Die Autoren möchten BRF Aquatics-Team des Instituts Francis Crick für ihre technische Hilfe und kritische Beiträge danken. Diese Arbeit wurde von Francis Crick Institut unterstützt die erhält die Grundfinanzierung von Cancer Research UK (FC001999), UK Medical Research Council (FC001999) und des Wellcome Trust (FC001999).

1. Exposition der Vorfiltration Wächter aus einem umlaufenden System
<ol><li>
Setzen Sie einen saubere 8 L Tank aus einem umlaufenden System. Füllen Sie es mit Wasser aus der Ölwannen. Fügen Sie 2 keramische Perlen oder Schwamm Würfel aus Bio-Medien aus den Systemen zum Bildschirm (Abbildung 1). Fügen Sie 1-2 D.Rerio/l (d.h. 12 Fische). Verwenden Sie Wildtyp Fisch von den dominanten genetischen Hintergrund in der Anlage, zum Beispiel AB.
	<ol>
<li>Wählen Sie mindestens 6 Fische wie folgt: mindestens ein Weibchen und ein Männchen unter 6 Monate alt, ein Weibchen und ein Männchen zwischen 6 und 18 Monate und ein Weibchen und ein Männchen über dem Alter von 18 Monaten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Einmal am Tag zu füttern. Variieren Sie die Diäten (z.B. trockene Nahrung, Artemia) um sicherzustellen, dass die Wächter alle Diäten verwendet in der Zebrafisch-Anlage ausgesetzt sind. Wechseln Sie Wasser am Montag, Mittwoch und Freitag, d. h., dreimal pro Woche für 4 Monate.
	<ol>
<li>Um den Wasserwechsel durchzuführen, übertragen Sie Wächter und Bio-Medien in eine temporäre Tank. Die Sentinel-Tank vollständig entleeren und reinigen. Füllen Sie den Sentinel-Tank Sumpf nur mit Wasser. Setzen Sie die Wächter und Bio-Medien zurück.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Wächter für 4 Monate zu Sumpf Wasser aussetzen. Einschläfern der Fisch von einer anerkannten Methode wie eintauchen in eine Überdosis Lösung des 2-Phenoxyethanol (3 mL/L).</li>
	<li>
Um Tod zu bestätigen, warten Sie 10 Minuten nach Beendigung der Opercula Bewegung.
	<ol>
<li>Die Kadaver mit Zange greifen und ausschließlich auf-80 ° C in einem identifizierten Behälter einfrieren. Dies wird für PCR-12,15verwendet werden.</li>
		<li>Alternativ schneiden Sie die Tailat der kaudalen Blütenstiel, nick der Bauchwand, und inmitten von 4 % Formalin. Achtung: Benutzen Sie Handschuhe und Rauch Schrank für die Histopathologie. Den Probenbehälter zu kennzeichnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Sumpf Tupfer
<ol><li>Verwenden Sie einen sterilen trockenen Tupfer mit einem Kunststoffschacht. Tragen Sie Handschuhe. Lokalisieren Sie die Oberfläche Tupfer (Sumpf-Wand an der Oberfläche des Wassers) und entfernen Sie alle Elemente einfach Zugriff auf der Oberfläche zu verhindern. Wählen Sie eine Ölwanne Oberfläche mit low-Flow.</li>
	<li>
Ziehe den Tupfer durch Entfernen der äußeren Verpackung und setzen die sterilen Wattetupfer in die Luft. Vermeidung von Kreuzkontamination des Tupfers kümmert sich nicht um ungeprüfte Oberflächen berühren.
	<ol>
<li>Wischen Sie die Ölwanne Wand über 5-10 cm zu absorbieren Wasser und Biofilm an der Ölwanne Oberfläche Wasserstand.</li>
		<li>Den Tupfer wieder Mantel oder die Spitze in einem sterilen Zentrifugenröhrchen brechen. Beschriften Sie die Probe und senden für PCR-Tests oder Einfrieren bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Erkennung p. Tomentosa Eier an der Unterseite des Tanks
<ol><li>
Schlamm-Analyse von Mikroskopie
	<ol>
<li>Verwenden Sie eine 60 mL Spritze9 , um der Schlamm am unteren Rand ein Sumpf oder eines Panzers, der Fisch einschließlich Wächter hält Aspirieren. Teilen Sie die Probe in 15 mL-Tuben. Schließen Sie die Rohre mit ihren Schraubverschlüssen und beschriften Sie die Rohre.</li>
		<li>Vorbereiten die gesättigten Zuckerlösung (spezifisches Gewicht = 1,27) durch das Mischen von 227 g Kristallzucker in 177 mL heißes Wasser mit einem Magnetrührer14.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die 15 mL Röhrchen bei 175-250 X g für 10 min in einer Zentrifuge mit Schaukel Eimer. Dekantieren Sie die Röhrchen und halten Sie das Sediment in ihre Röhre.</li>
		<li>Füllen Sie die Rohre mit der gesättigten Zuckerlösung auf halbem Weg. Schließen Sie die Rohre mit den Schraubverschluss und mischen Sie das Sediment mit der Lösung.</li>
		<li>Legen Sie die Röhren in der Zentrifuge Schaukel Eimer und füllen sie mit gesättigten Zuckerlösung an die Spitze. Legen Sie ein Deckglas vorsichtig am Anfang jedes Rohr und im Kontakt mit der Zuckerlösung gesättigt.</li>
		<li>Zentrifuge bei 175-250 X g für 10 min. beachten Sie, dass einige Deckglas kann fallen und bei der Zentrifugation daher dort brechen sind 4 Röhren für jede 60 mL Probe. Heben Sie das Deckglas und setzen Sie ihn auf einen Objektträger. Beschriften Sie die Folie mit einem Bleistift oder Marker Stift.<ol>
<li>Für den Fall, dass zu viele Deckglas Brüche auftreten, füllen den größten Teil des Rohrs mit der gesättigten Zuckerlösung, Zentrifuge bei 175-250 X g für 10 min, nach oben mit der gesättigten Zuckerlösung auffüllen und dann sanft das Deckglas gesetzt. 30 min. warten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Suchen Sie nach p. Tomentosa Eiern mit dem Mikroskop13 (Abbildung 2 und Video 1). Die zweipolige Stecker bei Vergrößerung 400 X6zu identifizieren. Hinweis: Die Größe der Eier ist 57-78 µm lang und 27-39 µm Durchmesser16,17. Beachten Sie, dass eine positive Folie genug für die 60 mL Probe positiv deklariert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Screening importierte Tiere in Quarantäne für p. Tomentosa Eiern
	<ol>
<li>Männliche und weibliche D. Rerio in einen Panzer gesetzt. Fügen Sie in den Tank Gerät normalerweise verwendet, um zu ernten und erzeugte Eiern erhalten, sondern können sie hier sammeln Sie Kot (Abbildung 3 hinzu). Hinweis: zum Beispiel ist eine 1 L Zucht Tankfüllung (Außentank und Innenbehälter mit geriebenem unten) vollständig in einem 13 L Tank, ermöglicht freien Zugang für die Fische in die und aus der Zucht-Gerät verschieben getaucht.</li>
		<li>Entfernen Sie die Zucht Gerät nach einer Woche und ernten Sie den gesammelte Schlamm in die Zucht-Gerät zu, wie unter Schritt 3.1 "Schlamm-Analyse von Mikroskopie."</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) PCR auf Schlamm Sediment
<ol><li>Aspirieren Sie den Schlamm am unteren Rand ein Tank oder Sumpf mit einer 60 mL Spritze9 und übertragen Sie die Probe auf eine 60 mL-Tube. Verschließen Sie das Röhrchen mit den Schraubverschluss und beschriften Sie das Rohr. Entsorgen Sie die Spritze.</li>
	<li>Schütteln Sie die 60 mL-Tube und übertragen Sie 15 mL auf eine 15 mL Tube. Verschließen Sie das Röhrchen mit den Schraubverschluss und beschriften Sie das Rohr.</li>
	<li>Zentrifugieren der 15 mL Tube bei 175-250 X g für 10 min in einer Zentrifuge mit Schaukel Eimer. Dekantieren Sie die Röhrchen und halten Sie das Sediment in der Röhre.</li>
	<li>
Ziehe einen Tupfer durch Entfernen der äußeren Verpackung und setzen die sterilen Wattetupfer in die Luft. Vermeidung von Kreuzkontamination des Tupfers kümmert sich nicht um ungeprüfte Oberflächen berühren.
	<ol>
<li>Wischen Sie das Sediment in der Röhre für 15 s.</li>
		<li>Den Tupfer wieder Mantel oder die Spitze in einem sterilen Zentrifugenröhrchen brechen. Beschriften Sie die Probe, bei-80 ° C eingefroren und senden für PCR-Tests. Hinweis: 45 mL bleiben in der 60 mL Tube. Dies kann zur Erkennung von p. Tomentosa Eiern durch Schlamm Analyse von Mikroskopie gehalten werden, wie unter Schritt 3.1, um beispielsweise das PCR-Ergebnis zu bestätigen. Die PCR im Klärschlamm kann versucht werden, für das screening von importierten Tieren nach Schritt 3.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramecium+caudatum+enhances+transmission+and+infectivity+of+Mycobacterium+marinum+and+M.+chelonae+in+zebrafish+Danio+rerio.">Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio.</a> Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).</li><li>Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vital+Relationship+Between+Nutrition+and+Health+in+Zebrafish.">The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish.</a> Zebrafish. 13, 72-76 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Einschränkungen der Techniken, wichtige Schritte und Fehlerbehebung:
Alter, Geschlecht, Belastung und Dauer der Exposition der Wächter sind nicht standardisiert. Dies ist in Tabelle 1dargestellt. Es gibt sehr wenig Screening von Fischen unter 6 Monate alt oder Alter Fisch. Möglicherweise gibt es einige Krankheitserreger, die Jungfische zu beeinflussen, da gibt es einige Krankheitserreger, die häufiger in der älteren Bevölkerung10,18,19,20sind. Ebenso gilt das Geschlecht nicht in der Auswahl einiger Sentinel-Gruppen trotz einige berichten, gibt es eine Gender-Bias für einige Krankheitserreger21. Die vorgeschlagene Technik versucht, diese Probleme anzugehen, obwohl die Wahl der Sorte nach einem spezifischen Erreger erfolgen könnte, um zu überwachen. Z. B. TU ließe sich mit der Erkennung von Mycobacterium spp.12,22, aber besteht die Gefahr, die die Wächter dann als ein Reservoir oder Anzeige klinische Zeichen fungieren würde. Hinsichtlich der Dauer der Exposition erhöht der Ansatz der Zebrafisch International Resource Center10 die Chancen, Krankheitserreger zu erkennen, die mit einer unzureichenden Kontamination entgehen lassen könnte. Die Notwendigkeit einer über längere Zeit impliziert, dass Wächter nicht verfügbar sind. Die Zugabe von der Umweltproben ermöglicht eine gewisse Flexibilität und die Vermehrung von Screening-Veranstaltungen. Zum Beispiel kann Probenahme alle zwei Monate mit einem 4-monatigen Intervall zwischen jeder Screening-Methode erfolgen. Dadurch kann dem Ablauf der Zeit, bis ein neu eingeführten Erreger erkannt wird.
Die Umwelt Screening-Techniken beruhen auf der Nachweis von Krankheitserregern in der Umwelt. Die Erreger sind Schuppen der Fische und daher im System Wasser verdünnt. Die Möglichkeit der Erfassung der Krankheitserreger durch Wasser-Filtration-23 wurde nicht geprüft. Die Methoden, die wir beschreiben, sind nur wirksam, wenn Krankheitserreger genügend Zeit gegeben werden, zu Fisch und Biofilm zur Erreichung einer Schwellenwerts der Kontamination Detektion ermöglicht vermehren. Diese Einschränkung der Techniken wird durch eine kritische Auswahl der Probenahmestellen minimiert: der Schlamm im Tank wird anstatt des Ölwanne Schlamms abgetastet und das Wasser und Biofilm sind an der Oberfläche der Ölwanne und nicht in einem Tank oder Nachfiltrierung probieren. Die Proben aus dem gleichen System sind jedoch unwahrscheinlich, dass die gleichen Ergebnisse. Positive Ergebnisse für p. Tomentosa können bestätigt werden, mithilfe einer anderen Assay (Histopathologie, PCR oder Schlamm-Analyse). Mykobakteriellen PCR-positive Ergebnisse können durch Kultur oder von einem anderen diagnostischen Labor bestätigt werden. Jedoch sind bei der Festlegung einer Gesundheitszustands weiter Proben empfohlen, negative Ergebnisse aus einer ökologischen Siebtechnik bestätigen.
Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende/Alternative Methoden:
Mycobacterium spp. sind häufig in die Umwelt und ihre Anwesenheit im Sumpf nicht vorhersagen, ihre Pathogenität12. Mocho9 zeigte, dass Überwachung Sterblichkeitsraten Schlüssel für die Entwicklungen von gesundheitlichen Problemen zu befragen. Die Verwendung von tierischen Proben bleibt unverzichtbar, eine tierärztliche Untersuchung. Systemüberwachung Erkennung aller gängigen Erreger in einer Einrichtung bedeutet, und dies kann nicht mit die alleinige Nutzung der Umwelt Screening Techniken erreicht werden. Dennoch kann ein Mangel an Sensibilität der Diagnosetools verzögern oder verhindern eine genaue Beschreibung des Gesundheitszustandes. Während der Verwendung der Wächter die Zahl der Fische erforderlich reduziert, eine Mikrobe weit verbreitet in der Bevölkerung zu erkennen, verleiht der Mangel an Sensibilität Gewicht mit einer Kombination von Methoden, einschließlich Umwelt Screening5,23. In der Tat ist der spezifische Erreger freie Status in der Regel als das Fehlen einer Spezies in der Anlage so definiert, dass Umwelt- und Tierschutz Proben negativ24,25testen müssen.
Die Ölwanne Tupfer Ergebnisse Ermittlung Mycobacterium spp. zeigen, dass unter Berufung auf Fische, die Proben zu einem falsch negativen gesundheitlichen Status führen können. Die 6 getesteten mykobakteriellen Arten werden beschrieben als Pathogene oder Potenzial Pathogene im Zebrafisch15 und einige würden nicht behoben werden, indem Ei Flächendesinfektion mit Chlor26 in Quarantäne so routinemäßig durchgeführt. Daher müssen die falsche-negativ einige Konsequenzen für die Mitarbeiter, die Linien zu importieren. Z. B. M. Fortuitum wurde mittels PCR auf Fisch Probe verpasst, aber mehr als die Hälfte der Ölwanne Tupfer PCR es erkannt. Man bedenkt, dass diese Mykobakterien widerstandsfähiger gegenüber Chlor als andere, und ihre Fähigkeit zu wachsen in den Wassersystemen27sind, ist es ein Risiko für die unbelastete einführenden Anlage. Um den Import von Linien zu ermöglichen, müssen Manager Vertrauen und die Gesundheitsberichte der ausführenden Anlage mit den ihrigen zu vergleichen. ICLAS Performance Evaluation Program28 ist der Schlüssel zu diesem Prozess bei Nagetieren. RESAMA Netzwerk meldet den Nachweis von M. Gordonae und M. Mucogenicum in französischen D. Rerio11. Diese Mykobakterien sind nicht in den Feldern der kommerzielle Labors vorgeschlagen, die wir verwenden. Es wäre sinnvoll, das ICLAS-Programm zu erweitern und die diagnostische Assays sowie die Liste der pathogenen Arten29zu harmonisieren.
A. Hydrophila ist auch ein Erreger, die das Potenzial hat, eingeführt werden, bei der Einfuhr von Tieren, obwohl seine Anfälligkeit für Chlor30 ihre Beseitigung während der routinemäßigen Ei Flächendesinfektion wahrscheinlicher macht. Die Ölwanne, Tupfer und Schlamm-Ergebnisse zeigen, dass ökologische Screening verwendet werden kann, um diese Erreger zu erkennen. Andere Bakterien wie Mycobacterium spp. wurden im Klärschlamm durch PCR23festgestellt. Diese Art der Probe ist besonders relevant, da es den Nachweis von Krankheitserregern Schuppen erlaubt. Eine weitere neue Anwendung ist beispielsweise die Schlamm-Analyse, importierte Fische in Quarantäne für p. TomentosaBildschirm. Der Parasit ist eine Bedrohung des Tieres Gesundheit13 und Neoplasie Modelle16. Darüber hinaus sind Chlorkonzentrationen in Routine Zebrafisch Ei Flächendesinfektion verwendet nicht effizient31. Aus diesem Grund scheint die Fähigkeit, die importierte Tiere mit einem einwöchigen Umsatz und ohne irgendwelche Fische Euthanasie Bildschirm sehr attraktiv. Diese Technik kann die Quarantäne und Biosicherheit Regeln beeinflussen, indem Sie erlauben eine Selektierung der Einfuhren. Ein Prozess der Entscheidungsfindung ist dann entsprechend die vorherrschende Erreger in der ausführende Einrichtung, die erkannten Erreger in Proben aus den importierten Fischen und das Risiko einer Beeinträchtigung des Gesundheitszustands des einführenden Anlage10entworfen.
Zukünftige Anwendungen oder Richtungen nach Beherrschung dieser Techniken:
Auch wenn Routine Quarantäne Behandlung der gewählten Variante ist, kann die Wirksamkeit von solchen Medikamenten32,33,34,35,36 mit der Zucht Gerät Schlamm Analyse beurteilt werden. Ganz allgemein könnte die Umwelt Screening verwendet werden, um Verbindungen gegen Bakterien und Parasiten testen zu beseitigen, und namentlich im Fisch Biotop. Eine weitere Nischenanwendung der Umwelt Screening ist zur Überwachung der Erreger Bevölkerung im live feed37,38. Obwohl die Anwendung dieser Techniken als eine wertvolle Ergänzung zu der Diagnose-Toolbox für die Gesundheitsüberwachung im Zebrafisch-Einrichtungen ist. Durch eine genauere, Kosten und Zeit effizient Definition des Gesundheitsstatus, Sumpf-Tupfer und Schlamm Analyse sind komplementär zu der Sentinel-Surveillance und der routinemäßigen Quarantäne-Praxis. In der Tat ist die Zukunft dieser Techniken ein routinemäßiger Bestandteil jeder aquatischen Laborbericht Gesundheit sein.

Um Forschung und Tierschutz1,2zu schützen, ist das Vorhandensein von Krankheitserregern in Tierhaltungen überwacht. Im Falle der Zebrafisch,3,4,5,6,7,8,9,10,11 der Gesundheitsüberwachung stützt sich oft auf Tiere analysiert post-mortem durch Histopathologie, Bakteriologie Kultur oder molekularbiologische Methoden. Tests nur Kolonie Tiere ist nicht die empfohlene Methode aufgrund der Anzahl der Fische und damit verbundenen Aufwendungen, die erforderlich wären, um Krankheitserreger der niedrigen Prävalenz zu erkennen. Daher ist die bevorzugte Methode, eine kleine Gruppe von Tieren zu einer höheren Belastung von Schadstoffen aussetzen. Diese Fische werden Vorfiltration Wächter genannt. Diese Ausstellung dauert Monate und es geht um eine Zunahme der Tierpflegerin Arbeitsbelastung und/oder einige speziell entwickelte technische Lösung. Eine weitere Herausforderung ist die Vorführung von importierten Zeilen in Quarantäne, wo die fruchtbare Tiere sind lebendig gehalten werden und dies ist nicht kompatibel mit routinemäßigen Tests am Schlachtkörper.
Hier beschreiben wir einige Methoden um bestimmte Zebrafisch Krankheitserreger (A. Hydrophila, Mycobacterium spp. und p. Tomentosa) durch screening der aquatischen System-Umgebung zu erkennen. Ziel ist es, reduzieren Sie die Anzahl der Fische verwendet für die Systemüberwachung und Umsatz, Kosten und Empfindlichkeit der Erkennung zu optimieren. Solche Methoden sind eine Alternative zu der Verwendung von Tieren und Screening Einfuhren in Quarantäne können einige Techniken angewendet werden. Zum Beispiel Mocho9 war in der Lage, weitere pathogenen mykobakteriellen Arten zu identifizieren, durch die Durchführung der PCR auf Sumpf Tupfer nicht auf Zebrafisch (einschließlich Wächter), und dies wurde mit weniger Proben erhalten. In diesem gleichen Studie, p. Tomentosa Eiern wurden mit mehr Sensibilität von screening des Tank Schlamms mit Flotation und Mikroskopie erkannt anstatt Fisch durch PCR und Histopathologie.
Tabelle 1 fasst die unterschiedlichen Merkmale des Sentinel Programme3,4,5,6,7,8,9,10 durch eine Reihe von Zebrafisch Einrichtungen verwendet. Nachfiltrierung Wächter erhalten Wasser auf die gleiche Weise wie jede Kolonie Fisch während Vorfiltration Wächter Wasser erhalten, sobald es durch Kolonie Aquarien zuerst in Umlauf gebracht hat. Zum Beispiel können Vorfiltration Wächter auf dem umlaufenden System eingerichtet werden durch kontinuierlich Ölwanne Vorfluter. Dies kann keine Option sein, wenn in einem Raum gibt es viele unabhängige Systeme. In diesem Fall kann ein Tank der Vorfiltration Wächter verwendet werden, den ganzen Raum auf den Bildschirm. Die Wächter sind in einem statischen Tank aus dem umlaufenden System und ihr Wasser ist regelmäßig, mit nur Vorfiltration Wasser d.h.Sumpf Wasser aus allen Systemen im Raum verändert. Diese Technik ist beschrieben als Grundlage für den Vergleich mit der Wirksamkeit der Umwelt Screening. Die vorgeschlagene Einrichtung soll Wasser Qualitätsprobleme wie eine Abnahme der pH-Wert oder ein Stickstoff-Verschmutzung zu kontrollieren.
Das Konzept des bakteriellen Umwelt Screenings stützt sich auf die Hypothese, die dass die Bakterien nachweisbar im Biofilm wie gefunden an der Ölwanne Wand an der Wasseroberfläche oder in den Schlamm an der Unterseite des Tanks sind. Die Ölwanne scheint eine ideale Aufnahmepunkt in einem umlaufenden Aquakultur-System da es Abfall (Wasser, Kot, Futter und anderes organisches Material sammelt) aus allen Tanks Vorfiltration. Die Oberfläche der Ölwanne ist oft leicht zu erreichen, rückt das Schrubben und zur Vermeidung von Cross-Kontamination der Probe (von Handschuhen zum Beispiel) aseptisch durchgeführt werden kann. Der Begriff wird verwendet, um verbreiteten pathogenen Mycobacterium spp. im Zebrafisch Systeme9,12zu identifizieren. Die Technik wird im folgenden beschrieben und berichten wir auch Nachweis von A. Hydrophila in Zebrafisch Ölwanne Oberfläche Tupfer und Schlamm.
Das ökologische Screening für die Parasiteneier basiert auf der Erkennung von Murray Et al. 13 und die Flotation-Technik wird routinemäßig für Parasitologie und mikroskopische Screening Parasit Eier im Kot14verwendet. Mocho9 vorgeschlagen, eine Alternative zu der Bemusterung und zeigte, dass die Technik verwendet werden könnte, um andere Arten von Fisch Biotop zu erkennen. Infizierten D. Rerio pass p. Tomentosa Eiern mit ihren Kot und die Parasiteneier bleiben an der Unterseite des Tanks in den Schlamm. Sie können dort aufgrund ihrer Dichte größer als Wasser gesammelt werden. Die Dichte der Eier wird verwendet, um die Umwelt Probe zu verarbeiten. Eine erste Börsengang mit Zentrifugation trennt Wasser und leichten Schmutz von schwerer Materie. Eine zweite Zentrifugation stützt sich auf gesättigten Zuckerlösung (mit einer Dichte größer als die Dichte von p. Tomentosa Eiern) um die Parasiteneier entstehen an der Oberfläche des Rohres zu ermöglichen.
Das Screening für Bakterien im Biofilm und p. Tomentosa aus dem Boden des Tanks kann durch die Durchführung von PCR für diese Erreger auf den Schlamm Probe Sediment erhalten nach der ersten Zentrifugation kombiniert werden. Dies optimiert die Abtastzeit. Das Verfahren wird nachfolgend beschrieben. Wir bieten auch diese Techniken in einem Quarantäne-Kontext zu verwenden. Auf dem Bildschirm importierte Erwachsene Zebrafisch, die am Leben gehalten werden müssen, wird ein Zucht-Gerät das Quarantänebecken eingefügt. Nach einer Woche Kot und andere Abfallstoffe in der Zucht-Gerät gesammelt und abgeschirmt durch Mikroskopie oder PCR. Die Technik wird im folgenden beschrieben und einige p. Tomentosa Eiern wurden von Mikroskopie in diesem Zusammenhang erkannt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="683">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Aqua-Sed 250 mL</td>
			<td style="width:140px;">Vetark</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:191px;">2-phenoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tubed Sterile Dryswab Tip</td>
			<td style="width:140px;">mwe</td>
			<td style="width:124px;">MW100</td>
			<td>Sump surface</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric</td>
			<td style="width:140px;">Becton 
			Dickinson</td>
			<td style="width:124px;">300866</td>
			<td style="width:191px;">They are actually 
			graduated to 60 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Centrifuge tube 15 mL Corning</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:229px;">Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing&#8211;Out Rotor (unsealed)</td>
			<td style="width:140px;">Sanyo</td>
			<td style="width:124px;">MSB020.CX1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Cover Glass 22 mm x22 mm</td>
			<td style="width:140px;">Menzel-Glaser</td>
			<td style="width:124px;">MNJ-350-020H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:229px;">Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap</td>
			<td style="width:140px;">Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">F155CA</td>
			<td>Swab sediment from sludge</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">430921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">In-Tank Spawning Tray Set&#160;</td>
			<td style="width:140px;">MBK Installations Ltd</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

environmental screening of aeromonas hydrophila, mycobacterium spp., and pseudocapillaria tomentosa in zebrafish systems

Gesundheit-monitoring-Systeme entwickelt und in Zebrafisch Forschungseinrichtungen eingesetzt, weil Krankheitserreger von Danio Rerio wie Aeromonas Hydrophila, Mycobacterium spp. und Pseudocapillaria Tomentosa das Potenzial haben beeinträchtigen Sie Tierschutz und Forschung. Die Fische sind in der Regel analysiert post-mortem , Mikroben zu erkennen. Die Verwendung der Wächter ist eine vorgeschlagene Möglichkeit, die Empfindlichkeit der Überwachung zu verbessern und die Anzahl der Tiere zu reduzieren. Die Einstellung eines Vorfiltration Sentinel-Tanks aus einem umlaufenden System wird beschrieben. Die Technik ist Verunreinigung des Wassers zu verhindern und die Fischpopulation vertreten durch eine sorgfältige Auswahl von Alter, Geschlecht und Belastungen entwickelt. Um die minimale Anzahl der Tiere zu nutzen, werden Techniken die Umwelt auf den Bildschirm auch detailliert beschrieben. Polymerase Chain Reaction (PCR) auf Oberfläche Ölwanne Tupfer wird verwendet, um die Erkennung einiger weit verbreitet und pathogenen mykobakteriellen Arten wie z. B. Mycobacterium Fortuitum, Mycobacterium Haemophilumund deutlich zu verbessern Mycobacterium Chelonae. Eine weitere ökologische Methode besteht darin, Verarbeitung des Schlamms am unteren Rand einen Fäkalientank oder Sumpf zu p. Tomentosa Eiern suchen. Dies ist eine günstige und schnelle Technik, die in Quarantäne angewendet werden kann, wo ein Zucht-Gerät in den Fäkalientank von importierten Tieren eingetaucht. Zu guter Letzt PCR wird der Schlamm Probe angewendet und A. Hydrophila wird an der Ölwanne Unterseite und Oberfläche erkannt. In der Regel haben diese ökologischen Screening Techniken angewendet, um diese spezifischen Erreger zu einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber der Prüfung der Vorfiltration Wächter geführt.

Die Vorteile der Ölwanne Tupfer verbreitet Mycobacterium spp. im Vergleich zu Fischproben identifizieren werden durch die Ergebnisse in Abbildung 4unterstützt. 115 Fisch getestet wurden M. Chelonae und M. Haemophilum bei 5 % und 3 % der Proben festgestellt. Keine andere Pathogene mykobakteriellen Spezies identifiziert wurde. Aus den gleichen Systemen ergab 49 Ölwanne Tupfer 5 mykobakteriellen Arten. Odds-Ratio werden berechnet mit der Hypothese, dass M. Chelonae und M. Fortuitum häufiger durch PCR in die Oberfläche Ölwanne Tupfer als in der Fisch-Probe erkannt werden. Dies ist statistisch signifikant mit entsprechenden Odds Ratio von 11 (95 % CI: 4, 29; p < 0,0001) und 306 (95 % CI: 18, 5208; p = 0,0001). Die Ergebnisse zeigen, dass die Oberfläche Sumpf-Tupfer-Technik eine wertvolle Alternative für die alleinige Nutzung der Wächter zum Bildschirm der Zebrafisch-Anlage für Mycobacterium SPP ist. Die Umweltproben dienten auch zum Bildschirm für A. Hydrophila. Diese Bakterien wurden in Fisch, Schlamm und Bodenproben (Abbildung 4) nachgewiesen. Dies unterstützt auch die Möglichkeit der vorgeschlagenen Techniken der Fisch Biotop auf den Bildschirm.
Bezüglich der Schlamm-Analyse, p. Tomentosa Eiern zu erkennen erkannt Mocho9 der Parasit in 27 % der Fischproben von PCR und Histopathologie, während die Eizellen in 93 % der analysierten Schlamm aus dem gleichen System erkannt wurden. Hier wurde die Technik herausgefordert, Quarantäne-Screening zu reproduzieren. In diesem Zusammenhang eingeführte Tiere abgetastet werden können nicht, und der Beurteilung ihres Gesundheitszustandes in einer fristgerechten Weise hilft bei der Biosicherheit-Management. Fisch von unbekannten Gesundheitszustand von einer p. Tomentosa positive Einrichtung wurden in 8 Panzer mit Zucht Geräte eingestellt: max. 16 Fische/13 L Tank, 7 transgenen und 1 Wildtyp-Linie gemischt Geschlecht, im Alter von 4-24 Monate. Der Schlamm wurde von den Geräten nach einer Woche geerntet und von Mikroskopie analysiert. P. Tomentosa Eiern wurden in 7 (88 %) Proben gesehen. Schließlich war der PCR-Nachweis von Parasiten auf Sumpf Tupfer und Schlamm Sedimente erprobt. 4 von 6 Schlamm Proben waren PCR positiv und alle Ergebnisse negativ für die Oberfläche Tupfer. Dies ist nicht verwunderlich, da der Schlamm-Screening stützt sich auf die Fähigkeit der Eier fallen auf den Boden des Tanks. Dies zeigt, dass die Schlamm-Analyse-Techniken verwendet werden, um Bildschirm D. Rerio Aquarien für p. Tomentosa Befall und die Methoden für das Screening von importierten Tieren angepasst werden können.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig1.jpg"> Abbildung 1: Vorfiltration Sentinel Tank aus dem umlaufenden System. Ein 8-L-Tank ist voller Wasser und Bio-Medien aus den Sümpfen der Systeme zum Bildschirm. Die beiden weißen Keramik Bio-Medien-Perlen sitzen an der Unterseite des Tanks (Bildmitte). 12 Fische werden nach ihrem Alter, Stamm und Geschlecht ausgewählt, und sie werden hinzugefügt, um die Sentinel-Tank. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55306/55306fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig2.jpg"> Abbildung 2: p. Tomentosa Ei während der Schlamm Analyse von Mikroskopie erkannt. Vergrößerung verwendet wurde 400 X. Pfeile zeigen die zweipolige Stecker. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55306/55306fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig3.jpg"> Abbildung 3: Zucht Gerät unter Wasser in einem Aquarium halten, Schlamm für die Analyse zu sammeln. Dieser Tank befindet sich auf einer Bank für das Bild. Es ist sonst im umlaufenden System eingestellt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55306/55306fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig4.jpg"> Abbildung 4: Anteil der Identifizierung von Mycobacterium spp., A. Hydrophilaund p. Tomentosa mittels PCR auf Fisch, Oberflächen-Sumpf Tupfer und Ölwanne Schlamm. Prozentsatz wird ermittelt, indem die Anzahl der positiven Ergebnisse für jede Art der Erreger durch die Anzahl der untersuchten Proben. Der Anteil der positiven Ergebnisse erhält durch Probentyp als Fisch, Oberfläche oder Schlamm und nach der Bakterien Name angegeben wird. 115 Fisch- und 49 Oberfläche Ölwanne Tupfer wurden mittels PCR zur Identifizierung von Mycobacterium SPP getestet. Die Daten werden mit Mocho9 Ergebnisse zusammengestellt, da es eine Erweiterung dieser Studie ist. Die Fische sind vor allem Vorfiltration Wächter gemäß Protokoll Abschnitt 1. Selten, wenn Wächter nicht zur Verfügung standen, Flüchtlinge und alte Kolonie Fisch (> 18 Monate) gesampelt wurden. Alle getesteten Systeme für Mycobacterium SPP wurden auf Fisch und Ölwanne Tupfer getestet. Odds-Ratio werden berechnet mit der Hypothese, dass M. Chelonae und M. Fortuitum häufiger durch PCR in die Oberfläche Ölwanne Tupfer als in der Fisch-Probe erkannt werden. Dies ist statistisch signifikant mit entsprechenden Odds Ratio von 11 (95 % CI: 4, 29; p < 0,0001) und 306 (95 % CI: 18, 5208; p = 0,0001). Mycobacterium marinum PCR für alle Proben negativ war und ist daher als abwesend aus diesen Einrichtungen und nicht in die Analyse einbezogen. 12 Fisch, 14 Oberfläche Ölwanne Tupfer und 6 Ölwanne Schlamm wurden mittels PCR auf das Vorhandensein von A. Hydrophilagetestet. 6 Ölwannen wurden auf das Vorhandensein von p. Tomentosa an der Oberfläche und im Klärschlamm untersucht. PCR = Polymerase-Kettenreaktion. CI = Konfidenzintervall. * und ** zeigen statistischen Signifikanz; andere Vergleiche waren statistisch nicht signifikant. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55306/55306fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55306/55306vid1.jpg"> Video 1: Scannen für ein Ei der P. Tomentosa mit dem Mikroskop. Die Folie wird aus Klärschlamm Analyse gewonnen, wie unter Punkt 3.1 beschrieben. Das Feld wird gescannt, um ein Ei von p. Tomentosazu erkennen. Sobald eine Struktur zu erkennen ist, wird es vergrößert, um die Identifikation mit einer höheren Auflösung zu bestätigen. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55306/video_scan_for_egg.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Autoren</td>
			<td>Alter bei Beginn der Exposition</td>
			<td>Dauer der Exposition</td>
			<td>Probenahme-Alter</td>
			<td>Pre oder Post Filtration</td>
			<td>Geschlecht</td>
			<td>Angabe</td>
		</tr>
<tr>
<td>Barton Et al. 3
</td>
			<td>4 Monate</td>
			<td>6 Monate</td>
			<td>10 Monate</td>
			<td>Vorfiltration</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Borges Et al. 4
</td>
			<td>6 Monate</td>
			<td>6 Monate</td>
			<td>12 Monate</td>
			<td>Vorfiltration</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AB Wildtyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collymore Et al. 5
</td>
			<td>So jung wie möglich</td>
			<td>3 Monate</td>
			<td>< 6 Monate</td>
			<td>Vorfiltration</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geisler Et al. 6
</td>
			<td>4 Monate</td>
			<td>4 Monate</td>
			<td>8 Monate</td>
			<td>Pre- und post Filtration</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AB Wildtyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>Liu Et al. 7
</td>
			<td>3 Monate</td>
			<td>1-6 Monate</td>
			<td>4-9 Monate</td>
			<td>Pre- und post Filtration</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wildtyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>Martins Et al. 8
</td>
			<td>3 Monate</td>
			<td>3 Monate</td>
			<td>6 Monate</td>
			<td>Vorfiltration</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wildtyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mocho9
</td>
			<td>< 6 Monate 6 - 12 Monate > 18 Monate</td>
			<td>4 Monate</td>
			<td>7 - 24 Monate</td>
			<td>Vorfiltration</td>
			<td>1 Hündin und 1 Rüde von jede Altersgruppe</td>
			<td>AB Wildtyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murray Et al. 10
</td>
			<td>3-4 Monate</td>
			<td>3 Monate, 6 Monate, 1 Jahr</td>
			<td>7, 10 und 16 Monate</td>
			<td>Pre- und post Filtration</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AB Wildtyp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Vergleich der Sentinel-Einstellungen im Zebrafisch Einrichtungen. Die Sentinel-Fische können je nach Alter, Geschlecht oder Belastung ausgewählt werden. Sie sind für einen bestimmten Zeitraum ausgesetzt und Pre- oder Post-Filtration System Wasser erhalten. Die Daten sind zusammengestellt aus 2016 Themenheft Gesundheit der Zebrafisch Journal3,4,5,6,7,8,9, 10.

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Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Sumpf Tupfer und Schlamm Analyse der Zebrafisch Systeme führt zu erhöhten Erkennung im Vergleich zu den alleinigen Einsatz von Wächter, Krankheitserreger wie Aeromonas Hydrophila, Mycobacterium spp. und zu erkennen Pseudocapillaria Tomentosa. Außerdem wird ein System zur Überwachung von p. Tomentosa Eiern in Quarantäne vorgeschlagen.

Environmental Screening von Aeromonas Hydrophila, Mycobacterium spp. und Pseudocapillaria Tomentosa im Zebrafisch-Systeme

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, ...

environmental-screening-aeromonas-hydrophila-mycobacterium-spp

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

9.7K Aufrufe.  The Francis Crick Institute. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Sumpf Tupfer und Schlamm Analyse der Zebrafisch Systeme führt zu erhöhten Erkennung im Vergleich zu den alleinigen Einsatz von Wächter, Krankheitserreger wie Aeromonas Hydrophila, Mycobacterium spp. und zu erkennen Pseudocapillaria Tomentosa. Außerdem wird ein System zur Überwachung von p. Tomentosa Eiern in Quarantäne vorgeschlagen.

Serie: Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Mit Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) zu Diagnose-Tools entwickeln

Forschung

Biologie

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in the environment, as well as directly for the transmission of pathogens to drinking water supplies. Natural porous media is composed of an intricate physical topology, varied surface chemistries, dynamic gradients of nutrients and electron acceptors, and a patchy distribution of microbes. These features vary substantially over a length scale of microns, making the results of macro-scale investigations of microbial transport difficult to interpret, and the validation of mechanistic models challenging. Here we demonstrate how simple microfluidic devices can be used to visualize microbial interactions with micro-structured habitats, to identify key processes influencing the observed phenomena, and to systematically validate predictive models. Simple, easy-to-use flow cells were constructed out of the transparent, biocompatible and oxygen-permeable material poly(dimethyl siloxane). Standard methods of photolithography were used to make micro-structured masters, and replica molding was used to cast micro-structured flow cells from the masters. The physical design of the flow cell chamber is adaptable to the experimental requirements: microchannels can vary from simple linear connections to complex topologies with feature sizes as small as 2 &mu;m. Our modular EcoChip flow cell array features dozens of identical chambers and flow control by a gravity-driven flow module. We demonstrate that through use of EcoChip devices, physical structures and pressure heads can be held constant or varied systematically while the influence of surface chemistry, fluid properties, or the characteristics of the microbial population is investigated. Through transport experiments using a non-pathogenic, green fluorescent protein-expressing Vibrio bacterial strain, we illustrate the importance of habitat structure, flow conditions, and inoculums size on fundamental transport phenomena, and with real-time particle-scale observations, demonstrate that microfluidics offer a compelling view of a hidden world.

Microfluidic devices can be used to visualize complex natural processes in real time and at the appropriate physical scales. We have developed a simple microfluidic device that mimics key features of natural porous media for studying growth and transport of bacteria in the subsurface.

Fenster an einem Microworld: Einfache mikrofluidische Systeme für Studium Mikrobielle Transport in porösen Medien

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Basierend HeLa Zellfreie Expressionssysteme zur Expression von<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale quantitative phenotypic measurements from cells. This approach has proved powerful for deepening our understanding of a wide range of both fundamental and applied events in cell biology. To date, the majority of applications for this technology have relied on the use of cells grown in monolayers, although it is increasingly realized that such models do not recapitulate many of the interactions and processes that occur in tissues. As such, there has been an emergence in the development and use of 3-dimensional (3D) cell assemblies, such as spheroids and organoids. Although these 3D models are particularly powerful in the context of cancer biology and drug delivery studies, their production and analysis in a reproducible manner suitable for HCS and HCA present a number of challenges. The protocol detailed here describes a method for the generation of multicellular tumor spheroids (MCTS), and demonstrates that it can be applied to three different cell lines in a manner that is compatible with HCS and HCA. The method facilitates the production of several hundred spheroids per well, providing the specific advantage that when used in a screening regime, data can be obtained from several hundred structures per well, all treated in an identical manner. Examples are also provided, which detail how to process the spheroids for high-resolution fluorescence imaging and how HCA can extract quantitative features at both the spheroid level as well as from individual cells within each spheroid. This protocol could easily be applied to answer a wide range of important questions in cell biology.

This protocol details a method for the production of three different types of spheroids in a manner that makes them suitable for large-scale high-content screening and analysis. In addition, examples are presented showing how they can be analyzed at spheroid and individual cell levels.

Eine robuste Methode für die großtechnische Produktion von Sphäroiden für High-Content-Screening- und Analyseanwendungen

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an incredible diversity of microbial life and can be a good source of these bioremediative fungi. This work aims to search for soil fungi with bioremediation potential by using different screening tests. Mineral culture media supplemented with recalcitrant substances as the sole carbon source were used as growth tests. First, soil dilutions were plated on Petri dishes with mineral medium amended with humic acids or lignocellulose. The growing fungal colonies were isolated and tested on different substrates, such as complex mixtures of hydrocarbons (petrolatum and used motor oil) and powders of different plastic polymers (PET, PP, PS, PUR, PVC). Qualitative enzymatic tests were associated with the growth tests to investigate the production of esterases, laccases, peroxidases, and proteases. These enzymes are involved in the main degradation processes of recalcitrant material, and their constitutive secretion by the examined fungal strains could have the potential to be exploited for bioremediation. More than 100 strains were isolated and tested, and several isolates with good bioremediation potential were found. In conclusion, the described screening tests are an easy and low-cost method to identify fungal strains with bioremediation potential from the soil. In addition, it is possible to tailor the screening tests for different pollutants, according to requirements, by adding other recalcitrant substances to minimal culture media.

Here, we present a protocol for screening soil biodiversity to look for fungal strains involved in the degradation of recalcitrant materials. First, fungal strains able to grow on humic acids or lignocellulose are isolated. Their activity is then tested both in enzymatic assays and on pollutants such as hydrocarbons and plastics.