This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).

1. Vorbereitung der Ausrüstung <ol><li> Besorgen Sie sich ein Chemostat Glas (150-250 ml) oder einem Erlenmeyerkolben (250 ml) mit einer Einlassöffnung und eine Austrittsöffnung enthält. Verbinden Sie die Anschlüsse mit Silikonschlauch so dass für Flussraten von 10 bis 100 ml / h. Optional kann ein Entlüftungsventil, eine Luftaustrittsöffnung, und temperiertes Wasser Einlass- und Auslasskanäle verwenden. </li><li> Besorgen Sie sich eine Vorrichtung, die geeignet für die chemostat Glas, die für das Rühren und Temperaturkontrolle bietet (oder einen Dreh Schüttelinkubator verwenden). </li><li> Erhalten zwei peristaltische Pumpen, um frisches Medium zu liefern und die Kultur zu sammeln. </li><li> Besorgen Sie sich ein Reservoir Glas (10-20 L) eine mittlere Austrittsöffnung und eine Lufteinlassöffnung enthält. </li><li> Erhalten Silikonschlauch geeignet für die Verdünnungsrate (dh ID 0,8 mm, Durchflussbereich von 0,06 bis 36 ml / min; L / S 13 Schläuche). </li></ol> 2. Medium Vorbereitung und Sterilisation <ol><li> Initial Medium <ol><li> Man löst 0,3 g Glucose, 0,08 g NH 4Cl, 0,05 g NaCl, 0,75 g Na 2 HPO 4 · 2H 2 O und 0,3 g KH 2 PO 4 in 90 ml destilliertem Wasser (DW) in einem Chemostat jar. </li><li> Seal die chemostat Glas zusammen mit dem Schlauch mit Schellen. Sie nicht die Lüftungsöffnung abzudichten. </li><li> Sterilisieren Sie die chemostat Glas in einem Autoklaven bei 121 ° C für 15 min. Nach der Sterilisation, speichern Sie die chemostat Glas bei Raumtemperatur. </li><li> Man löst 0,02 g MgSO 4 · 7H 2 O, 0,01 g CaCl 2 und 0,1 mg Thiamin in 10 ml DW (Lösung A). </li><li> Filterlösung A eine Spritze und eine vorge sterilisierten Spritzenfilter unter Verwendung von (a 0,45 um Porenfilter). </li><li> Fügen Sie die Lösung A Filtrate zum Chemostat Glas. </li></ol></li><li> Stress-Medium <ol><li> Man löst 30 g Glucose, 8 g NH 4 Cl, 5 g NaCl, 75 g Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 30 g KH 2 PO 4 und 300 g Dinatriumsuccinat Hexahydrat (Na 2 · Succinat · 6H &lt;sub&gt; 2 O; der Stressor in diesem Experiment verwendet) in 9,9 L DW in einem Reservoir jar. </li><li> Verschließen Sie den Behälter Glas zusammen mit dem Schlauch mit Schellen. Sie nicht die Lüftungsöffnung abzudichten. </li><li> Sterilisieren des Behälters jar in einem Autoklaven bei 121 ° C für 15 min. Nach der Sterilisation, speichern Sie das Gefäß bei Raumtemperatur. </li><li> Man löst 2 g MgSO 4 · 7H 2 O, 1 g CaCl 2 und 10 mg Thiamin in 100 ml DW (Lösung A). </li><li> Filter Lösung A mit einer Spritze und einem vorher sterilisierten Spritzenfilter (0,45 &amp; mgr; m ein Porenfilter). </li><li> Fügen Sie die Lösung A Filtrate zum Reservoir Glas. </li><li> Aseptisch schließen Sie das sterilisierte Silikonschlauch mit dem Reservoir Glas und die peristaltische Pumpen befestigen. </li></ol></li><li> High-Stress-Mittel <ol><li> Bereiten Sie das Medium , wie in Abschnitt 2.2, aber mit einer größeren Konzentration von Stressor (dh 3-5 g / l höher in der Succinat - Anpassung). Hinweis: Dieses Protokoll zur Anpassung an eine Stress than kann über das Medium geliefert werden. Im Falle von physikalischen Stressoren, wie Temperatur, Rühren oder Beleuchtung, die Kultivierung sollte entsprechend ausgelegt werden. </li></ol></li></ol> 3. Erste Anbau <ol><li> Impfen eine einzige Kolonie von Wildtyp E. coli in einem 15 ml Teströhrchen mit 4 ml des anfänglichen Mediums. </li><li> Inkubieren des Teströhrchens in einem Schüttelinkubator 12 Stunden bei 37 ° C und 220 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Aseptisch 1 ml der Vorkultur in Chemostat Glas. </li><li> Inkubieren Sie die chemostat Glas und bietet für die Belüftung (Luft 50 ml / min) und Rühren (200 Umdrehungen pro Minute), bei 37 ° C für 6 Stunden. </li></ol> 4. Stress-Anpassung <ol><li> Aseptisch schließen Sie das Ende des Silikonschläuche von den Pumpen zum Chemostat Glas. </li><li> Starten Sie den Ausgang Pumpe (10 ml / h oder höher) und sammeln Kultur. Hinweis: Die Kultur in der exponentiellen Phase sein sollte, in der Regel 4-8 Stunden nach der anfänglichen Kultivierung. </li><li> CHeck der optischen Dichte (600 nm) der Kultur aus dem Auslassschlauch. </li><li> Starten Sie den Zulaufpumpe (10 ml / h, auf eine Rate von Verdünnung von 0,1 h -1 entspricht). </li><li> Überprüfen Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 nm von dem Auslass alle 24 h Schläuche. </li><li> Betreiben Sie den chemostat für 96 Stunden (9,6-fache Umsatz) oder mehr. Wenn die optische Dichte stabil ist, tauschen Sie das Reservoir, das den hochbelasteten Medium enthält. Wenn die optische Dichte von weniger als 0,2 ist, stoppen Sie die Fütterung Zulaufpumpe für 6 Stunden. Starten Sie den Zulaufpumpe und prüfen, ob die optische Dichte über 0,2 ist. </li><li> Nach und nach die Konzentration des Stressor erhöhen, indem sie zu einem Reservoir Ändern einer höheren Stressor Konzentration enthält. </li><li> Nehmen Sie Proben der angepassten Kultur , wenn es einen Meilenstein erreicht (zB ein Stamm angepasst bis 100 g / L Succinat Stress) und Speicher für weitere Genomanalyse. </li><li> Für die Probenlagerung, mischen Sie die Kulturprobe (0,5 ml) mit einer sterilisierten 80% Glycerin solutiauf (0,5 ml) und lagern Sie es bei -80 ° C. Hinweis: Wenn der Mikroorganismus die Fähigkeit erwirbt die Stressoren während der ALE-Verfahren abzubauen, die Stressor Konzentration in der Fermentations Glas wie in der frischen Reservoir ist nicht das Gleiche. </li></ol> 5. Einzelkolonie Isolierung des Stress angepasst Dehnungs <ol><li> Bereiten Agarplattenmedium (1,6% Agar), enthaltend die gleichen Stressor und bei der gleichen Konzentration des Mediums. </li><li> Platte die Austritts Kultur (0,1 ml) aus dem Chemostat und inkubieren bei 37 ° C für 16 Stunden. </li><li> Pick einzelne Kolonien von der Platte einen sterilen Zahnstocher und inokulieren sie in 15 ml Teströhrchen das gleiche Stressor enthält, und bei der gleichen mittleren Konzentration wie im Chemostat, und Inkubation für 6 Stunden. </li><li> 1 ml der Kulturbrühe in einen 250 ml Erlenmeyerkolben mit 50 ml Medium enthält. Ernte 0,5 ml der Kulturbrühe alle 1 h und Messung der OD bei 600 nm. Vergleichen Sie die Wachstumsrate des angepassten strain derjenigen des Wildtyp-Stamm der Stressor gegeben. </li></ol>

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	<li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance.">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase.">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476 (2014).</li><li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+evolution.">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li><li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling.">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum.">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15 (2014).</li><li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat.">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li><li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain.">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li><li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+dynamics+during+experimental+evolution.">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li><li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq.">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mikroorganismen sind in der Lage aufgrund ihrer schnellen Wachstumsrate und der genetischen Vielfalt zu fast allen Umgebungen anzupassen. Adaptive Laborentwicklung ermöglicht Mikroorganismen unter Bedingungen entwickelt, zu entwickeln, die eine Möglichkeit der Auswahl der einzelnen Organismen beherbergt spontane Mutationen bereit, die unter den gegebenen Bedingungen von Vorteil sind. Die chemostat Technik ist robuster für den folgenden Gründen künstlich angetrieben Evolution als Übertragungstechniken zu erreichen: (a) eine stetige Umgebung - weil Transfertechniken auf Batch-Kulturen basieren entweder auf festen oder in einem flüssigen Medium, die Umgebung der Zellen verändert sich während Batch Kultur, während die Umweltbelastung des chemostat ist stabil; (B) eine größere Bevölkerung und eine kontinuierliche Auswahl - die größere Population der chemostat bietet mehr genetische Vielfalt als die kleinere Population von Transfertechniken. Kontinuierliche Auswahl des chemostat Technik ist ein schneller Weg, die Evolution als intermittierende Auswahl von Transfertechniken zu erreichen. Es ist entscheidend, dass die Chemostat-Kultur nicht von anderen Mikroorganismen während der ALE-Verfahrens kontaminiert werden und aseptischen Bedingungen werden während Chemostat-Kultur erforderlich. Das ALE-Verfahren kann durch Änderungen an Stressoren, wie oxidativer Stress, osmotischen Stress und toxische Produkt Stress verändert werden. Es gibt ein paar technische Einschränkungen ALE durch Chemostatkultur. Entwicklung erfolgt durch Zufall; daher verschiedene Forscher nicht in der Lage sein, das gleiche Ergebnis zu erhalten Evolutions, obwohl die Folgen von Mutationen in Beziehung gesetzt werden können. Eine weitere Einschränkung ist die Auswaschung von Chemostat-Kultur, wenn die Konzentration der Stressor zu schnell erhöht wird. Wenn die Biomasse zu einem bestimmten Betrag (dh OD = 0,2 in diesem Verfahren) , nachdem die Konzentration der Stressor erhöht wird verringert, Verabreichung der Stressor sollte mindestens einige Generationen angehalten werden , umgeben die Belastung der Zeit anzupassen. Die jüngsten Entwicklungen in der Genomsequenzierungstechnologie haben das Verständnis von Mutationen dazu beigetragen, dass in Reaktion auf bestimmte Stressbedingungen zu entwickeln. Zum Beispiel ändert eine DNA - Mutation eine bestimmte systemische Wirkung, die der gegebenen Umwelt von Vorteil ist (dh Toleranz gegenüber einer toxischen Stressoren). So kann ALE verwendet werden Genfunktion oder Netzregulierung oder als Rohstoff für die &quot;beschleunigte Evolution&quot; zu studieren. ALE Studien sind auch nützlich in der Entwicklung von Antibiotika-resistenten Bakterien zu simulieren, was auf die Mechanismen, mit denen gefährliche arzneimittelresistenten Bakterienstämmen auftreten. Da die Flugbahn der Evolution des Genoms eingraviert ist, die genetischen Veränderungen aufzudecken, die zu den gewünschten Phänotypen (wie Stresstoleranz) führen , ist das nächste Hindernis einmal entwickelte Stämme 8 erhalten werden. Zu den aktuell nächsten Generation Sequenzierungstechnologien zur Verfügung, die Illumina und Ion Torrent platFormen sind für den Nachweis von Nukleotidsubstitutionen oder kleine indels geeignet, die in den entwickelten Stämme auftreten, und beide sind erschwinglich. Da in der Regel Variantenerkennung Kurz lesen Abbildung der Referenzsequenzen beinhaltet, ist die Verfügbarkeit der Genomsequenz des Ursprungsstamm von entscheidender Bedeutung. Selbst wenn die Genomsequenz des Gründerstammes aus öffentlichen Datenbanken verfügbar ist, ist es oft wünschenswert, es zu sequenzieren gleichzeitig mit dem entwickelten ein, denn es könnte einige zusätzliche Unterschiede in der tatsächlichen Ausgangsstamm sein. Protokolle für die Mutation Identifizierung sind über das Web oder einer Literaturrecherche 9,10 leicht zugänglich sind . Zum Beispiel ist BRESEQ eine speziell entwickelte Pipeline für die genomische Analyse von Labor-entwickelten Mikroben nächsten Generation Sequenzierungsdaten 11 verwendet wird . Vergleiche der entwickelten Stämme bei bestimmten Meilensteinen (zum Beispiel in dieser repräsentativen Daten, Wildtyp, DST50, DST100 und DST160) kann die Sequenz des entwickeltem Stamm lieferns und geben einen Einblick in die Folgen eines bestimmten Stressor. Daher Wissen und Anwendungen von ALE Experimente, gekoppelt mit der Systembiologie und die Identifizierung der systemischen Störungsvariablen werden in naher Zukunft zu erwarten.

Mikroorganismen können auf unterschiedliche Umgebungen überleben und sich anzupassen. Unter starkem Stress, Anpassung kann 1-3 über Erwerb von positiven Phänotypen durch statistische genomische Mutationen und anschließende positive Selektion auftreten. Daher kann mikrobiellen Zellen anzupassen durch metabolische oder regulatorische Netzwerke für ein optimales Wachstum zu ändern, die &quot;adaptive Evolution&quot; bezeichnet wird. Vor kurzem sind wichtige mikrobielle Tendenzen, wie Ausbrüche von Superbugs und dem Auftreten von robusten mikrobielle Stämme, sind sehr eng miteinander verbunden Evolution unter Stressbedingungen zu adaptiv. Unter definierten Laborbedingungen, sind wir die Mechanismen der molekularen Evolution zu studieren können und sogar die Richtung der mikrobiellen Evolution für verschiedene Anwendungen zu steuern. Im Gegensatz zu mehrzelligen Organismen sind einzellige Organismen gut geeignet, um adaptive Labor Entwicklung (ALE) aus den folgenden Gründen: sie regenerieren schnell, sie pflegen große Populationen, und es ist leicht hom zu erstellen und zu pflegenogeneous Umgebungen. In Kombination mit den jüngsten Fortschritten in der DNA-Sequenzierungstechniken und Hochdurchsatz-Technologien, ermöglicht ALE für die direkte Beobachtung von genomischen Veränderungen, die zu einer systemischen regulatorischen Veränderungen führen. Mutations Dynamik und Vielfalt der Bevölkerung sind auch zu beobachten. Die Gentechnik - Strategien können aus der Analyse der ALE - Stämme 4,5 bestimmt werden. Chemostatkultur ist eine Methode verwendet Steady-State - Zellen zu erhalten und die Produktivität bei Fermentationsprozessen 6 erhöhen. Frisches Medium wird zugesetzt und Kulturbrühe wird während des Verfahrens geerntet (letzteres enthält Medium und Biomasse). Langzeit Chemostat - Kultur, ändert jedoch den steady-state Produktivität der Kultur und bewirkt die Anhäufung von spontanen Mutationen und Selektion während der Kultivierung (Abbildung 1a). Unter verschiedenen Selektionsdruck (Stressoren), wird die Akkumulation von Mutationen verbessert. Eine allmähliche Zunahme der Spannung in einem langfristigen<html> Chemostat sorgt für eine kontinuierliche Auswahl von Mutationen , die gegen den gegebenen Stressoren arbeiten, wie beispielsweise Temperatur, pH, osmotischer Druck, Nährstoffmangel, Oxidation, toxische Endprodukte usw. Colony Übertragung von einem festen Medium und serielle Übertragung aus einem flüssigen Medium (wiederholte Batch - Kultur) erlauben auch Forscher entwickelten Mikroorganismen (Abbildung 1b und 1c) zu erhalten. Obwohl Chemostatkultur komplizierte Methoden erfordert, ist der Pool der Vielfalt (Anzahl der Replikationen und Populationsgröße) höher als die durch Kolonie-Transfer und serielle Übertragungstechniken erhalten. Die stabile Stressbelastung auf einzelne Zellen und verringerte Veränderung der zellulären Zustand während Chemostatkultur (Steady State) sind weitere Vorteile von ALE im Vergleich zu Batch-Kultur-basierte Techniken. Stress-induzierten ALE von Escherichia coli zu hoher Succinat Bedingungen unterworfen wird in diesem Artikel eingeführt. iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Methoden der adaptiven Labor Evolution (A) Chemostat;. (B) eine serielle Übertragung; (C) Kolonie übertragen. Die Top - Zahlen das Konzept der Methoden für das ALE illustrieren, und die unteren Zahlen die Anzahl der Zellen darstellen , die während ALE wuchs. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Mini-chemostat fermentor</td><td>Biotron Inc.</td><td>-</td><td>manufactured by special order</td></tr><tr><td>silicon tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 13</td><td>tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.</td></tr><tr><td>reservoir jar</td><td>Bellco</td><td>Media storage bottle</td><td>20 L</td></tr><tr><td>chemicals</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>-</td><td>reagent grade</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>ACS reagent</td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>for molecular biology, suitable for cell culture, &amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>ACS reagent, &amp;ge;99%</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4272</td><td>98.5-101%</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>ACS reagent, &amp;ge;99%</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>ACS reagent, &amp;ge;98%</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td>ACS reagent, &amp;ge;96%</td></tr><tr><td>thiamine&amp;middot;HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>reagent grade, &amp;ge;99%</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;succinate&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>ReagentPlus, &amp;ge;99%</td></tr></tbody></table>

procedure for adaptive laboratory evolution of microorganisms using a chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Für High-Succinat Stress Anpassung, die Wildtyp - E coli - W3110 - Stamm war in einem Chemostat bei D kultiviert = 0,1 h -1 für 270 Tage (Abbildung 2). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> Abbildung 2: High-Succinat Stress Anpassung von E. coli W3110 unter Verwendung Chemostat - Kultur. Dünne Pfeile zeigen die Zeiten , bei denen die Konzentration der Stressor erhöht wurde, und die dicken Pfeile zeigen die Zeiten , zu denen Kulturen erhalten wurden. Zahlen mit Pfeile zeigen die Konzentrationen des Stressor, Dinatriumsukzinat Hexahydrat. Die Änderung in der Biomasse während ALE und die Konzentrationen von Stressor dargestellt. Die Figur wurde von J. geändert Biosci. Bioeng 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54446/54446fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54446/54446fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Eine anfängliche Stressor Konzentration von 30 g / L (Dinatriumsuccinat Hexahydrat) wurde nach und nach erhöht, wenn der Chemostat-Kultur einen stationären Zustand erreicht hat, bis die Konzentration des Stressor 160 g / L. Die adaptierte E. coli DST160 Stamm (tolerant bis 160 g / l Dinatriumsukzinat Stress) wurde nach 270 Tage erworben. Die DST160 Stamm ungehemmtes Wachstum unter Hoch Succinat Stress (160 g / l Stressor) zeigte, während der Vorfahr - Stamm (W3110) fast kein Wachstum zeigten (Abbildung 3). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig3.jpg" /> Abbildung 3: Wachstumskurven der Wildtyp (W3110, weißer Kreis) und angepasst Stamm (DST160, schwarzer Kreis) unter Hoch Succinat Stress Die Abbildung zeigt , dass die angepasste Stamm wuchs ohne Verzögerung unter Hoch Succinat Stressbedingungen während der Wildnis. Typ nicht. Der FehlerBalken zeigen die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Die Figur wurde von J. geändert Biosci. Bioeng 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54446/54446fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54446/54446fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Verfahren zur adaptiven Laborevolution von Mikroorganismen unter Verwendung eines Chemostaten | Genetik | Video

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

mit Chemostatkultur Hier präsentieren wir ein Protokoll adaptive gerichtete Evolution von Mikroorganismen unter Bedingungen zu erhalten. Auch genomische Analyse des entwickelten Stamm wird diskutiert.

Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

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Serie: Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

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We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

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Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring fitness phenotypes and improving our understanding of how genotypes are shaped by selection. Extensive recent efforts to develop and apply niche continuous culture devices have revealed the benefits of conducting new forms of cell culture control. This includes defining custom selection pressures and increasing throughput for studies ranging from long-term experimental evolution to genome-wide library selections and synthetic gene circuit characterization. The eVOLVER platform was recently developed to meet this growing demand: a continuous culture platform with a high degree of scalability, flexibility, and automation. eVOLVER provides a single standardizing platform that can be (re)-configured and scaled with minimal effort to perform many different types of high-throughput or multi-dimensional growth selection experiments. Here, a protocol is presented to provide users of the eVOLVER framework a description for configuring the system to conduct a custom, large-scale continuous growth experiment. Specifically, the protocol guides users on how to program the system to multiplex two selection pressures &#8212; temperature and osmolarity &#8212; across many eVOLVER vials in order to quantify fitness landscapes of Saccharomyces cerevisiae mutants at fine resolution. We show how the device can be configured both programmatically, through its open-source web-based software, and physically, by arranging fluidic and hardware layouts. The process of physically setting up the device, programming the culture routine, monitoring and interacting with the experiment in real-time over the internet, sampling vials for subsequent offline analysis, and post experiment data analysis are detailed. This should serve as a starting point for researchers across diverse disciplines to apply eVOLVER in the design of their own complex and high-throughput cell growth experiments to study and manipulate biological systems.

The eVOLVER framework enables high-throughput continuous microbial culture with high resolution and dynamic control over experimental parameters. This protocol demonstrates how to apply the system to conduct a complex fitness experiment, guiding users on programming automated control over many individual cultures, measuring, collecting, and interacting with experimental data in real-time.

Die Entwicklung automatisierter, durchsatzer, kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for more than 35 years and 77,000 bacterial generations. The setup and procedures used in the LTEE epitomize reliable and reproducible methods for studying microbial evolution. In this protocol, we first describe how the LTEE populations are transferred to fresh medium and cultured each day. Then, we describe how the LTEE populations are regularly checked for possible signs of contamination and archived to provide a permanent frozen "fossil record" for later study. Multiple safeguards included in these procedures are designed to prevent contamination, detect various problems when they occur, and recover from disruptions without appreciably setting back the progress of the experiment. One way that the overall tempo and character of evolutionary changes are monitored in the LTEE is by measuring the competitive fitness of populations and strains from the experiment. We describe how co-culture competition assays are conducted and provide both a spreadsheet and an R package (fitnessR) for calculating relative fitness from the results. Over the course of the LTEE, the behaviors of some populations have changed in interesting ways, and new technologies like whole-genome sequencing have provided additional avenues for investigating how the populations have evolved. We end by discussing how the original LTEE procedures have been updated to accommodate or take advantage of these changes. This protocol will be useful for researchers who use the LTEE as a model system for studying connections between evolution and genetics, molecular biology, systems biology, and ecology. More broadly, the LTEE provides a tried-and-true template for those who are beginning their own evolution experiments with new microbes, environments, and questions.

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

This protocol describes how to maintain the Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) by performing its daily transfers and periodic freeze-downs and how to conduct competition assays to measure fitness improvements in evolved bacteria. These procedures can serve as a template for researchers starting their own microbial evolution experiments.

Tägliche Transfers, Archivierung von Populationen und Fitnessmessung im Langzeit-Evolutionsexperiment mit Escherichia coli

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the microscale&#8213;to create micro-environments for microbial chemotaxis experiments. To create chemical pulses, we developed a system to introduce amino acid sources near-instantaneously by photolysis of caged amino acids within a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chamber containing a bacterial suspension. We applied this method to the chemotactic bacterium, Vibrio ordalii, which can actively climb these dynamic chemical gradients while being tracked by video microscopy. Amino acids, rendered biologically inert (&#39;caged&#39;) by chemical modification with a photoremovable protecting group, are uniformly present in the suspension but not available for consumption until their sudden release, which occurs at user-defined points in time and space by means of a near-UV-A focused LED beam. The number of molecules released in the pulse can be determined by a calibration relationship between exposure time and uncaging fraction, where the absorption spectrum after photolysis is characterized by using UV-Vis spectroscopy. A nanoporous polycarbonate (PCTE) membrane can be integrated into the microfluidic device to allow the continuous removal by flow of the uncaged compounds and the spent media. A strong, irreversible bond between the PCTE membrane and the PDMS microfluidic structure is achieved by coating the membrane with a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) followed by plasma activation of the surfaces to be bonded. A computer-controlled system can generate user-defined sequences of pulses at different locations and with different intensities, so as to create resource landscapes with prescribed spatial and temporal variability. In each chemical landscape, the dynamics of bacterial movement at the individual scale and their accumulation at the population level can be obtained, thereby allowing the quantification of chemotactic performance and its effects on bacterial aggregations in ecologically relevant environments.

A protocol for the generation of dynamic chemical landscapes by photolysis within microfluidic and millifluidic setups is presented. This methodology is suitable to study diverse biological processes, including the motile behavior, nutrient uptake, or adaptation to chemicals of microorganisms, both at the single cell and population level.

Generieren kontrollierter, dynamischer chemischer Landschaften zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Biotechnik

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and reagents. Moreover, microplate-based high-throughput cultivation methods developed in recent years have poor microbial growth status and experiment parallelization because of their low dissolved oxygen, poor mixture, and severe evaporation and thermal effect. Due to many advantages of micro-droplets, such as small volume, high throughput, and strong controllability, the droplet-based microfluidic technology can overcome these problems, which has been used in many kinds of research of high-throughput microbial cultivation, screening, and evolution. However, most prior studies remain&#160;at the stage of laboratory construction and application. Some key issues, such as high operational requirements, high construction difficulty, and lack of automated integration technology, restrict the wide application of droplet microfluidic technology in microbial research. Here, an automated Microbial Microdroplet Culture system (MMC) was successfully developed based on droplet microfluidic technology, achieving the integration of functions such as inoculation, cultivation, online monitoring, sub-cultivation, sorting, and sampling required by the process of microbial droplet cultivation. In this protocol, wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 and a methanol-essential E. coli strain (MeSV2.2) were taken as examples to introduce how to use the MMC to conduct automated and relatively high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution in detail. This method is easy to operate, consumes less labor and reagents, and has high experimental throughput and good data parallelity, which has great advantages compared with conventional cultivation methods. It provides a low-cost, operation-friendly, and result-reliable experimental platform for scientific researchers to conduct related microbial research.

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

This protocol describes how to use the Microbial Microdroplet Culture system (MMC) to conduct automated microbial cultivation and adaptive evolution. MMC can cultivate and sub-cultivate microorganisms automatically and continuously and monitor online their growth with relatively high throughput and good parallelization, reducing labor and reagent consumption.

Automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution mit mikrobiellem Mikrotröpfchenkultursystem (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Biologie

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Design und die Verwendung Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

<meta charset="utf8"></head><body>Experimentelles Evolutionsprotokoll für die thermophile Anpassung mit kostengünstigen Thermomischern

Adaptation at the Extremes of Life: Experimental Evolution with the Extremophile Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures is a key requirement, not only for understanding fundamental evolutionary processes but also for developing S. acidocaldarius as a chassis for bioengineering. One major obstacle to conducting experimental evolution with thermophiles is the expense of equipment maintenance and energy usage of traditional incubators for high-temperature growth. To address this challenge, a comprehensive experimental protocol for conducting experimental evolution in S. acidocaldarius is presented, utilizing low-cost and energy-efficient bench-top thermomixers. The protocol involves a batch culture technique with relatively small volumes (1.5 mL), enabling tracking of adaptation in multiple independent lineages. This method is easily scalable through the use of additional thermomixers. Such an approach increases the accessibility of S. acidocaldarius as a model system by reducing both initial investment and ongoing costs associated with experimental investigations. Moreover, the technique is transferable to other microbial systems for exploring adaptation to diverse environmental conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Verständnis der Mikrobenanpassung mit innovativen Techniken zur Erforschung der thermophilen Evolution

Here, we present an experimental evolution protocol for adaptation in thermophiles utilizing low-cost, energy-efficient bench-top thermomixers as incubators. The technique is demonstrated through the characterization of temperature adaptation in Sulfolobus acidocaldarius, an archaeon with an optimal growth temperature of 75 &#176;C.

Anpassung an den Extremen des Lebens: Experimentelle Evolution mit dem extremophilen Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures ...