Name: avian semen collection by cloacal massage and isolation of dna from sperm
Uploaded: 2018-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
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Wir danken Jose Noguera für frühe Hilfen mit Blasenekstrophie Massage und Jeffrey Kittilson für Labor zu unterstützen. Diese Arbeit wurde durch einen ND EPSCoR FAR0022429 Award, BJH unterstützt. Publikationskosten waren der NDSU Abteilung der biologischen Wissenschaften großzügig unterstützt.

Dieses Protokoll beinhaltet vertebrate Tiere Themen und durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der North Dakota State University genehmigt wurde.
1. die Samengewinnung aus dem passerine Vogel mit Blasenekstrophie massage
Hinweis: Blasenekstrophie Massage ist eine wirksame Sperma Sammlung Technik auf nur reproduktiv aktive Vögel, aber außerhalb der Brutzeit im entsprechenden gefangen Situationen erfolgreich durchgeführt werden kann. Vermehrungstätigkeit sollte für Zielarten vor mit Blasenekstrophie Massage bestimmt werden. Diese Technik kann verwendet werden, auf Wildvögel bei der Erfassung oder Vögel in Gefangenschaft gehalten.
<ol><li>Beginnend mit einem Männchen (bei der Zucht Zustand) Bander es halt in der nichtdominanten Hand übertragen den Vogel auf die dominante Hand mit seiner ventralen Seite berühren die Handfläche (Abbildung 1).<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Vogels am nächsten der seitliche Rand der Palme ist. Kopf und Körper mit dem kleinen Finger, Ring und Mittelfinger leicht zu sichern. Dies lässt des Vogels Vent und Tail ausgesetzt.</li>
		<li>Lassen Sie den Vogel Beine lose oder leicht zurückhaltend mit der Handfläche.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg"> Abbildung 1 : Griff für Blasenekstrophie Massage. Der Vogel ist mit seiner ventralen Seite berühren die Handfläche und Kopf gesichert durch den kleinen Finger leicht in die dominante Hand gesichert. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="2"><li>Legen Sie die dominanten Zeigefinger und Daumen auf beiden Seiten des überlegenen Ende der Kloake und auseinanderziehen Sie leicht der Finger während der Anwendung sehr leichten Druck in Richtung Heck ( Abbildung 2). Die Kloake wird evert, Freilegung der Blasenekstrophie Schleimhaut (rosa innen). Hinweis: Wenn der Vogel nicht produziert derzeit Sperma, Blasenekstrophie Protuberanz kann klein sein und die Kloake ist schwierig, evert. Mit Erfahrung ist es leicht zu unterscheiden zwischen den Cloacas reproduktiv aktive und inaktive Männchen5,11.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg"> Abbildung 2 : Finger Position und Blasenekstrophie Protuberanz. Evert der Kloake durch leichten Druck auf die überlegene Ende (A). In einem reproduktiv aktiven männlichen Botaniker Blasenekstrophie Protuberanz ist offensichtlich und Firma (B). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="3"><li>Legen Sie mit der nichtdominanten Hand das Pad des Zeigefingers an der dorsalen Seite der Schwanzwurzel, die Hand zu stabilisieren, und platzieren Sie die Spitze des Daumens direkt unter der ausladenden Kloake. Hinweis: Kurze und glatte Miniaturansicht ist vorteilhaft für die Durchführung von Blasenekstrophie Massage und den Vogel vor Verletzungen schützt.</li>
	<li>Den nicht-dominanten Daumen tief und cranially in eine sich ständig wiederholende Bewegungen mit mittlerem Druck, bleiben unterhalb der Kloake zu bewegen. Fortgesetzt, bis der Vogel ejakuliert. Abhängig von der Einzelperson geschieht dies in der Regel zwischen 1 und mehreren Dutzend Schläge.</li>
	<li>Sobald der Vogel ejakuliert, sammeln Sie das Sperma in einem Microhematocrit Rohr. Wiederholen Sie bei Massage um mehrere ejakuliert zu erhalten. Hinweis: Sperlingsvögel Samen ist hellbraun und hat in der Regel eine etwas dicke Konsistenz. Weiße oder dunkle Stoffe aus der Kloake ausgeworfen nicht Sperma, und können die Samenprobe kontaminieren. Das Aussehen einer kleinen Menge von Blut auf der Kloake oder gemischt in mit das Sperma wird in der Regel verursacht durch zuviel Druck während der Massage.</li>
	<li>Legen Sie für DNA-Extraktion das Sperma in einem Microcentrifuge Schlauch mit 20 µL 1 X PBS (pH 7,4). Hinweis: Samen mit 1 X PBS-Puffer gespeichert ist nicht geeignet für künstliche Befruchtung, aber kann für DNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden wenn bei-80 ° c gelagert Die PBS ist Raumtemperatur oder gekühlt, aber sollte in einem flüssigen Zustand sein, wenn die Samenprobe hinterlegt ist.<ol>
<li>Bestätigen Sie das Vorhandensein von Samenzellen in der Probe, indem Sie anzeigen eine kleine Menge der verdünnten Probe unter dem Mikroskop Compound (Abbildung 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bis zur Extraktion lagern Sie der Samenlösung bei-80 ° C.</li>
</ol>(2) Extraktion von DNA aus Vogel-Samen
Hinweis: Dieses Protokoll wurde mit mehreren kommerziellen DNA Extraktion Kits getestet, aber es wurde nur erfolgreich, wenn Sie mit einem DNA-Kit12verwendet. Schritte, die geändert werden aus dem Kit-Protokoll sind gekennzeichnet durch *.
<ol><li>Bereiten Sie eine 1 M Lösung von Dithiothreitol (DTT) in Wasser und mischen mit einem vortex.*<ol>
<li>Aliquoten die DVB-t-Lösung und bei-20 ° C bis unmittelbar vor der Anwendung zu speichern. Jede Probe extrahiert werden erfordert 10 µL 1 M DVB-t-solution.*</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie einen Puffer mit 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; und 4 % SDS. Jede Probe extrahiert werden erfordert 90 µL von diesem buffer.*<ol>
<li>Lagern Sie den Puffer bei Raumtemperatur. Wenn es ausgefällt hat, warm es auf 56 ° C zu dissolve.*</li>
	</ol>
</li>
	<li>Heizen Sie einen Inkubator mit einer Wippe oder Shaker auf 65 ° C.*</li>
	<li>Unmittelbar vor Beginn der Extraktion, mix 10 µL DVB-t-Lösung mit 90 µL des Puffers in Schritt 2.2 für jede Probe extrahiert werden, z. B. 900 µL Puffer plus 100 µL DVB-t-Lösung bereit, wenn 10 Proben zu extrahieren. Diese Mischung wird DVB-t-buffer.* aufgerufen werden</li>
	<li>Die gesamte verdünnte Samenprobe 70 µL 1 X PBS hinzu und mischen Sie gut mit einer vortex.*</li>
	<li>Hinzufügen von 100 µL DTT-Puffer und 10 µL Proteinase K-Lösung zur Probe. Wirbel für 20 Sekunden, dann brüten in den vorgewärmten Brutkasten für 1 Stunde auf einer Wippe oder shaker.*</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Puffer AL und 200 µL frische EtOH (100 %) und Vortex für 20 seconds.*</li>
	<li>Übertragen Sie das gesamte Sample auf einer Spin-Spalte und Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen.</li>
	<li>Legen Sie die Spalte auf einen neuen Schlauch und fügen Sie 500 µL vorbereitet Buffer AW1 hinzu. Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen.</li>
	<li>Legen Sie die Spalte auf einen neuen Schlauch und 500 µL vorbereitet Puffer AW2. Zentrifuge für 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen durchströmte und die Spalte mit der u-Bahn zurück.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 3 Minuten bei 20.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen und setzen Sie die Säule an einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Pipettieren 35 µL AE-Puffer direkt auf die Spalte Membran und in 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 14.000 x g. verwerfen die Spin-Spalte und speichern Sie entnommene Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+size+and+sperm+competition+in+birds.">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li><li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+life+histories:+the+long+and+the+short+of+it.">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li><li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+of+the+male+gamete.">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li><li>Burrows, W. H., Quinn, J. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Wir beschreiben eine einfache und zuverlässige Methode für das Sammeln von Samen von kleinen und mittleren Vögel in reproduktiv aktiven Zustand und Extrahieren von DNA aus Vogelgrippe Sperma.
Die beschriebenen Samen DNA Extraktion Protokoll ist aus einem Bausatz für Einfachheit geändert, aber wurde für den Einsatz auf Vogelgrippe Sperma veredelt. Spermien sind resistent gegen lyse von standard-Extraktion Chemikalien9,13, und Spermaproben von Singvögel sind ziemlich klein (in der Regel wenige Mikroliter). Diese Faktoren stellen Herausforderungen dar, die erfolgreich überwunden werden, indem eine entsprechende Konzentration von DVB-t und Inkubation bei 65 ° C. Mit dieser Methode haben wir konsequent nutzbare Mengen DNA für qPCR Analyse der Spermien Telomerlänge (in der Regel zwischen 40-250 ng/µL, je nach Ejakulatvolumen) isoliert.
DVB-t wurde zuvor verwendet, um DNA aus Vogelgrippe Spermien in Kombination mit Phenol/Chloroform Reaktion13zu extrahieren. Phenol/Chloroform Reaktionen sind wirksam für die Isolierung von DNA, aber sie werden mehr Zeit in Anspruch, sind gefährlicher und erfordern eine Abzugshaube. Eine bemerkenswerte Einschränkung unserer Extraktion-Protokoll ist, dass es nur bei Verwendung einer Marke und Typ des Extraktion Kit, möglicherweise aufgrund des geringen Volumens der Probe ab erfolgreich war. Sehr kleine Samenproben (weniger als 1 µL) oder Proben mit geringe Spermien-Dichte können verhindern, dass erfolgreiche Extraktion von DNA durch unzureichende DNA in der Probe vorhanden, aber wir haben dieses Problem nicht angetroffen, wenn Blasenekstrophie Massage für Vögel bei der Zucht Zustand ausgeführt wird . Um dieses Problem zu vermeiden, kann Blasenekstrophie Massage sofort wiederholt werden, um mehrere ejakuliert zu sammeln, die für Extraktion gebündelt werden können.
Blasenekstrophie Massage wurde seit Jahrzehnten im Einsatz und in vielen Arten1,4,5,6,7,15,16,17, und ist ein schnelle und effektive Mittel zur Erfassung der Samen von Vögel in vielen Fällen. Für Studien mit wild oder ungeübte Vögel, die erfasst werden können, ist es effektiver als Methoden der Datenerhebung, die überzeugend ein Männchen kopulieren mit einem Element und seinen Samen freiwillig einzahlen abhängig4. Eine andere Methode der Sperma-Sammlung ist durch Dissektion der Hoden oder Samen-Glomera, aber dies ist keine Option für Zwecke der Bestandserhaltung oder wiederholte Bemusterung4,14. Die größte Einschränkung der Blasenekstrophie Massage ist die Schwierigkeit beim Erlernen der Technik ohne Demo. Schriftliche Beschreibungen sind oft nicht ausreichend zu verstehen und zu lernen, den Prozess zu implementieren. Durch die Darstellung Blasenekstrophie Massage im Detail, hoffen wir, Lernzeit und Schwierigkeiten für diejenigen, die die Technik erlernen zu reduzieren.

Vögel sind ideale Motive für Studien mit Spermien-Qualität und Wettbewerb1, Sperma Telomere Dynamik2Epigenetik3und ähnliche Themen, wie sie weit in der biologischen Forschung verbreitet sind und Spermien leicht entnommen werden können, mit Blasenekstrophie Massage. Blasenekstrophie Massage ist eine sanfte, nichtinvasive manuelle Technik zum Sammeln von Samen von Vögel4,5,6. Wiederholte Proben können leicht erhalten werden und sind keine Spezialwerkzeuge erforderlich, so dass es einfach in das Feld oder Labor durchzuführen. Obwohl Blasenekstrophie Massage seit Jahrzehnten im Einsatz gewesen ist, ist es schwierig, aus den verfügbaren Beschreibungen geschrieben zu lernen. Diese Veröffentlichung dient zur Verringerung der Zeit und Unsicherheit Blasenekstrophie Massage lernen.
Samen gesammelt von Vögel mit Blasenekstrophie Massage kann sofort für Motilität Bewertung4,7 oder künstliche Befruchtung8verwendet, oder für andere Nutzungen wie erweiterte Bildgebung und DNA-Extraktion eingefroren. Spermaproben von passerine Vögel sind klein, aber dicht gepackte Spermien enthalten. DNA wird mit einer kommerziellen Extraktion Kit für Einfachheit, mit Modifikationen, die speziellen Schutzfunktionen von Spermien9zu überwinden. Nach der Extraktion können Sperma Telomere mit qPCR10gemessen werden.

<table><tbody><tr><td>Microhematocrit capillary tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362566</td><td>Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Any</td><td></td><td>Used for storing semen samples prior to DNA extraction.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1233508</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA micro kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

avian semen collection by cloacal massage and isolation of dna from sperm

Sammlung des Samens möglicherweise nützlich für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Studien, die Qualität der Spermien, Sperma Telomere Dynamik und Epigenetik. Vögel sind weit verbreitete Themen in der biologischen Forschung und sind ideal für Studien mit wiederholter Spermaproben. Einige Ressourcen sind jedoch derzeit für diejenigen, die lernen, wie man sammeln und Vogelgrippe Samenzellen DNA extrahieren. Hier beschreiben wir Blasenekstrophie Massage, eine sanfte, nicht-invasive manuelle Technik zur Vogelgrippe Sperma zu sammeln. Obwohl diese Technik in der Literatur hergestellt ist, kann es schwierig, aus den verfügbaren Beschreibungen zu lernen sein. Wir bieten auch Informationen zur Extraktion von DNA aus Vogelgrippe Samen mit einem kommerziellen Extraktion Kit mit Modifikationen. Blasenekstrophie Massage kann leicht auf jede kleine bis mittlere männliche Vogel in reproduktive Zustand verwendet werden. Nach Sammlung kann das Sperma sofort für Motilität Assays verwendet oder eingefroren für DNA-Extraktion nach dem hier beschriebenen Protokoll. Diese Extraktion-Protokoll wurde für Vogelgrippe Sperma verfeinert und auf Proben von mehreren Sperlingsvögel (Passer Domesticus, Spizella Passerina Haemorhous Mexicanusund Turdus Migratorius erfolgreich eingesetzt ) und eine Columbid (Columba Livia).

Blasenekstrophie Massage und DNA-Extraktion verwenden, die das beschriebene Protokoll für mehrere Sperlingsvögel Arten und eine Columbid (Tabelle 1) ausgeführt wurde. Das Vorhandensein von Samenzellen im Spermaproben von Blasenekstrophie Massage wurde bestätigt, indem Sie anzeigen eine kleine Menge der verdünnten Proben unter dem Mikroskop Verbindung bei 400 X Vergrößerung (Abbildung 3). Nach Extraktion von DNA aus Spermaproben von Haussperlinge mit dem beschriebenen Protokoll hier gesammelt, wurden acht Proben für Gelelektrophorese mit einer DNA-Leiter ausgeführt (drei Proben sehen in Abbildung 4). Verschiedene Bands ohne Verschmieren wurden in alle acht der Probe Spuren, zeigt erfolgreiche Isolierung von hoher Qualität DNA gesehen. Alle anderen Proben extrahiert unter Verwendung dieses Protokolls wurden für die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer (siehe Tabelle 1) bewertet.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig3.jpg"> Abbildung 3: Sperma von zwei kleinen Singvögel. Diese Spermien Proben von Blasenekstrophie Massage von ein Haus Fink (Haemorhous Mexicanus), links, und ein Haussperling (Passer Domesticus), Recht, erhalten wurden gefangen in Fargo, ND in 2016. Die Proben waren jeweils in 20 µL PBS verdünnt und unter dem Mikroskop Verbindung bei 1.000 X und 400 X Vergrößerung bzw. angesehen. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55324/55324fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig4.jpg"> Abbildung 4 : DNA gel-Elektrophorese der Samenzellen DNA. Drei Proben von DNA extrahiert vom Haussperling Sperma laufen auf einem Gel mit einer DNA-Leiter. Beachten Sie die Anwesenheit von verschiedenen Bands, zeigt erfolgreiche Gewinnung von qualitativ hochwertigen DNA. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55324/55324fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Haussperling (Passer Domesticus)</td>
			<td>Chipping Sparrow (Spizella Passerina)</td>
			<td>Haus Fink (Haemorhous Mexicanus)</td>
			<td>Amerikanischer Robin (Turdus Migratorius)</td>
			<td>Felsen-Taube (Columba Livia)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anzahl der Proben gesammelt</td>
			<td>156</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anzahl der Proben extrahiert</td>
			<td>90</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Samen Erfolg Sammelquote</td>
			<td>98 %</td>
			<td>75 %</td>
			<td>100 %</td>
			<td>67 %</td>
			<td>67 %</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Arten und Proben gesammelt und bis dato extrahiert. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung wurden Proben mit dem beschriebenen Protokoll 4 Sperlingsvögel Arten und 1 Columbid verarbeitet. Samen Erfolg Sammelquote bezieht sich auf den Anteil der, den einzelnen für die eine Probe aus der Gesamtzahl versucht erfolgreich abgerufen wurde.

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Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Dieses Protokoll beschreibt Blasenekstrophie Massage, eine nicht-invasive manuelle Technik zum Sammeln von Samen von Vögel und DNA-Extraktion aus Vogelgrippe Spermien mit einem kommerziellen Extraktion Kit mit Modifikationen.

Vogelgrippe Samengewinnung von Blasenekstrophie Massage und Isolierung von DNA aus Spermien

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

avian-semen-collection-cloacal-massage-isolation-dna-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K Aufrufe.  North Dakota State University. Dieses Protokoll beschreibt Blasenekstrophie Massage, eine nicht-invasive manuelle Technik zum Sammeln von Samen von Vögel und DNA-Extraktion aus Vogelgrippe Spermien mit einem kommerziellen Extraktion Kit mit Modifikationen.

Serie: Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and maturation. As of yet, weekly injections of human chorionic gonadotropin (hCG) have proved to maturate males after just 5-6 weeks of treatment, producing high volumes of high-quality sperm during several weeks. In addition, sperm cryopreservation protocols using different extenders, cryoprotectants and cooling and thawing times have been previously described for European eel. Here, we show that Tanaka&#180;s extender solution can be directly used for fertilization or for cryopreservation, making unnecessary the usage of different types of solutions and dilutions. Furthermore, the use of methanol as a cryoprotectant makes this protocol easy to use as methanol has low toxicity and does not activate the sperm. The sperm does not need to be cryopreserved immediately after the addition of the cryoprotectant, and it can be used long after being thawed. Moreover, sperm motility is still high after thawing although it is lower than that of fresh sperm. The aim of this work is to show the best available protocol for European eel handling, maturation, and sperm cryopreservation.

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Protocols for European eel maturation and sperm cryopreservation have been improved over the last years. This article describes the best protocol available using human chorionic gonadotropin (hCG) for inducing maturation and methanol as cryoprotectant.

Handhabung und Behandlung der männlichen europäischen Aal (Anguilla Anguilla) für die hormonelle Reifung und Kryokonservierung von Spermien

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Biologie

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgenen Nager Assay zur Quantifizierung von männlichen Keimzellmutantenhäufigkeit

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Spermiengewinnung differenzielle Qualität mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish species is that it possesses interfertile cave and river-dwelling populations. This enables the genetic mapping of heritable traits that were fixed during adaptation to the different environments of these populations. While this species can be maintained and bred in the lab, it is challenging to both obtain embryos during the daytime and create hybrid embryos between strains. In vitro fertilization (IVF) has been used with a variety of different model organisms to successfully and repeatedly breed animals in the lab. In this protocol, we show how, by acclimatizing A. mexicanus to different light cycles coupled with changes in water temperature, we can shift breeding cycles to a chosen time of the day. Subsequently, we show how to identify suitable parental fish, collect healthy gametes from males and females, and produce viable offspring using IVF. This enables related procedures such as the injection of genetic constructs or developmental analysis to occur during normal working hours. Furthermore, this technique can be used to create hybrids between the cave and surface-dwelling populations, and thereby enable the study of the genetic basis of phenotypic adaptations to different environments.

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

In vitro fertilization is a commonly used technique with a variety of model organisms to maintain lab populations and produce synchronized embryos for downstream applications. Here, we present a protocol that implements this technique for different populations of the Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus.

Gamete Collection und In-Vitro-Fertilisation von Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...

Recording Electrical Currents across the Plasma Membrane of Mammalian Sperm Cells

Recording of the electrical activity from one of the smallest cells of a mammalian organism- a sperm cell- has been a challenging task for electrophysiologists for many decades. The method known as "spermatozoan patch clamp" was introduced in 2006. It has enabled the direct recording of ion channel activity in whole-cell and cell-attached configurations and has been instrumental in describing sperm cell physiology and the molecular identity of various calcium, potassium, sodium, chloride, and proton ion channels. However, recording from single spermatozoa requires advanced skills and training in electrophysiology. This detailed protocol summarizes the step-by-step procedure and highlights several 'tricks-of-the-trade' in order to make it available to anyone who wishes to explore the fascinating physiology of the sperm cell. Specifically, the protocol describes recording from human and murine sperm cells but can be adapted to essentially any mammalian sperm cell of any species. The protocol covers important details of the application of this technique, such as isolation of sperm cells, selection of reagents and equipment, immobilization of the highly motile cells, formation of the tight (Gigaohm) seal between a recording electrode and the plasma membrane of the sperm cells, transition into the whole-spermatozoan mode (also known as break-in), and exemplary recordings of the sperm cell calcium ion channel, CatSper, from six mammalian species. The advantages and limitations of the sperm patch clamp method, as well as the most critical steps, are discussed.

This protocol describes how to perform electrical recordings from mammalian sperm cells in a whole-cell configuration, with the goal of directly recording ion channel activity. The method has been instrumental in describing the electrophysiological profiles of several sperm ion channels and helped to reveal their molecular identity and regulation.

Recording of the electrical activity from one of the smallest cells of a mammalian organism- a sperm cell- has been a challenging task for ...

U-Shaped Horizontal Swimming Technique for Preparing High-Quality Sperm with Low DNA Fragmentation Index

Human semen is a complex mixture comprising progressively motile spermatozoa, non-progressively motile spermatozoa, immotile spermatozoa, cell debris, and viscous seminal plasma. High-quality sperm refers to progressively motile spermatozoa with normal morphology, which often exhibit a lower DNA fragmentation index (DFI) and higher fertilization potential. Preparing high-quality sperm is a critical step in human-assisted reproductive technology. The traditional sperm preparation method, discontinuous density gradient centrifugation (DGC), is time-consuming and labor-intensive. Repeated centrifugation can damage sperm DNA, thereby affecting subsequent fertilization and embryo development. This study introduces a U-shaped horizontal swimming (UHS) method for preparing intracytoplasmic sperm injection (ICSI) sperm, which significantly eliminates the detrimental effects of&#160;centrifugation on sperm DNA.&#160;The UHS method involves creating a UHS lane using a fertilization medium within an ICSI operating dish. A 10 &#181;L fertilization medium microdroplet is placed at the starting point on the left side of the UHS lane to hold the semen. Two additional 10 &#181;L fertilization medium buffer droplets are positioned at intervals along the left middle section of the lane, with all droplets connected by fertilization medium. The dish is then covered with culture oil and incubated overnight at 37 &#176;C with 6% CO2 to equilibrate. Subsequently, 3 &#181;L of semen is added to the microdroplet at the starting point. High-quality spermatozoa swim to the right side of the UHS lane, facilitating their suction into the ICSI injection needle. Dead sperm, cell debris, and other viscous impurities largely remain at the initial point or in the buffer droplets. We simultaneously processed 21 semen samples using both UHS and DGC techniques and compared their DFI. The results demonstrated that the DFI in the DGC group was 5.5% &#177; 3.2%, whereas the DFI in the UHS group was 1.7% &#177; 1.1%. The difference between the two groups was statistically significant (P &#60; 0.05).

This protocol describes a method for screening high-quality sperm with a low DNA fragmentation index by utilizing sperm motility characteristics and thigmotaxis. The method employs a U-shaped horizontal swimming lane, enabling high-quality sperm to reach the opposite side through buffer droplets, while dead sperm, cell debris, and impurities are excluded.

U-förmige horizontale Schwimmtechnik zur Aufbereitung hochwertiger Spermien mit niedrigem DNA-Fragmentierungsindex

Human semen is a complex mixture comprising progressively motile spermatozoa, non-progressively motile spermatozoa, immotile spermatozoa, cell debris, and ...