Diese Arbeit wurde von der Fritz-Thyssen-Stiftung (Az.10.14.2.152) unterstützt. Wir sind dankbar, dass die Gewebeeinbettung Anlage und das Mikroskop Core Facility des ZMMK. Wir sind dankbar für die Diskussionen und technische von den Mitgliedern des Labors für Zentrosom und Zytoskelett Biologie unterstützt. Wir danken Li Ming Gooi das Manuskript für das Korrekturlesen.

1. Erzeugung von Brain Organoide (23 Tage) <ol><li> Initiierung von Neuroektoderms (5 Tage) HINWEIS: Die folgenden Punkte sollten vor dem Beginn der Differenzierung in Betracht gezogen werden. Die Umprogrammierung Methode (lentiviral-, Sendai-Virus-, Episomen oder microRNA-Basis etc.) menschlichen iPSCs erhalten sollte idealerweise die gleiche für alle Patienten und iPSC Leitungen steuern. Verschiedene Umprogrammierung Kits und Anweisungen auf der Grundlage veröffentlichter Protokolle sind 15, 16, 17, 18. Die Qualität der menschlichen iPSC Linien ist der Schlüssel für eine optimale Differenzierung zu erreichen. Überwachen Kolonie und der Zellmorphologie mit einem Mikroskop und validieren Pluripotenz durch Testen der Expression von Markern wie Oct3 / 4, Nanog oder TRA-1-60. <ol><li> Kultur menschlicher iPSCs unter feeder freien Bedingungen in Medium A auf einem Teller beschichtet mit Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) Matrix. HINWEIS: Wachsen menschliche iPSCs feeder freie und serumfreien Kultur mit einem definierten Zustand zu erhalten und einen zusätzlichen Schritt zur Entfernung von embryonalen Maus-Feeder-Zellen (MEFs) vor Beginn der Differenzierung zu vermeiden. Die optimale Durchgangszahl für die menschlichen iPSCs zur Differenzierung im Bereich von Kanal 15 bei Neuprogrammierung zu Durchgang 70 insgesamt zu starten. Wenn Passagierung lösen hiPSC Kolonien als Zellen, die mit geringer mechanischer Belastung eine geeignete Zellentfernungslösung aggregate verwendet und eine 2-ml serologische Pipette Aggregate auf eine neue Schale zu übertragen. Vermeiden Sie Dissoziation auf einzelne Zellen, wie diese Differenzierung induzieren könnte und Apoptose in den meisten iPSC Linien. Es wurde berichtet , dass eine langfristige, Single-Cell - Passagierung genomische Veränderungen in der menschlichen 19 iPSCs erhöhen könnte, 20. Vermeiden Zellablösung Verfahren, die einen Zentrifugationsschritt erforderlich Entfernungslösung zu entfernen, da dies die Gesamtfähigkeit der iPSCs reduziert. Testalle Kulturen für mikrobielle Kontaminationen, insbesondere Mykoplasmen, auf einer regelmäßigen Basis, denn dies könnte die Qualität der iPS-Zellen und deren Differenzierungsfähigkeit verändern. <ol><li> Mantel eine 60 mm-Gewebekulturschale mit EHS-Matrix gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Auftauen eines Aliquots von 1 × 10 6 menschlichen iPSCs. Same ist das iPSCs in einer 60-mm - Gewebekulturschale in beschichtet EHS - Matrix und die 5 ml Medium A (siehe Materialien Tabelle). Ändern Sie das Medium täglich und Durchgang nach 5 bis 7 Tagen, wenn die Zellen erreichen ~ 80% Konfluenz. HINWEIS: Die Passage die aufgetaute iPSCs bei 80% Konfluenz unter Verwendung von Standardverfahren, wie beispielsweise die enzymfreie Ablösung von Kolonien 21, mindestens einmal , bevor die Differenzierung beginnt. Kurz gesagt, entfernen Sie das iPSC Medium, waschen Sie die einmal Zellen mit vorgewärmten 37 ° C Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium: Nährsalzgemisch F12 (DMEM / F12) und inkubieren Sie die iPS-Zellen nach Angaben des HerstellersReagenz A Anweisungen (siehe die Material Tabelle). Überschreiten Sie die empfohlene Inkubationszeit nicht um Dissoziation zu einzelnen Zellen zu vermeiden. Menschliche iPS sollte abgelöst und variabel als Aggregate werden, nicht als einzelne Zellen. Sie können dann auf neue EHS-Matrix-beschichteten Schalen übertragen werden; iPSC beispielsweise Aggregate, die aus einer 60-mm-Schale zu 4 neuen Schalen mit 60 mm verteilt werden kann. </li><li> Überprüfen Sie für Mykoplasmen mit einem Mycoplasma Detection Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie nur Mycoplasma frei iPSCs, wie Mykoplasmen die Differenzierungsfähigkeit von iPS-Zellen verändern können. </li></ol></li><li> Dissoziieren iPSCs (80% konfluent) und bereite Reagenz B. eine Einzelzellsuspension unter Verwendung von <ol><li> Waschen Sie die iPSCs einmal mit vorgewärmten (37 ° C) DMEM / F12. </li><li> Fügen vorgewärmten Reagens B ( zum Beispiel 1 ml in einer 60 mm - Schale) und inkubiere die iPSCs für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Flick 20 mal mit einer Fingerspitze auf den Seiten und am Boden vondie Schale, die die iPSCs abzulösen. Überprüfen Sie für die Ablösung von Zellen unter dem Mikroskop. </li><li> Pipette, um die Zellsuspension nach oben und unten in der Schüssel 5 mal mit einer 1-ml-Mikropipette. </li><li> 3 ml Medium A 1 ml Reagens B zu verdünnen und die Zellsuspension in eine 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu sammeln. </li><li> Spin-down vorsichtig die iPS-Zellen (500 × g) für 4 min bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml Medium B, und die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen. Hinweis: Beachten Sie nur Medium B für Aufwirbelung mit. Vermeiden Medium A verwendet wird, da sie eine zu hohe Konzentration an bFGF enthält, die die Differenzierung inhibieren könnten. </li></ol></li><li> Verdünne die Zellsuspension auf 4,5 x 10 5 Zellen pro ml in Medium B , ergänzt mit 10 &amp; mgr; M rho-assoziiertes Protein - Kinase - Inhibitor (Y-27632). </li><li> Je 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung in einer nicht-haftenden, V-Boden, 96-Well-Platte. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig im sus verteiltpension von der Röhre ausgeschüttelt, bevor 100 ul-Portionen Entnahme. Es ist wichtig, dass jede Vertiefung eine äquivalente Anzahl von Zellen, um Neurosphären enthalten sollte homogen in der Größe und Form (rund, definierten Oberflächen) zu erhalten. </li><li> Spin sanft die Platte mit den Zellen nach unten bei 500 xg und Raumtemperatur für 3 min und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie das Medium täglich um 50 &amp; mgr; l Entfernen und Hinzufügen von 50 &amp; mgr; l frischem Medium B in jede Vertiefung für die nächsten 5 Tage. </li></ol></li></ol> 2. Embedding Neurosphären in EHS-Matrix (4 Tage) <ol><li> Bereiten Neurosphäre Medium durch Vermischen der folgenden Bestandteile: 1: 1-Mischung aus DMEM / F12 und Medium C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplement 1, 1: 100 (v / v) Ergänzung 2 ohne (w / o) Vitamin A, 1: 100, L-Glutamin, 0,05 mM nicht-essentielle Aminosäuren (MEM), 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1,6 g / L insulin, und 0,05 mM β-Mercaptoethanol. </li><li> Sammeln Sie die Neurosphären witha 200 &amp; mgr; l Mikropipette eine ~ 2 mm Spitze zuvor geschnitten mit einer sterilen Schere verwenden. </li><li> Platzieren Sie die Neurosphären etwa 5 mm voneinander entfernt auf Paraffinfilm (3 x 3 cm 2) in einer leeren 100 - mm - Schale und vorsichtig entfernen , so viel des verbleibenden Mediums wie möglich. </li><li> Einen Tropfen (7 &amp; mgr; l) von EHS Matrix auf jeden einzelnen Neurosphäre. </li><li> Inkubieren der Matrix mit den EHS Neurosphären für 15 min in einem Inkubator abfällt. </li><li> Waschen Sie die Neurosphären vorsichtig aus dem Paraffinfilm, indem sie mit Neurosphere Spülmedium. Zu spülen, verwenden, um eine 1 ml-Mikropipette und 100 mm-Petrischale, die 10 ml Medium Neurosphäre. </li><li> Inkubiere die Neurosphären für die nächsten 4 Tage und mit 2 ml frischem Neurosphere Medium am Tag 2. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Regale in dem Inkubator flach sind, so dass die EHS-Matrix eingebettete Neurosphären nicht zusammen auf einer Seite des Tellers verklumpen werden. </li></ol> 3. Organoide in einem Rotations SuspensionKultur (14 Tage) <ol><li> Bereiten brain organoiden Medium durch Vermischen der folgenden Bestandteile: 1: 1-Mischung aus DMEM / F12 und Medium C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplement 1, 1: 100 (v / v) Ergänzung 2 w / o Vitamin A, 1: 100, L-Glutamin, 0,05 mM MEM, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1,6 g / l Insulin, 0,5 uM Dorsomorphin, 5 &amp; mgr; M SB431542 und 0,05 mM β-Mercaptoethanol. </li><li> 100 ml Gehirn organoiden Medium zu jedem Zentrifugenkolben durch seine Seitenarme und sie in einem Inkubator für die Vorwärmung für mindestens 20 min. </li><li> Stellen Sie ein mitreißendes Programm bei 25 Umdrehungen pro Minute auf, nach dem Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Bevor Sie die EHS-Matrix eingebettete Neurosphären in Rotationskolben übertragen, stellen Sie sicher, dass sie alle voneinander getrennt sind. Wenn zwei oder mehr durch EHS-Matrix verbunden sind, trennen sie von der Verbindungsmatrix mit einem Skalpell geschnitten wird. </li><li> übertragen sorgfältig die EHS-Matrix eingebettet Neurosphären in Rotationskolben, enthaltend 100 ml Medium organoiden using eine 2 ml serologische Pipette. Verwenden, um die Seitenarme des Spinner-Flasche, die Neurosphären in den Kolben zu übertragen. </li><li> Platzieren Sie die spinner flasks auf einem Magnetrührstab Plattform in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2; dies ist Tag 0 der organoiden Kultur. </li><li> Ändern Sie das Medium einmal pro Woche (oder öfter, wenn es eine Farbänderung) um die Hälfte des Mediums entfernt und Zugabe der gleichen Menge an frischem Medium. HINWEIS: aus dem Inkubator Wenn die Spinnerflaschen nehmen, warten 3-5 min die Organoide sinken bis auf den Boden des Kolbens zu lassen. Entfernen des Mediums durch die Glaspipettenspitze Platzierung (mit einer Pumpe) auf der Oberfläche der Flüssigkeit; anzusaugen, das Medium vorsichtig durch eine Seitenöffnung / Arm des Kolbens. Diese Manipulationen müssen unter der laminaren Haube erfolgen. </li></ol> 4. Analyse von Brain Organoide <ol><li> Fixierung von Organoiden <ol><li> Sammeln Sie die Organoide am Tag 14 der Rührflasche Kultur with einen Schnitt 1 mL Mikropipette (cut ~ 5 mm). Legen Sie alle von ihnen in einer 60-mm-Schale und waschen Sie sie einmal mit 5 ml warmem DMEM / F12 für 3 min. </li><li> Vorbereiten ein 1,5-ml-Röhrchen mit 500 &amp; mgr; l warm 4% Paraformaldehyd (PFA). Achtung: Tragen Sie Haut- und Augenschutz und das Arbeiten unter der Schutzhaube bei PFA Fixativ Handhabung. </li><li> Platzieren jeder organoiden separat in jedem Röhrchen und fixieren sie für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Sie nicht die Organoide länger als 60 min beheben. Um die Organoide zu bewegen, eine Impföse oder andere devise verwenden, die bequem ist. </li><li> Entfernen Sie die PFA und wäscht die Fest Organoide zweimal für jeweils 10 min mit 1 ml PBS. </li><li> Lagern Sie die Organoide in 1 ml PBS bei 4 ° C für bis zu 7 Tage, bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> Das Einbetten der Organoide für Kryoschneiden <ol><li> Entfernen Sie die PBS und füge 1 ml 30% Saccharose in destilliertem Wasser Lösung pro Röhrchen der Organoiden zu entwässern, bevor sie cryofreezing; nach der Zugabe von Sucrose Lösung sollte die Organoide an der Oberfläche schwimmen. Lagern Sie die Organoide über Nacht in Saccharose-Lösung bei 4 ° C; am nächsten Tag haben die Organoide sollten den Boden des Röhrchens herabgesunken. HINWEIS: Organoide kann für bis zu 3-5 Tage bei 4 ° C in einer Zuckerlösung bei Bedarf gespeichert werden. </li><li> Füllen eine Vinylprobenform mit 400 ul optimaler Schnitttemperatur (OAT) -Verbindung und die Verwendung eine Impföse eine organoiden in der Mitte der Form zu platzieren. Beschriften den Rand der Form mit dem Probennamen. </li><li> Einfrieren die organoiden haltigen Form bei -80 ° C bis Kryoschneiden. </li><li> Coat Glas cryoslides mit 0,1% Poly-L-Lysin-Lösung (PLL) in PBS für 5 min bei Raumtemperatur und ließ die Objektträger trocknen 3 Stunden. Lagern Sie die Folien bei 4 ° C und erwärmen sie vor dem Gebrauch auf Raum gemäßigten bis. HINWEIS: Die PLL-Beschichtung ist ein wichtiger Schritt, da er die organoiden Scheiben aus davonzuschweben zu verhindern. Sammeln und Speichern von PLL-Lösung bei 4 ° C für bis zu 3Monate. Vor der Wiederverwendung filtert es mit einer 0,22-um-Spritze und lassen Sie es auf Raumtemperatur warm. </li><li> Abschnitt cryofrozen Organoiden in 20-50 um dicke Scheiben auf PLL-beschichtete Glas cryoslides 22. Lassen Sie die Folien mit den Abschnitten 1 h bei Raumtemperatur trocknen. Speichern der Abschnitte bei -80 ° C bis zur Weiterverarbeitung. </li></ol></li></ol> 5. Immunfluoreszenzanfärbung von organoiden Sections HINWEIS: Für die allgemeine Charakterisierung von Organoiden, mit nestin Färbung, ein neuralen Vorläufer Marker und TuJ1, ein pan-neuronalen Marker, wird empfohlen. Als weitere Beispiele, Immunofluoreszenzfärbung mit phospho-Vimentin (p-VIM), die mitotische apikalen radialen Gliazellen Etiketten und Arl13b, für Flimmer, werden beschrieben. Um zu testen, die Apoptose, verwenden Sie die Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) -Test. Legen Sie die Folien in einer Kunststoff-Box während der Inkubationen sie vor Staub zu schützen, Licht,und auszutrocknen. <ol><li> Tauen Sie die Folien für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen des Objektträgers zweimal mit 200 ul PBS-Glycin (0,225 g Glycin in PBS) für 3 min, um die PFA-induzierte Autofluoreszenz zu löschen. </li><li> Permeabilisieren die Abschnitte mit 200 ul 0,5% Triton X100 / 0,1% Tween in PBS-Lösung für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie sie zweimal mit 200 ul PBS-Glycin-Lösung für 3 min. </li><li> Inkubieren sie mit 200 ul 0,5% Fischgelatine / 0,1% Triton X100 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C Bindung unspezifischer Antigen zu blockieren. HINWEIS: Wenn ein TUNEL-Test erforderlich ist, führen Sie den Test gemäß dem Protokoll des Herstellers. Beginnen Sie mit dem TUNEL-Test vor der Immunfärbung durchgeführt wird, wie es mit sekundären Antikörpern stören könnten und Fluorophore löschen, wenn danach verwendet. </li><li> Verdünne die Antikörper in Blocking-Lösung in den folgenden Konzentrationen: Nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TuJ1, 1: 200;Arl13b, 01.20; und sekundärer Antikörper, 1: 1000. </li><li> Inkubieren mit 200 &amp; mgr; l der ersten primären Antikörpern (zB Nestin) für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung. </li><li> Verdünne die erste (anti-Maus 488) Sekundärer Antikörper: 1: 1000 in Blocking-Lösung und den Objektträgers in 200 &amp; mgr; L für 1-2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Von nun an schützt immer die Folien aus Licht. </li><li> Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung. </li><li> Inkubieren mit 200 &amp; mgr; l des nächsten primären Antikörper (zB TuJ1) für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung. </li><li> Füge 200 &amp; mgr; L des nächsten sekundären Antikörpers (Anti-Kaninchen-647) für 1-2 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen 3 x 3 min. mit 200 ul Blockierungslösung. </li><li> Füge 200 &amp; mgr; l von 4&#39; , 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer 30 nM concentration in PBS für 15 min bei Raumtemperatur für die Kernfärbung. </li><li> Waschen 2 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung. </li><li> Wäsche 1 x 1 min mit 200 ul destilliertem Wasser und lassen die Abschnitte für 10-20 min trocknen, bis kein offensichtlicher Wassertropfen mehr sichtbar ist. </li><li> Montieren der Schnitte mit Medium einbettet. Lagern Sie sie von Licht bei 4 ° C geschützt bis zu mehreren Wochen. </li><li> Fahren Sie mit der mikroskopischen Analyse zu Bild einen Überblick über die organoiden, ventrikulären Zone, primitive Kortikalplatte und andere Bereiche von Interesse. </li><li> Verwenden , um ein konfokales Mikroskop mit einem Objektiv und 63X Ölfluoreszenzfilter, ausgewählt gemäß dem Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sekundärantikörper 1 verwendet wird , 10. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

MCPH ist eine komplexe menschliche Erkrankung des Nervensystems , die nicht in Tiermodellen in vivo oder in einfachen menschlichen Zellkulturansätze in vitro rekapituliert werden kann. Die klinische Manifestation der MCPH beginnt während des ersten Trimesters zu erscheinen, wenn sie früh beginnt die Neurogenese. Somit stellen die 3D Gehirn Organoide ein zuverlässiges experimentelles System MCPH Entwicklung zu modellieren. Darüber hinaus 3D menschliches Gehirn Organoide ist ein idealer Ansatz, da i) sie ermöglichen die Anpassung eines Spektrum von Patientenproben mit verschiedenen genetischen Hintergründen, ii) sie organisiertes Gewebe zeigen Typen unterschiedliche neuronale Zelle enthält, und, was wichtig ist, iii) verschiedene Differenzierung Stadien der Entwicklung des Nervensystems in diesem in vitro - Ansatz werden auf ihre in vivo Pendants verbunden 25, 26, 27. Zum Beispiel ist die neuronale Rosette eine äquivalente Struktur zu der Entwicklungs neuronalenTube. Lancaster et al. die doppelte Anzahl von Patienten verwendet iPSCs iPSCs verglichen zu steuern, um bei der Erzeugung von Patienten Organoide erfolgreich zu sein. Bemerkenswert ist , mit dem Protokoll hier beschrieben, durch die bestehenden Methoden zu modifizieren, könnten wir 4 Startsteuerung und Mikrozephalie Gehirn Organoide aus den gleichen Zellzahlen generieren. Dies war möglich durch die definierten Kulturbedingungen iPSCs und aufgrund einer gerichteten Differenzierung. In diesem Protokoll wurde organoiden Generation verbessert, indem den häufigsten durchgeführten EB Bildungsschritt ersetzt durch neuronale Differenzierung direkt von iPSCs einleitet. Zweitens in Schritt 3 Dorsomorphin und SB431542 wurden in das Kulturmedium allein anstelle von Retinsäure ergänzt. Retinsäure isomerisiert wird leicht , wenn das Zellkulturmedium 28 angelegt. Daher ist seine biologische Aktivität weniger definiert als die von stabileren Verbindungen wie Dorsomorphin. Dorsomorphin hemmtder BMP4 Signalweg und SB431542 ist ein Inhibitor des Activin / Knoten Signalweg (TGF-β1 ALK-Inhibitor). Eine Kombination beiden Verbindungen führt zur Hemmung der BMP und das Aktivin / Knoten Signalweg induziert neuronale Differenzierung und reduziert die Differenzierung in andere Linien in verschiedenen Zelllinien aus menschlichem ES oder humanen iPS - Zellen mit einer ähnlichen Effizienz 29. Verbindung Stabilität und universelle Zellantwort auf eine Verbindung , sind wichtige Punkte für ein Protokoll zur Festlegung, die an verschiedene Zelllinien Patienten angewandt werden kann , um eine Krankheit in vitro zu modellieren. So organoiden ein robustes und effiziente Differenzierung Ergebnisse in homogenem Gehirn Kulturen und schließlich in reproduzierbaren Daten. Mit diesen Modifikationen kritische Schritte in dem Protokoll zur Einleitung der Differenzierung in Schritt 1. An dieser Stelle minimiert werden, ist es wichtig, die iPSCs in eine Einzelzellsuspension eines sanft dissoziierennd zu verteilen, sie genau und gleichmäßig in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Rho-assoziiertes Protein-Kinase-Inhibitor (Y-27632) muss während der ersten 24 h zu Medium B zugegeben werden, da sie die Überlebenszeit von iPSCs bei ihrer Dissoziation einzelner Zellen unterstützt. Es ist wichtig, Zellen in engen Kontakt miteinander zu bringen, indem sie bis auf den Boden der Vertiefungen zu drehen. Sobald Neurosphären am Ende von Schritt 1 gebildet werden, kann der erfolgreiche Abschluss des weiteren experimentellen Verfahrens zu erwarten. Im Fall neurospheres die Pluripotenz der humanen iPS-Zellen nicht bilden, die Nichteinhaltung der Zellen in 96-Well-Platte, und die Schleudert Bedingungen zu prüfen. Das gesamte Verfahren am Tag 0 von Schritt 1 soll nicht länger als 1 h aufgrund der Empfindlichkeit der menschlichen iPS-Zellen. Medium Änderungen in den folgenden Tagen muss sorgfältig durchgeführt werden, Scherkräfte zu vermeiden, um nicht zu zerstören frisch gebildete Zellkontakte zwischen den Zellen. Es ist bemerkenswert, dass centrosomal-Mutanten haben defekte Zellproliferation und veränderten Zellzyklus-Dynamik. Somit erfordert MCPH Modellierung ein leistungsfähiges Protokoll, das die Zellfunktionen beeinträchtigt standhalten kann. Daher erlaubt das aktuelle Protokoll für die Erzeugung von homogenen Organoide von hohen Qualität und dient als ein einzigartiges Werkzeug Stammzelle Homöostase im VZ zu studieren. Im Gegensatz zu anderen Protokollen ermöglicht dieses Protokoll, um die Erzeugung von Organoiden von Kontroll- und Patienten iPSCs mit gleichen Zellzahlen beginnen. Für Studien , basierend auf in vitro Differenzierung identische Kulturbedingungen für verschiedene iPSCs sind eine Grundvoraussetzung krankheitsbedingten Veränderungen und zu vermeiden Kultur-Zustand Artefakte zu identifizieren. Neben der Modellierung Mikrozephalie genetischen Ursprungs, kann dieses Protokoll auch auf Mikrozephalie von nicht-genetischem Ursprung angewandt werden, einschließlich von neurotrophic viralen Infektionen, Chemikalien oder Strahlung. 30 Darüber hinaus moderne Molekularbiologie - Tools wie CRISPR / Cas9 genom bearbeitening Technologien können auf 3D Organoide angewendet werden , um spezifische Aspekte des menschlichen Gehirns Entwicklungsparadigma in 31 vitro sezieren, 32, 33. Auf der anderen Seite hat sich die Erzeugung von Gehirn Organoide bisher noch nicht über den ersten und frühen zweiten Trimester der menschlichen Entwicklung 34 gegangen. Überschreiten diese Einschränkung und ermöglicht die Erzeugung von reifen Gehirns Organoiden in vitro würden neue Wege öffnen , um neurodegenerative Erkrankungen zu modellieren , die in späteren Stadien manifestieren, wie beispielsweise Parkinson oder Alzheimer-Krankheit. Für zukünftige Anwendungen, Protokolle Differenzierung spezifischer Regionen, wie das Vorderhirn oder das Mittelhirn zu leiten, könnte von Interesse sein , komplexe neurologische Störungen zu untersuchen wie Autismus und Schizophrenie 35, 36, 37, </sbis&gt; 38. Wichtig ist, dass bestimmte Aspekte berücksichtigt werden, wenn Schlussfolgerungen aus organoiden Studien zeichnen. Die erste Einschränkung besteht darin, dass es keine offensichtliche Vaskularisierung in Organoiden ist. Somit Gasaustausch und Nährstoffversorgung in vitro nur annähernd in vivo Bedingungen. Zweitens, da Gehirn Organoide nicht zu komplexen Organsystemen verbunden ist, mangelt es das organoiden Modell eine vollständige Immun, Stoffwechsel- und Hormonsystem. Dennoch stellt das Fehlen dieser Aspekte manchmal einen Vorteil. Zum Beispiel können die hier beschriebenen Organoide können immunsupprimierten in - vivo - Modelle ersetzen , wenn die Wirkung des Immunsystems in der Pathogenese von Erkrankungen des Gehirn Adressierung. Mit dem Einsatz von Spinnerflaschen, kann eine große Anzahl von Organoiden für biochemische Experimente erzeugt wird, ganze Transkriptom-Sequenzierung Analyse und Hochdurchsatz-Drogenscreenings. Zusammengenommen mit usingt dieses aktuelle Protokoll kann ein Gehirn Organoide aus menschlichen iPS-Zellen erzeugen, die dann in einem breiten Spektrum von Anwendungen eingesetzt werden können, von Krankheit Modellierung Drogentestplattformen, um zuverlässig Tierversuche in Zukunft zu ersetzen.

Menschliche Entwicklung des Nervenstörungen, wie Mikrozephalie, nur schlecht in Tiermodellen untersucht werden, aufgrund der Tatsache, dass das menschliche Gehirn haben eine erweiterte kortikalen Oberfläche, ein einzigartiges Merkmal der sich von nicht-menschlichen Tieren. Dieser Aspekt macht die menschliche Entwicklung des Gehirns einen komplexen Prozess, der nicht ausreichend in einem 2D untersucht werden, in vitro Zellkultursystem. Schwellen 3D-Kulturtechniken ermöglichen die Erzeugung von gewebeähnlichen Organoide aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS). Die in - vitro - Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in einer 3D - Suspensionskultur ermöglicht die Bildung von verschiedenen Zelltypen in einer angemessenen und regionsspezifische Weise, was zu einem organisierten, geschichteten Gewebe 1, 2, 3. Dank Laboratorien, die 3D-Kulturtechnologien Pionierarbeit geleistet und die Komplexität der Organbildung entmystifiziert, aus Stammzellen beginnen,entwickeln wir eine robuste Methode Gehirn Organoide der Erzeugung frühe Ereignisse der menschlichen Gehirn Entwicklung zu beschreiben und Mikrozephalie in vitro 1, 2, 3 zu modellieren. Es ist bemerkenswert , dass wir die ursprüngliche Methode , entwickelt von Lancaster et al angepasst. zerebrale Organoide 1 zu erzeugen. Diese Methode wurde nach unseren experimentellen Anforderungen modifiziert. Das Ziel einer Studie von Gabriel et al. war die zellulären und molekularen Mechanismen der neuronalen Stammzell Wartung während der Entwicklung des Gehirns zu untersuchen. Um dies zu tun, wurde eine mechanistische Studie durch die Analyse von neuralen Vorläuferzellen (NSC) in 3D durchgeführt Gehirn Organoide von einem Patienten stammte Mikrocephalie 4. Dieser Patient trug eine Mutation in CPAP, ein konserviertes Protein zentrosomalen für Zentrosom Biogenese 5 erforderlich. Eine weithin akzeptierte hypoThese ist , dass Mikrocephalie das Ergebnis einer Erschöpfung des NPC - Pools ist, und dies könnte entweder zum Zelltod oder zu einem vorzeitigen Differenzierung 1, 6, 7, 8, 9 liegt. Durch die Analyse der ventrikulären Zonen (VZs) von Mikrocephalie brain Organoiden, wurde gezeigt , dass eine beträchtliche Anzahl von NSC asymmetrischer Zellteilung zu unterziehen, im Gegensatz zu Gehirn Organoide von einem gesunden Spender stamm 4. Umfangreiche mikroskopische und biochemische Analysen von microcephalic Gehirn Organoide ergab eine unerwartete Rolle für CPAP in rechtzeitige Zilien Demontage 4. Insbesondere mutierte CPAP mit retardierten cilium Demontage- und verzögerte Zellzyklus - Wiedereintritt verbunden ist , auf die Differenzierung von vorzeitiger NSC führenden 4. Diese Ergebnisse legen nahe, eine Rolle für Zilien in Mikrozephalie und thEIR Beteiligung während der Neurogenese und Gehirngröße Kontrolle 10. Der erste Teil dieses Protokolls ist eine Beschreibung eines dreistufigen Verfahrens homogene brain Organoiden zu erzeugen. Wie bereits erwähnt, wurde das ursprüngliche Lancaster Protokoll angepasst und modifiziert unser Ziel 1 zu entsprechen. Erstens sind menschliche iPSCs Kultur in einem definierten feeder freien Zustand auf Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Matrix. Dieser Schritt vermeidet die Variationen von Feeder-abhängigen pluripotenten Stammzellkulturen. In diesem Protokoll zur Induktion neuronaler Differenzierung zu bilden direkt von iPSCs neuralen Epithel beginnt. Durch den Embryoidkörper (EB) Bildungsschritt übersprungen, die neurale Differenzierung erfolgt in einer kontrollierteren und Weise gerichtet. Dieser Ansatz begrenzt die spontane und ungerichteten Bildung anderer Keimzellschichten, wie Mesoderm und Endoderm. Durch dieses Protokoll anwenden, können Neurosphären neuronale Rosetten enthalten am Tag geerntet werden 5 für EHS-Matrix und Einbettung stationäre Suspensionskultur. Das organoiden Medium für den dritten Schritt unseres Protokolls verwendet wird mit Dorsomorphin und SB431542 ergänzt. Dorsomorphin ist ein niedermolekularer Inhibitor von knochenmorphogenes Protein (BMP) und SB431542 hemmt die TGF &amp; bgr; / Activin / Knoten Signalweg. Die Kombination dieser Faktoren könnte neuronale Differenzierung mehr fördert effizienter als Retinsäure allein 11, 12, 13, 14. Insgesamt ermöglichen diese Modifikationen die reproduzierbare Erzeugung von brain Organoide mit minimalen Variationen in Organoiden. Wichtig ist, dass diese Methode microcephalic Gehirn Organoide von Patienten zu iPSCs robust erzeugt aufgebracht, die Mutationen in Genen tragen, die Zentrosomen und Zellzyklusdynamik beeinflussen. Der zweite Teil dieses Protokolls gibt Anweisungen br vorzubereitenain Organoide für die Analyse und Interpretation von zellulären Defekte in Mikrozephalie. Dazu gehören Fixierung, Kryoschneiden, Immunofluoreszenzfärbung und konfokale mikroskopische Analyse. Dieses Protokoll wird dem Leser eine detaillierte Beschreibung der erwarteten Ergebnisse liefern und mit Anleitung zur Interpretation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="670">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse 488</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td style="width:212px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-rabbit 647</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-21245</td>
			<td style="width:212px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Arl13b</td>
			<td style="width:123px;">proteintech</td>
			<td style="width:119px;">17711-1-AP</td>
			<td style="width:212px;">ARL13B rabbit polyclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CELLSPIN system</td>
			<td style="width:123px;">IBS Integra Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">183001</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, US</td>
			<td style="width:119px;">32670</td>
			<td style="width:212px;">4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco, US</td>
			<td style="width:119px;">31331093</td>
			<td style="width:212px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dorsomorphin</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, US</td>
			<td style="width:119px;">P5499</td>
			<td style="width:212px;">Compound C; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Embedding medium</td>
			<td style="width:123px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A9011, 0100</td>
			<td style="width:212px;">Mowiol; embedding medium; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354277</td>
			<td style="width:212px;">Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Fish gelatin&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, US</td>
			<td style="width:119px;">G7765-250ML</td>
			<td style="width:212px;">Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1067,1000</td>
			<td style="width:212px;">Glycine for molecular biology; multiple suppliers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inoculation loop with needle, disposable (1 &#181;l)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich, US</td>
			<td style="width:119px;">BR452201-1000EA</td>
			<td style="width:212px;">multiple suppliers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, US</td>
			<td style="width:119px;">I3536-100MG</td>
			<td style="width:212px;">multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco, US</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td style="width:212px;">L-glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium A</td>
			<td style="width:123px;">Stem cell technologies</td>
			<td style="width:119px;">#05850</td>
			<td style="width:212px;">mTeSR1 (hiPSC medium)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium B</td>
			<td style="width:123px;">Stem cell technologies</td>
			<td style="width:119px;">#05835</td>
			<td style="width:212px;">Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Medium C</td>
			<td style="width:123px;">Gibco, US</td>
			<td style="width:119px;">21103049</td>
			<td style="width:212px;">Neural Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:123px;">Gibco, US</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td style="width:212px;">MEM non-essential amino acids solution (100x)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td style="width:123px;">Lonza, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">#LT07-218</td>
			<td style="width:212px;">Mycoplasma detection kit; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nestin</td>
			<td style="width:123px;">Novus biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NBP1-92717</td>
			<td style="width:212px;">Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:123px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3813, 0500</td>
			<td style="width:212px;">4% in PBS, store solution at -20&#176;C; caution: wear skin and eye protection and work under hood&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:123px;">Gibco, US</td>
			<td style="width:119px;">18912014</td>
			<td style="width:212px;">See manufacturer&#180;s instructions; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco, US</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td style="width:212px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Poly-L-lysine solution (PLL)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, US</td>
			<td style="width:119px;">P8920-100ML</td>
			<td style="width:212px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pVim</td>
			<td style="width:123px;">MBL</td>
			<td style="width:119px;">D076-3S</td>
			<td style="width:212px;">Phospho-Vimentin (Ser55) mAb</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Reagent A&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Stem cell technologies</td>
			<td style="width:119px;"># 05872</td>
			<td style="width:212px;">Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer&#180;s protocol; alternative products from muliple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Reagent B&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, US</td>
			<td style="width:119px;">A6964-100ML</td>
			<td style="width:212px;">Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 &#34;enzymatic cell dissociation solution&#8221;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Research Cryostat Leica CM3050 S</td>
			<td style="width:123px;">Leica biosystems</td>
			<td style="width:119px;">CM3050 S</td>
			<td style="width:212px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SB431542</td>
			<td style="width:123px;">Selleckchem.com</td>
			<td style="width:119px;">S1067</td>
			<td style="width:212px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spinner flask 250 ml</td>
			<td style="width:123px;">IBS Integra Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">182026</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:123px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A4734, 1000</td>
			<td style="width:212px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost ultra plus microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo scientific, US</td>
			<td style="width:119px;">J3800AMNZ</td>
			<td style="width:212px;">Slides should be labeled with a &#34;+&#34; and positively charged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Supplement 1</td>
			<td style="width:123px;">Gibco, US</td>
			<td style="width:119px;">17502048</td>
			<td style="width:212px;">N-2 supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Supplement 2 w/o Vitamin A</td>
			<td style="width:123px;">Gibco, US</td>
			<td style="width:119px;">12587010</td>
			<td style="width:212px;">B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td style="width:123px;">Sakura, NL</td>
			<td style="width:119px;">4565</td>
			<td style="width:212px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:123px;">Sakura, NL</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td style="width:212px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1388,0500</td>
			<td style="width:212px;">Multiple suppliers multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TUJ1</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich, US</td>
			<td style="width:119px;">T2200</td>
			<td style="width:212px;">&#946;-Tubulin III (rabbit polyclonal)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TUNEL assay</td>
			<td style="width:123px;">Promega, US</td>
			<td style="width:119px;">G3250</td>
			<td style="width:212px;">DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20 for molecular biology</td>
			<td style="width:123px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A4974,0500</td>
			<td style="width:212px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">waterproof sheet</td>
			<td style="width:123px;">BEMIS company, inc.</td>
			<td style="width:119px;">PM996</td>
			<td style="width:212px;">Parafilm &#8220;M&#8221;; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Y-27632&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Selleckchem.com</td>
			<td style="width:119px;">S1049</td>
			<td style="width:212px;">ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:123px;">Gibco, US</td>
			<td style="width:119px;">31350010</td>
			<td style="width:212px;">2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of ipsc-derived human brain organoids to model early neurodevelopmental disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Die Erzeugung von brain Organoide erfordert mindestens drei Wochen ununterbrochener Kultivierung (1A). Um reproduzierbare Ergebnisse zu erreichen, empfehlen wir, dass die Forscher jeden Schritt dokumentiert und, was wichtig ist, vermeidet jegliche Änderungen in Bezug auf Medienkomponenten, Zeitpunkte und die Handhabung von Zellen. Hier geben wir einen Überblick darüber, wie zu beurteilen, ob kritische Meilensteine ​​erreicht, um sich Organoide von ausreichender Qualität am Ende des Experiments zu erhalten. Die Bildung von Neurosphären in einer 96-Well - Platte soll von Tag deutlich sichtbar sein 4. Neurosphären können als gut definierten Bereichen auf dem Boden jeder Vertiefung (1B, Schritt 1) erkannt werden. Am Tag 5 sollte neurospheres ~ 500 &amp; mgr; m im Durchmesser sein und eine glatte Oberfläche, mit einem hellen Rande weist eine dunkele Mitte umgibt. Es könnte möglich sein, bereits neuronale rosettenartigen erweitert stru zu beobachtenctures innerhalb dieser hellen Rand (1C, von Schritt 2 beginnen). Wenn die Neurosphären auseinander fallen oder erscheinen eher wie Zellaggregate, die Differenzierung soll nicht weiter fortgesetzt werden. Schließlich Organoide sollten eine ähnliche Größe während des Differenzierungsprozesses in Spinnerflaschen (1D, Schritt 3) erhöhen und zeigen. Siehe die Tabelle zur Fehlerbehebung (Tabelle 1) für weitere Informationen. Die Qualität der Kindertages 14 Organoide sollte durch Lichtmikroskopie überprüft werden. VZs besteht aus dicken Schichten aus Nestin-positiver NSC / radial Gliazellen mit einer Palisade Kernform an der apikalen Seite. Auf der anderen Seite werden die primitiven Kortikalis reichlich TuJ1-positiven Neuronen auf der basalen Seite enthalten, räumlich getrennt von der apikalen Seite (Figur 1E). Wichtig ist, TuJ1-positive Neurone werden sollten nicht an der apikalen Seite der VZ gesehen. <p class="jove_content" fo:keep-together.wiDünn page = &quot;1&quot;&gt; Um die Teilungsebene der apikalen radialer Gliazellen (args) zu analysieren, empfehlen wir die Verwendung von phospho-Vimentin (p-VIM) und Arl13b Färbung. Arl13b bezeichnet die primären Zilien der innersten args das Lumen der VZ auskleiden. Somit dient die Arl13b-positive ciliated Region als Orientierungshilfe zu lokalisieren und die Teilungsebene der p-Vim-positiven args in Anaphase zu analysieren. Typischerweise werden die VZ eines 14 Tage alten Steuer organoiden zeigen eine signifikante Anzahl von ARG, deren Teilungsebenen horizontal ausgerichtet. Ein horizontal ausgerichtetes Teilungsebene ist von wesentlicher Bedeutung für die frühe Expansion der symmetrischen args (1F und G) 23,24. Wenn ausreichend ARG Expansion erreicht ist, beginnt die Neurogenese, ändern sich die teilender Zellen , ihre Ausrichtung auf das Lumen und die Teilungsebene schaltet von horizontalen (symmetrisch) zur Vertikalen (asymmetrisch) 4, 12, 24. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55372/55372fig1.jpg" /> Abbildung 1: Erzeugung von Gehirn Organoide von Human iPS - Zellen. (A) Arbeitsablauf des Differenzier Protokolls. Schritt 1: Starten der Differenzierung. Während dieser Phase tritt die Bildung von Neurosphären aus menschlichem iPSCs in einer 96-Well-Platte. Die Zeitdauer beträgt 5 Tage. Schritt 2: Einbetten der Neurosphären in EHS Matrixtröpfchen. Ein stationärer Suspensionskultur von EHS-Matrix eingebettet Neurosphären hat eine Zeitdauer von 4 Tagen. Schritt 3: Organoide in Spinnerflaschen. Die Übertragung von EHS-Matrix eingebettet Neurosphären flasks Spinner erfolgt. Die Zeitdauer beträgt 14 Tage. (B) ein Neurosphäre in einer Multi-Well - Platte. Repräsentative Bild eines Neurosphere am Tag 4 in einer 96-Well-Platte in Schritt 1 dargestellt. Die Kugel sollte mit einer glatten, runden Oberfläche (rot arro auf dem Boden des Schachtes, deutlich sichtbar seinw). (C) Morphology of Neurosphären vor der EHS - Matrix Einbettung. Neurospheres am Tag gesammelt 5 von Schritt 1 sollte groß und weisen eine glatte Oberfläche mit einem hellen Rand (Halterung und Pfeil) gleichmäßig sein. (D) Organoide in Spinnerflaschen. Ein Rührkolben mit Gehirn Organoide während Schritt 3 (rote Pfeile) wird hier gezeigt. (E) Immunfluoreszenz - Bildgebung von gefriergeschnitten Organoide einen typischen VZ und primitive kortikale Platte anzeigt. Die linke Tafel zeigt die Kernfärbung von Zellen an der VZ. Die VZ erstreckt sich von der apikalen Seite (Lumen L) zu der basalen Seite (gelbe Linie). Man beachte, dass Zellen innerhalb der Anzeige VZ Palisade artigen Kerne, was darauf hindeutet, dass sie Gliazellen radial sind. Die rechte Tafel zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von Nestin-positiver NSC (grün) innerhalb der VZ und TuJ1-positiver Neuronen (magenta) in der primitiven Kortikalis. Maßstabsbalken = 50 um. (F) Immunfluoreszenz - Bildgebung von Organoiden gefriergeschnitten. zwei Beispielevon VZs gefärbt mit p-Vim und Arl13b (I und III). Die durch weiße Quadrate markiert sind rechts für jede Bildeinfügung (ii und iv) vergrößert. Die Teilungsebene der Anaphase apikalen radialen Gliazellen (args). Dividieren apikalen radiale Gliazellen an der apikalen Seite der VZ sind p-Vim-positive (magenta). Beispiele für symmetrisch Dividieren args gezeigt sind (weiße Quadrate und -einsätze). Die Teilungsebene ist als eine weiße Linie angegeben. Die Teilungsebene eines der Anaphase Zelle ist horizontal an die Lumenoberfläche Linie (gelb gepunktete Linie) und wird durch Arl13b Färbung (grün) markiert. Maßstabsbalken = 50 um. (G) stellt diese schematisch die vertikale oder horizontale Ausrichtung des ARG in der Anaphase relativ zu dem Lumen. Die sich teilende Zellen von Kontroll Organoide am Tag 14 werden überwiegend horizontal ausgerichtet (0-30 °) relativ zu der Lumenoberfläche des VZ. Die apikalen Seite des Lumens durch die primären Zilien von args ausgekleidet, die die Lumenfläche der VZ (grüne Linie) angeben. Im Gegensatz dazu most die radialen Gliazellen Mikrocephalie Organoide zeigt eine vertikal ausgerichtete (60-90 °) Teilungsebene. Die weiße Linie zeigt die Achse der Teilungsebene. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55372/55372fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55372/55372fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Problem: </td><td> Mögliche Gründe: </td><td> Vorschläge: </td></tr><tr><td> Schritt 1.1.1.2 </td><td rowspan="2"> Schlechte Effizienz der Reprogrammierung </td><td rowspan="2"> Prüfen hiPSCs für Pluripotenz Marker: Wenn Qualität niedrig ist, manuell undifferenzierte Kolonien holen für einige Passagen pluripotente Kolonien zu bereichern </td></tr><tr><td> Menschliche iPS-Zellen differenzieren vor Beginn der Differenzierung </td></tr><tr><td></td><td> Stress aufgrund der frühen Passagierung oder passaging als einzelne Zellen </td><td> Nicht Passage vor Konfluenz von 80% erreicht ist. Passage als Aggregate, nicht einzelne Zellen </td></tr><tr><td></td><td> Kontamination mit Mykoplasmen </td><td> Test für Mykoplasmen-Kontaminationen </td></tr><tr><td> Schritt 2 </td><td> Schlechte Qualität des hiPSCs </td><td> Verbesserung der Qualität von hiPSCs (siehe oben) </td></tr><tr><td> Neurosphären überhaupt nicht oder nicht auseinander fallen am Tag 5 nach dem Beginn der Differenzierung bilden </td><td> Ab Anzahl der Zellen pro Vertiefung ist zu niedrig oder zu hoch </td><td> zählen genau die Anzahl der Zellen und verteilen sie gleichmäßig in jede Vertiefung </td></tr><tr><td></td><td> hiPSC Medium wurde anstelle von neuronalen Differenzierungsmedium verwendet, </td><td> Verwenden neuronaler Differenzierungsmedium </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> Zentrifugationsschritt war zu hart oder zu mild </td><td rowspan="2"> Spin 96-Well-Platte 500 × g für 3 min und prüfen, ob Zellen an dem zentral angesammeltBoden jeder Vertiefung </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td></td><td> Nein Y-27632 bei Beginn der Differenzierung </td><td> Verwenden Y-27632, um das Überleben der Zelle zu verbessern </td></tr><tr><td></td><td> Die Zellen hafteten und wuchsen an der Unterseite der Platte </td><td> Stellen Sie sicher, dass eine nicht-haftende 96-Well-V-Bodenplatte verwendet wird. </td></tr><tr><td> Schritt 2 </td><td> Kein täglicher Medienwechsel </td><td> Ändern halbe Menge des Mediums täglich </td></tr><tr><td> Neurosphären sind nicht homogen in der Größe </td><td rowspan="2"> Ab Anzahl der Zellen pro Vertiefung nicht gleich war </td><td rowspan="2"> Mischen Sie den Schlauch mit Einzelzellsuspension vor jeder Entnahme von 100 ul Zellsuspension </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td></td><td> Mediumwechsel wurde nicht für jeden gut täglich durchgeführt </td><td> Stellen Sie sicher, erhält jeder gut tägliche Medienwechsel </td></tr><tr><td> Schritt 2 </td><td> hiPSC wurden nicht int distanzierteo einzelne Zellen vor Beginn der Differenzierung </td><td> Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, wenn hiPSC auf einzelne Zellen nach Accutase Behandlung dissoziiert sind. Wenn es noch werden aggregiert, Pipettenzellen 10 mal auf und ab mit 100 ul Mikropipette und erneut prüfen oder wiederholen Accutase Behandlung </td></tr><tr><td> Neurospheres keinen hellen Rand oder runde Oberfläche anzuzeigen; sie bilden große Zysten an der Oberfläche </td><td> Ab Anzahl der Zellen pro Vertiefung zu hoch war </td><td> zählen genau die Anzahl der Zellen und verteilen sie gleichmäßig in jede Vertiefung </td></tr><tr><td></td><td> Mediumwechsel wurde für jede Vertiefung nicht täglich gemacht </td><td> Ändern Sie die Hälfte Medium täglich </td></tr><tr><td> Schritt 2.7 </td><td> Schlechte Qualität des hiPSCs </td><td> Verbesserung der Qualität von hiPSCs (siehe oben) </td></tr><tr><td rowspan="3"> EHS-Matrix eingebettet Neurosphären haften und verklumpen </td><td> Nicht genügend Medium (Volumen) </td><td> Zur Verfügung stellenMinimum von 10 ml Medium in einem 100 mm Petrischalen </td></tr><tr><td rowspan="2"> Regal des Inkubators nicht einmal </td><td> Legen Schüssel auf einer ebenen Fläche </td></tr><tr><td> Nachdem in Inkubator platziert, bewegen sich die Schale, so dass Neurosphären gleichmäßig verteilt sind </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Fehlerbehebung Tabelle.

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Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.6K Aufrufe.  University of Cologne. Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described. 

Serie: Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

Zika-Virus-Infektion der kultivierten menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen für Immunocytochemical Analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...