränderungen in der extrazellulären Glutamat nach traumatischem Gehirn zu studieren10 Verletzungen, 11, 12, Alterung 13, 14, Stress 15, 16, Epilepsie 17, 18, Alzheimer-Krankheit 19, 20, und die Injektion eines viralen mimic 21 und stellen eine Verbesserung gegenüber den räumlichen und zeitlichen Beschränkungen , die in Mikrodialyse. Während Mikrodialyse die Fähigkeit , in der Nähe der Synapse zu messen einschränkt 22, 23, MEAs hat eine hohe räumliche Auflösung , die in der Nähe zum selektiven Maßnahmen der extrazellulären Glutamat - Spill - over ermöglicht 24 Synapsen, 25. Zweitens ist die geringe zeitliche Auflösung der Mikrodialyse (1 - 20 min) begrenzt die Fähigkeit, die untersuchenschnelle Dynamik der Glutamatfreisetzung und Clearance in Millisekunde 26 bis Sekunden - Bereich auftritt. Da Unterschiede in der Freisetzung oder Clearance von Glutamat nicht in Maßnahmen von Tonika, Ruheglutamatwert offensichtlich sein können, kann es wichtig sein, dass die Freisetzung von Glutamat und Clearance direkt gemessen werden. MEAs ermöglichen diese Maßnahmen aufgrund ihrer hohen zeitlichen Auflösung (2 Hz) und niedrigen Nachweisgrenzen (&lt;1 uM). Drittens erlauben MEAs zur Untersuchung der subregionalen Variationen in Neurotransmittern innerhalb einer bestimmten Hirnregion, wie die Ratte oder Maus Hippocampus. Beispielsweise unter Verwendung von MEAs wir Gyrus dentatus separat ausrichten können (DG), Ammonshorn 3 (CA3) und Ammonshorn 1 (CA1) des Hippocampus, die über eine trisynaptic Schaltung 27 verbunden sind, um subregionalen Unterschiede in extrazellulären Glutamat zu untersuchen. Aufgrund der Größe der Mikrodialysesonden (1 - 4 mm Länge) und der durch Implantation verursachten Schadens 28 &lt;/ sup&gt;, 29, sind subregionalen Unterschiede schwer zu adressieren. Außerdem werden nur die optischen Systeme Stimulation durch externe Reize, wie beispielsweise eine whisker Stimulation oder Lichtflimmern, ermöglichen die nicht subregionalen Stimulation 7 zulässt. Ein letzter Vorteil der MEAs gegenüber anderen Methoden ist die Fähigkeit , diese Subregionen in vivo zu studieren , ohne ihre äußeren und inneren Anschlüsse zu stören. Hier beschreiben wir , wie ein Aufzeichnungssystem (beispielsweise FAST16mkIII) in Kombination mit MEAs, bestehend aus einer auf Keramik basierende Multi - Site - Mikroelektrode, kann differentiell auf den Aufzeichnungs Seiten beschichtet wird , um störende Mittel zu ermöglichen , erfaßt und von dem Analyten - Signal entfernt werden. Wir zeigen auch Diese Arrays können für Amperometrie-basierten Untersuchungen der in vivo Glutamat Vorschrift im DG, CA3 und CA1 Hippocampus - Subregionen von betäubtem RTG (TauP301L) 4510 - Mäuse, ein häufig verwendeter m verwendet werden ,ouse Modell der Alzheimer-Krankheit. Darüber hinaus stellen wir die Bestätigung der Empfindlichkeit des MEA - Systems auf der schnelle Dynamik der Glutamatfreisetzung und Freigabe durch die Mäuse , die mit Riluzol Behandlung, ein Medikament in vitro gezeigt Glutamatfreisetzung zu verringern und Glutamataufnahme 30, 31, 32, 33 zu erhöhen, und zeigt diese jeweiligen Veränderungen in vivo im Maus - Modell TauP301L.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FAST-16mkIII-8 channel</td>
			<td>Quanteon</td>
			<td>16mkIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode arrays</td>
			<td>CenMet</td>
			<td>W4 or 8-TRK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-3059</td>
			<td>10 g (expires after 1 month)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-6257</td>
			<td>100 mL (expires after 6 months)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate Oxidase</td>
			<td>US Biological or Sigma Aldrich</td>
			<td>G4001-01 or 100646</td>
			<td>50 UI (expires after 6 months)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>#701</td>
			<td>2 syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>UN1230</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>1330560250</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference Electrodes (RE-5B)</td>
			<td>BAS</td>
			<td>MF-2079</td>
			<td>3 electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir plate</td>
			<td>Cole-parmer</td>
			<td>EW-04804-01</td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-1626</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>TCI</td>
			<td>50-81-7</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>62-31-7</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN2920</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7647-40-7</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>153502</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>BDH</td>
			<td>1310732</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pressure ejection pipettes</td>
			<td>CenMet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky wax</td>
			<td>Kerrlab</td>
			<td>625</td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td>WalMart</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>AM systems</td>
			<td>782000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>BDH</td>
			<td>7647010</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>AM Systems</td>
			<td>778000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder gun</td>
			<td>Lowes or Home Depot</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimeter</td>
			<td>WalMart</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhysioSuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic device</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Lab Standard</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meiji EMZ microscope</td>
			<td>Meiji</td>
			<td>EMZ-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metricide</td>
			<td>Metrex</td>
			<td>102800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25806</td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td></td>
			<td>Obtain from the vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>S48050</td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>Local drug store</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgery drape</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>S5815</td>
			<td>Can make own soltuion using filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (3%)</td>
			<td>Local drug store</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>WalMart</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in alzheimer's mouse models

Neurotransmitters Störung ist oft ein wichtiger Bestandteil von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), eine Rolle in der Pathologie spielen Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Depression und Angst zu Grunde liegen. Traditionell wurde, Mikrodialyse die häufigste (gelobt) -Technik Neurotransmitter Veränderungen zu untersuchen, die bei diesen Erkrankungen auftreten. Aber weil die Mikrodialyse die Fähigkeit hat, langsam 1-20 Minuten Änderungen über große Bereiche des Gewebes zu messen, hat es den Nachteil, Invasivität, potentiell zerstörte intrinsische Verbindungen im Gehirn und eine langsame Sampling-Fähigkeit. Eine relativ neuere Technik, die Mikroelektroden-Anordnung (MEA), hat zahlreiche Vorteile für die in diskreten Gehirnbereichen spezifische Neurotransmitterveränderungen messen, wie sie auftreten, so dass für eine räumlich und zeitlich präzise Annäherung. Zusätzlich MEAs unter Verwendung minimal - invasiver ist, so dass zur Messung von Veränderungen Neurotransmitter in vivo. In unserem Labor ha wirve speziell interessiert an Veränderungen des Neurotransmitters Glutamat, im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit Pathologie gewesen. Als solches hier beschriebene Verfahren wurde verwendet, um in Glutamat in einem transgenen Mausmodell der Alzheimer-Krankheit mögliche Hippocampus-Störungen zu beurteilen. Kurz gesagt, verwendet das Verfahren mit einem Enzym, einem Multi-Site-Mikroelektrode beinhaltet das Beschichten sehr selektiv für den Neurotransmitter von Interesse und unter Verwendung von sich selbst verweisende Seiten Hintergrundrauschen und Interferenten zu subtrahieren. Nach der Plattierung und die Kalibrierung kann die MEA mit einer Mikropipette ausgebildet sein und abgesenkt in die Hirnregion von Interesse einer stereotaxische Vorrichtung. Hier beschriebene Verfahren RTG (TauP301L) 4510-Mäuse anästhesiert und beinhaltet eine stereotaxische Vorrichtung unter Verwendung genau Subregionen (DG, CA1 und CA3) des Hippocampus zielen.

Während diese Technologie Änderungen in glutamatergen verwendet werden kann, signalisieren in vielen Arten von Tiermodellen zu messen, wie traumatische Hirnverletzung, Alter, Stress und Epilepsie, hier zeigen wir, wie die MEA-Technologie verwendet werden kann glutamatergen Veränderungen in transgenen Mausmodell zu untersuchen menschlicher Tauopathie 19, 20. Die RTG (TauP301L) 4510 Maus drückt die P301L Mutation in Tau mit frontotemporale Demenz und Parkinsonismus auf Chromosom 17 verbunden verbunden sind, und ist allgemein mit der Alzheimer-Krankheit, neurodegenerativen Tauopathien und frontotemporale Demenz zu untersuchen tau-Pathologie verwendet. Wir zeigen auch, dass glutamatergen Signalgebung durch pharmakologische Intervention modifiziert werden können. Wir behandeln TauP301L Mäuse mit Riluzol, ein FDA-zugelassenes disease modifying Medikament für die amyotrophe Lateralsklerose (ALS), die moduliert glutamatergen Signalisierung durch die stabilisierendeinaktivieren Zustand der spannungsabhängigen Natriumkanäle, zu einer Verringerung der Glutamat - Freisetzung führt, und eine Potenzierung der Glutamataufnahme durch eine Erhöhung der Glutamattransporter - Expression, was zu einem erhöhten Glutamat - Clearance 30, 31, 32, 33. Wir haben aus vier Gründen dieses besondere Daten-Set zu Demonstrationszwecken gewählt. Zuerst zeigt dieser Datensatz die zeitliche Auflösung des Systems, wie unsere Fähigkeit gezeigt, um die schnelle Dynamik der transienten Freisetzung und Aufnahme von Glutamat zu messen. Darüber hinaus ist dieses vorklinischen Tiermodell zeigt Veränderungen in Tonika Glutamat, Glutamat-Freisetzung und Glutamat-Clearance, so dass für ein Beispiel von Veränderungen in jedem Takt. Zweitens, die Verwendung dieses Datensatzes, die hohe räumliche Auflösung, die für die Messung der Subregion Unterschiede in der DG, CA3, ein erlaubtnd CA1 des Hippocampus nachgewiesen wird. Drittens erlauben diese Daten für die Demonstration, wie pharmakologische Intervention kann verwendet werden, glutamatergen Veränderungen in präklinischen Tiermodellen beobachtet zu mildern. Schließlich, weil diese präklinischen Modell Veränderungen in Glutamatfreisetzung hat, kann die Notwendigkeit einer sorgfältigen Interpretation von Glutamat-Clearance in Gegenwart veränderte Glutamatfreisetzung erläutert. Nachdem eine stabile Basislinie erreicht, wie von &lt;0,004 nA / min Steigungsänderung angegeben (10 - 20 min), wir zuerst Tonikum Glutamat Spiegel (um) durch Mittelung der extrazellulären Glutamatspiegel über 10 s vor Anwendung der Lösungen gemessen. Wir haben beobachtet , in den CA3 und CA1 - Regionen von Mäusen tonische TauP301L Glutamatspiegel erhöht, und Riluzol Tonikum Glutamat Ebene , die der Kontrollgruppe (3A) gestellt. Als nächstes wurde KCl lokal geliefert (über eine Mikropipette) zu jedem der drei Teilbereiche eines hemisphere alle 2 - 3 Minuten. Nach 10 reproduzierbaren Signalen, die von einem intakten neuronalen Glutamatsystem 34 anzeigt, wurden die Ergebnisse für jede Gruppe gemittelt und die Durchschnittsamplitude verglichen. Repräsentative Spuren (3B) zeigten in allen drei Subregionen nach Anwendung von KCl Glutamat - Freisetzung in TauP301L Mäusen erhöht (nur CA3 ist gezeigt), eine Wirkung , die von Riluzol Behandlung (3C) gerettet wurde. Die MEA wurde dann in der gegenüberliegenden Hemisphäre und erlaubte eine stabile Grundlinie zu erreichen (10 - 20 min) , bevor exogene Glutamat angewandt wurde Glutamat - Clearance (4) zu untersuchen. Variierende Mengen (50 bis 250 nL) von 200 &amp; mgr; M sterilfiltriert Glutamat-Lösung wurden in den Extrazellularraum angewandt alle 2 - 3 Minuten, und die Netto-Fläche unter der Kurve (AUC) wurde als Maß für die Glutamataufnahme verwendet. Diese schnelle Anwendung von Glutamat in ter extrazellulären Raum ermöglicht endogener Glutamatfreisetzung und die Messung der Glutamataufnahme nachahmt. Da Glutamattransporter zeigen Michaelis-Menten 35 Kinetik eine Reihe von Volumina (50-250 nL) von exogener Glutamat injizierte Unterschiede in der Aufnahme zu belichten. Dazu erhält jedes Tier 1 bis 2 Injektionen bei 50 nL Inkrementen innerhalb des 50 bis 250 nL Bereich. Obwohl man immer je Gruppe, daß das Volumen pro Region injiziert bestätigen sollte am p ≤ 0,05 Pegel statistisch nicht unterschiedlich ist, ist die beste Art und Weise net AUC, um sicherzustellen, ist die Aufnahme im Zusammenhang, und nicht die Menge an Glutamat angewendet oder Diffusion, ist, dass, um sicherzustellen, sowohl Amplitude (4A) und T Anstieg (ein Maß für die Diffusion von der Punktquelle (Mikropipette) an die MEA in 4B) unterscheiden sich nicht 10, 11, 19, 20. diese allows für „peak matching“ die Amplituden (4C) , so dass Unterschiede in der Netto - AUC angenommen aufgrund von Unterschieden in der Aufnahme zu sein , und nicht die Menge angewandt oder Diffusion. Spitzenanpassung ist besonders wichtig, wenn die Tiere bestehende Unterschiede in der Glutamatfreisetzung haben. Da eine Reihe von Volumina injiziert wird, sind die Varianz für Amplitude und T Anstieg oft groß und weitere Tiere Zugabe für diese Maßnahmen der Varianz nicht abnimmt, da sie auf das Design inhärent sind. Da die Amplitude und T Anstieg zwischen den Gruppen in jedem Teilbereich ähnlich waren (4A, 4B), gehen wir davon aus, dass die Unterschiede in Netto-AUC (4C, 4D) auf Unterschiede in der Glutamataufnahme zurückzuführen sind. Riluzol verbesserte Glutamat - Clearance im Vergleich zu Kontrollen in allen drei Teilbereichen (4D). Schließlich wird eine MEA mit einem angeschlossenen Mikro verwendet, um lokal anwenden einen Farbstoff MEA Platzierung nach Gehirn bestätigen sectioning, Wie in Figur 3D gezeigt. Diese Daten zeigen , dass die MEA - Technologie ist in der Lage Messneurotransmitterfreisetzung in kleinen Teilregionen des Hippocampus 24, 25, im Gegensatz zu früheren Techniken (zB Mikrodialyse), die nur aus großen Probenbereichen erfaßt und beschädigt oft neuronaler Schaltkreise 28, 29. Darüber hinaus bietet die MEAs uns mit hohen zeitlicher Auflösung 25 die schnelle Kinetik der Glutamat - Freisetzung und die Clearance zu messen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55418/55418fig1.jpg" /> Abbildung 1: In - vitro - Kalibrierung eines mich selbst verweis Microelectrode Messung der Änderung des Strom (pA) auf einer Glutamatoxidase - Site (GluOx; rot) im Vergleich zu einer Sentinel - Site (Sent; blau). Die Störstoffe Ascorbinsäure (AA: 250 &amp; mgr; M) und Dopamin (DA: 2 uM) haben keinen Einfluss auf den Strom an entweder Glutamat-Oxidase oder Sentinel-Site. Die Zugabe von Glutamat (Glu: 20, 40, 60 &amp; mgr; M) erzeugte einen schrittweise Stromanstieg auf der Glutamat-Oxidase-Website, aber keine Änderung auf der Sentinel-Website. Wasserstoffperoxid (H 2 O 2: 8,8 um) , hergestellt auf beiden Seiten eine Erhöhung des Stromes. Empfindlichkeit, Neigung, Nachweisgrenze, und R 2 - Werte wurden nach der Kalibrierung berechnet. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55418/55418fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55418/55418fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55418/55418fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ein Beispiel Elektro Arbeitsblatt. Dieses Arbeitsblatt enthält Spalten für die Zeit der Einspritzung oder Injektion Nummer (TIME / TTL), Gehirn-Koordinaten (AP, mL, DV),die Menge an Druck ausgeübt (Stickstoff), die Länge des Druck (Zeit), und die durch den Druck Auswerfer injizierte Volumen. Irgendwelche Hinweise, wie ungeradee Signale oder Verstopfung des Mikro sollen in der Spalte Notizen aufgezeichnet werden. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55418/55418fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55418/55418fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55418/55418fig3.jpg" /> Abbildung 3. Extrazelluläre Tonic und Kaliumchlorid (KCl) -evoked Freisetzung von Glutamat im DG, CA3 und CA1 Region des Hippocampus. (A) in der CA3 und CA1 - Regionen des Hippocampus, tonisch Glutamat - Spiegel wurden in Vehikel-behandelten Mäusen signifikant erhöht TauP301L (Veh-TauP301L), ein Effekt abgeschwächt durch Riluzol Behandlung. (B) Ausgangsangepassten repräsentative Aufzeichnungen von KCl-evozierte Glutamat - Freisetzung in der CA3 zeigte r<html> iluzole Behandlung (rIL-TauP301L) abgeschwächt den deutlichen Anstieg in der Amplitude der Glutamat-Freisetzung in Veh-TauP301L Mäusen beobachtet. Die lokale Anwendung von KCl (↑) erzeugte eine robuste Zunahme des extrazellulären Glutamat, die schnell auf Tonika Niveau zurückgekehrt. (C) Die erhöhte signifikant KCl-evozierte Glutamatfreisetzung beobachtet in Veh-TauP301L Mäuse in der DG, CA3 und CA1 nach lokaler Anwendung von KCl mit Riluzol Behandlung abgeschwächt wurde. (D) Kresylviolett gebeiztes 20 um Schnitt des Hippocampus zeigt Lage der MEA Spuren in CA3 und CA1 (± SEM Mittelwert; ** p &lt;.01 Veh-Control vs. Veh-TauP301L, # p &lt;.05 rIL-Taunus P301L vs. Veh-TauP301L, ## p &lt;.01 rIL-TauP301L vs. Veh-TauP301L; n = 14-19 / Gruppe). Diese Zahl mit freundlicher Genehmigung von John Wiley and Sons 20 19, nachgedruckt.rget = „_ blank“&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55418/55418fig4.jpg" /> Abbildung 4. Glutamate Uptake Nach Exogene Glutamate Anwendung in der DG, CA3 und CA1 Regionen des Hippocampus. (A) Die Amplitude des lokal angewendet Glutamat - Signal war ähnlich zwischen den Gruppen in jeder Region. (B) T steigen, ein Indikator für die Glutamat - Diffusion von der Mikropipette wurde in jeder Region unter den Gruppen ähnlich. (C) Repräsentative Glutamat Signale in der CA3 von lokaler Applikation von Glutamat in Veh-Controls, Veh-TauP301L und rIL-TauP301L Mäusen. (D) Riluzol Behandlung reduziert die erheblichen Steigerungen der Nettofläche unter der Kurve (AUC) beobachtet in Veh-TauP301L Mäuse in allen 3 - Regionen des Hippocampus, was anzeigt , verbesserte Glutamataufnahme in Riluzol behandelten TauP301L Mäuse (Mittelwert ± SEM; * p &lt;.05 Veh-Control gegen Veh-TauP301L, ** p &lt;.01 Veh-Control gegen Veh-TauP301L, # p &lt;.05 Ril-TauP301L vs. Veh- TauP301L, ## p &lt;.01 rIL-TauP301L vs. Veh-TauP301L; n = 13-15 / Gruppe). Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von John Wiley and Sons nachgedruckt 20. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55418/55418fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55418/55418fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 0,05 M PBS </td><td> 2 L VE-Wasser: </td></tr><tr><td> Speicher in Glasbecher mit Alufolie umwickelt. Bringen Sie pH-Wert auf 7,4 mit KOH, falls erforderlich. </td><td> NaH 2 PO 4 · H 2 O: 2,8 g Na 2 HPO 4: 11,34 g Natriumchlorid: 11,68 g </td></tr><tr><td> 20 mM Ascorbinsäure </td&gt; <td> 50 ml DI-Wasser: </td></tr><tr><td> Machen Sie täglich frisch. </td><td> Ascorbinsäure: 0,18 g </td></tr><tr><td> 20 mM L-glutamat </td><td> 50 ml DI-Wasser: </td></tr><tr><td> Machen Sie wöchentlich frisch. </td><td> L-Glutamat-Mononatriumsalz-Hydrat: 0,15 g </td></tr><tr><td> 2 mM Dopamine </td><td> Dopamine-Hydrochlorid: 0,038 g </td></tr><tr><td> Machen Sie frische monatlich. </td><td> 0,1 M Perchlorsäure: 10 ml Bringen Volumen auf 100 ml mit entionisiertem Wasser </td></tr><tr><td> 8,8 mM Wasserstoffperoxid </td><td> 50 ml DI-Wasser: </td></tr><tr><td> Machen Sie wöchentlich frisch. </td><td> Wasserstoffperoxid: 500 &amp; mgr; l </td></tr><tr><td> 70 mM Kaliumchlorid </td><td> 100 ml DI-Wasser: </td></tr><tr><td> Machen Sie frischen Tag des Experiments. </td><td> Kaliumchlorid: 0,08 g Natriumchlorid: 0,07 g Calciumchlorid: 0,004 g </td></tr><tr><td> 200 μ; M Glutamate </td><td> 20 mM Glutamat: 100 &amp; mgr; l </td></tr><tr><td> Machen Sie frischen Tag des Experiments. </td><td> Sterile Kochsalzlösung: 10 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Kalibrierlösungen.

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Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Hier beschreiben wir die Setup - Software Navigation, und die Datenanalyse für eine räumlich und zeitlich genaue Methode der tonischen und phasische extrazellulären Glutamat Veränderungen in vivo Messung unter Verwendung von enzymgekoppelten Mikroelektrodenarrays (MEA).

Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

using-enzyme-based-biosensors-to-measure-tonic-phasic-glutamate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Aufrufe.  West Virginia University.  Hier beschreiben wir die Setup - Software Navigation, und die Datenanalyse für eine räumlich und zeitlich genaue Methode der tonischen und phasische extrazellulären Glutamat Veränderungen in vivo Messung unter Verwendung von enzymgekoppelten Mikroelektrodenarrays (MEA). 

Serie: Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature infants and the most common antecedent of cerebral palsy. PVL is characterized by periventricular white matter damage with prominent oligodendroglial injury. Hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation are the primary causes of PVL. We use P6 mice to create models of neonatal brain injury by the induction of hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation with unilateral carotid ligation followed by exposure to hypoxia with or without injection of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Immunohistochemistry of myelin basic protein (MBP) or O1 and electron microscopic examination show prominent myelin loss in cerebral white matter with additional damage to the hippocampus and thalamus. Establishment of mouse models of PVL will greatly facilitate the study of disease pathogenesis using available transgenic mouse strains, conduction of drug trials in a relatively high throughput manner to identify candidate therapeutic agents, and testing of stem cell transplantation using immunodeficiency mouse strains.

We established mouse models of periventricular leukomalacia (PVL), the predominant brain injury in premature infants characterized by periventricular white matter lesions. Hypoxia/ischemia with/without systemic infection are the primary causes of PVL. Unilateral carotid ligation and hypoxia exposure with/without lipopolysaccharide injection creates PVL-like lesions in P6 mice.

Mausmodellen periventrikuläre Leukomalazie

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

Forschung

Neurowissenschaften

Hyponeophagia: A Measure of Anxiety in the Mouse

Before the present day, when fast-acting and potent rodenticides such as alpha-chloralose were not yet in use, the work of pest controllers was often hampered by a phenomenon known as "bait shyness". Mice and rats cannot vomit, due to the tightness of the cardiac sphincter of the stomach, so to overcome the problem of potential food toxicity they have evolved a strategy of first ingesting only very small amounts of novel substances. The amounts ingested then gradually increase until the animal has determined whether the substance is safe and nutritious. So the old rat-catchers would first put a palatable substance such as oatmeal, which was to be the vehicle for the toxin, in the infested area. Only when large amounts were being readily consumed would they then add the poison, in amounts calculated not to affect the taste of the vehicle. The poisoned bait, which the animals were now readily eating in large amounts, would then swiftly perform its function.
Bait shyness is now used in the behavioural laboratory as a way of measuring anxiety. A highly palatable but novel substance, such as sweet corn, nuts or sweetened condensed milk, is offered to the mice (or rats) in a novel situation, such as a new cage. The latency to consume a defined amount of the new food is then measured.
Robert M.J. Deacon can be reach at <a href="mailto:robert.deacon@psy.ox.ac.uk">robert.deacon@psy.ox.ac.uk</a>

Mice and rats, due to their innate cautiousness, are initially slow in consuming a novel food, particularly in a novel place. This hyponeophagia can readily be measured in the laboratory, even though laboratory animals are much less anxious than their wild counterparts

Hyponeophagia: A Measure of Anxiety in der Maus

Before the present day, when fast-acting and potent rodenticides such as alpha-chloralose were not yet in use, the work of pest controllers was often ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Nachweis von neuritischen Plaques bei Alzheimer-Maus-Modell

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, respectively 4,5,6,7 The GABAA channel is a pentameric GABA-gated chloride channel. The channel subunits are grouped into 8 families (&alpha;1-6, &beta;1-3, &gamma;1-3, &delta;, &#949;, &theta;, &pi; and &rho;). Two alphas, two betas and one 3rd subunit form the functional channel 8. By combining studies of sub-type specific GABA-activated single-channel molecules with studies including all populations of GABAA channels in the neuron it becomes possible to understand the basic mechanism of neuronal inhibition and how it is modulated by pharmacological agents.
We use the patch-clamp technique 9,10 to study the functional properties of the GABAA channels in alive neurons in hippocampal brain slices and record the single-channel and whole-cell currents. We further examine how the channels are affected by different GABA concentrations, other drugs and intra and extracellular factors. For detailed theoretical and practical description of the patch-clamp method please see The Single-Channel Recordings edited by B Sakman and E Neher 10.

We use the patch-clamp technique to measure GABA-activated single-channel currents (GABAA channels, GABAA receptors) and the synaptic and tonic currents they generate in neurons. Activation of the channels decreases neuronal excitability in health and disease 1,2,3,4.

GABA-aktivierten Single-Channel-und Tonic Currents in Hirnschnitten der Ratte

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a useful method to quantify neuronal profiles of various brain structures. Here we provide a software-based stereology protocol to estimate the total length of cholinergic fibers in the nucleus basalis of Meynert (NBM) of the basal forebrain. The method uses a space ball probe for length estimates. The cholinergic fibers are visualized by choline acetyltransferase (ChAT) immunostaining with the horseradish peroxidase-diaminobenzidine (HRP-DAB) detection system. The staining protocol is also valid for fiber and cell number estimation in various brain regions using stereology software. The stereology protocol can be used for estimation of any linear profiles such as cholinoceptive fibers, dopaminergic/catecholaminergic fibers, serotonergic fibers, astrocyte processes, or even vascular profiles.

Neuronal fiber length within a three-dimensional structure of a brain region is a reliable parameter to quantify specific neuronal structural integrity or degeneration. This article details a stereological quantification method to measure cholinergic fiber length within the nucleus basalis of Meynert in mice as an example.

Stereologische Abschätzung der cholinergen Faserlänge im Nukleus Basalis von Meynert des Maushirns

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...