This study was supported by the Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).

1. Coimmunpräzipitation <ol><li> Seed HEK293 Zellen bei 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung in eine 6-Well - Platte in 2 ml nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) Nahrungsergänzungsmittel mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) . </li><li> Wachsen Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Wasche die Zellen mit kalter Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) dreimal. Ernte die Zellen durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie Kern- und Cytoplasma-Fraktionen kommerziellen Kern und Cytoplasma-Extraktion unter Verwendung von Reagenzien. Folgen Sie Anweisungen des Herstellers mit einigen Modifikationen. <ol><li> Verwenden 3 x 10 6 Zellen für einen Co-Immunpräzipitation Experiment (ungefähr 90% Konfluenz von 3 Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen). In 300 ul kalten Cytoplasma-Extraktionslösung (CER I) und Vortex 15 Sekunden lang mit der höchsten Geschwindigkeit. </li><li> Inkubieren für 30 Minuten auf Eis. Während der Inkubation Vortex für 5 s alle 10 min. </li><li> In 16,5 ul kalt zytoplasmatischen Extraktionslösung II (CER II), Vortex für 5 Sekunden und Inkubation für 5 min auf Eis. </li><li> Rührers 5 sec und Zentrifuge bei 16.000 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand (Zytoplasmaextrakt) in eine neue vorgekühlte Rohr und auf Eis halten, bis sie verwendet. </li><li> Waschen Sie unlöslichen Pellets (mit Kernen) dreimal mit 1 ml kaltem PBS jedes Mal durch Auf- und Abpipettieren fünfmal. Entfernen PBS nach dem Waschen. </li><li> In 150 ul kalten Kernextraktionslösung (NER), Vortex für 15 Sekunden und Inkubation 1 Stunde auf Eis. Während der Inkubation Vortex für 15 Sekunden und Pipette 10 mal mit einer 200 ul Spitze alle 10 min. </li><li> Vortex für 15 s und Zentrifuge bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand (Kernextrakt) in eine neue vorgekühlte Röhrchen, auf Eis halten bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Nehmen Sie 10% des Volumens der Kern- und Zytoplasmaextrakte jeweils als Eingänge. </li><li> EINdd kaltem PBS auf die verbleibenden Extrakte auf ein Endvolumen von 1 ml. Halten Sie sich auf Eis bis zum Gebrauch. HINWEIS: Pre-Clearing nicht wesentlich ist, wenn Protein G-konjugierten magnetischen Kügelchen verwendet wird. Wenn jedoch der Hintergrund hoch ist, führen Pre-Clearing von 40 &amp; mgr; l Protein G-konjugierten magnetischen Kügelchen inkubiert (50% Slurry) und 1 ml für 30 min auf einem Rotator Lysat aus diesem Schritt bei 4 ° C verdünnt. Separate Überstand (bereits geklärten Lysat) von Perlen mit Magnethalter. Entsorgen Sie die Perlen. </li><li> Zu kuppeln primäre Antikörper mit Protein G-konjugierten magnetischen Kügelchen, inkubiere 40 &amp; mgr; l Protein G-konjugierten magnetischen Kügelchen (50% ige Aufschlämmung) mit 4 &amp; mgr; g Kaninchen-polyklonalen Anti-RBM3 Antikörper oder Kaninchen-IgG (negative Kontrolle) in 200 &amp; mgr; l PBS plus Tween 20 Puffer (PBST, 0,02% Tween 20) bei Raumtemperatur (RT) für 40 min auf einem Rotator. </li><li> Separate Antikörper-gekoppelten Kügelchen und der Überstand mit einem Magnetträger, und den Überstand verwerfen. Waschen Sie die Perlen einmal mit 200 ul PBST (0,02%). </li><li> 1ml verdünnt Lysaten (oder, falls erforderlich, bereits geklärten Lysate) an die Kügelchen, und über Nacht bei 4 ° C auf einem Rotator inkubiert. </li><li> Am nächsten Tag, trennen Sie die Perlen und Überstand durch einen Magnetträger, und den Überstand verwerfen. Waschen 3 x 10 min mit 0,5 ml PBST (0,02%) für jedes Röhrchen bei 4 ° C auf einem Rotator mit einer festen Drehzahl von 20 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Eluieren von Proteinen aus den Perlen durch 40 &amp; mgr; l Probenpuffer Zugabe (1x Handelsprobenpuffer und 50 mM 1,4-Dithiothreitol (DTT)). Hitze bei 70 ° C für 10 min. Spin down und Übertragungsflüssigkeiten in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Verdünnte Eingangs Lysate in Probenpuffer (Endkonzentration: 1x Handelsprobenpuffer und 50 mM DTT) und Wärme bei 70 ° C für 10 min. Lasteingänge und immunpräzipitiert Proteine ​​aus dem letzten Schritt zu einer vorgegossenen 4-12% Bis-Tris-Gel. Das Ladevolumen von jeder Vertiefung sollte nicht mehr als 20 &amp; mgr; l nicht überschreiten. Führen Elektrophorese in 1x kommerziellen Laufpuffer auf Eis für 35 min. HINWEIS: Legen Sie nuklearen und Zytoplasmaextrakts in einem Verhältnis von 1: 2 (V / V), die den gleichen Anfangsmenge an Zellen widerspiegelt. </li><li> Transfer-Proteine ​​auf PVDF-Membran in 1x Handelstransferpuffer bei 30 V für 2 h bei 4 ° C. </li><li> Block-Membran mit 5% Magermilch in PBST (0,1% Tween 20) bei RT für 40 min auf einem Schüttler. </li><li> Inkubieren Membran mit primärem Antikörper (beide in einer Verdünnung von 1: 1000) in PBST (0,1%) bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Waschen 3 x 10 min mit PBST (0,1%) bei RT auf einem Schüttler. </li><li> Inkubieren Membran mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem Anti-Maus oder Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (beide in einer Verdünnung von 1: 5000) in PBST (0,1%) bei RT für 1 Std. </li><li> Waschen 3 x 10 min mit PBST (0,1%) bei RT auf einem Schüttler. </li><li> Verwenden 0,2 ml verstärkte Chemilumineszenz (ECL) Substratmischung pro cm 2 Membran, inkubiere 5 min bei RT. Vermeiden Sie alles Licht von diesem Schritt ab, außer roten Ampeln. </li><li> Verwerfen Flüssigkeit und belichten zu einem Röntgenfilm in einer Filmkassette. Entwickeln Film einen automatischen Film pr mitHOLZBEARBEITUNGS- Maschine. </li></ol> 2. Immunzytochemie und Proximity Ligation Assay <ol><li> Seed HEK293 - Zellen mit 1,5 × 10 4 Zellen pro Kammer in einem 8-Kammer poly-D-Lysin beschichteten Objektträger in 0,4 ml DMEM mit 10% FBS ergänzt und 100 U / ml Pen-Strep. </li><li> Wachsen Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Absaugen Medium und fixieren Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei RT. </li><li> Absaugen PFA und waschen 3 x 10 min mit 0,5 ml PBS pro Kammer. </li><li> Permeabilisieren und Block-Zellen mit 0,5% Triton X-100 und 5% normalem Ziegenserum (NGS) in PBS bei RT für 1 Std. </li><li> Inkubieren mit primärem Antikörper in 0,1% Triton X-100 und 5% NGS in PBS auf einem Schüttler bei 4 ° C über Nacht. Verdünnte Maus monoklonaler anti-NF90 Antikörper und polyklonalem Kaninchen-anti-RBM3 Antikörper 1: 100 in PBS für Doppelfärbung. Für negative Kontrolle wegzulassen unabhängig eine der beiden primären Antikörper und wegzulassen beide Antikörper in einem dritten Steuer. HINWEIS: Verwenden Sie kommerzielle Blockierung und Verdünnungs Reagenzien verwenden nicht. </li><li> Waschen Sie 3 x 10 min mit 0,5 ml PBS pro Kammer. </li><li> Vorbehaltlich Immunzytochemie oder Nähe Ligatur Assay - Protokolle <ol><li> Immunzytochemie <ol><li> Inkubieren mit 1: 500 verdünnt grün fluoreszierender Farbstoff-gekoppelten anti-Maus und roten Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper bei RT für 1 Std. Vermeiden Sie Licht, das von diesem Schritt ab. </li><li> Gegenfärbung Kerne mit 4 &#39;, 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI), verdünnt 1: 5.000 in PBS bei RT für 10 min. </li><li> Waschen Sie 3 x 10 min mit 0,5 ml PBS pro Kammer. </li><li> Entfernen Sie die Kammern aus dem Glasträger und trocken. Montieren Sie mit 250 μ, Eindeckmedium pro Folie. </li></ol></li><li> Proximity-Ligation-Assay <ol><li> Bereiten Nähe Ligatur Assay-Sonden. Mischen und Verdünnen zwei Proximity Ligation Assay-Sonden (anti-Maus und Anti-Kaninchen-Sekundär mit verschiedenen Oligonukleotiden gebunden Antikörper, die th ligieren kannrough die Zugabe von zwei weiteren Oligonukleotiden in Ligationslösung) beide 1: 5 in 0,1% Triton X-100 und 5% NGS in PBS, mit einem Gesamtvolumen von 320 &amp; mgr; l für eine 8-Kammerobjektträger (etwa 40 &amp; mgr; l pro cm 2) . 20 min bei RT inkubiert. </li><li> Entfernen Sie die Kammern aus dem Objektträger aus Glas und fügen Sie die verdünnten Sonden. Inkubieren in einer feuchten Inkubator bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Bereiten Sie Ligierungslösung. Mischen Sie 8 ul - Ligase, 64 ul 5 x Ligatur Lager und 248 &amp; mgr; l H 2 O. </li><li> Abklopfen die Flüssigkeit aus der Folie, und waschen 2 x 5 min in 1x Waschpuffer A (versehen mit dem Kit). </li><li> Hinzufügen Ligationslösung und Inkubieren in einer feuchten Inkubator bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Bereiten Sie Amplifikationslösung. Mix 4 ul - Polymerase, 64 &amp; mgr; l 5x Verstärkung Lager und 252 &amp; mgr; l H 2 O Vermeiden Sie Licht von diesem Schritt ab. </li><li> Abklopfen Flüssigkeit aus dem Schlitten und waschen 2 x 2 min in 1x Wash Buffer A. </li><li> Fügen Sie den Verstärkerlification Lösung und für 100 min bei 37 ° C in einer dunklen Feuchte Inkubator inkubiert. </li><li> Abklopfen die Flüssigkeit aus der Folie, und waschen 2 x 10 min in 1x Waschpuffer B (im Lieferumfang des Kits). Waschen Sie für 1 min in 0,01x Waschpuffer B. </li><li> Trocknen Sie die Rutsche und Halterung mit 250 &amp; mgr; l eines handelsüblichen Montagemedium (mit DAPI) pro Folie. </li></ol></li></ol></li><li> Untersuchen Sie Fluoreszenzsignale unter einem Mikroskop mit einem 10x Okular Objektiv und 20X Objektiv verwendet wird. Erwerben Sie Bilder von einer CCD-Kamera. </li></ol>

<ol>
	<li>Pati&#241;o, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF90+isoforms,+a+new+family+of+cellular+proteins+involved+in+viral+replication?.">NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?.</a> Biochimie. 108, 20-24 (2015).</li><li>Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+of+NF90+is+required+for+interleukin-2+mRNA+stabilization.">Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization.</a> Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NF90-NF45+complex+functions+as+a+negative+regulator+in+the+microRNA+processing+pathway.">The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway.</a> Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).</li><li>Dresios, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+stress-induced+protein+Rbm3+binds+60S+ribosomal+subunits,+alters+microRNA+levels,+and+enhances+global+protein+synthesis.">Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).</li><li>Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+expression+of+mouse+Rbm3,+a+cold-shock+protein,+in+Sertoli+cells+of+cryptorchid+testis.">Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).</li><li>Wellmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-regulated+expression+of+the+RNA-binding+proteins+RBM3+and+CIRP+by+a+HIF-1-independent+mechanism.">Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).</li><li>Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-inducible+RBM3+inhibits+PERK+phosphorylation+through+cooperation+with+NF90+to+protect+cells+from+endoplasmic+reticulum+stress.">Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress.</a> FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).</li><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-immunoprecipitation+of+the+Mouse+Mx1+Protein+with+the+Influenza+A+Virus+Nucleoprotein.">Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).</li><li>Jarvius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+phosphorylated+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta+using+a+generalized+proximity+ligation+method.">In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-protein+interactions+in+cross-talk+pathways+reveals+CRKL+protein+as+a+novel+prognostic+marker+in+hepatocellular+carcinoma.">Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Es gibt mehrere Vorteile sowie Nachteile für beide Methoden. Als eine relativ neue Technik, ein offensichtlicher Vorteil Proximity Ligation Assay ist die Durchführbarkeit Protein-Protein-Wechselwirkungen auf Einzelzellebene statt einer Charge von heterogenen Zellen aufzuklären. Bilder mit hoher Auflösung und Größe (zB durch konfokale Mikroskop) bieten die Möglichkeit zur Quantifizierung von einzelnen fluoreszierenden Flecken zu zählen. Im Gegensatz dazu kann die herkömmliche Kombination von Co-Immunpräzipitation mit Western-Blot-Technik nur Proteinbanden semi-quantitativ, vor allem, weil eine geeignete Ladesteuerung schwierig ist, für IP-Proben zu bestimmen. Zusätzlich wird , wenn Protein-Protein - Wechselwirkung ist schwach oder transient, eine große Menge von biologischem Material, beispielsweise Zellen oder Gewebe, für die Co-Immunpräzipitation oder einem künstlichen überexprimierenden System mit Fused - Tag angewendet wird benötigt, um die Chance zu erhöhen , die Wechselwirkungen zu detektieren . Alternativ Erkennung techniques mit hoher Empfindlichkeit wie Massenspektrometrie kann das Experiment Qualität zu verbessern. in Bezug auf die Menge an Ausgangsmaterial weist jedoch das Proximity Ligation Assay-Verfahren klare Vorteile. Nur wenige Zellen benötigt werden, vorgesehen, um eine hohe Qualität der Antikörper gegeben. Weiterhin kann in Gewebeproben, in situ Darstellung von Protein-Protein - Wechselwirkungen in verschiedenen Gewebestrukturen und Zelltypen durch Proximity Ligation Assay erreicht werden, in einem ähnlichen Muster wie normale Immunhistochemie. Im Gegensatz dazu Co-Immunpräzipitation ist naturgemäß nicht geeignet, die räumliche Verteilung von Protein-Protein-Wechselwirkungen anzuzeigen. In Zellen mit großen Kernen, aber kleine cytoplasmatischen Kompartimenten, ist die Nähe Ligatur Testverfahren beschränkt bei der Analyse von Kern zytoplasmatischen Verteilungen und traditionelle Coimmunpräzipitation hat seine eigene Überlegenheit. Beispielsweise in T - Lymphozyten - Zelllinien, beispielsweise Jurkat - Zellen, kern zytoplasmatischen distriträge von NF90-RBM3 Wechselwirkung durch Ligation Assay-Technik Nähe eingeschränkt ist, weil der Kern fast den ganzen Raum im Inneren der Zelle einnimmt, und es ist schwierig, die Grenze der cytoplasmatischen Kompartiment zu identifizieren. Dies kann ein häufiges Problem für Immunzytochemie im Allgemeinen sein, wenn der Kern-Zytoplasma-Verhältnis extrem unausgewogen ist. Jedoch ist Co-Immunpräzipitation in dieser Situation zu dieser Begrenzung unterliegt. Ein besonderes Anliegen in Bezug auf die Nähe Ligatur-Test ist, ob die Signale von der Nähe Ligatur Test repräsentieren direkte oder indirekte Protein-Protein-Wechselwirkungen. Sowohl NF90 und RBM3 haben RNA-Bindungseigenschaften und ihre Wechselwirkung hängt von RNA, wie in unserer früheren Studie 7 berichtet. Somit Vorbehandlung von Zelllysaten mit RNase löst Wechselwirkung zwischen NF90 und RBM3 und nichts nachweisbar ist durch Coimmunpräzipitation Methode 7. Jedoch ist die Proximity Ligation Assay Signal nicht beeinflusstselbst wenn eine RNA-abhängige Protein-Protein-Wechselwirkung verliert der RNA-Spezies, wie sie erzeugt wird, wenn der Abstand zwischen zwei Proteinen weniger als 40 nm, die üblicherweise als eine direkte Interaktion betrachtet wird. Diese Eigenschaft des Proximity Ligation Assay kann technische Probleme von Co-Immunpräzipitation, wie RNase Freisetzung in Zelllysat zu überwinden, die die Wechselwirkungen erfordern RNA Vermittlungs abschaffen kann. Jedoch auf der anderen Seite kann die Proximity Ligation Assay-Verfahren auch falsche positive Signale zu erzeugen, wenn die RNA-abhängige Protein-Protein-Wechselwirkung nicht tatsächlich aufgrund des Fehlens spezifischer RNA in physiologischen Bedingungen existieren. Ein weiteres Thema besondere Aufmerksamkeit verdient ist die Spezifität der primären Antikörper und die Möglichkeit der Proteinisoformen, Vorprodukte und Proteinaggregate. Wir beobachteten , durch Western - Blot , dass die lange NF90 Isoform, NF110, ist viel weniger reichlich in beiden Zellkern und Zytoplasma in HEK293 - Zellen im Vergleich zu NF90 (FiAbbildung 1). Jedoch Co-Immunpräzipitation entwirrt eine höhere Bindungsaffinität zu NF110 RBM3 besonders in Kern. Drei Hauptbanden wurden in RBM3 Blots in Nucleus entdeckt, sondern nur die 20 kDa-Bande wurde normales RBM3 hauptsächlich in Zytoplasma beobachtet. Ob die beiden anderen 50 kDa und 100 kDa-Banden RBM3 Isoformen reflektieren, Vorläufer, Proteinaggregate mit gebundenen RBM3 oder waren aufgrund unspezifischer Hintergrund bleiben aufgeklärt werden. Stattdessen, da Assay der Annäherungs Ligierung auf Immunofärbung basiert, können die Proximity Ligation Assay unterscheidet nicht den Unterschied zwischen verschiedenen Protein-Isoformen, Vorläufern, Aggregate oder unspezifische Färbung, während Co-Immunpräzipitation weitere Informationen über die Antikörperspezifität oder Protein-Isoformen und Vorläufern als das zur Verfügung stellen kann Proximity Ligation Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen in zu untersuchen. RBM3 Bezug, wenn alle drei RBM3 Bands in Nukleus beobachtet Berücksichtigung der Western-Blot-Ergebnis steht im Einklang mit überwiegendem Kerne localizatiauf der RBM3 durch Immunfärbung beobachtet. Abschließend beide Coimmunpräzipitation und Proximity-Ligation-Assay-Techniken haben wesentliche Vorteile und Einschränkungen. In vielen Fällen produzieren sie konsistente Ergebnisse, aber es ist vorteilhaft, beide Techniken zu verwenden, wenn systematisch bestimmte Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Doch in besonderen Fällen oder mit bestimmten Zweck könnte man Überlegenheit als die anderen zeigen. Vor kurzem Proximity Ligation Assay wurde zum Screenen von Protein-Protein - Wechselwirkungen verwendet worden 12 neuartige prognostische Marker zu entwickeln. Protein-Protein-Wechselwirkung wird als zuverlässiger Biomarker als ein einziges Protein angesehen. In Zukunft können die Proximity Ligation Assay werden potentiell eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit, Protein-Protein-Wechselwirkungen als diagnostische und prognostische Biomarker in Kliniken zu analysieren, wobei die Identifizierung und Charakterisierung dieser Biomarker noch die üblichen Co-immuoprecipication me erfordertthode.

Nuclear factor 90 (NF90) ist ein Multi-Isoform - Proteins mit zahlreichen Funktionen , einschließlich der Reaktion auf eine virale Infektion, die Regulierung von Interleukin-2 post-Transkription und Regulierung der miRNA Biogenese 1-3. RBM3 ist ein RNA-bindendes Protein, involviert in Translation und miRNA Biogenese und kann durch verschiedene Stressoren einschließlich Hypothermie und Hypoxie 4-6 induziert werden. Vor kurzem fanden wir NF90 und RBM3 in einem Proteinkomplex 7. Das Zusammenspiel von NF90 und RBM3 ist essentielles Protein - Kinase - RNA-ähnliche Endoplasmatischen Retikulum - Kinase (PERK) Aktivität in ungefalteten Protein - Reaktion 7 zu modulieren. Sowohl NF90 und RBM3 befinden sich überwiegend im Kern aber einem geringen Anteil an NF90 und RBM3 Shuttle in das Zytoplasma und binden dort miteinander für bestimmte Funktionen, beispielsweise PERK Aktivität zu regulieren. Daher ist es wichtig, die Verteilung von NF90-RBM3 Wechselwirkungen in dem subzellulären Kompartiment zu visualisieren, die anzeigen kannihre verschiedenen Rollen in den jeweiligen Fach. Vor Jahrzehnten, Hefe - Zwei - Hybrid (Y2H) wurde die Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen 8 zu erkennen , entwickelt. Aufgrund künstliche Konstruktion von Fusionsproteinen, falsch-positive Ergebnisse haben die Anwendung dieses Verfahrens beschränkt. Für eine lange Zeit, Co-Immunpräzipitation war das Haupt Technik Protein-Protein - Wechselwirkungen, insbesondere in endogener Bedingungen 9 zu analysieren. Um die Co-immunpräzipitiert Proteinkomplex zu analysieren, Western-Blot ist die bequemste Methode, während der Massenspektrometrie verwendet wird, wenn Super Empfindlichkeit und Genauigkeit erwünscht sind. In den letzten Jahren Proximity Ligation Assay wurde als ein neues Verfahren entwickelt worden , Protein-Protein - Wechselwirkungen in beiden Zellen und Gewebe in situ 10,11 zu erkennen. Hier verglichen wir die beliebtesten Coimmunpräzipitation Verfahren und relativ neuartige Nähe Ligatur Testverfahren in NF9 Erfassung0-RBM3 Interaktion in subzellulären Fraktionen. Wir diskutierten auch die Vorteile und Grenzen beider Techniken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>High glucose 
			4500 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (PenStrep)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRBP76 (NF90/NF110) antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>612154</td>
			<td>use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBM3 antibody</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>14363-1-AP</td>
			<td>use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamin A/C antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2032</td>
			<td>use 1:1000 for WB&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8245</td>
			<td>use 1:1000 for WB&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal rabbit IgG</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG, HRP-lined secodary antiboy</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#7074</td>
			<td>use 1:5000 for WB&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse HRP secondary antibody</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4759.1</td>
			<td>use 1:5000 for WB&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Blotting Substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td>
			<td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP00061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX X-ray film</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>4741029230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide</td>
			<td>Corning BioCoat</td>
			<td>354632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink PLA&#160; probe Anti-rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink Wash Buffers Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AX-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>SPOT</td>
			<td>Insight 2MP Firewire</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>Super RX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film processing machine</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>FPM-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of protein-protein interaction in nuclear and cytoplasmic fractions by co-immunoprecipitation and in situ proximity ligation assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.
Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.

Abbildung 1 zeigt , dass NF90 und RBM3 sind beide Kernproteine und nur ein kleiner Teil ist in das Zytoplasma. Bemerkenswert ist, gibt es drei verschiedene Bands für RBM3 positiv gefärbt. Die kleinste knapp unter 20 kDa die richtige Größe der RBM3 reflektiert (das vorhergesagte Molekulargewicht von RBM3 ist 17 kDa). Der Ursprung der beiden anderen Bänder noch untersucht werden. Co-Immunpräzipitationsexperimenten mit RBM3 als Köder-Protein ergab, dass NF90-RBM3 Wechselwirkungen sind überwiegend in den Zellkern und einer Minderheit im Zytoplasma. Co-Immunpräzipitation Daten unterstützt die Lokalisierung jedes einzelnen Proteins. Wie in 2A gezeigt, sind NF90 und RBM3 hauptsächlich im Kern befindet , sondern auch im Zytoplasma in situ. Beide Proteine ​​zeigen perfekte Co-Lokalisation in beiden Fächern. Proximity-Ligation-Assay zeigte das Mustervon NF90-RBM3 Wechselwirkungen, die zu herkömmlichen Immunzytochemie sehr ähnlich ist, wobei die meisten Interaktionen in Nukleus in der Mehrzahl der Zellen. Nur ein kleiner Anteil der Zellen zeigten überwiegend Cytoplasma-Verteilung von NF90-RBM3 Wechselwirkungen. Zusammen, Co-Immunpräzipitation und Proximity Ligation Assay Techniken reflektieren im Prinzip das gleiche Verteilungsmuster von Protein-Protein-Wechselwirkungen in nuklearen und zytoplasmatischen Kompartimente. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55218/55218fig1.jpg" /> Abbildung 1: Western - Blot - Analyse von NF90 und RBM3 und deren Wechselwirkungen in Kern- und Cytoplasma - Fraktionen von HEK293 - Zellen. 2 (V / V), die gleiche Menge an Zellen widerspiegelt, wie im Extraktionsprotokoll angegeben: Kern- und cytoplasmatische Extrakte wurden einer SDS-PAGE-Gel in einem Verhältnis von 1 geladen. Lamin und GAPDH wurden als Kern verwendetund zytoplasmatische Marker, respectively. Co-Immunpräzipitation mit anti-RBM3 Antikörper oder Kaninchen-IgG als Negativkontrolle durchgeführt. 2 (v / v), jeweils: Kern- und cytoplasmatische Extrakte wurden auch mit anti-RBM3 Antikörper in einem Verhältnis von 1 inkubiert. Oberes Band in NF90-Blot zeigt 110 kDa lange Isoform NF110. N: Kernextrakt; C: Zytoplasmaextrakt, IP: Immunpräzipitation. Protein-Marker wurden für RBM3 positive Banden markiert. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55218/55218fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55218/55218fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55218/55218fig2.jpg" /> Abbildung 2: Immunzytochemie und Proximity Ligation Assay von HEK293 - Zellen. (A) Doppel-Anfärbung von HEK293 - Zellen mit anti-NF90 (grün) und anti-RBM3 (rot) Antikörper. Pfeil zeigen Zellen mit klaren Zytoplasma-Co-Lokalisation von NF90 und RBM3. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. (B) Proximity - Ligation - Assay mit anti-NF90 und anti-RBM3 Antikörper in HEK293 - Zellen. Rot fluoreszierende Flecken zeigen NF90-RBM3 Wechselwirkungen. Die Pfeile zeigen NF90-RBM3 Wechselwirkungen im Zytoplasma. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Negative Kontrolle 1 (NC 1): beide primäre Antikörper weggelassen wurden. Negative Kontrolle 2 (NC 2): RBM3 einzigen primären Antikörper nur. Negativkontrolle 3 (NC 3): NF90 einzigen primären Antikörper nur. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55218/55218fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55218/55218fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.

Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

visualization-protein-protein-interaction-nuclear-cytoplasmic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

12.7K Aufrufe.  University of Basel. Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.

Serie: Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Forschung

Biochemie

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for skin-care cosmetics. The goals of the protocol are: (1) to process chicken feathers into KH by alkaline-enzymatic hydrolysis and purify it by dialysis, and (2) to test if adding KH into an ointment base (OB) increases hydration of the skin and improves skin barrier function by diminishing transepidermal water loss (TEWL). During alkaline-enzymatic hydrolysis feathers are first incubated at a higher temperature in an alkaline environment and then, under mild conditions, hydrolyzed with proteolytic enzyme. The solution of KH is dialyzed, vacuum dried, and milled to a fine powder. Cosmetic formulations comprising from oil in water emulsion (O/W) containing 2, 4, and 6 weight% of KH (based on the weight of the OB) are prepared. Testing the moisturizing properties of KH is carried out on 10 men and 10 women at time intervals of 1, 2, 3, 4, 24, and 48 h. Tested formulations are spread at degreased volar forearm sites. The skin hydration of stratum corneum (SC) is assessed by measuring capacitance of the skin, which is one of the most world-wide used and simple methods. TEWL is based on measuring the quantity of water transported per a defined area and period of time from the skin. Both methods are fully non-invasive. KH makes for an excellent occlusive; depending on the addition of KH into OB, it brings about a 30% reduction in TEWL after application. KH also functions as a humectant, as it binds water from the lower layers of the epidermis to the SC; at the optimum KH addition in the OB, up to 19% rise in hydration in men and 22% rise in women occurs.

The goal of the protocol is to prepare keratin hydrolysate from chicken feathers by alkaline-enzymatic hydrolysis and to test whether adding keratin hydrolysate into a cosmetics ointment base improves skin barrier function (heightening hydration and diminishing transepidermal water loss). Tests are conducted on men and woman volunteers.

Vorbereitung der Keratin-Hydrolysat aus Hühnerfedern und ihre Anwendung in der Kosmetik

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA is a novel transcription activator found specifically in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia. Protein pulldown assays using affinity beads have revealed that GrgA binds two &#963; factors, namely &#963;66 and &#963;28, which recognize different sets of promoters for genes whose products are differentially required at developmental stages. We have used BLI to confirm and further characterize the interactions. BLI demonstrates several advantages over pulldown: 1) It reveals real-time association and dissociation between binding partners, 2) It generates quantitative kinetic parameters, and 3) It can detect bindings that pulldown assays often fail to detect. These characteristics have enabled us to deduce the physiological roles of GrgA in gene expression regulation in Chlamydia, and possible detailed interaction mechanisms. We envision that this relatively affordable technology can be extremely useful for studying transcription and other biological processes.

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interactions of transcription factors (TFs) with the RNA polymerase are usually studied using pulldown assays. We apply a Biolayer Interferometry (BLI) technology to characterize the interaction of GrgA with the chlamydial RNA polymerase. Compared to pulldown assays, BLI detects real-time association and dissociation, offers higher sensitivity, and is highly quantitative.

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...