Die Autoren möchten die DFG für die Unterstützung zu erkennen.

1. Hydrophobierung von magnetischen Nanopartikeln <ol><li>für die Synthese von hydrophoben Magnetpartikel, 0,85 g FeCl 3 Hexahydrat (3,14 Mmol) und hinzufügen 0,30 g FeCl 2 Tetrahydrat (1,51 Mmol) 200 mL Wasser/Ethanol-Lösung (4:1 V/V).</li>
	<li>Diese Mischung hinzufügen 0,20 mL 1H, 1H, 2 H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) (5,23 Mmol) unter kräftigen Rühren mit einem Magnetrührer (500 u/min). Führen Sie die Synthese in einer Schutzgasatmosphäre (N 2) mithilfe eine Rundboden-Flasche mit einem Korken um die sekundären Oxidation von Magnetit-Partikel zu verhindern.</li>
	<li>Einstellen den Lösung Tropfen klug mit einer Ammonium Hydroxid Lösung (1,5 M), einem pH-Wert von 8 (pH-Wert bestimmt durch ein pH-Meter). Rühren Sie die Lösung für 24 h mit einem Magnetrührer.</li>
	<li>Trennen die Partikel magnetisch von der Lösung, indem den Kolben auf eine Bar Magnet (Neodym Quader Magnet 40 x 20 x 10 mm, Kleber force 25 kg). Gießen Sie die Lösung unter Beibehaltung des Magnet an der Unterseite des Kolbens befestigt.</li>
	<li>Waschen die Partikel dreimal mit Wasser/Ethanol-Lösung bei der Verwendung einer Bar Magnet wie unter 1.4). Trocknen Sie die Partikel bei 60 ° C für 24 h (Ausbeute ca. 0,43 g).</li>
	<li>Für die Analyse der Partikel, verwenden ein Rasterelektronenmikroskop laut Hersteller &#39; Anweisungen s.</li>
</ol> 2. Herstellung von Mikroreaktoren <ol><li>die getrockneten Partikel leicht mit einem Glas Stößel zermahlen und anschließend stellen sie direkt in eine Waagschale (46 × 46 × 8 mm, Polystyrol).</li>
	<li>Pipette 10 µL Reaktionslösung (Zusammensetzung wie beschrieben in 5.1) auf alle Teilchen und verschieben das Wiegen Pfanne leicht in einen kreisförmigen Weg für ca. 10 s (Partikelmasse für eine 10 µL haarfeinen: ca. 3,2 x 10 -7 kg 33). Die restlichen Partikel (Teilchen, die nicht rund um die Reaktionslösung selbst zusammensetzen) bei Raumtemperatur für weitere Anwendungen zu speichern.</li>
	<li>Für die Messung der Kontaktwinkel der Mikroreaktortechnik, bauen eine 5 µL haarfeinen mit Wasser wie unter 2.2), legen Sie es auf eine Teflon-Film und den Kontaktwinkel mithilfe einer optischen Kontaktwinkel-Messgerät laut Hersteller analysieren &#39; s Anweisungen.</li>
</ol> 3. 3D-Druck von den Spulenkörper <ol><li>mit einer CAD-Software nach Hersteller entwerfen die doppelte Spulenkörper mit einer Höhe von 16 mm (eine Kammer), einem Durchmesser von 10 mm und einem Innendurchmesser von ca. 4 mm &#39; s Anweisungen.</li>
	<li>Drucken Sie den Spulenkörper mit einem 3D Drucker laut Hersteller &#39; s Anweisungen unter Verwendung von Materialien wie Polylactid Filament. Wickeln Sie den Körper mit einem 0,08 mm Kupfer Draht 4.500 Wicklungen mit einem Computer gesteuerte Wickelmaschine erreichen.</li>
</ol> 4. Herstellung der Betätigung Plattform <ol><li>Anordnen das doppelte Spulen in einer Matrix (z.B. 3 x 3 Matrix) auf eine Schalttafel mit einem Peltier-Element unter, Schrauben Sie die doppelte Spulen und verbinden Sie diese mit einer Steuerung über Ribbon Kabel ( Abbildung 3).</li>
	<li>Abhängig von der gewünschten Anwendung ein Eisenkern (32 mm Höhe, 4 mm Durchmesser) oder hinzufügen einen Neodym-Magneten (12,5 mm Höhe, 4 mm Durchmesser, 1.035 kA m -1) der Spulenkörper ein stärkeres Magnetfeld zu gewinnen.</li>
	<li>Bis Ende die Plattform legen Sie eine Platte, vorzugsweise Quarzglas mit einer maximalen Höhe von 1 mm auf der Spule Matrix.</li>
	<li>Einer haarfeinen auf der Oberfläche der Plattform zu platzieren.</li>
	<li>, Die oberen Partikel aus der Reaktionslösung zurückziehen und somit einen haarfeinen aktivieren eine Spule mit einem Neodymmagneten im Inneren mithilfe des Steuerelements in 4.1 genannten). Schließen der Mikroreaktortechnik wieder ausschalten die Spule.</li>
	<li>, Zwei Mikroreaktoren verschmelzen die zunächst ca. 10 mm voneinander entfernt sind verwenden Sie Neodym-Magneten wie unter 4.2). Heben Sie den Magneten in die gewünschten Spulenkörper durch die Aktivierung der Spulen für ca. 25 s, einen haarfeinen (Abstand zwischen haarfeinen und Magnet liegt ca. 12 mm) zu öffnen und zu einer in der gleichen Position auf der Plattform bewegen.</li>
	<li>, Um die Reaktion zu kühlen einschalten Lösung in der Mikroreaktortechnik auf der Oberfläche der Plattform und die Spulentemperatur verringern das Peltier-Element unter der Spule Matrix positioniert, wie unter 4.1 beschrieben).</li>
</ol> 5. Enzymatische Reaktion durch Zusammenführen von Mikroreaktoren <ol><li>auflösen-Meerrettich-Peroxidase in einer Konzentration von 0,1 µg mL -1 in Kalium-Phosphat-Puffer (0,1 M, pH 6,5). Verdünnen Sie das Substrat, 10-Acetyl-3,7-Dihydroxyphenoxazine (10 mM in Dimethylsulfoxide (DMSO)) mit Kalium-Phosphat-Puffer (0,1 M, pH 6,5) zu einer Konzentration von 200 µM.</li>
	<li>Einsatz 10 µL jede dieser Lösungen, zwei Mikroreaktoren zu bauen, wie unter 2.2). Verschmelzen die beiden Mikroreaktoren durch das Mittel der magnetischen Kräfte (Zylinder Neodymmagneten: 12,5 mm x 4 mm, 1.035 kA m -1) wie in 4.6 beschrieben) bei 25 ° c</li>
	<li>Erkennen die Reaktion durch die Positionierung einer Fluoreszenz-Sonde (Erregung Wellenlänge: 570 nm, Emissionswellenlänge: 585 nm) ca. 10 mm direkt über eine geöffnete haarfeinen vor dem Merge.</li>
</ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+Peroxidase+Activity+by+Covalently+Tethered+DNA+Oligonucleotides.">Tuning of Peroxidase Activity by Covalently Tethered DNA Oligonucleotides.</a> Bioconjugate Chem. 20 (5), 969-975 (2009).</li><li>Al-Kaidy, H., Tippk&#246;tter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superparamagnetic+hydrophobic+particles+as+shell+material+for+digital+microfluidic+droplets+and+proof-of-principle+reaction+assessments+with+immobilized+laccase.">Superparamagnetic hydrophobic particles as shell material for digital microfluidic droplets and proof-of-principle reaction assessments with immobilized laccase.</a> Eng. Life Sci. 16 (3), 222-230 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Für den erfolgreichen Einsatz von mikrofluidischen Technologien ist es wichtig, das Reaktionsvolumen entsprechend den Anforderungen der biotechnologische Synthese und Analysen zu bewegen. Die hier vorgestellten Betätigung-Plattform ermöglicht es mikrofluidischen Tröpfchen durch Magnetkraft verschieben. Die Bewegung kann frei in zwei Dimensionen auf einer planaren Fläche einer Reaktion-Plattform durchgeführt werden, unter Beifügung den flüssigen Tropfen mit einem magnetischen superhydrophob Schale. Damit wird ein alternatives System zu vordefinierten mikrofluidische Kanäle mit komplexen Steuerung Installationen, wie in herkömmlichen mikrofluidischen Systemen verwendet, um Lösungsmittel und Proben übergeben eingeführt. Die automatisierte Betätigung des kleinen Reaktion Tröpfchen ist somit eine deutliche Vereinfachung der bekannten Lab-on-a-Chip-Plattformen. Darüber hinaus macht die Plattform möglich, einen haarfeinen zum Hinzufügen und Entfernen von Reaktion Proben reversibel zu öffnen. In Kombination mit einem Dispenser-System Dies kann dazu führen, dass ein hohes Maß an automatisierten Reaktionskontrolle und ist der erste Schritt für in Silico gestaltbare Microreactions in einem virtuellen Labor-in-a-Tropfen. Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist, dass die Mikroreaktoren nur mit kleinen Mengen (bis zu ca. 30 µL) gebaut werden können. Ein entscheidender Schritt im Protokoll ist der Nachweis der enzymatischen Reaktion innerhalb der Mikroreaktoren, weil die Fluoreszenz-Sonde muss richtig eingestellt sein. Eine weitere Möglichkeit der Erkennung möglicherweise UV/Vis-Spektroskopie.
Der Entwicklungsprozess der Plattform hat gezeigt, dass eine elektromagnetische Spule mit einem Durchmesser von 10 mm für Tröpfchen Bewegung ausreicht. Auf der anderen Seite ist eine doppelte Spule gefüllt mit Luft oder einem Eisenkern nicht in der Lage, die magnetische Kraft zu induzieren, die benötigt wird, um eine haarfeinen Shell zu öffnen. Daher wurden Neodym Kerne in den Spulen ausgewählt, um diese Aufgabe durchzuführen. Die daraus resultierende Magnetfeld Gradienten können wieder durch Nervenströme Bewegung des Magneten senkrecht zur Reaktion Plattform variiert werden. Die Pitch-Größe der Plattform ist nur durch die Kontrolle begrenzt. Die bereits vorhandenen Steuerung und Software ist entworfen und für ein 10 x 10 Matrix einsatzbereit. Das Peltier-Element ist nicht erforderlich für die beschriebenen Anwendungen aber kann erforderlich sein, wenn der Mikroreaktortechnik für eine längere Zeit fixiert werden und es es ermöglichen wird, das Reaktionsgemisch über der Plattform Oberfläche abzukühlen.
In Zukunft kann die Kombination der Betätigung Plattform mit der flüssigen Murmeln als flexible Labor-in-a-Tropfen-Systeme für die Durchführung des Screenings, schnelle optische Analysen und komplexe Kaskade Enzymreaktionen mit sehr kleinen Reaktion Volumen fungieren. Darüber hinaus kann die Plattform für (Bio-) chemischen Analysen wie PCR, Elektrophorese oder ELISA verwendet werden. Darüber hinaus sind die Vorführung des neuen, industriell relevanten Enzyme und Aptamer Amplifikationen vielversprechende Möglichkeiten.

Technische Anwendungen mit Mikro Reaktionen erfolgen überwiegend in vordefinierten Microchannel-Chips. Diese Systeme sind weit verbreitet und in der Literatur umfassend beschrieben (inter Alia 1,2,3). Im Jahr 2011 betrug der Umsatz von mikrofluidischen Technologien weltweit 6,2 Milliarden Euro 4. Im Gegensatz dazu war die Verwendung von frei beweglichen Mikro Reaktorsektionen zuvor nur untersucht und veröffentlicht in begrenztem Umfang. Die am häufigsten verwendete Methode zum Verschieben von wässriger micro Tröpfchen ist Electrowetting 5. Andere Methoden für die Bewegung der Tropfen auf Oberflächen basieren auf elektrische Felder 6, Magnetkraft 7 oder akustische Betätigung 8. Aufgrund ihrer ungünstigen Oberfläche zu Volumen-Verhältnis sind diese haarfeinen Droplet-basierte Systeme starke Verdunstung Einflüssen ausgesetzt. Damit ist die Drop-Bewegung in der Regel als einen flüssigen Zweiphasensystem eingerichtet wo die obere Phase hat einen hohen Siedepunkt die wässrige Phase vor Verdunstung zu schützen. Dieser Ansatz beinhaltet jedoch ein hohes Risiko der Kontaminierung der Reaktion Tröpfchen durch unkontrollierte Diffusion. Dies ist ein erhebliches Hindernis für die technische Einrichtung der genannten Systeme.
Neuere Arbeiten befasst sich mit nicht-anhaftende flüssig-fest Phasenübergänge. Ein hochwirksamer Ansatz ist die Verwendung von superhydrophob Oberflächen, so dass die Bildung von sphärischen wässrige Tröpfchen. Eine Erweiterung dieses Konzepts der Reaktion ist die Verwendung von micro Reaktion Fächer mit einem superhydrophob Oberfläche oder Schale, die zum Beispiel aus Polytetrafluorethylen (PTFE) Partikel 9bestehen kann. Der Kontaktwinkel auf Oberflächen sind in der Regel im Bereich von 160° (abhängig von der Rauheit der Oberfläche). Die sphärische Fächer somit minimale Widerstand gegen die Bewegung auf einer Fläche und bieten gleichzeitig Schutz vor Verdunstung.
Wässrige Tropfen mit Mikropartikeln Größe PTFE beschichtet können ihre Kugelform bis zu einem Durchmesser von etwa 2 mm beibehalten. Bei höheren Lautstärken ist die hydrophobe Shell in der Regel nicht komplett nicht mehr 10geschlossen. Der Einfluss der anderen Shell-Materialien und der Ausbau der Anwendungsbereich des flüssigen Marmors gegenüber unpolaren Lösungsmitteln wurde Gao und McCarthy mithilfe ionische Flüssigkeiten 12implementiert. Für die Bildung von hydrophoben partikelbasierte Muscheln wurden Partikeldurchmesser in Größen von 10 nm bis 30 µm bisher beschriebenen 11,14,16. Neue Studien zeigten, dass hydrophobe Nanopartikel als Hüllenmaterial noch besser zu nutzen als die Mikropartikel 13sind. Ersten Stabilitätsstudien bestätigt eine Erhöhung in Stabilität, wenn die Partikelgröße von reduziert wird ca. 600 nm bis ca. 100 nm. Dieser zu erwartenden Ergebnisse aus Dichter Partikelverteilung rund um den wässrigen Bereich 15.
Der Schutz der wässrigen Reaktion Fächer durch eine hydrophobe Shell und die Bezeichnung als flüssige Murmeln wurde erstmals im Jahr 2001 von Aussillous Et Al. und Mahadevan Et Al. beschrieben. 17 , 18. seitdem einige Anwendungen dieser definierte Reaktion Abteilungen beschrieben worden. Zum Beispiel ein Gassensor auf Basis flüssiger Marmor 19 und ein Nachweisverfahren für Wasserverschmutzung basierend auf einer optisch qualitative Basis entwickelten 20gewesen sind. Die Autoren unterscheiden die Vorteile der hohe Reaktionsgeschwindigkeiten und der niedrige Verbrauch von Chemikalien ihre Mikro Reaktionssysteme. Jüngste Publikationen beschäftigen sich mit der Herstellung von pH-Sensitive liquid Murmeln 16 oder die Darstellung der "Janus Partikel" mit zwei verschiedenen Beschichtungen aus verschiedenen Funktionen. Beispielsweise könnte Bormashenko Et Al. einen haarfeinen mit Muscheln aus Teflon und halbleitenden Ruß 21synthetisieren. Außerdem wurde nachgewiesen, dass Mikroreaktoren effizient können und bequem durch die Absorption von externen Sauerstoff als Comonomer durch die durchlässigen Gas-Flüssigkeits-Schnittstelle 24Polyperoxides zu synthetisieren. Bei einem anderen Ansatz bieten die Schale der Silica-Partikel-basierten flüssigen Murmeln die reaktiven Substratoberflächen, klassische Silberspiegel-Reaktion- 26zu regulieren. Aktuelle Probleme für Forschung und Entwicklung auf dem Gebiet der hydrophilen-Kern-hydrophobe-Schale Tropfen sind die Partikel Größenanpassung, die reproduzierbare Produktion von monodispersen Tropfen, die Benetzbarkeit von Oberflächen und die Wirkung einer Sekunde hydrophile Hülle auf das Mikro Reaktion Fächer 22sowie eine bessere Kontrolle über die Tröpfchen Flugbahnen, z.B. für die Entwicklung des MicroPCR-Durchlaufanlagen 4.
Eine magnetischen Betätigung des diese Mikroreaktoren bietet den Vorteil, relativ hohe Bewegung reicht und eine gute Selektivität der Kraft bei der Arbeit in biochemischen Systemen. Bei der Verwendung von hydrophoben Magnetit-Teilchen erfüllen sie sowohl die Funktion der magnetischen Kraftübertragung für den Verkehr von der Mikroreaktoren, als auch die Funktion einer hydrophoben Schale. Die magnetische Bewegung der Tröpfchen mit magnetischen Partikeln in einem Tröpfchen wurde erstmals im Jahr 2006 von Lehmann Et Al. postuliert. 23 und Shikida Et al. 25, die manuell benutzt wechselte Permanentmagneten als Aktoren für die Mobilisierung eines einzelnen Tropfens. Ein weiterer Ansatz, eine kleine Menge Flüssigkeit zu bewegen wurde von Zhao Et Al., realisiert, die die hydrophoben Fe3O4 Partikel als magnetische Hülle verwendet. Die Hülle des magnetischen Flüssigkeit Marmor wurde auf der oberen Seite des Tropfens durch eine vertikale umgekehrter Magnetfeld 27eröffnet. Basierend auf diesem Konzept, konnten Xue Et Al. Partikel zu entwickeln, die einen haarfeinen mit einer Oberflächenspannung von 20,1 dyn cm−1 28bilden. Lin Et Al. fabriziert Roman Zellulose basierende Mikro/Nano hierarchische Kugeln mit Superparamagnetism und Superhydrophobicity die magnetischen Tropfen Transport und Manipulation 31Gott Stabilität vorsehen. Dies war bisher nur veröffentlicht, wie ein Proof of Principle studieren und nicht für jede Anwendung verwendet. Die magnetische und elektrische Steuerung der flüssigen Marmor wird derzeit in ersten Ansätzen verfolgt. Zhao Et Al. 2010 15 und Zhang Et Al. 2012 29 waren in der Lage, eine Tröpfchen Manipulation durch die manuelle (handbetrieben) Bewegung eines Permanentmagneten unter Kern-Schale-Tröpfchen zu entwickeln. Bormashenko Et al. 11 erreicht die Beschleunigung einer ferromagnetischen flüssige Murmel auf eine Geschwindigkeit von 25 cm s-1 durch die Annäherung an einen Neodym-Magneten. Dem oben genannten Grundsatz Studien wurden ausschließlich durch die manuelle Bewegung des kleinen Dauermagneten durchgeführt. Als nächstes Entwicklung wurden Zhao Et Al. vor kurzem in der Lage, die erforderliche magnetische Flussdichte für die Bewegung der magnetischen Flüssigkeit Marmor durch Variation der Entfernung eines Permanent-Magnet- 30zu schätzen. Für eine Reaktionskontrolle vergleichbar mit der gemeinsamen Lab-on-a-Chip-Systeme scheint es unumgänglich, die automatische Steuerung des diskreten liquid v zur Verfügung zu stellenOlumes. Um dieses Bedürfnis zu befriedigen, haben wir eine neue Steuerung basierend auf Variablenfeld Steigungen zu fixieren, bewegen und öffnen Sie die magnetischen Mikroreaktoren entwickelt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">3D-printer</td>
			<td style="width:163px;">FelixPrinters</td>
			<td style="width:211px;">Pro1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A12222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:163px;">TU-KL</td>
			<td>1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CAD software</td>
			<td style="width:163px;">Siemens</td>
			<td style="width:211px;">Soled edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Contact angle measuring device</td>
			<td style="width:163px;">Dataphysics</td>
			<td style="width:211px;">OCA 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Cylinder magnet</td>
			<td style="width:163px;">Webcraft GmbH</td>
			<td style="width:211px;">S-04-13-N</td>
			<td>https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dipotassium phosphate</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>7758-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drying oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>FD 115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>68-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">FeCl2 tetrahydrate</td>
			<td style="width:163px;">TU-KL</td>
			<td>1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">FeCl3 hexahydrate</td>
			<td style="width:163px;">TU-KL</td>
			<td>1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence probe</td>
			<td style="width:163px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:211px;">LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish peroxidase</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9003-99-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td>Th.Geyer GmbH &#38; Co</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peltier element</td>
			<td style="width:163px;">Conrad&#160;</td>
			<td style="width:211px;">193569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perfluoroctyltriethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51851-37-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:163px;">FEI</td>
			<td style="width:211px;">Helios NanoLab 650 DualBeam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Separation bar magnet</td>
			<td style="width:163px;">Webcraft GmbH</td>
			<td style="width:211px;">Q-40-20-10-N,&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Winding machine</td>
			<td style="width:163px;">IWT GmbH</td>
			<td style="width:211px;">FW122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aqueous droplets used as enzymatic microreactors and their electromagnetic actuation

Für die erfolgreiche Umsetzung von mikrofluidischen Reaktionssysteme, wie PCR und Elektrophorese ist die Bewegung der Flüssigkeit Kleinmengen unerlässlich. In konventionellen Labor-auf-ein-Chip-Plattformen Lösungsmittel und Proben definierten mikrofluidische Kanäle mit komplexen Steuerung Installationen durchlaufen. Die Tröpfchen Betätigung Plattform präsentiert hier ist eine viel versprechende Alternative. Damit ist es möglich, einen flüssigen Tropfen (haarfeinen) auf eine planare Fläche einer Reaktion-Plattform (Labor-in-Drop) bewegen. Die Betätigung von Mikroreaktoren für die hydrophobe Oberfläche der Plattform basiert auf der Verwendung von magnetischen Kräfte, die auf die äußere Hülle des flüssigen Tropfen aus einer dünnen Schicht von superhydrophob Magnetit-Teilchen. Die hydrophobe Oberfläche der Plattform ist erforderlich, um jeglichen Kontakt zwischen dem flüssigen Kern und der Oberfläche ermöglichen eine reibungslose Bewegung der Mikroreaktortechnik zu vermeiden. Auf der Plattform können ein oder mehrere Mikroreaktoren mit einem Volumen von 10 µL positioniert und gleichzeitig bewegt. Die Plattform selbst besteht aus einer 3 x 3 Matrix der elektrische doppelte Spulen, die entweder Neodym oder Eisen Kerne unterzubringen. Die Magnetfeld-Gradienten werden automatisch gesteuert. Durch Veränderung des magnetischen Feldes Steigungen kann die Mikroreaktoren magnetische hydrophobe Shell automatisch manipuliert werden, um die haarfeinen verschieben oder öffnen Sie die Shell reversibel. Reaktionen der Substrate und entsprechende Enzyme können durch Zusammenlegung der Mikroreaktoren oder bringen sie in Kontakt mit Oberflächen immobilisiert Katalysatoren initiiert werden.

Die Shell-Partikel haben einen Durchmesser von rund 640 nm. Die magnetisierbaren Nanopartikeln in diesem Fluorosilane Shell Partikel eingeschlossen haben Durchmesser im Bereich von 22 nm und 37 nm. Eine 5 µL haarfeinen mit Wasser als einen flüssigen Kern hatte einen Kontaktwinkel von rund 160 ° c.
Der Kraftaufwand zu bewegen ist ein 10 µL haarfeinen wie oben beschrieben 1,34 ± 0,08 µN. Abbildung 1 zeigt die elektromagnetische Kraft aus einer Spule mit 4.500 Windungen Kupferdraht und innere Eisenkern mit 58 powered mA. Die Kraftverteilung wird durch ein finite-Elemente-Modell (FEM), die erforderlichen Spule Eigenschaften einer haarfeinen bewegen bestimmen geschätzt. Wie in Abbildung 1ersichtlich ist, ist die Magnetkraft, durchgeführt von der beschriebenen Spule stark genug, um einen haarfeinen bis zu einer Entfernung weiter als 10 mm von der Mitte der Spule zu bewegen.
Die magnetische Kraft, einen haarfeinen öffnen entspricht 0,85 ± 0,05 mN ist viel größer als die Kraft, die das Tröpfchen bewegen musste. Da die magnetische Kraft induziert durch die Spule mit Eisenkern innerhalb (Abbildung 1) nicht stark genug, um einen haarfeinen zu öffnen ist, wurde ein Neodym-Magneten in den Spulen verwendet. Durch die doppelte Spulen in Wechselstrom Durchflussrichtungen einschalten, kann der Permanentmagnet in Richtung oder Weg von der Plattform verschoben werden. Dabei kann die haarfeinen geöffnet oder geschlossen magnetisch werden. Nebeneinander liegen zwei Mikroreaktoren mit einem völlig intakte Hülle verbinden sie nicht wie die Oberflächenspannung ihre Fusion hemmt. Daher muss mindestens geöffnet werden.
Abbildung 2 zeigt die Michaelis-Menten-Kinetik durch Verschmelzung einer 10 µL haarfeinen mit Peroxidase mit einem anderen 10 µL haarfeinen mit dem entsprechenden Substrat (n = 3). Lineweaver-Burk-Linearisierung der berechneten K-m -Wert für die Reaktion innerhalb der Mikroreaktortechnik 86.85 µM ± 10,95 µM ist liegt der V-max -Wert bei 378.8 Nmol L-1 s-1 ± 115,6 Nmol L-1 s-1. Wie die K-m -Wert in guter Übereinstimmung mit der angegebenen Literatur, 81 ± 3 µM 32, kann davon ausgegangen werden, dass die enzymatische Reaktion innerhalb der kleinen haarfeinen mit den hydrophoben Hüllenmaterial in Bezug auf nicht beeinflusst wird Affinität.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54643/54643fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Elektromagnetische Kraft Simulation aus einer Spule mit 58 mA und 4.500 Wicklungen von Kupfer Draht in Abhängigkeit des Abstandes der Mikroreaktortechnik in die Spule Mitte bestimmt durch FEM Die Spule Durchmesser 10 mm, der Durchmesser des Eisenkerns beträgt 4 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54643/54643fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54643/54643fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Michaelis-Menten Kinetik der Peroxidase gemessen durch die Zusammenlegung von zwei 10 µL Mikroreaktoren. Die Temperatur liegt bei 25 ° C und der Puffer verwendet, ist Kalium Phosphat (0,1 M) mit einem pH-Wert von 6,5. Drei Wiederholungen wurden durchgeführt.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54643/54643fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Betätigung Plattform. Die Betätigung-Plattform besteht aus einer 3 x 3-Matrix aus zwei Spulen. Eine Spule hat 4.500 Wicklungen, eine Höhe von 16 mm (eine Kammer), einem Durchmesser von 10 mm und einem Innendurchmesser von ca. 4 mm. Die Höhe der Spulen ist durch die Höhe des verwendeten Neodymmagneten Zylinder vordefiniert. Der Durchmesser wurde gewählt, weil frühere Studien haben gezeigt, dass dies einem angemessenen Abstand zum Verschieben einer haarfeinen mit dieser Art von Magneten. Die Anzahl der Wicklungen und der Strom wurde bestimmt durch FEM <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54643/54643fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>

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Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

Labor-in-a-Drop Reaktionssysteme erlauben die vielseitige Implementierung von komplexen Reaktionen in mikrofluidischen Maßstab. Eine automatisierte Betätigung-Plattform, bestehend aus einem 3 x 3-Matrix von elektromagnetischen Spulen wurde entwickelt und erfolgreich eingesetzt, um verschmelzen zwei 10 µL Mikroreaktoren und dadurch eine enzymatische Reaktion in die resultierenden flüssige Murmeln zu initiieren.

Wässrige Tröpfchen als enzymatische Mikroreaktoren und deren elektromagnetischen Betätigung

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In ...

aqueous-droplets-used-as-enzymatic-microreactors-their

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

5.3K Aufrufe.  University of Kaiserslautern. Labor-in-a-Drop Reaktionssysteme erlauben die vielseitige Implementierung von komplexen Reaktionen in mikrofluidischen Maßstab. Eine automatisierte Betätigung-Plattform, bestehend aus einem 3 x 3-Matrix von elektromagnetischen Spulen wurde entwickelt und erfolgreich eingesetzt, um verschmelzen zwei 10 µL Mikroreaktoren und dadurch eine enzymatische Reaktion in die resultierenden flüssige Murmeln zu initiieren.

Serie: Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and fold into higher order nanostructures. Structurally similar to peptides, peptoids are poly N-substituted glycines, where the side chains are attached to the nitrogen rather than the alpha-carbon. Their ease of synthesis and structural diversity allows testing of basic design principles to drive de novo design and engineering of new biologically-active and nanostructured materials.
Here, a simple manual peptoid synthesis protocol is presented that allows the synthesis of long chain polypeptoids ( up to 50mers) in excellent yields. Only basic equipment, simple techniques (e.g. liquid transfer, filtration), and commercially available reagents are required, making peptoids an accessible addition to many researchers' toolkits. The peptoid backbone is grown one monomer at a time via the submonomer method which consists of a two-step monomer addition cycle: acylation and displacement. First, bromoacetic acid activated in situ with N,N'-diisopropylcarbodiimide acylates a resin-bound secondary amine. Second, nucleophilic displacement of the bromide by a primary amine follows to introduce the side chain. The two-step cycle is iterated until the desired chain length is reached. The coupling efficiency of this two-step cycle routinely exceeds 98% and enables the synthesis of peptoids as long as 50 residues. Highly tunable, precise and chemically diverse sequences are achievable with the submonomer method as hundreds of readily available primary amines can be directly incorporated.
 
Peptoids are emerging as a versatile biomimetic material for nanobioscience research because of their synthetic flexibility, robustness, and ordering at the atomic level. The folding of a single-chain, amphiphilic, information-rich polypeptoid into a highly-ordered nanosheet was recently demonstrated. This peptoid is a 36-mer that consists of only three different commercially available monomers: hydrophobic, cationic and anionic. The hydrophobic phenylethyl side chains are buried in the nanosheet core whereas the ionic amine and carboxyl side chains align on the hydrophilic faces. The peptoid nanosheets serve as a potential platform for membrane mimetics, protein mimetics, device fabrication, and sensors. Methods for peptoid synthesis, sheet formation, and microscopy imaging are described and provide a simple method to enable future peptoid nanosheet designs.

A simple and general manual peptoid synthesis method involving basic equipment and commercially available reagents is outlined, enabling peptoids to be easily synthesized in most laboratories. The synthesis, purification and characterization of an amphiphilic peptoid 36mer is described, as well as its self-assembly into highly-ordered nanosheets.

Solid-Phase Submonomer Synthese von Peptoid Polymere und ihre Self-Assembly in hoch geordneten Nanoschichten

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

Forschung

Biotechnik

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Ein Toolkit zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in wässrigen Umgebungen aktivieren

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in the tissues are important parameters for successful clinical outcomes. In order to improve tissue integration, porous metallic implants have being developed. Open porosity of metallic foams is very advantageous, since the pore areas can be functionalized without compromising the mechanical properties of the whole structure. Here we describe such modifications using porous titanium implants based on titanium microbeads. By using inherent physical properties such as hydrophobicity of titanium, it is possible to obtain hydrophobic pore gradients within microbead based metallic implants and at the same time to have a basement membrane mimic based on hydrophilic, natural polymers. 3D pore gradients are formed by synthetic polymers such as Poly-L-lactic acid (PLLA) by freeze-extraction method. 2D nanofibrillar surfaces are formed by using collagen/alginate followed by a crosslinking step with a natural crosslinker (genipin). This nanofibrillar film was built up by layer by layer (LbL) deposition method of the two oppositely charged molecules, collagen and alginate. Finally, an implant where different areas can accommodate different cell types, as this is necessary for many multicellular tissues, can be obtained. By, this way cellular movement in different directions by different cell types can be controlled. Such a system is described for the specific case of trachea regeneration, but it can be modified for other target organs. Analysis of cell migration and the possible methods for creating different pore gradients are elaborated. The next step in the analysis of such implants is their characterization after implantation. However, histological analysis of metallic implants is a long and cumbersome process, thus for monitoring host reaction to metallic implants in vivo an alternative method based on monitoring CGA and different blood proteins is also described. These methods can be used for developing in vitro custom-made migration and colonization tests and also be used for analysis of functionalized metallic implants in vivo without histology.

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

In this video, we will demonstrate modification techniques for porous metallic implants to improve their functionality and to control cell migration. Techniques include development of pore gradients to control cell movement in 3D and production of basement membrane mimics to control cell movement in 2-D. Also, a HPLC-based method for monitoring implant integration in-vivo via analysis of blood proteins is described.

Multi-Skala Modifikation von metallischen Implantaten mit Pore Farbverläufe, Polyelektrolyte und ihre indirekte Überwachung<em&gt; In vivo</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

Fern Magnetische Betätigung des Mikrometrische Sonden für<em&gt; In situ</em&gt; 3D-Mapping der bakteriellen Biofilm Physikalische Eigenschaften

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Enzymatic Assay zur Transcription Hemmung durch Gallium (III) und H messen<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) Corrole

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe a novel protocol employing the TiO2 photocatalysis to locally alter cell affinity of the substrate surface. For this experiment, a thin TiO2 film was sputter-coated on a glass coverslip, and the TiO2 surface was subsequently modified with an organosilane monolayer derived from octadecyltrichlorosilane (OTS), which inhibits cell adhesion. The sample was immersed in a cell culture medium, and focused UV light was irradiated to an octagonal region. When a neuronal cell line PC12 cells were plated on the sample, cells adhered only on the UV-irradiated area. We further show that this surface modification can also be performed in situ, i.e., even when cells are growing on the substrate. Proper modification of the surface required an extracellular matrix protein collagen to be present in the medium at the time of UV irradiation. The technique presented here can potentially be employed in patterning multiple cell types for constructing coculture systems or to arbitrarily manipulate cells under culture.

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.

Photostrukturierungs Proteinen und Zellen in wässriger Umgebung Mit TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Photokatalyse

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Schnelle enzymatische Prozessierung von Proteinen für MS-Detektion mit einem Durchfluss-Mikroreaktor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.