This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the S&#228;chsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).

Alle menschlichen Blutproben wurden von gesunden Freiwilligen erhalten und die angelegte Leukozyten-Anreicherung Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig. Die Versuche mit Rattenblut wurden von der zuständigen örtlichen Ethikkommission (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), nach den deutschen Richtlinien für die Tierpflege und Verwendung zugelassen. 1. Experimenteller Aufbau Hinweis: Da die hypotone Lyse Verfahren zur Abreicherung von Erythrozyten aus den Blutproben eine zeitkritische Verfahren, bereiten alle notwendigen Geräte (zB Puffer) für diesen Teil des Protokolls im Voraus. <ol><li> Beschriften Sie ein 15 ml Zentrifugenröhrchen für hypotone Lyse und ein 1,5-ml-Probenröhrchen für die nachfolgende aminophenyl Fluorescein (APF) Färbung pro Blutprobe. <ol><li> Wenn die Leukozyten-Anreicherung wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, führen Sie diese Kennzeichnung unter einem FlussBox. </li></ol></li><li> Bereiten etwa 12 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 10 mM) pro Probe. Je nachdem, ob die Leukozyten werden unter sterilen Bedingungen oder nicht isoliert werden, bereiten entweder PBS durch sterile gebrauchsfertige Lösung von einem Anbieter oder durch PBS Tabletten in destilliertem Wasser gelöst. Überprüfen Sie den pH-Wert und bei Bedarf einstellen auf pH 7,4 durch geringe Mengen an 0,1 M HCl und NaOH Lösungen. <ol><li> Löse PBS-Tabletten (siehe Tabelle der Materialien) in 200 ml destilliertem Wasser mit einer nicht-sterilen Pufferlösung für etwa 16 Proben ausreichend zu erhalten. Falls gewünscht, sterilisiert diese Lösung durch Sterilfiltration. </li></ol></li><li> Bereiten etwa 1 ml Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) mit Ca 2+ ergänzt pro Probe. <ol><li> Man löst 970 mg HBSS Salz in 100 ml (Endvolumen) doppelt destilliertem Wasser. Vor dem Befüllen auf das Endvolumen, überprüfen Sie den pH-Wert und stellen Sie es auf pH 7,4. Aufgrund seiner geringen Pufferkapazität, bereiten diese Puffer täglich frisch eind Legen Sie den pH-Einstellung mit besonderer Sorgfalt durch den Einsatz geringer Mengen von 0,1 M HCl und NaOH-Lösungen durchführen. HINWEIS: Die sterile Lösung kann verwendet werden, je nach dem Experiment. Die Lösung kann durch Sterilfiltration sterilisiert werden. </li></ol></li><li> Neben den beiden Puffer, Etikett und bereiten ein Rohr (zB 50 ml Zentrifugenröhrchen) oder Kolben (zB 250 ml Messbecher) mit doppelt destilliertem Wasser für die hypotone Lyse Verfahren im Voraus. Bereiten Sie ca. 10 ml Wasser pro Probe. </li><li> Bereiten Sie einen Behälter mit zerstoßenem Eis für die APF-Färbung (Abschnitt 3), die auf Eis durchgeführt wird. </li><li> Bereiten Sie Teilmengen von APF, im Voraus die schnelle Zubereitung von Arbeitslösungen während der Färbung (Schritt 3.2) und zu vermeiden, wiederholtes Einfrieren und Auftauen der APF-Lösung verwendet werden kann. HINWEIS: APF wird üblicherweise als 5 mg / ml (11,81 mM) Stammlösung in Methylacetat erhalten. <ol><li> Gefrierteilmengen von 10 bis 100 &amp; mgr; l in 0,5-ml-Röhrchen. Zur Färbung der APF eine endgültigeFarbstoffkonzentration von 10 uM verwendet wird (Schritt 3.8). </li></ol></li></ol> 2. hypotonische Lyse der Erythrocyten HINWEIS: Führen Sie die hypotone Lyse Schritte (mit Ausnahme der Zentrifugationsschritte) unter einer Laminar-Flow-Bank Kontamination zu vermeiden. Führen Sie das gesamte Verfahren bei Raumtemperatur. Da die hypotone Lyse ein zeitkritischen Prozess ist, stellen Sie die Pipetten für Wasser (2 ml) und PBS (5 ml) zusätzlich im Voraus und öffnen Sie das Wasser und PBS-Kolben vor Beginn des Verfahrens. Bewahren Sie die PBS-Lösung und das destillierte Wasser bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch. <ol><li> Von jeder Blutprobe Transfer 100 ul in die entsprechende 15 ml Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: In unseren Experimenten Blutproben enthalten in der Regel 10 U / ml Heparin, um Koagulation zu vermeiden. Doch aufgrund der unterschiedlichen Quellen des Probenmaterials der Art und Konzentration des Antikoagulans kann unterschiedlich sein. Deren Einfluss auf die APF-Färbung sollte getestet werden comparing die Ergebnisse zu den Ergebnissen aus Blutproben mit anderen Arten oder Konzentrationen von Antikoagulans ergänzt erhalten. </li><li> 2 ml destilliertem Wasser und die Proben mischen mit einem Vortexer auf einen mittleren Wert eingestellt. Inkubieren Sie die Proben für 60 Sekunden, dann fügen Sie 5 ml PBS pro Probe und mischen Sie den Vortexer. HINWEIS: bis zu etwa 5 Proben können parallel hergestellt werden. Halten Sie die Probe, um das gleiche für die Zugabe von Wasser und PBS vergleichbar Inkubationszeiten zu erreichen. </li><li> Nach der Regeneration von isotonischen Bedingungen durch Zugabe PBS (Schritt 2.2) die verbleibenden intakten Zellen in allen Proben durch Zentrifugation für 6 Minuten bei Raumtemperatur und 450 x g pelletieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, indem sie in einer Tabelle Abfallbehälter zu gießen. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich durch die Zentrifugationsröhrchens Umkehren und die Öffnung auf einem Papiertuch klopfen. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet so trocken wie möglich ist. </li><li> Wiederholen Sie die hypotonischen Lyseverfahren, wie zuvor beschrieben (Schritt 2.2). NOTE: Im Prinzip dieser hypotonischen Lyseverfahren (Schritte 2,3 bis 2,5) mehr als einmal wiederholt werden kann, von der Reinheit des gemischten Leukozytenfraktion in Abhängigkeit zu erhalten. Nach zwei Lyse der Anteil der verbleibenden Erythrozyten in der erhaltenen gemischten Zellfraktion Schritte ist etwa 25%. </li><li> Pellet die verbleibenden intakten Zellen durch Zentrifugation für 6 Minuten bei Raumtemperatur und 450 x g. Entfernen Sie den Überstand (siehe Schritt 2.4). In 500 ul HBSS zu dem Pellet und vorsichtig lösen, bis eine homogene Lösung erhalten wird. Bringen Sie jede Probe auf den entsprechend markierten 1,5 ml Probenröhrchen. </li><li> Je nach Experiment analysieren direkt erhaltenen Proben (beispielsweise über Durchflusszytometrie) 25, Fleck mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern (zur Identifizierung von einzelnen Zelltypen) 32, inkubieren mit Zellreize (für die Zellaktivierungsversuche) 33 oder auf Eis gelagert und Verwendung später. Je nach dem Ziel der Studie, führen unmittelbar nachfolgenden Experimente andie gemischte Leukozytenfraktion da Granulozyten haben eine relativ kurze Halbwertszeit von etwa 20 h. ANMERKUNG: Dies gilt auch für die Peroxidase-Aktivität-Färbung unten beschrieben. </li></ol> 3. Halogenierungs Peroxidaseaktivität Anfärben HINWEIS: HOCl- und HOBr-Produktion durch die Blut abgeleiteten Häm Peroxidasen MPO und EPO wird durch Verwendung APF quantifiziert, die von den genannten unterhalogenige Säuren Fluorescein oxidiert wird. Deshalb, wenn Zellmarkierung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern in Kombination mit APF-Färbung durchgeführt wird, zu vermeiden Fluorophore, die mit dem Emissionssignal von Fluorescein stören. <ol><li> Führen Sie APF-Färbung bei 4 ° C auf Eis. </li><li> Für eine Arbeitslösung von APF Herstellung auftauen eines geeigneten Aliquots des Farbstoffs (beispielsweise 10 &amp; mgr; l, 11,81 mM) und verdünnt sie mit HBSS auf genau 1 mM (zB 108,1 &amp; mgr; l Puffer in die 10 &amp; mgr; l hinzufügen). <ol><li> Für jede Probe (500 &amp; mgr; l Zelllösung) vorbereiten 5 μl der beschriebenen APF-Arbeitslösung. Dementsprechend verwenden ein 10-ul-Aliquot von APF (11,81 mM), die 118,1 ul APF-Arbeitslösung (1 mM) ergibt etwa 20 Proben vorzubereiten. Durch Verlust beim Pipettieren etwa 10% mehr APF Arbeitslösung als berechnet vorzubereiten. </li></ol></li><li> Um die Peroxidase Spezifität der APF - Färbung zu prüfen, Kontrollproben mit dem Häm Peroxidasehemmstoff 4-Aminobenzoesäurehydrazid (4-ABAH) 35 vorzubereiten. <ol><li> Bereiten Sie eine 1 M Stammlösung von 4-ABAH (151,17 g / mol) in Dimethylsulfoxid (DMSO) durch Verdünnen von 75,6 mg 4-ABAH in 500 &amp; mgr; l Lösungsmittel. Weitere 4-ABAH 1/10 in HBSS verdünnen. </li></ol></li><li> Zur Herstellung einer Lösung , H 2 O 2 Arbeits Etikett zwei 1,5 ml Zentrifugationsröhrchen mit &quot;70 mM H 2 O 2&quot; und &quot;7 mM H 2 O 2&quot; bezeichnet. <ol><li> In dem Rohr mit &quot;70 mM H 2 O 2&quot;, verdünne 10 ul frischeiner 30% Stammlösung (8,8 mM) H 2 O 2 unter Verwendung von 990 &amp; mgr; l destilliertem Wasser mit einer Konzentration von etwa 88 mM zu erhalten. Lagern auf Eis und innerhalb von 4 Stunden. HINWEIS: H 2 O 2 wird in der Regel als 30% ige Stammlösung von den Lieferanten geliefert. Wenn sie bei 4 ° C gelagert, ist es seit etwa 3 Jahren stabil. Führen Verdünnungen von H 2 O 2 in destilliertem Wasser Zersetzung zu vermeiden. H 2 O 2 Verdünnungen könnte auch in 0,1 M NaOH - Lösung hergestellt werden. </li><li> Zur Bestimmung der genauen H 2 O 2 -Konzentration eine weitere 1 bis 10 Verdünnung von dem ersten H 2 O 2 - Stammlösung (etwa 88 mM) durch Zusatz von 100 &amp; mgr; l dieser Lösung zu 900 ul destilliertes Wasser in 1,5 - ml - Röhrchen vorbereitet markiertem &quot;7 mM H 2 O 2&quot;. </li><li> Nehmen Sie ein Spektrum im nahen UV - Bereich (zB 200-300 nm) durch eine UV-Vis - Photospektrometer und verwenden die Absorption bei 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) anhand der H 2 O 2 -Konzentration in der zweiten H 2 O 2 Stammlösung 34 zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die Referenz Küvette nur destilliertes Wasser enthält. Für die Messung Verwendung Quartzküvetten als ein Spektrum im UV-Bereich aufgezeichnet. </li><li> Aus diesem Ergebnis errechnen die genauen Konzentrationen beider H 2 O 2 Stammlösungen. Passen Sie die Konzentration der ersten Stammlösung in dem &quot;70 mM H 2 O 2&quot; Probenröhrchen genau 70 mM durch eine entsprechende Menge an destilliertem Wasser zugegeben wird . Speichern Sie die erhaltene Arbeitslösung auf Eis und innerhalb von einer Stunde. </li></ol></li><li> Werden 5 &amp; mgr; l der 4-ABAH-Arbeitslösung (100 mM) auf die entsprechenden Proben auf eine Endkonzentration von 1 mM. Inkubiere die Proben für 15 min bei 37 ° C im Inkubator vor APF hinaus. </li><li> Werden 5 ul APF-Arbeitslösung (1 mM) zu jedem500 &amp; mgr; l Probe, die eine endgültige Farbstoffkonzentration von 10 uM zu erhalten. Mischen Sie die Proben vorsichtig (zB durch Verwendung des Wirbelmischer auf mittlerer Stufe) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Werden 5 &amp; mgr; l H 2 O 2 Arbeitslösung (70 mM) zu jeder 500 ul Probe für eine Endkonzentration von 700 uM. Vorsichtig mischen die Proben und Inkubation sie für 60 min bei 37 ° C. Führen Sie geeignete Kontrollmessungen parallel. HINWEIS: Kontrollmessungen zeigten , dass 700 &amp; mgr; M H 2 O 2 für die Zellen nicht toxisch sind. Es wurden auch keine signifikanten zellulären Reaktionen beobachtet. HINWEIS: Die APF - Färbung auch durch Weglassen der Zugabe von H 2 O 2 in Abhängigkeit von der wissenschaftlichen Fragestellung durchgeführt werden kann. In Abwesenheit von Wasserstoffperoxid nur der basalen Chlorierungsmittel MPO und EPO - Aktivität bestimmt wird , während die Zugabe von H 2 O 2 die Erfassung des maximalen HOCl und HOBr - Produktion durch die Zellen ermöglicht. Ter Letzteres bedeutet eine deutlich höhere Fluoreszenzsignal. </li><li> Für die Zellen pelletiert, Zentrifugieren Sie die Proben für 10 Minuten bei Raumtemperatur und 400 x g. Gründlich entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu zerstören und 250 ul HBSS fügen Sie die Zellen erneut zu suspendieren. HINWEIS: Die Proben sind nun bereit für die Analyse über Durchflusszytometrie 25. </li><li> Lagern Sie die Proben im Dunkeln bis zur Analyse Bleichen zu vermeiden. Nach Anregung bei 480-490 nm bei etwa 525 nm 37 die Emission von Fluorescein erkennen. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Als Neutrophile die häufigsten Leukozyten im menschlichen Blut die Isolierung von Peroxidase-positive Zellen sind oft konzentriert sich nur auf diesen Zellen und enthält eine Trennung von Neutrophilen von anderen Leukozyten durch Dichtegradientenzentrifugation 38. Doch wie Neutrophile viel weniger reichlich in murine Blutproben sind 39 für die letztere komplizierteren Methoden müssen 40 verwendet werden. Darüber hinaus auch beide Methoden zur Entfernung von Peroxidase-positive führen Monozyten aus den Proben und aufgrund der Notwendigkeit größerer Blutmengen (zB 400 &amp; mgr; l 41), sind nicht für Mikroproben während wiederholten Blutentnahme aus kleinen Labortieren erhalten 38,40. Die Reinigung von Maus - Neutrophilen aus peritonealen Exsudaten müssen auch die Opfer der Tiere und überdies nicht aus Blut gewonnenen Granulozyten 38,40 ergeben. Kürzlich Methoden entwickelt hochgereinigten Granulozyten-Fraktionen aus murinen bl zu erhaltenOOD (beispielsweise die Anwendung von Antikörpern) sind oft teuer, kompliziert und zeitraubend und 40,42,43 wieder nur konzentrieren sich auf die Reinigung einer Peroxidase-positiven Leukozyten - Typs. Somit ist die hier vorgestellte Verfahren hat einige Vorteile gegenüber anderen zur Reinigung von Peroxidase-positiven Leukozyten aufgetragen Methoden. Wie es die Situation, in der Zirkulation beruht repräsentieren auf kleinen Blutproben die erhaltenen Zellen. Aufgrund der geringen Ausgangsprobenvolumens für das Protokoll benötigt wird, ist das Verfahren sowohl anwendbar menschlichen und nicht-menschlichen Blut, trotz der speziesspezifische Unterschiede in der Abundanz von Neutrophilen. Tatsächlich Blutvolumina so klein wie 50 &amp; mgr; l an initial das beschriebene Verfahren anzuwenden wir auch in der Lage waren (Daten nicht gezeigt). Die kleine Blutprobe für das Verfahren erforderlich macht es auch für eine wiederholte Blutentnahme geeignete von kleinen Labortieren oder für spezielle medizinische Anwendungen (zB newborn Diagnose). Da ter Leukozyten-Anreicherung an der Abreicherung von Erythrozyten basiert alle Peroxidase-positive Zellen (Neutrophile, Eosinophile, Monozyten) in der erhaltenen gemischten Leukozytenfraktion enthalten und separat analysiert werden kann durch Durchflusszytometrie unter Verwendung. Das Verfahren ist schnell, zuverlässig und hat eine geringe Anforderungen an Chemikalien und Instrumentierung, das Protokoll geeignet für mehrere wissenschaftliche Umgebungen. Als Neutrophilen leicht ein kritischer Schritt bei der beschriebenen Methode die genaue Einstellung des pH-Wertes der Pufferlösungen verwendet wird, aktiviert werden (PBS und HBSS, siehe Schritte 1.2 und 1.3 des Protokolls Abschnitt). Weiterhin die Inkubationszeit der Blutzellen mit destilliertem Wasser sollte als 60 sec nicht mehr vor normosmotic Bedingungen der Wiederherstellung (Schritt 2.2 des Protokolls Abschnitt. Der (fast) vollständig Entfernung des Lösungsmittels aus dem Zellpellet (Schritt 2.4) vor der Zugabe Wasser für die zweite hypotonische Lyse ist ein weiterer wichtiger Schritt als Buffer Rückstände wird die Effizienz des hypotonischen Lyseverfahren vermindern. Ein weiterer kritischer Schritt bezieht sich auf die Anwendung von H 2 O 2 während der APF Färbung. Obwohl die aufgebrachte Menge nicht zytotoxischen sein sollte, sollten die Vitalität der Zellen geprüft werden. Während unserer Untersuchungen wenden wir typischerweise den Farbstoff 5,5 &#39;, 6,6&#39;-Tetrachlor-1,1&#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine Iodid (JC-1) für den Nachweis von frühen apoptotischen Ereignisse. Darüber hinaus gibt es eine Reihe von Einschränkungen in der vereinfachten Leukozyten Anreicherungsverfahren beschrieben. Während die Technik kann von mehreren Arten (Mensch, Ratte und Maus versucht worden sind), um Blutproben angewendet werden, hängt im Blut auf ihren Anfangsfluss der Leukozyten Menge nach Lyse von Erythrozyten erhalten. Letztere variiert sicher zwischen den Arten 39 und ist auch abhängig von der Entzündungszustand des sondierten Individuums. Während darüber hinaus kann das Lyseverfahren mit bis zu einem geschehenhundert Proben parallel die Zwischen Zentrifugationsschritte stellen eine Begrenzung in Abhängigkeit von der Zentrifuge verwendet wird, nur bis zu 30 Proben parallel bearbeitet werden können. Während ferner APF leicht HOCl und HOBr in Gegenwart von SCN detektiert - die Halogenierung Aktivität von MPO und EPO wirkt sich auch auf die letzteren pseudo-Halogenid ist . Dadurch hypothiocyanite (- OSCN) gebildet wird, die nicht in der Lage ist APF zu oxidieren. Eine weitere Einschränkung kommt von den Eigenschaften des Farbstoffes APF für die Bestimmung von HOCl- verwendet und HOBr-Produktion durch MPO und EPO. Da der Farbstoff Fluorescein oxidiert wird, kann die Färbung nicht mit fluoreszierendem Antikörper mit einem Emissionsspektrum in dem gleichen Bereich kombiniert werden. Natürlich die jegliche Interferenzen zwischen APF-derived Fluoreszenz und dem Signal zusätzliche Fluoreszenzsignale zu Zytometer für in der Strömung kontrolliert und ausgeglichen werden. wenn die Erfassung der Peroxidaseaktivität Halogenierung Ansonsten ist nicht der Umfang derstudieren, nach der Anwendung der Erythrozyten-Depletion Methode anderen analytischen Verfahren verwendet werden können anstelle von APF. Da die beschriebene hypotonische Lyse Verfahren nur Verfahren nur zu einem teilweisen Abbau von Erythrozyten und Leukozyten, da alle Leitungen sind noch in der erhaltenen gemischten Zellfraktion, die eine Einzelzellanalyse ermöglichen angewandt werden. Verfahren , die die Lyse von Zellen (zB Western - Plot - Analyse) umfassen wird zuverlässige Ergebnisse nicht liefern. Die kleine anfängliche Probenvolumen kann ein weiteres Hindernis für eine solche Analyseverfahren sein. Die Untersuchung von MPO In Bezug auf (und EPO) Aktivität in Leukozyten oft nur die allgemeine Oxidationsmittel - Produktion durch die Zellen anstelle von speziell Auswertung der Häm - Peroxidase - Aktivität 44,45 gerichtet. Darüber hinaus oft keine Versuche unternommen werden, zwischen der Halogenierung und der Peroxidase - Aktivität von MPO und EPO 46,47 zu unterscheiden. Methoden, die speziell auf die Chlorierung von MPO-Aktivität von qu Adresseantifying HOCl abgeleitete Produkte wie Chlortyrosin nicht erkennen überoxidiert und / oder metabolisiert Produkte und damit häufig zu einer Unterschätzung der realen HOCl-Produktion 48 führen. Außerdem dieses Verfahren sowie die Detektion von HOCl-derived 2-chloroethidium sind auch zeitaufwendig, benötigen teure Analysegeräte und umfassen die Lyse von Zellen 48-50 .Es gibt viele Berichte über neue Farbstoffe für die spezifische Bestimmung der MPO - Aktivität Chlorierungsmittel in vitalen Zellen 44,51,52. Doch bisher nur APF und seine verwandten Verbindung hydroxyphenyl Fluorescein (HPF) sind im Handel erhältlich und deshalb routinemäßig in der Forschung 25,33 verwendet. In der Tat, durch APF verwenden konnten wir zeigen , dass die Chlorierung von MPO - Aktivität nicht nur durch Verwendung des isolierten Enzyms 53 quantifiziert werden kann , sondern auch durch den Farbstoff zu lebenden Zellen 26,33 Anwendung. Somit kann durch die schnelle Leukozyten-Anreicherung von Blut Mikroproben kombiniert mit einem oben genanntenn APF Färbung entwickelten wir ein Protokoll, das speziell geeignet ist , und gleichzeitig wird die Halogenierung Aktivität von MPO und EPO in allen Peroxidase positive Leukozyten adressieren, dh Neutrophile, Monozyten und Eosinophile 32. Darüber hinaus ist die Methode erfordert keine Zelllyse, welche eine Vielzahl von analytischen Methoden ermöglicht, einschließlich der Durchflusszytometrie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Außerdem kann diese Peroxidase Aktivitätsfärbung mit der Anwendung der Zelloberflächenmarker kombiniert werden, die die spezifische Analyse von Leukozyten-Unterfraktionen ermöglicht, auf die wissenschaftliche Aufgabe abhängig. Dennoch muss berücksichtigt werden, dass die aufgebrachte fluoreszenzmarkierte Antikörper interferieren nicht mit dem Fluorescein basierende Fluoreszenzsignal verwendet, um die HOCl- und HOBr-derived APF Oxidation zu quantifizieren. Zusammenfassend kann dieses Verfahren ein neues Werkzeug zur Verfügung stellen, um weitere Einblicke in die physiologische Rolle der Halogenierung Peroxidase-Aktivität des immunologischen re erhaltenlevant Blut abgeleiteten Peroxidasen MPO und EPO, die noch nicht gut verstanden 8,20,23. Außerdem in einer Tierstudie an rheumatoider Arthritis konnten wir vor kurzem beobachten, dass dieses Protokoll zur Bewertung der MPO-derived HOCl-Produktion als neuer klinischer Marker bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen (nicht veröffentlichte Daten) führen kann.

Polymorphkernigen Leukozyten (PMNs, die auch als Granulozyten) und Monozyten sind wichtige zelluläre Komponenten des angeborenen Immunsystems im Blut 1,2. Sie tragen zur primäre Abwehr von Krankheitserregern sowie zur Aktivierung des erworbenen Immunsystems und die Einleitung einer systemischen Entzündungsreaktion 2-4. Doch vor allem Neutrophile, die am häufigsten vorkommende Art von Granulozyten und Monozyten tragen auch wesentlich zur Regulierung und die Beendigung der akuten entzündlichen Ereignisse 5. Daher können diese Zellen auch eine wichtige Rolle bei chronisch - entzündlichen Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis 6,7 spielen. In der Tat, Asthma, eine chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege, wird durch eine beeinträchtigte Apoptose von Eosinophilen gekennzeichnet, die zweithäufigste Granulozyten Typ im Blut 8. Doch die Apoptose von Granulozyten und deren schnelle Beseitigung durch Makrophagen sind zwei wesentliche Schritte, die während der zellulären BeendigungEntzündungs ​​11.09. In den genannten Immunzellen zwei eng verwandte Enzyme, nämlich Myeloperoxidase (MPO, Neutrophilen und Monozyten) und eosinophile Peroxidase (EPO, Eosinophilen) können 12,13 gefunden werden. Diese Häm Peroxidasen klassisch sind mit der humoralen Immunantwort , wie sie im Zusammenhang mit zwei elektronisch zu oxidieren (pseudo-) -halogenide zu dem entsprechenden hypo (pseudo) halogenhaltige Säuren , die für ihre bakterizide Eigenschaften 14-16 bekannt sind. Unter physiologischen Bedingungen MPO hauptsächlich Formen Hypochlorsäure (HOCl) und hypothiocyanite (- OSCN) , während die letztere und Hypobromsäure (HOBr) durch EPO 17-19 gebildet werden. Neue Ergebnisse deuten darauf hin , dass diese (pseudo-) Halogenierung Enzymaktivität auch für die Regulierung der Entzündungsreaktionen und zur Beendigung von Immunreaktionen 20,21 beitragen. In der Tat wurden die HOCl Produktion von MPO und daraus abgeleitete Produkte gezeigt T - Zell-basierte adaptive Immunantwort 22-2 zu unterdrücken4. Um weitere Einblicke in die immunologischen Rolle der Leukozyten aus dem angeborenen Immunsystems bei chronischen Entzündungskrankheiten zu gewinnen und den Beitrag von MPO und EPO dieser physiologischen Funktion zu bestimmen, haben wir ein Verfahren, um schnell Leukozyten aus kleinen Blutproben für einen nachfolgenden spezifischen reichern Bestimmung der Halogenierung Peroxidase-Aktivität in diesen Zellen. Für Erythrozyten-Depletion haben wir ein standardisiertes Verfahren mit zwei nachfolgenden hypotone Lyse Schritte mit destilliertem Wasser ausgewählt, die bei niedrigen Materialkosten zu einer schnellen Leukozyten-Anreicherung führt. Für die anschließende Bestimmung der Halogenierung MPO und Aktivität EPO die HOCl- und HOBr-spezifischen Farbstoff aminophenyl Fluorescein (APF) wurde 25-27 verwendet. Im Gegensatz zu der Anwendung von unspezifischen Peroxidase Färbemethoden 28,29, ermöglicht dieser Ansatz die selektive Erfassung der Halogenierung Peroxidase - Aktivität, die häufig bei schweren infl beeinträchtigt wirdammation 30,31.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="738">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">materials/equipment</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">15 ml centrifugation tubes</td>
			<td style="width:203px;">VWR/Corning</td>
			<td style="width:120px;">734-0451</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">1.5 ml sample tubes</td>
			<td style="width:203px;">VWR/Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">211-2130DE</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:213px;">Pipettes for volumes up to 5 ml</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">e.g. 3120000070</td>
			<td style="width:203px;">We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 &#181;l, 10-100&#181;l, 100-1000 &#181;l an 500-5000&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">laminar flow bench</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Electron Corperation</td>
			<td style="width:120px;">HeraSafe</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:203px;">Bender &#38; Hobein AG</td>
			<td style="width:120px;">Vortex Genie 2</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tabletop centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td style="width:120px;">Laborfuge 400R</td>
			<td style="width:203px;">The centrifuge should be able to be used at 450x g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Small centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">5415D</td>
			<td style="width:203px;">The centrifuge should be able to be used at 400x g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Incubator</td>
			<td style="width:203px;">Heraeus</td>
			<td style="width:120px;">cytoperm 2</td>
			<td style="width:203px;">Settings: 37 &#176;C, 95% humidity, 5 % CO2 content</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:203px;">Varian</td>
			<td style="width:120px;">Cary 50 bio</td>
			<td style="width:203px;">A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Flow cytometer</td>
			<td style="width:203px;">Becton, Dickinson</td>
			<td style="width:120px;">BD Facs Calibur</td>
			<td style="width:203px;">Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:203px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Chemicals</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">amresco</td>
			<td style="width:120px;">K812</td>
			<td style="width:203px;">sterile solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;"></td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P4417</td>
			<td style="width:203px;">tablets for solving in 200 ml millipore water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H1387</td>
			<td style="width:203px;">970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:203px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">1.09057.1000</td>
			<td style="width:203px;">1M solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:203px;">Riedel-deHa&#235;n</td>
			<td style="width:120px;">30620</td>
			<td style="width:203px;">Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:213px;">Aminophenyl fluorescein</td>
			<td style="width:203px;">Cayman</td>
			<td style="width:120px;">10157</td>
			<td style="width:203px;">5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 &#181;l should be prepared and stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:213px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H1009</td>
			<td style="width:203px;">This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:213px;">4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A41909</td>
			<td style="width:203px;">A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">DMSO</td>
			<td style="width:203px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:120px;">23500.26</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and specific assessment of the halogenating peroxidase activity in leukocyte-enriched blood samples

In diesem Beitrag wird ein Protokoll für die schnelle und standardisierte Anreicherung von Leukozyten aus kleinen Vollblut-Proben beschrieben. Dieses Verfahren wird auf der hypotonischen Lyse der Erythrozyten basieren und kann als an Blut von nicht-menschlichen Ursprungs sowie für die menschliche Proben angewendet werden. Die geringe anfängliche Probenvolumen von etwa 50 bis 100 &amp; mgr; l macht dieses Verfahren für wiederkehrende Blutentnahme von kleinen Labortieren. Darüber hinaus wird Leukozyten Anreicherung innerhalb von Minuten und mit geringem Material Anstrengungen in Bezug auf Chemikalien und Instrumentierung erreicht, ist dieses Verfahren anwendbar in mehreren Laborumgebungen. Standardisierte Reinigung von Leukozyten wird mit einem hochselektiven Färbeverfahren kombiniert Halogenierung Peroxidaseaktivität von Häm - Peroxidasen, Myeloperoxidase (MPO) und eosinophile Peroxidase (EPO), dh die Bildung von unterchloriger und hypobromige Säure (HOCl und HOBr) auszuwerten. Während MPO stark in neut ausgedrücktrophils, die häufigste Immunzelltyp im menschlichen Blut sowie in Monozyten, die verwandten Enzym EPO wird ausschließlich in Eosinophilen exprimiert wird. Die Halogenierung Aktivität dieser Enzyme wird unter Verwendung der fast HOCl- und HOBr-spezifischen Farbstoff aminophenyl fluorescein (APF) und den primären Peroxidasesubstrat Wasserstoffperoxid behandelt. Bei der anschließenden Durchflusscytometrieanalyse alle Peroxidase-positive Zellen (Neutrophile, Monozyten, Eosinophilen) unterscheidbar und ihre Halogenierung Peroxidase-Aktivität quantifiziert werden können. Da APF Färbung kann mit der Anwendung von Zelloberflächenmarkern kombiniert werden, kann dieses Protokoll speziell verlängert werden, um Leukozyten-Unterfraktionen adressieren. Das Verfahren ist für HOCl und HOBr Produktion sowohl in der Human- und in Nagetier Leukozyten zu erkennen. Angesichts der breiten und mannigfaltig diskutiert immunologische Rolle dieser enzymatischen Produkte in chronisch-entzündlichen Erkrankungen kann dieses Protokoll zu einem besseren Verständnis des beitragenimmunologischer Relevanz von Leucocyten abgeleitetes Häm Peroxidasen.

Wie zuvor berichtet , oben gedreht beschriebene Verfahren geführt anwendbar sowohl für die menschliche zu sein und nicht menschlichen Material 32. Außerdem, wie für die Mäuse, die mit asthmatischen Symptomen der Färbung APF gezeigt ist, kann ein geeignetes Werkzeug sein, um Unterschiede in der systemische proinflammatorische Zustand erkennen. Deshalb wird in einer anschließenden Studie , die wir dieses Protokoll zur Bewertung wiederholt die Halogenierung Aktivität von MPO (und EPO) in der weiblichen dunklen Agouti Ratten mit Pristan-induzierte Arthritis (PIA). Ein repräsentatives Beispiel für Leukozyten - Anreicherung und Färbung während dieses Experiments durchgeführt wird in Abbildung 1 dargestellt. Etwa 200 &amp; mgr; l Vollblut wurde aus dem retrobulbären Venenplexus des Tieres unter Narkose und heparinisiert erhalten. Die Erythrozytenabbau und eine nachfolgende APF-Färbung wurden unter Verwendung von 100 &amp; mgr; l Probenvolumen durchgeführt. Danach wurde die Probe mittels Durchflusscytometrie analysiert. (1A), eine starke Verarmung von Erythrozyten aus der Probe erzielt wurde. Weiterhin verschiedenen Leukozytentypen deutlich erkennbar waren, die durch Aufbringen von fluoreszenzmarkierten Zelloberflächenmarker (nicht gezeigt) identifiziert. Kurz die Erythrozyten (CD235a-positiv) / Zelle nur Trümmer Region für 22% der Ereignisse berücksichtigt, während etwa 48% der Ereignisse als CD16-positive Neutrophile identifiziert wurden. Des Weiteren 3% der Veranstaltungen wurden jeweils als CCR3-positive Eosinophilen und CD14-positiven Monozyten und etwa 19% der Ereignisse identifiziert entfielen CD5 / CD19-positive B und T-Lymphozyten sind. Die Intensitätsverteilung des APF-abgeleitete Fluoreszenz (1B) deutlich die Unterscheidung von peroxydasenegativ Erythrozyten und Lymphozyten erlaubt , während Monozyten und Eosinophile zu einer moderaten APF Oxidation geführt und Neutrophile wurden stark positive Peroxidase unter dem chOsen experimentellen Bedingungen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der hohen Fülle von MPO in den letzteren Zellen im Vergleich zu der Enzymkonzentration in Monozyten 20. Die relativ schwache Reaktion der Eosinophilen kann durch die Tatsache erklärt werden, dass kein Bromid gegeben, die das EPA abgeleiteten Bildung von HOBr aufgefordert haben. Vorläufige Studien an isolierten Eosinophilen hat überraschenderweise keinen großen Einfluss von außen hinzugefügt Bromid auf der APF Oxidation durch diese Zellen zeigen. Dennoch Oxidation von APF von den Eosinophilen wurde beobachtet , die durch die Einführung von geringen Mengen an Br erklärt werden kann - über den Pufferlösungen (PBS und HBSS). Alternativ erzeugen EPO kann auch kleine Mengen von HOCl, zumindest unter sauren Bedingungen (beispielsweise in Phagolysosomen). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54484/54484fig1.jpg" /> Abbildung 1: Leukocyte Anreicherung und APF-derived Fluoreszenz in einem Blutmikroprobe von einer Ratte. Eine Menge von etwa 200 &amp; mgr; l Vollblut wurde aus dem retrobulbären Venenplexus eines weiblichen Dunkle Agouti Ratten erhalten. Nach Anwendung des beschriebenen Hämolyse Verfahren zu 100 ul Blut und einem nachfolgenden APF die gemischte Zellfraktion Färbung wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Wie durch den FSC gezeigt / SSC Plot (A) wurden die Erythrozyten von der Probe und die verschiedenen Leukozyten - Typen unterschieden werden könnte leicht stark abgereichert. Die Verteilung des APF-derived Fluoreszenzintensität (B) zeigten deutlich , Häm - Peroxidase-negativen Zellen (Erythrozyten und Lymphozyten) sowie Leukozyten mit moderater (Eosinophilen und Monozyten) oder stark (Neutrophile) Halogenierung Peroxidase - Aktivität. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54484/54484fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier anzuschauen größere Version der Figur.</a>

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Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

fast-specific-assessment-halogenating-peroxidase-activity-leukocyte

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K Aufrufe.  University of Leipzig. This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Serie: Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität of Clinical Antikörper Proben

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome. Aging is associated with an increased susceptibility to viral and bacterial infections and decreased responsiveness to vaccines with a well-documented decline in humoral as well as cell-mediated immune responses1,2. We have recently assessed the effects of aging on Toll-like receptors (TLRs), key components of the innate immune system that detect microbial infection and trigger antimicrobial host defense responses3. In a large cohort of healthy human donors, we showed that peripheral blood monocytes from the elderly have decreased expression and function of certain TLRs4 and similar reduced TLR levels and signaling responses in dendritic cells (DCs), antigen-presenting cells that are pivotal in the linkage between innate and adaptive immunity5. We have shown dysregulation of TLR3 in macrophages and lower production of IFN by DCs from elderly donors in response to infection with West Nile virus6,7. 
Paramount to our understanding of immunosenescence and to therapeutic intervention is a detailed understanding of specific cell types responding and the mechanism(s) of signal transduction. Traditional studies of immune responses through imaging of primary cells and surveying cell markers by FACS or immunoblot have advanced our understanding significantly, however, these studies are generally limited technically by the small sample volume available from patients and the inability to conduct complex laboratory techniques on multiple human samples. ImageStream combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging and thus facilitates investigation in multiple cell populations contemporaneously for an efficient capture of patient susceptibility. Here we demonstrate the use of ImageStream in DCs to assess TLR7/8 activation-mediated increases in phosphorylation and nuclear translocation of a key transcription factor, NF-&kappa;B, which initiates transcription of numerous genes that are critical for immune responses8. Using this technology, we have also recently demonstrated a previously unrecognized alteration of TLR5 signaling and the NF-&kappa;B pathway in monocytes from older donors that may contribute to altered immune responsiveness in aging9.

We describe use of ImageStream technology (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank">www.amnis.com</a>), which combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging, to quantify cellular mechanisms of primary immune cells from well-defined patient cohorts. Our studies provide a blueprint for translational investigations to quantify lineage specific cellular responses in small samples from subject cohorts.

Quantitative Bildgebung von Lineage-spezifischen Toll-like Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion in Monozyten und dendritischen Zellen aus kleinen Proben des menschlichen Blutes

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

Magnetrührers Verfahren zum Nachweis von<em&gt; Trichinella</em&gt; Larvae in Muskelproben

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...