This work was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF), funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (Grants NRF-2015M3C7A1028790); and by a grant from the Korea Health Technology R&amp;D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health &amp; Welfare, Republic of Korea (HI14C3347).

1. Herstellung von Materialien und Kulturmedium <ol><li> Für die Präparation und Dissoziation des SCZ, wickeln Sie das Gehirn Matrix, zweischneidigen Rasierklinge und Zange mit Aluminiumfolie, und sie dann im Autoklaven sterilisiert werden. </li><li> Vorbereitung 50 ml kaltem PBS-Puffer das gesamte Gehirn der Maus zu waschen. </li><li> Legen Sie ein Präpariermikroskop und bereiten die chirurgischen Instrumente für die Präparation des Gehirns erforderlich (autoklaviert Schere und Pinzette) und die Isolierung des SCZ (1 ml Spritze, 30 G-Nadel, Gehirn-Matrix und einer feinen Pinzette). </li><li> Herstellung von N2 Medium: <ol><li> Bereiten F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + Natriumbicarbonat) -Medium mit 2% B27, 1% N2 Ergänzungsmittel, und 1% Penicillin-Streptomycin. Hinweis: Das Wachstumsmedium besteht aus N2-Medium und Wachstumsfaktoren (20 ng / ml gereinigten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF2)). </li></ol></li><li> Bereiten Sie einen Verdauungspuffer (40 Einheiten / ml Papain, 2,4 Einheiten / ml DISPASII e und 2% Penicillin-Streptomycin in PBS) für eine Gewebe Verdauung. </li><li> Herstellung von Beschichtungs Plate und Deckglas: <ol><li> Bereiten poly-L-Ornithin (PLO; 0,01%) und Laminin (10 ug / ml , gelöst in dH &amp; sub2 ; O). Zur Beschichtung von Platten mit 6 Vertiefungen für die Aufrechterhaltung der SCZ-aNSCs als Einschicht- oder 18 mm-Deckgläschen für die Immunfärbung, inkubieren mit PLO über Nacht bei 4 ° C. Dann waschen Sie sie 3 - mal mit DH 2 O Lassen Sie die Platten und Deckgläser nach der letzten Wäsche zu trocknen. </li><li> Als nächstes brüten die Platten mit Laminin über Nacht bei 4 ° C. Dann waschen Sie sie 3 - mal mit DH 2 O. Achtung: Die Laminin nicht trocken, was die Zellbindung beeinflussen. Anmerkung: Die Beschichtungslösungen können 3-mal wiederverwendet werden. </li></ol></li></ol> 2. Isolierung und des Zerfalls des Adult SCZ <ol><li> Vor der Kultur Vorbereitung, legen Sie die Gehirn-Matrix und zweischneidiges Rasiermesser auf dem Eis. Hinweis: Das Gehirn Matrix nicht einfrieren, weil der brain könnte daran zu binden. </li><li> Opfere eine Maus (8 Wochen alt) von CO 2 Ersticken oder Genickbruch. <ol><li> Schneiden Sie den Kopf mit einer scharfen Schere nach dem Spritzen 70% Ethanol aus. Um den Kopf zu immobilisieren, halten fest an beiden Seiten des Kopfes. Schneiden Sie die Haut mit einer Schere an der Mittellinie in einer Schwanz-rostralen Richtung. Dies fördert die vollständige Entfernung der Haut von dem Schädel. </li><li> Entfernen Sie den kaudalen Teil des Schädels (posterior lambda) zuerst, und dann legen Sie die Zange zwischen dem Schädel und das Gehirn an der dorsalen Mittellinie Position. Besorgen Sie sich die links (oder rechts) Scheitelbein und vorsichtig abziehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Entfernung des anderen Scheitelbein. Hinweis: Wegnahme der Sehnerv und die Entfernung der Hirnhäute aus dem Gehirn machen es leichter, das Gehirn aus dem Schädel zu lösen. </li><li> Übertragen Sie das Gehirn zu kaltem PBS-Puffer (25 ml) und spülen Sie ihn zweimal überschüssiges Blut zu entfernen. </li></ol></li><li> Legen Sie das Gehirn in das Gehirn Matrix auf Eis und make koronale Schnitte 1 mm dicke Scheiben zu erhalten. Übertragen Sie die Gehirnscheiben (1 mm), um die SCZ Regionen enthalten, die im hinteren Teil des Gehirns zu einer kalten PBS in einer 35 mm Petrischale aus Kunststoff befinden. Achtung: Um eine parallele Ebene von koronalen Abschnitte zu erhalten, stellen Sie sicher, dass das Gehirn Riss in der Mittellinie des Gehirns Matrix angeordnet ist; es ist wichtig, unnötige Schwankungen in den Abschnitten zu vermeiden. Hinweis: Erhalten Gehirnscheiben bei 2-3 mm hinter Bregma; Dies ermöglicht die Trennung des SCZ vom SVZ. </li><li> Unter dem Binokular mit geringer Vergrößerung, Mikro-sezieren die SCZ aus der weißen Substanz Bereich des Cortex und Hippocampus mit einer gebogenen Nadel 30G 6,9. Dann entfernen Sie die Rinde Regionen über dem SCZ. Platzieren Sie den sezierten SCZ Region von den Scheiben in eine 35 mm Petrischale aus Kunststoff auf Eis ohne kaltem PBS. Hinweis: Die Kontamination von zusätzlichen Regionen reifen Neuronen, welche die Lebensfähigkeit von aNSCs und Neurosphere Bildung b beeinflussen könnteneil sie unterliegen in aNSZ nach folgenden Kriterien Kulturbedingungen Zelltod. </li><li> Mit einer gebogenen 30 G-Nadel, sofort hacken die sezierten Gewebe in kleine Stücke. Hinweis: Wenn eine längere Zeit zum Präparieren des SCZ Gewebe erforderlich ist, bevor Zerkleinern der sezierten Gewebe in kaltem PBS tauchen. </li><li> Re-suspendieren des zerkleinerten Gewebe mit 1 ml Verdauungspuffer, zu übertragen, das Gewebe zu einem 15 ml-Röhrchen mit 2 ml Verdauungspuffer, und inkubiere für 30 min in einem Wasserbad 37 ° C. Hinweis: Das Röhrchen wird alle 10 Minuten gut zu mischen. </li></ol> 3. subcallosa Zone abgeleiteten adulten neuralen Stammzellkultur <ol><li> Tippen Sie auf das Rohr leicht das verdaute Gewebe zu trennen, und dann zentrifugiert werden die Röhrchen bei 145 xg für 5 min. Überstand verwerfen, erneut suspendiert, um die verdaute Gewebe mit 1 ml vorgewärmtes N2 Medium, um die Verdauung Puffer zu waschen und sanft die Probenlösung maximal 5 mal pipettieren eine P1000 Pipette. Hinweis: Über Verreiben mit einem schmalenPipettenspitze kann die Lebensfähigkeit der Zellen und das anschließende Wachstum verringern. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 145 xg für 5 min. Nach Verwerfen des Überstandes, resuspendieren in 1 ml Medium N2 des Zellpellets. </li><li> Vorbereitung 1 ml N2-Medium in einer nicht-beschichteten 6-Well-Platte und 1 ml der suspendierten Zellen auf ein Endvolumen von 2 ml zu machen. </li><li> In EGF (20 ng / ml) und bFGF (20 ng / ml) in jede Vertiefung. Schütteln Sie die 6-Well-Kulturschale mit der Hand mit den plattierten Zellen die zusätzlichen Wachstumsfaktoren zu mischen. Halten Sie die 6-Well - Platte in einem 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator. </li><li> Hinzufügen, EGF (20 ng / ml) und bFGF (20 ng / ml) zu jedem Well täglich für 8 Tage. Jeden dritten Tag, 200 &amp; mgr; l N2 Medien die ungefähre 2 ml Volumen des Mediums aufrechtzuerhalten. </li></ol> 4. Passagierung von NSCs als Neurosphären und Monolayer-Kulturen <ol><li> Sammeln Sie die Neurosphären und sie auf einem neuen 15 ml konischen Röhrchen. Hinweis: Die Anzahl der Neurosphären (&gt; 50 &amp; mgr; m Durchmesser) per gut von der SCZ einer einzelnen Maus Gehirn war 64,3 ± 7,31, die als die des SVZ weniger war (190,5 ± 6,33) 9. </li><li> Inkubieren der Neurosphären mit 0,5 ml Dissoziationspuffer für 5 min in einem Wasserbad 37 ° C, um die Neurosphären in einzelne Zellen dissoziiert. Primäre Neurosphären können in einzelne Zellen und gepflegt über mehrere Passagen als Neurosphere oder Monolayer-Kulturen voneinander zu trennen sind. Hinweis: Der Ausbau SCZ-aNSCs als Monoschicht auf Neurosphären überlegen ist, weil SCZ-aNSCs kann&gt; 10-mal in einer Monokultur-Format agiert werden, aber &lt;5 mal in einem Neurosphere Kultur Format. Achtung: SCZ-aNSCs zeigen eine starke Aggregation, und es ist schwierig, sie in einzelne Zellen zu distanzieren. Somit wird der Neurosphärenkultur Format nicht für Routinezellexpansion empfohlen. </li><li> Pipettieren vorsichtig die Probenlösung nach oben und unten mit einer P1000 Pipette weniger als 5-mal und Zentrifuge das Rohr bei 145 g für 5 min. Überstand verwerfen und neu sudie Neurosphären mit 1 ml Medium N2 verbringen. Hinweis: Über eine schmale Pipettenspitze Verreiben kann die Lebensfähigkeit der Zellen und das anschließende Wachstum verringern. </li><li> Um die Zellen zu zählen, machen Sie eine 1: 1-Gemisch aus der Zellsuspension (10 ul) und der 0,4% Trypanblau-Lösung und dann die Anzahl der lebenden Zellen auf einer Zählkammer zählen. Nach der Beschichtung / Laminin eine 6-Well - Platte mit der PLO, die Platte , die Zellen bei 2,5 x 10 5 Zellen / ml mit 2 ml N2 - Medium für jede Vertiefung. Hinweis: Änderungen in der Zelldichte ihren Zustand und Differenzierungspotenzial beeinflussen können. </li><li> Pflegen die SCZ-aNSCs mit einer täglichen Behandlung von Wachstumsfaktoren (2 ml, 20 ng / ml) für 5 Tage, und diese Passage ihnen. </li></ol> 5. Differenzierung von subcallosa Zone abgeleiteten adulten neuralen Stammzellen <ol><li> Platte aNSCs auf eine PLO / Laminin-beschichtete 18 mm Deckglas mit 1 x 10 5 Zellen / ml in 1 ml N2 mit Wachstumsfaktoren (20 ng / ml) für die Differenzierung der SCZ-aNSCs. </li><li> Am nächsten Tag,Wenn die Zellen fest an dem Deckglas angebracht ist, das Wachstumsmedium mit N2 tauschen die Wachstumsfaktoren zu entfernen. </li><li> Nach 6 Tagen, wasche die differenzierten Zellen mit 1 ml PBS Zelltrümmer zu entfernen und sie für die Immunfärbung fixieren. Hinweis: BrdU in die neu synthetisierte DNA der proliferierenden Zellen eingebaut werden. Daher kann, falls gewünscht, BrdU (10 &amp; mgr; g / ml) zugegeben werden, um Zellen zu leben vor der Fixierung der Zellen. </li></ol> 6. Immunostaining adulten neuralen Stammzellen und Differentiated Vorläufern <ol><li> Für die Immunfärbung, waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie diese mit 4% PFA für 20 min bei Raumtemperatur. Achtung: PFA ist sehr giftig; Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. </li><li> Entfernen Sie die 4% PFA, spülen Sie die fixierten Zellen mit PBS 3 mal, und dann bei 4 ° Cuntil sie für die Immunfärbung benötigt werden. </li><li> Inkubieren der Zellen auf dem Deckglas mit Blockierungslösung (3% Rinderserumalbumin und 0,1% Triton X-100 in 1 × Pmindestens 30 min bei Raumtemperatur BS) für. </li><li> Bereiten Sie die primären Antikörper in frischen Blockierungslösung und die Proben unter über Nacht bei 4 ° C. <ol><li> Immunostaining die aNSCs <ol><li> Beflecken die aNSCs mit Anti-Nestin und Anti-BrdU-Antikörper. Vor der Fixierung hinzufügen 20 ug BrdU in die aNSCs und brüten sie für 2 h. Führen der Denaturierungsschritt unter Verwendung von 2 N HCl für 20 min bei 37 ° Cbefore den Blockierungsschritt durchzuführen. </li></ol></li><li> Immunostaining die differenzierten Vorläufern: <ol><li> Verwenden anti-O4, anti-Tubulin-bIII und Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) -Antikörper die differenzierten Vorläufern zu etikettieren. </li></ol></li></ol></li><li> Waschen der Proben mit 3 mal PBS und Inkubieren sie mit sekundären Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert Antikörper (1: 500) in Blocking-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Proben 3 mal mit PBS. Hinweis: Verwenden Sie sekundäre Antikörper, die die Gastgeber des primären entsprechenAntikörper. Hoechest33343 (1: 2000) wird für die Kernfärbung verwendet. </li><li> In einem Glasobjektträger Montagelösung und fahren Sie mit Montage. Beobachten und Bild der Probe auf einem konfokalen Mikroskop bei mehreren Wellenlängen: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm) und Hoechest33343 (405 nm). </li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

Dieses Dokument beschreibt ein detailliertes Protokoll NSC von der adulten Maus SCZ zu erzeugen und sie für verschiedene Anwendungen zu erhalten. Es gibt drei wichtige Schritte zur Ermittlung der In - vitro - Kultursystem erforderlich zu reinigen und SCZ-NSCs erweitern. Erstens ist es wichtig, sicherzustellen , dass die SCZ Region genau von anderen potentiellen neurogener Bereiche (1B) präpariert wird. Dick und präzise Abschnitte der SCZ Regionen enthielten , wurden mit einem 1 mm Abstand Gehirn Matrix erhalten, und dann wurde eine feine Nadel für die Mikro-Dissektion der SCZ aus anderen kortikalen Regionen (Abbildung 1A) verwendet. Wenn nicht-NSC von benachbarten Geweben, wie der Großhirnrinde, kultiviert werden , mit SCZ-aNSCs, katastrophalen Tod eintritt, was sich negativ auf die Lebensfähigkeit und die Kugelbildung SCZ-NSC 16-18,22 auswirkt. Die Schwanz SCZ (2-3 mm hinter Bregma) wurde zur Erzeugung von deutlichen SCZ-aNSCs als die beste Region bestätigt. Zweitens, die geeignet friate enzymatische Behandlung in der Ernte und Passagierung Schritte ist entscheidend, um eine hohe Ausbeute an Zellen zu erreichen. Dispase II und Papain waren wirksamer als für aNSCs Trypsin isoliert. Die Dissoziation von Zellen für Passagierung mit Dissoziationspuffers anstelle von Trypsin verstärkt ihre Lebensfähigkeit 19. Mechanische Dissoziation und Verreiben mit einer Pipette sollte minimal sein. Drittens wird ein Zellsieb in primäre Kultursysteme zur Entfernung zellulärer Debris nach Gewebe Verdauung verwendet. Jedoch aufgrund der Lokalisierung von SCZ-aNSCs werden diese Zellen nach dem Bruch der weißen Substanz durch Enzymverdau und mechanischen Verreibung erhalten. Während der Filtration mit einem Zellsieb würde eine beträchtliche Menge an Zellen verloren. Daher eine Zelle Sieb ohne die Verwendung von SCZ-aNSCs Kultivierung ist ein besserer Weg, um eine hohe Ausbeute an Zellen zu erhalten. Während sowohl Neurosphäre Kulturen und Monolayer-Kulturen können zur Wartung von NSC, eine Begrenzung der neuro angewendetKugel Kultur ist, dass einzelne NSCs distanzierte nach der Trennung zufällig aggregiert werden können. Die Aggregationsergebnisse in verschiedenen Größen von Neurosphären. Wenn die Größe eines Neurosphäre einen bestimmten kritischen Wert erreicht hat , wächst die Neurosphären als heterogene Struktur, aufgrund eines Mangels an Nährstoffen, Wachstumsfaktoren, und Sauerstoff im Kern 20. Neurosphären mit großen Größen sind nicht leicht mit Dissoziationspuffers distanzierte und erfordern längere enzymatische Behandlungszeiten mit umfangreichen mechanischen Zerreiben, was zu niedrigeren Lebensfähigkeit der Zellen Darüber hinaus. Daher wird die Monoschichtkultur System empfohlen SCZ-aNSCs durch mehrere Durchgänge zu erhalten. In einer Monolayer - Kultur - System werden aNSCs stabil als NSC (Typ B) gehalten wird, ohne spontane Differenzierung in spezifizierten Zellen, wie Progenitoren (Typen C und A) (3A). SCZ-aNSCs wurden für längere Zeit agierten, &lt;5 Passagen in einem Neurosphere Format und&gt; 10 Passagen als Monoschicht. Dies ist Nachteileistent mit früheren Ergebnissen, die darauf schließen lassen , dass die Monoschicht - Kultursystem in 21 Langzeitkulturen NSC in vitro beibehält. Jedoch verringert die proliferierenden Geschwindigkeit, und der Anteil der sterbenden Zellen erhöht über 5 Durchgänge. Erweiterte Passagierbarkeit wirkt sich auf die Multipotenz und die neuronale Differenzierung mit erhöhter Chromosomenaberration 22. Daher erweiterten Passagierung Effekte zu vermeiden, wird empfohlen, für die Proliferation und Differenzierung Analyse frühen Passage (&lt;Passage 5) Zellen zu verwenden. Obwohl das Potential zur Selbsterneuerung von SCZ-aNSCs ähnlich ist SVZ-aNSCs weniger neuronale Differenzierung wurde in SCZ-aNSCs 9 gezeigt. Verfahren zur aNSCs von neurogenen Regionen des erwachsenen Gehirns, einschließlich des SVZ und Gyrus dentatus (DG), wurden 22 aufgebaut isolieren. Obwohl solche Protokolle, die Isolierung und Kultivierung von aNSCs in vitro gefördert haben, gibt es einige Einschränkungen, um eine hohe Anzahl von ErlangungZellen. Viele Protokolle verwenden eine Hirngewebe chopper, die den Verlust von Hirngewebe während des Schneideverfahrens führen kann. Ein weiterer Ansatz aNSCs von neurogenen Regionen zu isolieren, verwendet einen koronalen Schnitt durch das Gehirn mit einem Skalpell. Dies wird durch die Mikrodissektion des SVZ oder der DG entlang der Längsspalte 23 gefolgt. Die Anwesenheit von anderen Hirnregionen können zu anderen Zelltypen , die aNSZ nach folgenden Kriterien Kultur zu verunreinigen, die die Lebensfähigkeit der Zellen in vitro beeinflussen könnte. Mit dem aktuellen Protokoll können viele verschiedene Proben in einem einzigen Experiment verwaltet werden, einschließlich der Kontrollen im Vergleich zu einer Vielzahl von experimentellen Gruppen. Auch Aufschneiden einen Gehirnmatrix überlegen ist ein Gehirn Zerkleinerungswerkzeug, wie es für die Erreichung der NSC aus verschiedenen Hirnregionen mit einer hohen Zellausbeute ermöglicht. Es ermöglicht auch den Vergleich von aNSCs aus verschiedenen Regionen desselben Gehirns. Transplantation und Engineering von endogenen NSCs wurden considered als mögliche Strategien für die Stammzelltherapie. Hierzu wird in vitro Studien über die Eigenschaften von aNSCs auch umfassend untersucht werden sollten. Daher wird die Einrichtung eines gut charakterisierten in - vitro - Kultursystem hilfreich sein für die Anwendung von NSCs fördern. In diesem Kultursystem wurden die Stammzelleigenschaften von SCZ-aNSCs gut gepflegt, wie es durch die Selbsterneuerung und Multiple-lineage Differenzierung unter den geeigneten Bedingungen belegt. Daher kann dieses Kultursystem für die Erweiterung der SCZ-aNSCs für biologische Untersuchungen und therapeutischen Anwendungen verwendet werden.

NSCs have characteristics of self-renewal and multiple-lineage differentiation. To confirm these properties, a neurosphere culture system has widely been used. The neurosphere culture system was developed in the early 1990s and served as a standard stem cell culture system1. Depending on self-renewal potency, NSCs continuously proliferate and generate a cell mass in a suspension culture. The number of cells and the size of the neurosphere are considered to be closely associated with the proliferation properties of the NSCs. Monolayer cultures are also widely used for the maintenance and differentiation of NSCs. Compared to the neurosphere culture, the monolayer culture system provides better homogenous maintenance and expansion of NSCs2. These two well-developed culture systems have contributed to the characterization of aNSCs in vitro. 
NSCs reside in different brain regions, such as the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and the subgranular zone (SGZ) of the hippocampus3-5. The subcallosal zone (SCZ) of the caudal subcortical white matter is recognized as a novel neurogenic region6-8. It was recently reported that the SCZ-aNSCs have therapeutic potential in traumatic brain injury9. Compared to other neurogenic regions, the SCZ resides along the subcortical white matter. In the human brain, subcortical white matter occupies a larger region than in the mouse brain10. Therefore, an understanding of the characteristics of SCZ-aNSCs using an in vitro culture system is important in order to promote the potential use of these cells for neural regeneration. Precise dissection of the desired brain region is required to rule out possible contamination by unwanted regions containing active or quiescent NSCs. For instance, aNSCs in non-neurogenic regions can be activated and produce new neural cells in injured brains or during in vitro culturing11. To obtain NSCs from the SCZ, cells were collected from brain slices containing the SCZ. Then, a careful micro-dissection of the SCZ region was performed using a fine needle. To generate the neurosphere from the SCZ, micro-dissected SCZ tissue chunks were dissociated into single cells and then cultured as a suspension in the presence of epidermal growth factor (EGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF). After SCZ-aNSCs form neurospheres, they also can be maintained as neurospheres or monolayers for expansion. This procedure also demonstrates immunostaining processes with various markers for the detection of NSCs and their progeny after their expansion and differentiation in a monolayer culture. Here, a visual protocol of the SCZ-aNSC culture system is presented. This protocol contains detailed instructions for the micro-dissection of the SCZ region and for the maintenance and passaging of the cells.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Medium components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>+L-glutamin, +Sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>BIOSOLUTION</td>
			<td>BP007a</td>
			<td>1X dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociattion buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04-942-078-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555229F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Storz</td>
			<td>E3321-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain matrix (1mm)</td>
			<td>RWD</td>
			<td>68707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged razor</td>
			<td>DORCO</td>
			<td>ST-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gage needle</td>
			<td>SUNGSHIM</td>
			<td>N1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10035</td>
			<td>petridish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td>petridish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip (18mm)</td>
			<td>Deckglaser</td>
			<td>111580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>32012</td>
			<td>non-coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>32006</td>
			<td>non-coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td>0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td>mouse (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2430</td>
			<td>rabbit (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCX</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC8066</td>
			<td>goat (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td>rabbit (1:2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>rat (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td>mouse (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td>Rat (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td rowspan="12">1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-151</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-606-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit 488</td>
			<td>Alexa</td>
			<td>A21206</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>711-165-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>711-605-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-goat 488</td>
			<td>Alexa</td>
			<td>A11055</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-goat cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>705-165-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-goat 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21447</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>712-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>712-605-153</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-100-6</td>
			<td>3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>usb</td>
			<td>22686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>P2031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechest33342</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Dye for staining nuclei</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult neural stem cells from the mouse subcallosal zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Definition des Kultursystems für aNSCs aus dem unbekannten neurogene Region ist von wesentlicher Bedeutung für diese Zellen zu verstehen und für ihre mögliche Verwendung in Gehirn Reparatur 12 zu entwickeln. Es ist bekannt , dass NSC in verschiedenen Entwicklungsstadien oder in unterschiedlichen Bereichen unterschiedlich 3,4 verhalten. Vor kurzem wurde berichtet , dass SCZ-abgeleiteten Zellen Differentialpotentiale für die neuronale Differenzierung in vivo aufweisen und in vitro im Vergleich zu SVZ abgeleiteten Zellen 7-9. Deshalb, um genau jede neurogenen Region isolieren, Hirnschnitten, die die SCZ beinhalten wurden unter Verwendung einer 1 mm Gehirnmatrix (1A) seziert. Nach 8 Tagen der Kultur mit Wachstumsfaktoren, von der SCZ abgeleitet aNSCs können die Zellen anschließend aufrechterhalten kann Neurosphären, in welcher Form (1B). Da eine Teilmenge von NSC in den Neurosphären können spo seinntaneously 13 differenziert, eine Einschichtfolie Kultursystem für die Aufrechterhaltung der relativ homogene Population von SCZ-aNSCs auch hilfreich. Wachstumsfaktoren und Dissoziation Enzyme wie Trypsin kann durchdringen nicht leicht tief im Inneren des Neurosphere 14,15. Monolayer-Kulturen bieten noch mehr Bedingungen für den Ausbau von NSCs. Von der Grundneurosphären wurden SCZ-aNSCs in einzelne Zellen durch eine Verdauungspuffer Behandlung distanzierte. Einen Tag nach der Zellaussaat, aNSCs wurden auf die beschichtete Platte befestigt und zeigte die Zellproliferation (2A). Um ihre Wirksamkeit der Proliferation zu bestätigen, wurde BrdU in den Medien gegeben. Nach Inkubation mit BrdU für 2 h wurden die Zellen mit anti-BrdU (ein Marker für die Proliferation) und Anti-Nestin (Marker für neurale Stammzellen) Antikörper leicht gefärbt, was darauf hinweist, dass SCZ-aNSCs aktiv proliferieren und Aufrechterhaltung der Schlüsseleigenschaften Stammzellen (2B). Demzufolge haben sie nicht exhibit Marker für differenzierte Zellen, wie EGFR (ausgedrückt in transient Verstärkungs Zellen) und DCX (ausgedrückt in Neuroblasten) (2C). Um zu bestätigen, wurden die multiple Differenzierungspotential von SCZ-aNSCs, Wachstumsfaktoren aus dem Kulturmedium entfernt. Nach 6 Tagen wurden die Zellen mit verschiedenen Entscheidungsträgern für differenzierte Zellen immunhistochemisch. Um zeigen die verschiedenen Nachkommen von aNSCs, Marker für Neuronen (TuJ1), Astrozyten (GFAP) und Oligodendrozyten (O4) eingesetzt; alle diese Zelltypen wurden aus der SCZ-aNSCs (Figur 3) erzeugt wird . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54929/54929fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die Isolierung des SCZ Region und die Bildung des Neurosphäre. (A) Verfahren für die Präparation des SCZ Region von der erwachsenen Gehirn der Maus. Zur Kultur der SCZ-aNSCs, ein 8 Wochen alten Mäusegehirn auf eine Gehirn-Matrix gelegt (1 mm-Intervallen). Nach dem Schneiden, 1 mm Gehirnscheiben, die die SCZ-Bereich (2-3 mm vom Bregma) aufgenommen wurden seziert (durch die rote gestrichelte Linie). (B) Neurosphäre Bildung. Acht Tage nach der in - vitro - Kultur, primäre Neurosphären (Passage 0) gebildet und agiert. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54929/54929fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54929/54929fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54929/54929fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Wartung der SCZ-aNSCs als Monolayer - Kultur. (A) Einen Tag nach der sezierten Zellen Aussaat, SCZ-aNSCs wurden befestigt und erweitert auf ein beschichtetes Gericht in einem einschichtigen Weise (links). Drei Tage nach der Wartung, die Anzahl der SCZ-aNSCs erhöht wurde (rechts). (B) Mit BrdU (rot, ein Marker für proliferierende Zellen), Nestin (grün, ein Marker für neurale Stammzellen) und Hoechest33343 (blau, ein Marker für Immunfärbung Kerne). (C) Immunfärbung mit neuralen Stamm- / Vorläuferzellmarker Nestin (rot, ein Marker für Typ B neurale Stammzellen), EGFR (grün, ein Marker für Typ C transiente Verstärkungs Zellen) und DCX (blau, ein Marker für Typ A Neuroblasten). Nuclei wurden mit Hoechest33343 (white) gegengefärbt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54929/54929fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54929/54929fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54929/54929fig3.jpg" /> Abbildung 3: Immunfärbung der differenzierten Zellen aus den SCZ-aNSCs. Immunostaining mit Differenzierungsmarker TuJ1 (grün, ein Marker für unreife Neuronen), O4 (rot, ein Marker für Oligodendrozyten) und GFAP (schreienow, ein Marker für Astrozyten). Vergrößerte Bilder werden als Einfügungen gezeigt. Hoechest33343 (blau) wurde für die Gegenfärbung der Kerne verwendet. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54929/54929fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54929/54929fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

isolation-culture-adult-neural-stem-cells-from-mouse-subcallosal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.0K Aufrufe.  Korea University College of Medicine. Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described. 

Serie: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Forschung

Neurowissenschaften

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Isolation und Kultur von Neural Crest Stem Cells aus menschlichen Haarfollikeln

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.