Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation [Grants 1721/12, 1368/12 und 1444/16] (AP). AP ist mit Brettler Center und David R. Bloom Center, School of Pharmacy, The Hebrew University of Jerusalem angeschlossen.

1. Ligieren des Gens von Interesse in die Reprimierbare Site of Vector <ol><li> Erhalten Sie induzierbaren Vektors wie pcDNA5 / FRT / TO oder pcDNA4 / TO. </li><li> Analyse das Gen von Interesse für alle potentiell anfällig Restriktionsstellen in der Mitte des Gens, der auch in der multiplen Klonierungsstelle des ausgewählten Vektor 4 durch in silico DNA - Analyse - Software gezeigt werden. </li><li> Unter Verwendung von Standard Überlappungs - PCR - Techniken 4, flankieren das Gen von Interesse mit zwei ausgewählten Restriktionsenzym - Erkennungsstellen (die in dem Gen von Interesse zu finden sind), die erste vor dem Startcodon eingeführt ist , und das zweite nach dem Stopp - Codon. </li><li> Digest sowohl den Vektor und Insert mit Restriktionsenzymen (ausgewählt in Schritt 1.2) bei Arbeitstemperatur &quot;Enzyme für eine Stunde, gefolgt von der Zugabe einer Einheit Kalbsdarm-Phosphatase (CIP), um den Vektor Reaktion nur 30 Minuten, um sich selbst zu vermeiden, Ligation. </li><li>Laden die verdaute DNA auf ein 1% iges Agarosegel und trennen die abgespaltenen Segmente durch Elektrophorese 9. </li><li> Mit UV-Licht, Schnitt mit einem Messer die Stücke des Gels die gewünschten Segmente des Vektors enthält, und fügen Sie ligiert werden. </li><li> Extrahieren, um die DNA-Segmente aus dem Agarosegel Stücke (kommerziell erhältliche DNA-Extraktion Kits) und messen ihre Endkonzentration von Spektrophotometer bei 260 nm. </li><li> Ligieren des Gens von Interesse in den ausgewählten induzierbaren Vektors bei Raumtemperatur für 20 Minuten unter Verwendung von T4-Ligase-Enzym. Um die Wahrscheinlichkeit des Einsatzes Ligieren mit dem Vektor zu erhöhen, verwenden Sie einen 3: 1-Molverhältnis des Einsatzes: Vektor. Zur Kontrolle bereiten eine Ligatur Reaktion, die nur den Vektor umfasst. </li><li> Bei bakteriellen Transformation, mit 10 ng Vektor allein und Vektor + Gen in 50 &amp; mgr; l kompetente E. coli. Inkubieren der Röhrchen auf Eis für 30 Minuten, gefolgt von 45 Sekunden Inkubation bei 42 ° C. Ab sofort setzen zurückauf Eis für zwei Minuten und die transformierten Bakterien auf 500 &amp; mgr; l LB-Medium übertragen. bei 220 rpm bei 37 ° C unter Rühren eine Stunde lang inkubieren. </li><li> Zur Selektion erfolgreich transformierter Bakterien, Platte 100 ul jeder Reaktion auf einem vorbereiteten LB Agarplatte (wie in 1.9 beschrieben) , um das geeignete Antibiotikum (beispielsweise 100 &amp; mgr; g / ml Ampicillin bei Verwendung pcDNA4 / TR). </li><li> Erlauben über Nacht bei 37 ° C wachsen. Platten können sie in Kunststoffparaffinfilm durch dicht für bis zu zwei Wochen bei 4 ° C gelagert werden Umhüllen. </li><li> Heben einzelne Kolonien eine 10 ul Spitze verwenden, und ermöglichen über Nacht in 3 ml LB + Antibiotika-Medium bei 37 ° C unter Rühren bei 220 Upm wachsen. Bakterien, die mit DNA von Interesse eingefroren werden können (-20 ° C) für die kurzfristige Lagerung durch den LB und Bakterien bei 11.000 xg zentrifugiert und der Überstand abgesaugt werden. Langzeitlagerung erfordert bei -80 ° C die Bakterien als Glycerinstamm einfriert. </li><li> Extrakt DNA through mini-prep und die Endkonzentration von Spektrophotometer bei 260 nm 5 messen. </li><li> Bestätigen des erfolgreichen Einsetzen des Gens von Interesse durch Sequenzierung des gereinigten Konstrukt 4. Alternativ diagnostischer Verdau des Konstrukts durch Restriktionsenzyme Elektrophorese der Schnittsegmente und bewerten ihre Präsenz und Länge können auch zu diesem Zweck verwendet werden , 4 zu trennen , verwenden. </li></ol> 2. Anzucht Zelllinien TetR Ausdruck <ol><li> Besorgen Sie sich eine Zellkulturlinie ein Tet-Repressor-Plasmid in ihre genomische DNA eingebaut beherbergen. Hierin wird das Protokoll unter Verwendung von humanen embryonalen Nierenzellen 293T (HEK-293T) beherberge pcDNA6 / TR Plasmid als Beispiel geschrieben werden. </li><li> Seed Zellen in 100 mm Gewebekulturplatte mit Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), ergänzt mit 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 25 mM HEPES, pH 7,3 (hierin: Voll DMEM) und inkubiere O / N bei 37 &amp;# 176; C und 5% CO 2. Alle Arbeiten mit Zellen sollten in einer biologischen Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. </li><li> Um die Expression von Tet-Repressor-Gen absaugen Medium und ersetzen Sie es mit Voll DMEM, ergänzt mit 5 ug / ml Blasticidin zu halten. Inkubiere Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Sobald Zellen 80 erreichen - 90% Konfluenz, aspirieren das Medium und die Zellen vorsichtig zweimal mit DPBS waschen (ohne Calcium und Magnesium) erwärmt auf 37 ° C. </li><li> Um ohne dass eine mechanische Beschädigung die Zellen vorsichtig heben, brüten die Kultur in DMEM mit Trypsin 0,05% erwärmt auf 37 ° C für 1,5 min. </li><li> Blockieren Sie die Trypsin Aktion mit einem gleichen Volumen von Voll DMEM. Pipette vorsichtig nach oben und unten, um die Zellen zu heben und sie in ein steriles Röhrchen übertragen. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 200 xg für 5 min. </li><li> Den Überstand aspirieren und ersetzen Sie es mit 1 ml Voll DMEM. Pipette, um die Lösung mit den Zellen auf und ab, bis keinZellklumpen zu sehen. Zählen und Berechnen der Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. </li><li> Samen von 1 bis 2 x 10 6 Zellen in 100 mm Gewebekulturschale mit 12 ml Voll DMEM mit 5 ug / ml Blasticidin. Teilen Sie die Zellen zweimal in der Woche, da sie 90% Konfluenz erreichen. </li></ol> 3. Transfektion der Plasmid von Interesse in Zellen <ol><li> Unter Verwendung des gleichen Verfahrens von Teilen von Zellen , wie oben beschrieben, Übertragungszellen in die Vertiefungen in einer 12-Well - Platte , hergestellt mit 0,9 ml Voll DMEM, ausreichend 50% konfluent zu machen (~ 200.000 Zellen) und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einem CO 2 Inkubator. </li><li> Bereiten Sie eine Transfektionsgemischs mit pcDNA4 / an das Gen von Interesse enthält, ein inertes Plasmid, das die Gesamt-DNA-Menge auf 1 &amp; mgr; g zu bringen (falls nötig), 3 ul Lipid Transfektionsreagenz und DMEM auf das endgültige Volumen von 100 &amp; mgr; l zu machen. Die optimale Menge an Plasmid-DNA verwendet werden, variiert stark, wie unterschiedliche Proteine ​​in unterschiedlichen Effizienz exprimieren. Für electphysiologische Experimente, umfassen EGFP in Säugetier - Expressions Plasmid in der Cocktail - Transfektion , um Zellen sichtbar zu machen , die erfolgreich Transfektion 4 unterziehen. </li><li> Inkubiere das Transfektionsgemisch bei RT für 30 min. </li><li> Transfektion von Zellen durch Pipettieren der Transfektionsgemisch tropfenweise auf den plattierten Zellen in 12-Well-Platte und Rock die Platte kräftig eine homogene Dispersion von DNA und Transfektionsreagenz zu gewährleisten. Zellen sollten zum Zeitpunkt der Transfektion ~ 80% konfluent sein. </li><li> Inkubieren der transfizierten Zellen O / N bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Bestätigen Sie, dass die Zellen durch die Beobachtung des Fluoreszenzsignals von EGFP unter UV-Lampe am nächsten Morgen erfolgreich transfiziert wurden, wenn die Elektrodurchführen. </li></ol> 4. Überzug Zellen auf Poly-D-Lysine (PDL) Deckgläser / Wells <ol><li> Sterilisieren 12 mm Deckgläser durch mit 70% Isopropyl Ethanollösung Begießen. Trockene und legen Sie eine einzelne coverslip in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte für elektrophysiologische Aufzeichnung. </li><li> Pipette eine Lösung von 0.1 - 0.2 mg / ml PDL-Lösung auf jedes Deckglas oder auch eines Kalzium-Imaging-Kammer. </li><li> Man lässt 30 min bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator zu sitzen. </li><li> Waschen Sie mit Zellkultur doppelt destilliertem Wasser (DDW) dreimal, zwischen jedem Wasch Absaugen. Nach dem letzten Waschen gründlich trocknen und lassen bei RT zu sitzen. </li><li> Für die Elektro füllen jede Vertiefung mit einem PDL beschichtet Deckglas mit 500 &amp; mgr; l Voll DMEM auf 37 ° C erwärmt. </li><li> Führen Sie die gleiche Methode, um die transfizierten Zellen spalten, wie oben beschrieben. Nach Resuspendieren der Zellen nach der Trypsin-Behandlung und Blockierung, die Übertragung 80 &amp; mgr; l Zellen (oder ca. 30.000 Zellen) zu der Mitte jedes PDL beschichteten Deckglas für die Elektro Aufnahme. Lassen Sie Zellen für mindestens 1,5 Stunden absetzen oder über Nacht in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C inkubiert. </li><li> Für Calcium Imaging Transfer und Stelle 20 &amp; mgr; l Zellen (etwa 20.000 Zellen) in die Mitte jedes Kalzium PDL beschichtet Bildgebung gut. Lassen Sie Zellen für mindestens 30 Minuten absetzen und fügen 180 ul Voll DMEM in jede Vertiefung. </li></ol> 5. Induzierende Genexpression <ol><li> Bereiten Sie eine Doxycyclin Stammlösung von 1 mg / ml in DDW gemäß den Anweisungen des Herstellers. Halten Sie Stammlösung vor Licht geschützt bei 4 ° C für bis zu 3 Wochen. Für die langfristige Lagerung halten Doxycyclin Stammlösung bei -20 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine frische 2 ug / ml (Elektrophysiologie) oder 3 ug / ml (Kalzium-Imaging) Doxycyclin-Lösung in Full DMEM und warm es auf 37 ° C. </li><li> Für elektrophysiologischen Ableitungen, Pipette 500 ul von 2 pg / ml Doxycyclin-Lösung in jede Vertiefung eine endgültige Konzentration von 1 ug / ml Doxycyclin zu machen. Für Calcium Imaging, 100 &amp; mgr; l von 3 ug / ml Doxycyclin-Lösung in jede Vertiefung eine endgültige Konzen zu machention von 1 &amp; mgr; g / ml Doxycyclin. Schreiben Sie die Stunde der Induktion nach unten. </li><li> Inkubieren Sie für die gewünschte Zeitdauer für die Induktion bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 6. Kalibrieren Chronologie der Proteinexpression <ol><li> Kalibrieren Proteinexpression durch Calcium Imaging 5, 10 <ol><li> Bereiten Ringerlösung (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 20 mM HEPES, pH eingestellt auf 7,4 mit NaOH) und erwärmen auf 37 ° C. </li><li> Bereiten Konzentrationen von Kanal-Agonisten in Ringer-Lösung zu sättigen. Da die Menge des Agonisten verdünnt wird, wenn sie den Calcium-Bildgebungskammern mit den Zellen und der extrazellulären Lösung, die doppelte Menge der gewünschten Endkonzentration des Agonisten zugegeben. Dies macht auch die Menge an Badlösung in jeder Vertiefung kritisch zu steuern. </li><li> Eine Lösung aus nichtionischen F-127 20% W / V in DMSO. Die Lösung wird auf 40 ° C bis nichtionogene F-127 gelöst ist. Bewahren Sie die nicht-ionischen F-127-Lösung bei RT und erwärmen auf 40 ° C vor dem Gebrauch. Nichtionogene F-127 wird verwendet dispergieren acetoxymethyl (AM) Ester von fluoreszierenden Ionenindikatoren wie Fura-2 in wässrigen Lösungen zu helfen. </li><li> Absaugen Medium und ersetzen Sie es mit Fura-02.00 Ladelösung (Ringer-Lösung, ergänzt mit 2 - 3 uM Fura-02.00, 0,02 mg / ml nicht-ionisches F-127 und 10 mM D-Glucose). </li><li> Inkubieren für 60 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Absaugen Fura-02.00 Lösung und waschen Sie die Zellen mit Ringer + 10 mM D-Glucose-Lösung extrazelluläre Farbstoff zu entfernen. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Lassen Sie 200 ul Ringer + 10 mM D-Glucose-Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Legen Kammer auf der Bühne über dem Mikroskop Nasenstück und befestigen Sie es mit Halter. </li><li> Schalten Sie die Lampe, Kamera und Mikroskop und wählen Sie Fura-2-Filter-Emission bei 510 nm wav zu erkennenelength. </li><li> Stellen Sie für die gewünschte Vergrößerung und Fokussierung Zellen im ausgewählten Bereich. </li><li> Im Dunkeln, Hintergrundlicht subtrahieren und Belichtungszeit einstellen. </li><li> Festlegen der Bild Sampling mit der gewünschten Geschwindigkeit und Rekordfluoreszenzantwort von Fura-2 beladenen Zellen durch Anregen sie bei 340 und 380 nm Wellenlänge. Das Verhältnis von 340/380 Signale ist ein Indikator für die intrazelluläre Ca 2+ -Konzentration und damit auch für TRPV1 Aktivität. </li><li> In 2 uM Capsaicin in 200 &amp; mgr; l Ringer-Lösung durch Pipettieren eine endgültige sättigenden Konzentration von 1 &amp; mgr; M Capsaicin zu schaffen, um die Expression von TRPV1 zu bewerten. </li><li> Analysieren TRPV1 Reaktion gemäß Induktionszeit und bestimmen Protokoll für das Protein von Interesse. </li></ol></li><li> Einstellen Protein Expression in heterologen Systemen die gesamte Zellkonfiguration der Patch - Clamp - Technik unter Verwendung von 4, 11. <ol><li> bereiten ter Badlösung aus (mM) 140 NaCl, 2,3 KCl, 2 MgSO 4, 5 HEPES und 5 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES), eingestellt auf pH 7,4 mit NaOH. </li><li> Bereiten Konzentrationen von Kanal-Agonisten in der extrazellulären Lösung zu sättigen. </li><li> Ziehen Glaselektroden mit einem Innendurchmesser (ID) von 1,10 mm und Feuerpolitur auf einen Widerstand von 2 bis 4 MOhm. </li><li> Bereiten einer Pipettenlösung (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2 MgSO 4, 0,5 CaCl 2, 1 EGTA und 10 HEPES , eingestellt auf pH 7,2 mit KOH. Filtern Sie die Pipettenlösung vor der Verwendung. Vor jedem Versuch, eine einzelne, feuerpolierte Glaspipette durch Eintauchen der Spitze in der Pipettenlösung für mindestens eine Minute lang gefüllt ist zurück, und dann geschmolzen und gedehnt Spitze mit einer Spritze mit der gleichen Pipettenlösung gefüllt werden. </li><li> Heben Sie vorsichtig mit einem einzigen PDL beschichtet Deck mit den plattierten Zellen aus dem Bohrloch zu einer 35 mm Petrischale aus Kunststoff mit etwa 2 ml Badlösung bei RT gefüllt. Beachten Sie unter epi-Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Suchen Sie ein EGFP positive Zelle, wie mit dem epifluoreszenten Mikroskop sichtbar gemacht, auf dem vorbereiteten Deckglas und dem Zentrum der visualisierten Bereich bewegen. </li><li> Bringen Sie die gefüllte Pipette auf die Pipettenhalter des Mikromanipulators und Injizieren einer kleinen Menge von Überdruck in das System Kontamination der intrazellulären Pipettenlösung zu vermeiden. Senken sie knapp über dem GFP - positive Zelle, für die richtige Widerstand zu prüfen. </li><li> Da die Pipette in die Zelle berührt, eine kleine Menge von Unterdruck, um eine GOhm Dichtung zwischen der Glaspipette und Zellmembran zu schaffen anzuwenden. </li><li> Mit einer kurzen, scharfen Impuls der Saug-, brechen die Zellmembran, so dass die Pipette in Kontakt mit den intrazellulären Inhalt der Zelle zu kommen. </li><li> Schalten Sie den Verstärker-Modus ganze Zelle, und senken Sie die Bessel-Filter und Ausgangsverstärkung auf 1 - 5 kHz und 0.5α sind. </li><li> Notieren Sie sich die aktuelle Antwort auf die sättigendenKonzentrationen von Kanal-Agonisten durch Spannungsrampen oder spaltfreie Protokoll. </li><li> Da die Expression Effizienz zwischen verschiedenen Proteinen verändern, wiederholen Sie die Aufnahmen unterschiedliche Induktions Länge Zeiten. </li></ol></li><li> Die Bestimmung ideale Induktionszeit für einzelne Kanalaufnahmen 4. <ol><li> Eine Lösung aus (mM) 150 Na-Gluconat, 15 NaCl, 5 EGTA, und 10 HEPES, eingestellt auf pH 7,4 mit NaOH, als Pipettenlösung. Für die Bad-Lösung, verwenden Sie die Lösung aus Schritt 6.2.1. </li><li> Wiederholen ganze Zelle Verfahren unter Verwendung von ID 0,86 mm Glaspipetten feuerpoliert auf einen Widerstand von 10 bis 12 M &amp; Omega; und legen Potential halten mV bis -40. </li><li> Erstellen Sie eine Dichtung auf der Membran wie zuvor beschrieben, und die Membran bersten. </li><li> Mit dem Mikromanipulator, heben Sie die Pipette mit der Membranfleck weg von der Zelle. </li><li> Positionieren Sie das Perfusionssystem direkt neben der Pipette mit dem Membran-Patch. </li><li> Lower tBessel er Filter und Ausgangsverstärkung auf 2 - 5 kHz und 10α sind. </li><li> Perfundieren Konzentrationen von Agonisten auf die Membranscheibe sättigt, Auswerten, ob der Patch einen oder mehrere Kanäle enthält gemäß der Antwort. </li><li> Analysieren Sie die Anzahl der Einzelkanal-Patches erfolgreich gegen die Induktionszeit auf Zellen angewendet aufgezeichnet. Stellen Sie die Induktionszeit entsprechend den gewünschten Ergebnissen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Transient+Expression+of+Membrane+Proteins+in+HEK-293+Cells+for+Functional+Characterization.">A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization.</a> Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li><li>Xu, X., Nagarajan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+sequence+of+the+Chinese+hamster+ovary+(CHO)-K1+cell+line.">The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).</li><li>Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pain+receptor+TRPV1+displays+agonist-dependent+activation+stoichiometry.">The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry.</a> Scientific reports. 5, 12278 (2015).</li><li>Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Residue+in+the+TRPV1+Vanilloid+Binding+Pocket+Regulates+Deactivation+Kinetics.">Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+induces+different+intracellular+calcium+signaling+in+CHO+K1+versus+HEK+293+cells.">Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells.</a> Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).</li><li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines.">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+tarantula+toxin+activates+the+capsaicin+receptor,+TRPV1,+by+targeting+the+outer+pore+domain.">A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain.</a> Cell. 141 (5), 834-845 (2010).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflu&#776;gers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+tetracycline-responsive+recombinant+protein+production+and+effect+on+cell+growth+and+ER+stress+in+mammalian+cells.">Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).</li><li>Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+potassium+channels.">High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels.</a> J Vis Exp. (71), e4209 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Transfection ist ein weit verbreitetes Protokoll für die Proteinexpression und Forschung, mit vielen verschiedenen Variationen Ausdruck Konsistenz und Stabilität zu verbessern. Transient Transfektionsreagentien bieten eine einfache, leicht zu verwendende Protokoll, wo die Zelle und Protein von Interesse innerhalb weniger Stunden analysiert werden können, um über Nacht aus der Zeit der Transfektion. Leider kann dieser Ansatz unberechenbar sein , wenn die Art der Analyse 2 ein einheitliches Niveau der Proteinexpression, wie einzelne Kanal - Aufnahmen in der Elektro erfordert. Alternativ stabilen Zelllinien unter dem Tetracyclin reprimierbare Expressionssystem entwickelt worden , eine Möglichkeit zu bieten die Expressionsniveau des Proteins von Interesse 12 zu steuern. Dieser Ansatz gewährleistet eine konstante Expression aller Zellen in einer Kultur mit der Einführung eines Tetracyclin abstammt ergänzen, wie Doxycyclin. Während dies für eine konsistente und genaue Kontrolle der Protein-Ebene ermöglicht, ter Zeit und Mühe , die gehen in eine stabile Zelllinie zu etablieren ist es unbequem und von Nachteil , wenn eine Vielzahl von Proteinen 8 studieren. Das Protokoll hier vorgestellten bietet eine middle-of-the-Road-Lösung für die aktuellen Transfektionsprotokolle angeboten. Durch transiente eines Gens unter einem regulierbaren Promotor in Zellen Transfizieren eines Tet-Repressor besitzen, können wir kontrollierbare Expression erreichen, während langwierige und komplizierte Verfahren zu vermeiden. Hier verwendeten wir das nicht-selektiven Kationenkanal TRPV1 mit Calcium Abbildungs- und elektrophysiologischen Analyse. Wir fanden , dass die ideale Induktionszeit für die kontrollierte Expression dieses spezifische Protein zur Analyse einzelner Kanal zwischen 2 war - 3 h Inkubation mit 1 &amp; mgr; g / ml Doxycyclin (Figuren 1 - 3). Auf einer breiteren Skala kann diese Technik auch auf jedes Protein von Interesse angewendet werden. Dieses Protokoll bietet auch eine Lösung Ausdruck zu steuern, wenn ein large Reihe von verschiedenen Proteinen oder Mutationen in Proteinsequenzen sind von Interesse und für jede Variante eine stabile Zelllinie zu schaffen ist nicht praktikabel. Wichtig ist , dass, während die Ergebnisse hier die optimale Zeit und Konzentrationen anwendbar für TRPV1 - Expression darstellen, hat jedes Gen seine individuelle und spezifische Übersetzung und -handel Tempo, so dass die Kalibrierung und die Expression Zeiten jedes Protein wird erheblich 13 unterscheiden. Während diese Technik eine praktische Lösung für kontrollierte Expression bietet, ist es nicht ohne Einschränkungen. Nur handelsübliche Zelllinien das Tet-System beherbergen können mit diesem System verwendet werden, was ein Problem darstellt, wenn diese bestimmte Zelllinien für die Art der Analyse ungeeignet sind, die durchgeführt werden soll. Ein weiterer pitfall Vergleich zu stabil transfizierten Linien besteht darin, daß nicht alle Zellen durchlaufen Transfektion und somit nicht alle Zellen exprimieren das Protein von Interesse. Insgesamt bieten wir eine bequeme Möglichkeit, Protein e zu steuernxpression in einem heterologen System, das auf einer Vielzahl von biomedizinischen Forschung angewandt werden kann.

Heterolog Systeme exprimierenden ist eines der am häufigsten verwendeten Techniken 1 eine Vielzahl von Zellfunktionen zu untersuchen. Ihre geringe endogene Proteinprofil, minimale Wartungsanforderungen, zuverlässige Wachstum und die Fähigkeit zur Aufnahme und zum Ausdruck bringen Fremd - DNA haben Zelllinien wie menschliche embryonale Nieren (HEK293) und chinesischen Hamsters (CHO) hergestellt fast wesentlich für die biologische Forschung 2, 3. Forschungsbereiche mit heterologe Systeme umfassen Membranproteine, intrazelluläre Signal und enzymatische Aktivität. Nach der Transfektion von Fremd - DNA in die Zelle, kann viele verschiedene Formen der Analyse durchgeführt werden, einschließlich der Elektrophysiologie, ratiometrisch Calcium Imaging, Western Blot, etc. 4, 5. Aufgrund der Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für die heterologe Expressionssysteme, viele different Reagenzien und Produkte wurden 6 dieser Zellen und ihre Qualitäten zu verwenden , entwickelt. DNA-Abgabesysteme, die vorübergehend oder dauerhaft von Fremd-DNA in die Zellen integrieren exogene Protein zu untersuchen hat für die biologische Forschung eine der beliebtesten und nützlichsten Werkzeuge geworden. Genauer gesagt transient in einer Zelle Transfizieren DNA wird als einfache, gerade nach vorne Prozess, der erfordert relativ wenig Zeit und Materialien verwendet. Darüber hinaus ist die Erfolgsrate der Zellen , die die Transfektion unterzogen 7 hoch. Diese Technik ist sehr zuverlässig , wenn sie mit einem Markergen , wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) kombiniert wird , und kann für viele verschiedene Techniken , wie Calcium Abbildungs- und Elektrophysiologie 5 verwendet werden. Doch leider kommt mit einigen großen Gefahren DNA in Wirtszellen transient exprimieren, nicht im geringsten, dass das Expressionsniveau pro Zelle unzuverlässig ist. Die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNA u gemachtp pro Zelle ist unkontrollierbar, so der Ausdruck zwischen den einzelnen Versuchen 2 stark variieren kann. Dieses Problem wird bedeutsam, wenn entweder versuchen, physiologischen Bedingungen zu replizieren, oder präzise Techniken der Datenerhebung durchführen. Als Lösung für die erwähnt haben Komplikationen oben stabile Transfektion Protokolle entwickelt worden, bei dem ein Gen von Interesse in das Genom einer Zelle unter der strengen Kontrolle eines induzierbaren Promotors eingesetzt werden kann, wie beispielsweise einem Tetracyclin-Repressor-Expressionssystem, gewährleistet eine einzige Kopie des Plasmids integriert in das Genom von jeder Zelle und wird erst nach Induktion des Transkriptionsmechanismus, beispielsweise in Gegenwart von Doxycyclin ausgedrückt. Während dies die Hindernisse inkonsistenter Proteinexpressionsniveaus löst, verliert diese Methode, um die Bequemlichkeit der schnellen und relativ einfaches Protokoll von transienten Transfektionen. eine stabile Zelllinie zur Festlegung dauert wenigstens einige Wochen in which muss man eine Tötung Kurve gesetzt durch spezifische Antibiotika kalibrieren die Proteinexpression zu erhalten und die Integration des Vektors sicherzustellen und geschickt wählen und Zellkolonien wachsen. Insgesamt dauert dies deutlich mehr Zeit und Aufwand mit einer niedrigeren Erfolgsquote 8. Hier stellen wir ein Zwischenprotokoll, das auf den Stärken der beiden bekannten Transfektion Optionen zieht eine einfache und effektive Möglichkeit zur Verfügung zu stellen, um die Expressionsniveaus in jeder induzierbaren Zelllinie zu steuern. Während Zellen, die mit einem induzierbaren Tet-System beibehalten wird, transfizieren wir transient unsere Gen von Interesse, Transient Receptor Potential Kationenkanal-Unterfamilie V Element 1 (TRPV1), in einen Vektor ligiert, der homolog mit dem Repressor-System zu kombinieren. Auf diese Weise kann das Gen in die Zellen eingeführt werden, ohne zu exprimieren beginnen. Nur mit der Zugabe von Doxycyclin beginnt das Gen zu exprimieren, uns erlaubt, die Mengen an Protein expr zu kalibrierenITZUNG nach der Technik oder in physiologischen Bedingungen beobachtet Ebenen. Unser Protokoll vermeidet auch langwierige Komplikationen im Zusammenhang mit einer stabil exprimierenden Zelllinie zu erzeugen. Wir beginnen mit den wechselnden Ebenen der TRPV1-Aktivierung in Kalzium-Imaging von nichtinduzierten über vier Stunden Induktion zeigt und wie der Anstieg der intrazellulären Kalziumspiegel korreliert. Wir dupliziert dann das Protokoll in der gesamten Zellkonfiguration der Patch-Clamp-Technik, zeigt die zunehmende Strom mit der Zeit der Induktion erhöht wird. Schließlich präsentieren wir Beispiele für Einkanal Elektro Aufnahmen und zeigen, dass diese Technik für kontrollierte Expression besonders nützlich ist, wenn für eine genaue Datenerfassung auf Basis von einzelnen Einheiten des Proteins suchen. Durch unser Protokoll, bieten wir eine bequeme Möglichkeit, Protein-Expression in heterologen Systemen zu steuern, während lange Zellkultur Komplikationen vermieden werden, so dass ein Weg, um Bedingungen zwischen den Experimenten zu steuern und bieten mowieder reproduzierbare Ergebnisse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pcDNA&#8482;4/TO Mammalian Expression Vector</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">V102020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pcDNA&#8482;5/TO Mammalian Expression Vector</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">V103320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PureLink Quick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Swift&#8482;&#160;MaxPro Thermal Cycler</td>
			<td style="width:153px;">Esco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Restriction Enzymes</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ER0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K210012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One Shot&#174; TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">C404006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td style="width:153px;">Gold Bio</td>
			<td style="width:119px;">A-301-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone for microbiology</td>
			<td style="width:153px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6.19305E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:153px;">BD worldwide</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;SIF6000R Incubated Shaker</td>
			<td style="width:153px;">LAB COMPANION</td>
			<td style="width:119px;">45H118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:216px;"> 
			NucleoSpin&#174;plasmid</td>
			<td style="width:153px;">Macherey Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740588.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS 300V Power Supply</td>
			<td style="width:153px;">Major Science</td>
			<td style="width:119px;">MP-300V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1A Mini Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T-REx&#8482;-293 cell line</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">R710-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">DMEM (1X), liquid (high glucose)</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HindIII-HF&#174;</td>
			<td style="width:153px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApaI</td>
			<td style="width:153px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0114S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart&#174; Buffer</td>
			<td style="width:153px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pcDNA&#8482;6/TR&#160; Mammalian Expression Vector</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">V102520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-022-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51026406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MSC-Advantage&#8482; Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51025411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blasticidine S hydrochloride</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">15205-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER</td>
			<td style="width:153px;">Hausser Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TransIT&#174;-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:153px;">Mirus</td>
			<td style="width:119px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round</td>
			<td style="width:153px;">Knittel Glass</td>
			<td style="width:119px;">GG-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioCoat&#8482; Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:153px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water, Cell Culture Grade</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fura-2, AM ester</td>
			<td style="width:153px;">Biotium</td>
			<td style="width:119px;">BTM-50034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pluronic&#174; F-127</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td style="width:153px;">ibidi</td>
			<td align="right" style="width:119px;">80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(E)-Capsaicin</td>
			<td style="width:153px;">Tocris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus IX70 Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:153px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lambda DG-4 Wavelength Switcher</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera</td>
			<td style="width:153px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thin Walled Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">B150-110-7.5HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard Walled Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">B150-86-7.5HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide anhydrous</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">P1000 micropipette puller</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MF-900 Microforge</td>
			<td style="width:153px;">NARISHIGE</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ValveBank perfusion sysytem</td>
			<td style="width:153px;">AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digidata&#174; 1440A Low-noise Data Acquisition System</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axopatch 200B Amplifier</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCLAMP 10.6 Software</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">micromanipulator</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controllable ion channel expression through inducible transient transfection

Transfektion die Abgabe fremder Nukleinsäuren in eine Zelle, ist ein leistungsfähiges Werkzeug in der Proteinforschung. Durch dieses Verfahren können Ionenkanäle durch elektrophysiologische Analyse biochemische Charakterisierung, Mutationsstudien untersucht werden, und ihre Auswirkungen auf zelluläre Prozesse. Transienten Transfektionen bieten ein einfaches Protokoll, in dem das Protein für die Analyse innerhalb von wenigen Stunden bis Tagen verfügbar wird. Obwohl dieses Verfahren eine relativ einfache und zeitspar Protokoll stellt eine der kritischen Komponenten kalibriert wird, die Expression des Gens von Interesse zu physiologisch relevanten Niveaus oder Ebenen, die für die Analyse geeignet sind. viele verschiedene Ansätze zu diesem Zweck, die die Fähigkeit bieten, die Expression des Gens von Interesse zu steuern entstanden. Mehrere stabile Zelltransfektion Protokolle bieten eine Möglichkeit, um dauerhaft ein Gen von Interesse in das zelluläre Genom unter der Regulierung eines Tetracyclin-kontrollierten TRANSCRIP einführentionalen Aktivierung. Während diese Technik zuverlässig Expressionsniveaus erzeugt, erfordert jedes Gen von Interesse ein paar Wochen der Facharbeit einschließlich Kalibrierung eines Tötungskurve, die Auswahl der Zellkolonien und mehr Ressourcen insgesamt. Hier stellen wir ein Protokoll, das die transiente Transfektion des Transient Receptor Potential Kationenkanal-Unterfamilie V Element 1 (TRPV1) -Gens in einem induzierbaren System als eine effiziente Weise verwendet ein Protein, das in einer kontrollierten Weise zu exprimieren, die in Ionenkanalanalyse wesentlich ist. Wir zeigen, dass mit Hilfe dieser Technik können wir Kalzium-Imaging, ganze Zelle, und Einkanal-Analyse mit gesteuerten Kanalpegel für jede Art der Datensammlung mit einem einzigen Transfektion erforderlich sind. Insgesamt stellt dies eine replizierbare Technik, die verwendet werden können Ionenkanäle Struktur und Funktion zu untersuchen.

Um schnell eine induzierbare Expression Modell zu erstellen, haben wir den Einsatz von HEK293 - Zellen , die Tetracyclin - Repressor - Protein (TR) exprimieren (zB T-Rex-293) und Vektoren , die Tetracyclin - Operatorsequenzen (TetO) zwischen dem CMV - Promotor und die multiple Klonierungsstelle enthalten (beispielsweise pcDNA4 / TO). Wenn transfizierte in TReX-293-Zellen wird die Expression des Gens von Interesse in pcDNA4 / TO drückt, als TR an tetO bindet. Hinzufügen von Doxycyclin zu dem Medium verhindert TR-TetO Wechselwirkung, so dass die Expression des transfizierten Protein. Zur Steuerung der Expression von Ratten TRPV1 (rTRPV1) wir eingefügt erste dieses Gen des Kanals in einen pcDNA4 / TO Vektor, der die oben beschriebenen Protokoll. Als nächstes wurden die T-Rex-293-Zellen mit dem rTRPV1- pcDNA4 transfiziert / nach 3 des Protokolls in Punkt zu den Schritten, um das Plasmid. Nach der Transfektion wurde rTRPV1 Expression durch Inkubation der Zellen in Gegenwart von Doxycyclin (1 μ induzierteg / ml) für 1 - 4 h. Wichtig ist, können unterschiedliche Konzentrationen verwendet werden Doxycyclin gewünschten Expressionsrate zu erreichen. Wir verwendeten elektrophysiologischen und Kalzium-Imaging-Methoden rTRPV1 Expressionsniveau zu jedem Zeitpunkt zu bewerten, durch seine Agonisten Anwendung Capsaicin. Wie in Abbildung 1 dargestellt ist , wird nach und nach mit längeren Induktionszeiten erhöht lebenden Zellen Kalzium - Imaging, intrazellulären Calciumspiegel nach der Capsaicin - Anwendung. Aktivierung von nicht-induzierten Zellen können zu einem basalen Leck in der TR-Aktivität, eine Überexpression des Plasmids oder Rest Tetracyclin in den Zellen Medienkomponenten zurückzuführen sein. die Gesamtzellkonfiguration der Patch-Clamp-Technik Anlegen von Spannungsrampen zwischen -80 mV bis +80 mV nächsten verzeichneten wir Ströme von Zellen. 2 zeigt , dass höhere Stromamplituden mit längeren Induktionszeiten erhalten. Die Sättigung der Stromamplitude bei 4 h Induktion ist consistent mit der Sättigung in Calcium - Reaktion zu sehen (Abbildung 1). Schließlich haben wir analysiert, rTRPV1 Expressionsniveaus in der Outside-out-Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Eine der Hauptschwierigkeiten Ionenkanalstruktur-Funktion in das Studium ist einkanaligen Analyse Expressionsniveaus geeignet für das Erreichen. Basierend auf der veröffentlichten unitären rTRPV1 Leitwert 4 wurde die aufgezeichnete Stromamplitude verwendet , um die Anzahl von Kanälen in dem exzidierten Patch zu bestimmen. Wie in 3 gezeigt, wenn die Anzahl von Kanälen in den Patch steigt proportional zur Doxycyclin inkubiert. Nach einer Stunde der Induktion waren wir jede Kanalaktivität (0 von 8) zu erfassen, nicht in der Lage. Doch in beiden Zwei- und Drei-Stunden-Zeitpunkten aufgezeichnet wir einzelne Kanalaktivität in ähnliche Erfolgsraten. Zu beachten ist, während in zwei Stunden die meisten Patches nicht, reagieren in drei Stunden die meisten Flecken zeigten Single-to-Multi-Kanal-Aktivität. Die Chancen für die Aufnahme mehrerer Kanäle nach drei Stunden Induktion hoch ist, damit die optimale Induktionszeit aufzuzeichnen Strom von einem einzelnen Kanal zwischen zwei bis drei Stunden unter den dargestellten Bedingungen. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die Expression von Ionenkanälen können dicht nach transienter Transfektion unter Verwendung dieses Protokoll gesteuert und geregelt werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55370/55370fig1.jpg" /> Abbildung 1. Antwort von TRPV1 - Aktivierung Erhöht nach Induktionszeit, wie durch Calcium Imaging visualisiert. (A) Pseudo-farbige Bilder von T-Rex-293 - Zellen rTRPV1 transient exprimieren, vor ( &#39;Basal&#39;) und nach dem Capsaicin (2 uM) Anwendung. Weiße Balken repräsentieren 30 um. Maßstabsbalken zeigt Ebenen der intrazellulären Kalzium. (B) mit der Zeit ändert der intrazellulären Calciumspiegel in transfizierten T-REx-293 - behandelten Zellen , wie gezeigtJeder Graph in A. stellt einen Mittelwert von 50 Capsaicin empfindliche Zellen. Beachten Sie die schrittweise Erhöhung der Capsaicin-Antworten in Bezug auf Induktionszeit. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55370/55370fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55370/55370fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55370/55370fig2.jpg" /> Abbildung 2. TRPV1 Strom erhöht sich infolge der Erhöhung der Induktionszeit in Whole Cell - Patch - Clamp - Aufnahmen. (A) Ganzzellableitungen von T-Rex-293 vorübergehend bei einem Haltepotential von -40 mV mit rTRPV1 transfiziert. Die Zellen wurden mit Doxycyclin (1 ug / ml) für die angegebene Zeit induziert und dann auf Capsaicin ausgesetzt ( &#39;Cap&#39;; 1 &amp; mgr; M; roter Balken). Dargestellt ist eine repräsentative Spur von 6-11 unabhängige Aufnahmen. (B) Mittlere / Scatter-Punkt - Diagramm , die die Ganzzell Amplitude evozierten wie in A. Statistik gezeigtal Signifikanz zwischen den Gruppen wurde mit ANOVA mit multiple Vergleiche bestimmt, wobei *** p darstellt ≤0.001 und ns- statistisch nicht signifikant (n = 6-11 Zellen). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55370/55370fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55370/55370fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55370/55370fig3.jpg" /> Abbildung 3. Erfolgsrate von Single Channel - Patch in TRPV1 Recordings ist abhängig von Induktionszeit. (A) Outside-out - Aufnahmen von T-Rex-293 vorübergehend bei einem Haltepotential von 50 mV mit rTRPV1 transfiziert. Die Zellen wurden mit Doxycyclin (1 ug / ml) für die angegebene Zeit induziert und wurden auf Capsaicin ausgesetzt ( &#39;Cap&#39;; 1 &amp; mgr; M; roter Balken). Dargestellt ist eine repräsentative Spur von 6 - 9 unabhängige Aufnahmen. (B) Mittlere / Scatter-Punkt - Diagramm, das die Anzahl von Kanälen in dem ausgeschnittenen Patch alsgezeigt, wurde in A. Die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen mit ANOVA mit multiple Vergleiche bestimmt, wobei *** p darstellt ≤0.001 und ns- statistisch nicht signifikant (n = 6 - 9 Zellen). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55370/55370fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55370/55370fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection at JoVE.com

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

controllable-ion-channel-expression-through-inducible-transient

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

9.3K Aufrufe.  The Hebrew University of Jerusalem (HUJI).  Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen. 

Serie: Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Forschung

Genetik

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to particular habitats and management practices. This article shows how certain terroir signatures can be detected in the berry metabolome and transcriptome of the grapevine cultivar Corvina using multivariate statistical analysis. The method first requires an appropriate sampling plan. In this case study, a specific clone of the Corvina cultivar was selected to minimize genetic differences, and samples were collected from seven vineyards representing three different macro-zones during three different growing seasons. An untargeted LC-MS metabolomics approach is recommended due to its high sensitivity, accompanied by efficient data processing using MZmine software and a metabolite identification strategy based on fragmentation tree analysis. Comprehensive transcriptome analysis can be achieved using microarrays containing probes covering ~99% of all predicted grapevine genes, allowing the simultaneous analysis of all differentially expressed genes in the context of different terroirs. Finally, multivariate data analysis based on projection methods can be used to overcome the strong vintage-specific effect, allowing the metabolomics and transcriptomics data to be integrated and analyzed in detail to identify informative correlations.

This article describes the application of untargeted metabolomics, transcriptomics and multivariate statistical analysis to grape berry transcripts and metabolites in order to gain insight into the terroir concept, i.e., the impact of the environment on berry quality traits.

Das Terroir-Konzept Interpretiert durch Grape Berry Metabolomics und Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly useful. Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based constructs is an efficient method for genetic manipulation of hepatocytes in adult mice. In addition to constitutive transgene expression, this system can be used for more advanced applications, such as shRNA-mediated gene knock-down, implication of the CRISPR/Cas9 system to induce gene mutations, or inducible systems. Here, the combination of constitutive CreER expression together with inducible expression of a transgene or miR-shRNA of choice is presented as an example of this technique. We cover the multi-step procedure starting from the preparation of sleeping beauty-transposon constructs, to the injection and treatment of mice, and the preparation of liver tissue for analysis by immunostaining. The system presented is a reliable and efficient approach to achieve complex genetic manipulations in hepatocytes. It is specifically useful in combination with Cre/loxP-based mouse strains and can be applied to a variety of models in the research of liver disease.

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based integration vectors enables stable transfection of murine hepatocytes in vivo. Here, we present a practical protocol for transfection systems that enables the long-term constitutive expression of a single transgene or combined constitutive and doxycycline-inducible expression of a transgene or miR-shRNA in the liver.

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

Transiente Expression von Fremdgenen in Insekt Zellen (sf9) für funktionelle Protein Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...