We thank the Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) and the Histology team of MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), the Institute of Neuroscience at the ULB and the FNRS for help and support. This work was supported by MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.).

Alle Tier verbundenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der University of Nottingham ethischen Review Board durchgeführt. 1. Auswahl geeigneter Gewebepräparation für Immunostaining <ol><li> Generieren Sie in Paraffin eingebetteten Abschnitt von Wildtyp - CD1 Maus - Embryonen und erwachsenen Gehirn Gewebe wie zuvor 25 beschrieben. Verwenden Sie Abschnitte Hirngewebe fixiert mit entweder 4% Formaldehyd (FA) oder 4% Paraformaldehyd (PFA) für 25 Verfahren immunostaining. HINWEIS: Die Verwendung von in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten erfordert Entparaffinierung vor der Antikörpermarkierung. Da die Behandlung mit 2 bis 4 M Salzsäure (HCl) in das Protokoll für die DNA-Denaturierung eingesetzt ist nicht kompatibel mit den meisten Antigen-Retrieval-Strategien, empfehlen wir die Verwendung von entweder Kryo- oder Mikrotomschnitten für die Co-Detektion von 5mC Oxidationsderivate mit Protein Marker. </li></ol> 2. Entwachsen Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten &lt;<html> / P&gt; <ol><li> In einer laufenden Klasse II Sicherheitsschrank, waschen Sie die in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten in einem Glas Coplin mit Xylol gefüllt, 2-mal für jeweils 10 Minuten bei RT. HINWEIS: Es ist wichtig , frisches Xylol zu verwenden , da unvollständige Paraffin Entfernung zu inkonsistenten Färbemustern führen kann. </li><li> Nach Entparaffinierung, Rehydrierung schnell die Gewebeschnitte durch Waschen nacheinander in 95, 75 und 50% Ethanol für jeweils 10 min bei RT. </li></ol> 3. Fixierung und Permeabilisierung von Kryo- und Mikrotomschnitten <ol><li> Befestigen Sie die rehydratisierten Gewebeschnitte von ihnen in entweder eiskalt 4% PFA oder 4% FA für 15 min bei RT platzieren. </li><li> (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) für 5 min bei RT Entfernung von überschüssigem Fixativ indem die Sektionen in PBS gewaschen. </li><li> Permeabilisierung die Gewebeschnitte von in einer Glasküvette mit PBX (0,5% Triton X-100 in PBS) bei RT für 30 min gefüllt platzieren. Überschüssiges PBX durch die Abschnitte kurz in PBT Waschen (0,01% Tween 20 in PBS). </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. Immunostaining für Oxi-5mC Derivate <ol><li> Platzieren Sie die permeabilisierten Schnitte in 2 N HCl für 60 min bei RT Depurinierung der DNA. Hinweis: Obwohl höhere Konzentrationen von HCl (beispielsweise 4 N) führen zu einer effizienteren DNA denaturierenden, sie sind nicht kompatibel für die Co-Detektion von oxi-mCs mit DAPI. </li><li> Platzieren Sie die Abschnitte in 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) für 30 min bei RT, um das HCl zu neutralisieren. Alternativ waschen Sie die Abschnitte dreimal für 5 Minuten jeweils in PBS. Inkubieren der Abschnitte in PBT für 5 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit aus dem Bereich der Gewebeschnitt umgibt, ohne den Gewebeschnitt zu lassen Sie die Folie vollständig in jedem Schritt zum Trocknen durch leichtes Schütteln. Verwenden Sie eine hydrophobe Barriere Stift, um den Abschnitt zu umgeben, ohne den Abschnitt zu berühren. HINWEIS: Die hydrophobe Barriere Stift das Volumen der Antikörper reduziert erforderlich , um das Gewebe zu färben und mehrere Abschnitte werden gefärbt mit differen zulassent-Antikörper auf derselben Folie. </li><li> Inkubieren Abschnitte in 100 &amp; mgr; l-Lösung (10% Rinderserumalbumin in PBS) für 1 Stunde bei RT in einer feuchten Kammer blockiert. HINWEIS: die Effizienz der Färbung der modifizierten Cytosin - Basen beeinflussen würde diesen Schritt überspringen. </li><li> Inkubieren der Gewebeschnitte in 100 ul einer 1: 5.000-Verdünnung von monoklonalem Maus-anti-5hmC und einer 1: 1.000-Verdünnung von polyklonalem Kaninchen-anti-5caC primäre Antikörper in Lösung für 1 h bei RT in einer feuchten Kammer blockiert. Alternativ führen die Inkubation über Nacht bei 4 ° C, wenn nötig. HINWEIS: Abschnitte ohne primären Antikörper verarbeitet als geeignete Negativkontrollen für das Färbeverfahren dienen. 12,5 Tage post coitum murinen embryonalen Hirnschnitten angereichert in 5caC, 5FC und 5hmC 20 kann als positive Kontrolle verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Antikörper durch die Abschnitte in einer Glasküvette mit PBT dreimal für jeweils 5 min in einem Cop gefüllt Waschenlin Glas bei RT. HINWEIS: das Volumen der Waschlösungen Erhöhung kann die Hintergrundfärbung zu reduzieren. </li><li> Überschüssiges PBT und, falls erforderlich, umkreisen die Abschnitte wieder mit dem hydrophoben Barriere Stift als PBT Reinigungsmittel enthalten, die die hydrophobe Barriere schwächen können. </li><li> Machen Sie eine 1: 400-Verdünnung von Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP-konjugierte Antikörper und eine 1: 400-Verdünnung von Esel-anti-Maus-555-konjugierte Antikörper in Lösung zu blockieren. </li><li> Inkubieren der Gewebeschnitte in 100 &amp; mgr; l sekundärem Antikörper Mischung aus Schritt 4.9 für 1 h bei RT in einer feuchten Kammer. </li><li> Waschen Sie die Gewebeschnitte in eine Coplin-Gefäß gefüllt mit PBT dreimal für jeweils 5 Minuten bei RT. </li><li> Platzieren Sie die Gewebeschnitte in 100 ul einer 1: 200 Verdünnung von Tyramid in dem Tyramid Signalverstärkungspuffer für 2 min bei RT. </li><li> Sofort entfernen überschüssige Tyramidesters Lösung durch die Dias dreimal für jeweils 5 Minuten in PBT Waschen. </li><li> vorsichty entfernen überschüssiges PBT und sofort , die Abschnitte mit einem Tropfen einer Mounting Medium (siehe Materialliste). </li><li> Sanft legen Sie ein Deckglas auf den Gewebeschnitten und sofort das Deckglas mit Nagellack versiegeln. </li><li> Speichern der Gewebeschnitte bei 4 ° C für mehrere Stunden vor der mikroskopischen Untersuchung. Untersuchen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 405, 488 und / oder 555 nm (10 - 40-facher Vergrößerung). </li></ol>

<ol>
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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li><li>Wheldon, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+accumulation+of+5-carboxylcytosine+indicates+involvement+of+active+demethylation+in+lineage+specification+of+neural+stem+cells.">Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells.</a> Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).</li><li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-resolution+analysis+of+5-hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+genome.">Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome.</a> Cell. 149, 1368-1380 (2012).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+assisted+bisulfite+sequencing+(CAB-Seq)+for+5-carboxylcytosine+detection+in+DNA.">Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA.</a> J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).</li><li>Globisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates.">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367 (2010).</li><li>Szwagierczak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+enzymatic+quantifi+cation+of+5-+hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA.">Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, e181 (2010).</li><li>Ruzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+distribution+of+high+levels+of+genomic+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+development.">Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development.</a> Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).</li><li>Almeida, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+immunohistochemical+detection+of+5-hydroxymethyl-cytosine+reveals+conservation+of+its+tissue+distribution+between+amphibians+and+mammals.">Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals.</a> Epigenetics. 7, 137-140 (2012).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905 (2013).</li><li>Santos, F., Dean, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11,+Using+immunofluorescence+to+observe+methylation+changes+in+mammalian+preimplantation+embryos.">Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos.</a> Nuclear reprogramming methods and Protocols. , 129-138 (2006).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523, 621-625 (2015).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest.

Obwohl der gemeldete geringe Häufigkeit von 5mC Oxidationsderivate, 5FC und 5caC in einigen Geweben erhebliche Einschränkungen für ein Standard - Immunochemie Protokoll darstellen würde der Einbau von Peroxidase-konjugiertem Sekundärantikörper erlaubt den Nachweis dieser Cytosin Modifikationen in festen Geweben und Zellen (Figur 2) . Jedoch sollte die optimale Inkubationszeit mit dem Tyramid Lösung optimiert werden experimentell für jede einzelne Charge von Tyramid Signalverstärkungs Kit , wo eine lineare Beziehung zwischen der Signalintensität und die Dauer der Tyramid basierten Signalverstärkung beobachtet wird, für Details siehe Almeida et al. 2012 26 . Zusätzlich kann das Signal / Hintergrund-Verhältnis signifikant durch die Durchführung der Waschungen in einem Coplin jar verbessert werden effiziente Entfernung von überschüssigem Antikörper zu ermöglichen. Nach der Inkubation mit Tyramidesters Lösung ist es wichtig, die Reaktion durch Waschen in PBT-Lösung d sofort zu beendenecrease Hintergrundfärbung. Es ist wichtig, nicht die Abschnitte zu erlauben, an jedem beliebigen Punkt während des Verfahrens, um zu trocknen. Die Effizienz der DNA Depurinierung kann durch Ausführen der Depurinierung Reaktion bei 37 ° C verbessert werden. Bei der Verwendung von 4 N HCl anstelle von 2 N verstärkt die Färbung der modifizierten Formen von 5mC unter Verwendung von 4 N HCl für DNA Depurinierung würde mit DAPI nicht zulassen Co-Färbung, wie sie ausschließlich mit doppelsträngiger DNA interagiert. Obwohl diese Technik robust semi-quantitative Beurteilung der modifizierten Formen von Cytosin-Basen in dem detektierbaren bereitstellen kann, kann sie nicht für die Bewertung der absoluten Niveaus der 5mC oder dessen Oxidationsderivaten verwendet werden. Daher empfehlen wir die Verwendung von anderen ergänzenden , aber quantitative Ansätze 16, 19 -24. Seit der Entdeckung von 5mC Oxidationsderivate in Säugergenomen wurden mehrere Ansätze entwickelt worden , deren biologische Rollen zu studieren 16, 19-24. Obwohl diese approaCHES kann bei der Bestimmung der absoluten Mengen an 5mC Oxidationsderivate wertvoll sein, bieten sie keine Informationen über ihre räumliche Verteilung 20, 26. Wir haben erfolgreich die hier beschriebenen Verfahren verwendet , um die räumliche Verteilung und Lokalisierung von 5mC Oxidationsderivate in verschiedenen Zelltypen zu kartieren der entwickelnden und adulten Gehirn 20 Durch die Offenbarung ihrer räumlichen Verteilung 20 kann diese Technik entscheidend sein , um die biologischen Implikationen für das Verständnis und das Schicksal von oxidierten Derivaten 5mC in verschiedenen biologischen Kontexten , in denen diese modifizierten Derivaten von 5mC können einschließlich zelluläre Differenzierung, Entwicklung und Krankheit nachgewiesen werden. Darüber hinaus kann die Methode, die wir hier beschreiben, geben semi-quantitative Abschätzungen der oxidierten Derivaten 5mC in verschiedenen Geweben durch die Kinetik der Peroxidase-Reaktion Beurteilung (die der Färbungsintensität proportional ist) bei unterschiedlichen Inkubationszeiten mit tyramide 26.

Die Methylierung von Cytosin - Basen in der DNA (5mC) stellt einen großen in Wirbeltiere Genome gefunden epigenetische Markierung im Zusammenhang mit Transkriptions 1 zum Schweigen zu bringen. 5mC wird von DNA - Methyltransferasen 2-5 eingeführt und gehalten, und wurde in einer Reihe von biologischen Prozessen einschließlich genomische Imprinting, X-Chromosom Inaktivierung zellulärer Differenzierung und Entwicklung 3, 6. Folglich wichtige Rollen spielen gezeigt, die Störung der 5mC genomische Muster mit einer Reihe von Krankheiten assoziiert 7, 8-11. Trotz der Fortschritte im Verständnis 5mC Rolle bei der Entwicklung und Krankheit, ist es immer noch weitgehend unbekannt bleiben, wie diese Marke bei der Entwicklung und adulten Geweben entfernt wird. Mehrere mögliche Mechanismen der DNA - Demethylierung aktiven und passiven Demethylierung Mechanismen vor kurzem vorgeschlagen wurden , 12, 13, 14, 15. Entdeckung der Produkte von 5mC sequenzielle Oxidation vermittelt durch 10 bis 11 Translokation enzymES (TET1 / 2/3), wie 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) und 5-carboxylcytosine (5caC) in eukaryotischen DNA 16, 17, 18, ​​19 veranlasst Spekulationen , ob sie als Zwischenprodukte dienen können , DNA - Demethylierung Prozesse oder als stabile epigenetische Markierungen in ihrem eigenen Recht 13. Während der Demonstration , dass die Komponente der Reparatur Basis Exzision, Thymin-DNA - Glycosylase (TDG) binden können und beide 5FC und 5caC von DNA 19 zu entfernen, schlägt vor , 20 eine Rolle für die modifizierten 5mC Derivate in einer aktiven DNA - Demethylierung. Neuere Erkenntnisse zeigen , dass 5FC / 5caC die Rate der RNA II processivity Punkte auf mögliche Beteiligung dieser Marken in der Transkriptionsregulation 29 modulieren können. Aufgrund dieses potentielle biologische Bedeutung von oxidierten Formen von 5mC, eine Reihe von biochemischen und Antikörper - basierte Techniken zur Untersuchung ihrer genomischen Verteilung und globale Inhalte wurden 19-24 16, eingesetzt. Da die meisten ter wirbel Organen verschiedener Zelltypen bestehen und daß die Verteilung der modifizierten Cytosin - Basen Gewebe- und Zelltyp - spezifische 16-18, 20, 23, 25-27, in verschiedenen Geweben , die räumliche Verteilung von oxidiertem 5mC Derivate Bestimmung wird zu einem wichtigen experimentellen Aufgabe erforderlich für ihre biologischen Funktionen enthüllt. Die meisten der biochemischen und Antikörper-basierte Ansätze bieten keine räumlichen Informationen bezüglich der Verteilung der modifizierten Formen von 5mC in verschiedenen Geweben und Zelltypen. Im Gegensatz dazu Immunochemie basierte Techniken kann die räumliche Verteilung und Kernlokalisation von 5mC 28 und dessen oxidierter Derivate 20 ein schnelles Werkzeug für die Beurteilung. Das heißt, der berichtete sehr geringe Häufigkeit von 5FC (20 in jedem 10 6 Cytosin) und 5caC (3 in je 10 6 Cytosin) in das Mausgenom 18 eine große Herausforderung für Standard Immunochemie darstellt. Hier,Wir beschreiben eine hochempfindliche immunochemischen Methode, die von oxidierten Form von Cytosin in Säugetierhirngewebe robust und eine schnelle Erkennung bietet. Durch die Integration von Peroxidase-konjugierten sekundären mit einem Signalverstärkungsschritt gekoppelten Antikörpern, umgeht diese Methode für die Herausforderungen der sehr geringe Mengen an 5FC und 5caC zu erkennen. zusammen detektieren die modifizierten Formen von Cytosin mit linienspezifischen Markern, effektiv ergänzt andere Ansätze bei der Aufklärung der biologischen Funktion dieser epigenetische Markierungen Zusätzlich kann diese Technik verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1281">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:388px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:180px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">UY-48585-30</td>
			<td style="width:595px;">Glass made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use only in Class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12821680</td>
			<td>pPH 7.5, filtered before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Once made can be stored at -20&#176;C in aliquotes for several months</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% formaldehyde&#160; (FA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Once made can be stored at -20&#176;C in aliquotes for several months</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, anhydrous denatured, histological grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;64-17-5&#160;&#160;</td>
			<td>95, 75, 50 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.01 % Tween 20 in PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>PBT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Triton X-100 in PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>PBX</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 N HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71826</td>
			<td>caution extremely toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 mM Tris-HCl&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5121</td>
			<td>PH adjusted to 8.5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td>for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slide moisture chamber</td>
			<td>Scientific Device Laboratory</td>
			<td>197-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-5mC mouse antibody</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15200081</td>
			<td>monoclonal primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-5hmC antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39791</td>
			<td>rabbit polyclonal primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-5caC antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>61225</td>
			<td>rabbit polyclonal primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K1497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">555-congjuated goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>&#160;secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10% BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">22x32mm Glass cover slips</td>
			<td>BDH</td>
			<td>406/0188/24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tyramide Signal Amplification System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL741001KT</td>
			<td>Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colourless nail polish</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">PA5-18598</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-NeuN mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Merck milipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB377B</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of modified forms of cytosine using sensitive immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Um die Verteilung der 5hmC in Hirngewebeschnitten bestimmen, führten wir co-Detektion dieser epigenetischen Modifikation mit einem Marker für die post-mitotischen Neuronen, NeuN, kommerziellen anti-5hmC Antikörper verwendet wird, der spezifisch mit dieser Markierung in Wechselwirkung tritt, aber nicht mit anderen Formen von modifiziertem Cytosin 20, 25. Immunhistochemische Analyse von 5hmC und 5caC Verteilungen im erwachsenen Gehirn zeigten , dass während der prominente 5hmC Färbung co-lokalisiert mit NeuN - positiven Zellen, NeuN-negativen Gliazellen besitzen geringere Mengen genomischer 5hmC (Abbildung 1) 20. Wir haben kürzlich gezeigt , dass Tet-abhängige 5mC Oxidation während der Abstammungslinie Spezifikation von neuralen Stammzellen (NSCs) 20 in Betrieb ist. Trotz in NSCs immunochemisch nicht nachweisbar ist, zeigen 5FC und 5caC prominente Immunfärbung in frühen Stadien der NSCs Differenzierung zu neuronalen ein<html> nd Glia-Abstammungslinien. Diese beiden Marken transient akkumulieren gleichzeitig mit dem Erscheinen der Marker der frühen neuronalen und glialen Differenzierung 20. Zur Bestimmung der Verteilung von 5caC bei der Differenzierung von NSCs wir Co-Färbung dieser Marke mit einem Glia Marker GFAP auf den festen Kulturen von NSCs an 3 Tagen nach der Induktion von Glia-Differenzierung durchgeführt. Anders als in NSC oder reifen Astrozyten (Daten nicht gezeigt), beobachteten wir starke 5caC Signal in relativ großen Anteil der Zellen, die GFAP in diesen Kulturen (Figur 2) 20. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54416/54416fig1.jpg" /> Abbildung 1. Co-Immunfärbung von 5hmC (grün) mit NeuN (rot) im Gewebe erwachsenen Gehirn counterstained mit DAPI (blau). Einzelne Kanäle und die fusionierte Ansicht gezeigt. Maßstabsbalken sind 25 &amp; mgr; m.blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54416/54416fig2.jpg" /> Abbildung 2. Co-Immunfärbung von 5caC mit GFAP in der Kultur von NSC an Tag 3 von Gliazellen Differenzierung. Einzelne Kanäle und die fusionierte Ansicht gezeigt. Maßstabsbalken sind 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54416/54416fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54416/54416fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

detection-modified-forms-cytosine-using-sensitive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.2K Aufrufe.  Université Libre de Bruxelles. Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Serie: Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Dünnschnitt der Scheibe Vorbereitungen für die Immunhistochemie

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Forschung

Biologie

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

Verhinderung der Ausbreitung von Malaria und Dengue-Fieber mit Hilfe gentechnisch veränderter Moskitos

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunhistochemie: Paraffin Schnitte mit der Vectastain ABC Kit von Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunhistochemie auf Paraffinschnitten von Mouse Epidermis unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörper

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons (10 to 25 &mu;m in diameter) are arranged in plexuses that are confined to distinct planes of the gut wall 1; the myenteric plexus can be found between the longitudinal and circular muscle layers, and the submucous plexus between the circular muscle layer and the mucosa. Since the effector systems for these plexuses (transporting epithelium, endocrine cells, immune elements, blood vessels and smooth muscle) are also contained within the gut wall, semi-intact preparations can be dissected that preserve individual components of different reflex pathways. The behavior of the effector systems is controlled by the submucous and myenteric plexuses acting in concert. Therefore, detailed knowledge of synaptic interactions within and between ganglia, and of communication between the plexuses, is essential for understanding normal gastrointestinal function. The ENS, as an intact nervous system, is a unique experimental model in which one can correlate molecular and cellular events with the electrical behavior of the neuronal network and its physiological outputs. Because of the quasi-two-dimensional organization of its plexuses, the ENS is particularly well suited for the study of neural networks using multiple site optical recording techniques that employ voltage-sensitive dyes 2,7,8,9. We will illustrate here the use of a relatively new naphthylstyryl-pyridinium dye (di-4-ANEPPDHQ) 3 that offers multiple advantages over its predecessors, including very low phototoxicity, slow rate of internalization, and remarkable chemical stability. When used in conjunction with a camera that permits sub-millisecond time resolution, this dye allows us to monitor the electrical activity of all the neurons in the field of view with a maximal spatial resolution of ~ 2.5 &mu;m at 100X magnification. At lower magnification (10X or 20X), the sacrifice of single-cell resolution is compensated by a gain in perspective, revealing the intricacies of the inter-ganglionic circuitry.

This protocol illustrates how voltage-sensitive dyes enable optical recording of electrical activity from intact neural networks such as the plexuses of the guinea-pig enteric nervous system, with an adjustable resolution that ranges from single-cells to multi-ganglionic circuitry.

Optische Erfassung der elektrischen Aktivität in Guinea-pig Enteric Networks mit spannungsabhängigen Farbstoffen

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.

We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.

Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.