Wir danken australischen Bio-Ressourcen (Garvan Institute, Australien), die biologische Ressourcen Centre (UNSW Australien) und der Animal Care &amp; Ethik-Kommission für die Unterstützung bei Tierversuchen. Diese Arbeit wurde von der National Health and Medical Research Council of Australia (Projektstipendium APP1062720) unterstützt. Dr. Cesar P. Canales ist Empfänger eines CONICYT-Becas Chile Stipendium (# 72101076). Herr Bassem Akladios ist ein Empfänger der Universität International Postgraduate Award von UNSW Australien.

Ethikerklärung: Alle Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden folgen den Richtlinien der Animal Care and Ethics Committee (ACEC) bei UNSW Australien unter ACEC genehmigten Protokoll 13 / 64B. 1. Vorbereitung der Transparent-Maus Hautgewebe Anmerkung: Alle Mäuse in dieser Studie verwendet wurden, waren auf einer C57BL / 6 genetischen Hintergrund <ol><li> Sammlung der Maushautgewebe. <ol><li> Human euthanize die Mäuse durch zervikale Dislokation. </li><li> Sorgfältig Haare aus dem jeweiligen Hautbereich zu entfernen mit einem Trimmer kümmert sich nicht um die Haut zu verletzen. </li><li> Haut mit 70% Ethanol in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) zu dekontaminieren. </li><li> Heben Sie dorsalen Halshaut mit einer Pinzette und machen Schnitt mit einer Schere. </li><li> Sezieren einen großen Bereich der dorsalen Haut von Mäusen (ca. 1,5 x 4 cm). </li><li> Flatten Haut Dermis-Seite nach unten auf einem Filterpapier, und notieren Sie sich die anterior-posteriore Ausrichtung der Probe. </li><li> Trim Filterpapier um den sezierten Haut und in einem 15 ml Röhrchen mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd (PFA) -Lösung in PBS gefüllt. </li><li> Fix für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlschrank bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Haut 2 x 5 min in PBS in einem 15-ml-Tube. Hinweis: Die folgenden (1.1.10 - 1.1.12) sind optionale Schritte zur Langzeitlagerung von Gewebe. </li><li> Dehydratisieren seziert Haut in PBS mit einer Konzentration von Ethanol Erhöhung (25%, 50% 70%) in einem 15 ml-Röhrchen während 1-stündigen Waschschritte bei Raumtemperatur. </li><li> Lagern Sie dehydrierte Haut in 70% Ethanol in PBS in einem 15-ml-Röhrchen bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> 4 Stunden vor dem Clearing, das Hautgewebe in PBS rehydriert mit Ethanolkonzentration abnimmt (70%, 50%, 25%, 0%) in einem 15-ml-Röhrchen während 1-stündigen Waschschritte bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Löschen der Maus Hautbiopsien <ol><li> Bereiten Sie die CUBIC1 Klärlösung durch Auflösen 3,85 g Harnstoff und 3,85 g N, N, N &#39;, N&#39;Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin in 5,38 ml Wasser auf die Heizung auf 60 eingestellt destilliert - 70 ° C. Verwenden Sie einen heißen Rührer. </li><li> Hinzufügen, 2,31 g Polyethylenglykol-mono-p-isooctylphenylether / Triton X-100 zu der Lösung, wenn es klar ist, und auf Raumtemperatur abgekühlt. </li><li> Schneiden Sie die Haut von Mäusen mit einer scharfen Rasierklinge in Biopsien von ungefähren Abmessungen 0,2 x 0,5 cm, und in 5 ml CUBIC1 Clearing-Lösung in einem 15-ml-Röhrchen versenken. Um die Visualisierung der Haarfollikel zu optimieren, dass die längere Seite der Biopsie entlang der antero-posterioren Richtung der Probe geschnitten wird. </li><li> Platzieren auf einer rotierenden Plattform in einem Hybridisierungsofen bei 37 ° C. </li><li> Ändern Sie den Clearing-Lösung nach 7 Tagen. Bereiten Sie frische CUBIC1 Lösung vor der Verwendung. </li><li> Überprüfen Sie die Transparenz des Gewebes nach 7 Tagen. Bei Bedarf lassen Biopsien in CUBIC1 Clearing-Lösung, bis das Gewebe vollständig transparent ist. </li><li> Sobald die Hautbiopsie ist transparent,Entfernen Sie die CUBIC1 Lösung und 4 ml 1 × PBS, das Gewebe 4 mal 6 Stunden bei 37 ° C zu waschen. </li><li> Waschen Sie die Hautgewebe in 20% w / v Sucrose in PBS in einem 15 ml Röhrchen für 4 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Frieren Sie das Gewebe in Eindeckmediums optimale Schnitt Temperatur (OCT) Verbindung in einem 15-ml-Röhrchen über Nacht in einem -80 ° C Gefrierschrank. Hinweis: Dieser Schritt der Biopsie der Permeabilität für die Antikörper-Penetration in den nachfolgenden Schritten wird zunehmen. </li></ol></li></ol> 2. Immunfluoreszenzanfärbung <ol><li> Auftauen Gewebe aus 1.2.9) auf Raumtemperatur für 2 - 3 Stunden. </li><li> Wasch Gewebe in der 15-ml-Röhrchen mit 5 ml PBS für 8 h bei Raumtemperatur OCT-Verbindung zu entfernen. </li><li> Transfer Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, und Inkubieren Gewebe in 1 ml Kaninchen-anti-Keratin14 oder Kaninchen-Anti-Ki67-Antikörper, beide verdünnt 1: 100 in PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) für 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C heißen Ofen. </li><li> Transfer-Biopsien in ein 15-ml-Röhrchen, einnd waschen Gewebe 4 mal für 6 Stunden in 5 ml PBST auf einem Schüttler in einem 37 ° C-Ofen. </li><li> Transfer-Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, 1 ml Anti-Kaninchen-Alexa594 sekundären Antikörper 1: 100 verdünnt in PBST und Inkubation 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen. </li><li> Transfer Biopsien in ein 15 ml-Röhrchen und wasche 4 Mal Gewebe für 6 Stunden in 5 ml PBST auf einem Schüttler in einem 37 ° C-Ofen. </li><li> Transfer-Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, 1 ml 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Kern counterstain Lösung (1: 1000) in PBST und Inkubation über Nacht auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen. </li><li> Entfernen DAPI Gegenfärbelösung und 1 ml PBST auf die 2-ml-Röhrchen Gewebe 4 mal 6 Stunden auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen zu waschen. Hinweis: Optional Schritt: Biopsien können im Dunkeln in 1x PBS mit 0,02% Natriumazid für mindestens 3 Wochen gelagert werden. </li></ol> 3. Nil-Rot-Färbung <ol><li> Auflösen Nile Red Pulver in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml </li><li> 1 &amp; mgr; l Nile Red Lösung auf 1 ml PBS auf eine Endkonzentration von 1 &amp; mgr; g / ml. </li><li> Auftau-Gewebe aus 1.2.9) auf Raumtemperatur für 2 bis 3 h und wasche mit 5 ml PBS für 8 h bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen und unterzutauchen Gewebe in 1 ml Nile Red Färbelösung 2,5 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Hautbiopsien in der 2-ml-Röhrchen mit 1 ml PBST 4 mal für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen PBST-Lösung aus dem 2-ml-Röhrchen, 1 ml DAPI Kern Gegenfärbelösung (1: 1000) in PBST und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen DAPI Gegenfärbelösung, und fügen Sie 1 ml PBST im 2-ml-Röhrchen das Hautgewebe 4 mal 6 Stunden bei Raumtemperatur zu waschen. Hinweis: Optional Schritt: Biopsien können im Dunkeln in 1x PBS mit 0,02% Natriumazid für mindestens 3 Wochen gelagert werden. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Bereiten Sie die CUBIC2 Clearing-Lösung, die 50 enthält% (W / v) Saccharose, 25% (w / v) Harnstoff, 10% (w / v) 2,2 &#39;, 2&#39; &#39;- Nitrilotriethanol und 0,1% (v / v) Triton X-100. </li><li> Inkubiere das Hautgewebe in 1 ml CUBIC2 Lösung in einem 2-ml-Röhrchen auf einem Schüttler für 24 h in einem 37 ° C-Ofen. Dieser Schritt wird der Brechungsindex des Gewebes gleichmäßig. </li><li> Überprüfen Sie die Klarheit des Gewebes. Sobald es klar ist, positionieren die gesamte Hautbiopsie (0,2 x 0,5 cm) an seiner längeren Seite auf einem Deckglas, so dass die Richtung der Länge der Haarfollikel ist parallel zur Deckfläche (# 1 24 x 60 mm) Hinweis: Optional Schritt: Antikörper-gefärbten Biopsien für ungefähr 7 Tage in CUBIC2 Lösung gelagert werden. Nile Red-gefärbten Biopsien können nur für bis zu 1 Tag in CUBIC2 Lösung gelagert werden und sollte so schnell wie möglich abgebildet werden. </li><li> Bereiten Abbildungskammer (Abbildung 1) Hinweis: Verbrauchsmaterialien für die Herstellung der Abbildungskammer erforderlich sind: blau tack, Knete oder ähnlich, und zwei Deckgläser (24 x 50 mm) (Fild 1A). <ol><li> Bereiten Sie zwei dünne Streifen blau Tack (Durchmesser ca. 1 mm x 2 cm) und zwei Deckgläser (1B). </li><li> Legen blau tack Streifen auf einem Deckglas, so dass genügend Platz für die Hautbiopsie (1C). 4.4.3) </li><li> Platzieren Hautbiopsie in zwischen den Streifen auf dem Deckglas in einem Tropfen CUBIC2 Lösung (1C). </li><li> Bedecken Hautbiopsie mit dem zweiten Deckglas (1D). </li></ol></li><li> Setzen Sie die Druckkammer mit der montierten Hautbiopsie auf die Bühne eines konfokalen Mikroskops und das Gewebe in den Lichtweg zu bewegen. </li><li> Scannen Sie die Probe unter Verwendung eines Quecksilber oder Halogen - Lichtquelle und Standard - Epifluoreszenz - Filter (zB DAPI / GFP / Cy3 / Cy5) zu fluoreszierend gefärbten Regionen von Interesse zu identifizieren. </li><li> Bildbereiche von Interesse unter Verwendung eines 10X und 20X Objektiv (NA 0,75) und Standard - konfokale Fluoreszenz - Imaging - Techniken (z. B. mit DAPI gefärbten Proben beleuchten mit einem 405-nm-Laser und sammeln Fluoreszenzsignal zwischen 425-475 nm und mit Alexa Fluor 594 oder Nile Red-gefärbten Proben beleuchten mit einem 561-nm-Laser und sammeln Fluoreszenzsignal zwischen 570-620 nm). </li><li> Generieren Bild Z-Stapel jeder Region von Interesse unter Verwendung des Mikroskops Z-Stapel Bildaufnahme - Software (z. B. unter Verwendung von NIS Elemente Imaging Software 4.13 wie unten beschrieben). <ol><li> Sorgen für eine optimale Laserleistung und PMT HV / Offset-Einstellungen ausgewählt wurden Probenfluoreszenz zu sammeln. </li><li> Öffnen Sie die &quot;ND Acquisition&quot; Symbolleiste &quot;Acquisition Controls&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Z-Serie Setup&quot; Register (sicherzustellen, dass alle anderen Registerkarten nicht ausgewählten) sind. </li><li> Während Live-Scannen, den Fokus auf das obere Ende der Probe und drücken Sie die &quot;Top&quot; Taste. </li><li> Fokus auf der Unterseite der Probe und drücken Sie die &quot;Unten&quot; -Taste. </li><li> Eingabe erforderlich Schrittgröße (oder drücken Schrittgröße Taste optimiert). </li><li> Vorss die &quot;Run now&quot; klicken. </li><li> Speichern resultierende Z-Stapel als einzelne Tiff Bildstapel (1 Fluorochrom pro Bild Z-Stack). </li></ol></li><li> Verwenden Bild Z-Stapel 3D - Volumen Regionen von Interesse mit Hilfe von 3D - Analyse - Software zu rekonstruieren (z. B. unter Verwendung von Imaris x64 7.2.3 wie unten beschrieben). <ol><li> Starten Sie Analyse-Software. </li><li> Wählen Sie &quot;Surpass&quot; Button in der Toolbar für 3D-Volumen Generation. </li><li> Öffnen erstes Farbbild Z-Stapel (z. B. DAPI). </li><li> Verwenden Sie den &quot;Channel hinzufügen&quot; Tool zusätzliche Farbkanäle hinzuzufügen, einen Kanal pro Fluorochrom. So wird eine Probe sowohl DAPI und Alexa Fluor 594 Fluorochrome enthalten, werden zwei Kanäle erfordern. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Bild-Eigenschaften&quot; Werkzeug richtig Pixel (Voxel) Dimensionen (XYZ) zu setzen, wie in 4.7 oben bestimmt. </li><li> Verwenden Sie &quot;Display - Einstellung&quot; Werkzeugkanal Farben nach Bedarf zu ändern (zB Set DAPI Kanal zu blau, Alexa Fluor 594 - Kanal rot). </li><li> Um position das 3D-Volumen im Bildfenster, verwenden Sie die Computer-Maus nach Bedarf durch Klicken und Ziehen Volumen. </li><li> Verwenden Sie den &quot;Snapshot&quot; Werkzeug in der Werkzeugleiste Screenshots des 3D-Bild zu erzeugen. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Animation&quot; in der Werkzeugleiste Filme von 3D-Probenrotation zu erzeugen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+the+surface+of+skin+development.">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).</li><li>Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells:+an+update.">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).</li><li>Hardy, M. 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(88), e51749 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die regulatorischen Mechanismen steuern Haut Entwicklung und Homöostase werden am häufigsten in 2D untersucht unter Verwendung von Gewebe Schnitte und histologischen Färbung oder die Markierung mit Antikörpern, die nur eine eingeschränkte Anerkennung der Hautmorphologie, Zellpopulationen oder Proteinexpression ermöglicht. Eine Anzahl von Verfahren wurden die Visualisierung der räumlichen Organisation von Zellen und Proteinen an Einzelzellauflösung in 3 Dimensionen in epidermal ganze Halterungen 10-13 zu verbessern entwickelt. Einige davon beinhalten jedoch eine Trennung der Epidermis von der Dermis, die insbesondere unter Verwendung von behaarter Haut technisch anspruchsvoll ist, und führt oft zu Gewebeschäden und Bruch der Haarfollikel. Auch Trennung der Epidermis und Dermis beeinträchtigt die zellulären und molekularen Wechselwirkungen zu studieren, die zwischen ihnen während der embryonalen Entwicklung und Gewebshomöostase auftreten. Die &quot;flache Halterung Ansatz&quot; ist ein weiteres Verfahren, bei dem die gesamte Dicke der MausHaut wird seziert und immunhistochemisch und dann geklärt Alkohol (BBBA) unter Verwendung von Benzylbenzoat und Benzyl während Immunofluoreszenz Signale zu erhalten 14. Dieses Verfahren erfordert nicht die technisch anspruchsvolle Trennung der Epidermis von der Dermis. Jedoch ist BBBA hoch toxisch, es denaturiert einige fluoreszierende Proteine ​​und es verunreinigen Ziele Mikroskop, nicht für die hochauflösende Abbildung der Proben ermöglicht erforderlichen zellulären und molekularen Wechselwirkungen in dem Gewebe zu untersuchen. Dieser Bericht beschreibt ein kubischer Protokoll 5-7 volle Dicke Maus Hautbiopsien von jedem gewünschten anatomischen Region und Alter zu klären , relativ sicher und kostengünstig unter Verwendung von Reagenzien. Dieses technisch einfaches Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Proteinexpression und Proliferation Muster durch Immunofluoreszenz in Hautbiopsien mit voller Dicke counterstained mit DAPI in drei Dimensionen auf Einzelzellauflösung und ermöglicht noch nie da gewesenen und hochgenaue qualitative Bewertung und Quantifizierung der Proteinexpression, Proliferation, Gewebemorphologie und Haarfollikel Dimensionen. Dieses Verfahren eignet sich auch zur Darstellung von Sebozyten mittels Nile Red Färbung trotz der Entfernung von Gewebe Lipiden während der Klärungsverfahrens. Eine wichtige Einschränkung dieser Methode ist die Verfügbarkeit von Antikörper effizient Bindung und ermöglicht die Visualisierung der jeweiligen Zielproteine ​​Skin Klärungsverfahren. Darüber hinaus sind die erzeugten Bild und Filme Dateien groß und eine gute IT-Ressourcen wie Computer mit leistungsfähigen Prozessoren und einen großen Datenspeicherplatz sind unerlässlich. Ein entscheidender Schritt in dem Verfahren ist die Herstellung der Hautbiopsien. An intakte Haarfollikel Anatomie, die Orientierung der Hautbiopsie visualisieren sollte berücksichtigt werden, und die Länge der Biopsien sollten parallel zur Richtung der Länge der Haarfollikel geschnitten werden. Darüber hinaus klein und sehr dünn Skin-Biopsien sind schwer richtig für die Mikroskopie zu montieren. Größere Biopsien mehr Zeit erfordert, zu löschen und Antikörper Eindringen Probleme entstehen können bei der Antigenerkennung Artefakte entstehen. Es ist daher ratsam, zu schneiden, klar und Flecken mehrere Biopsien pro Experiment. Es ist auch wichtig zu eng die Rohre abzudichten, während die kubische Lösungen bereitet Verdampfung des Inhalts während des Erhitzungsprozesses zu verhindern, die in Reagenzkonzentrationen in Änderungen führt und möglicherweise beeinträchtigte Gewebe Clearing- verursachen. Der nächste wichtige Schritt ist, dass das Gewebe wird bei 37 ° C geklärt werden, um den Löschvorgang zu beschleunigen. Nach 7 Tagen muss die CUBIC1 Lösung, um die alten zu ersetzen frisch hergestellt werden. In Zukunft werden mehr Antikörper identifiziert, die mit dem CUBIC Hautklärungsverfahren kompatibel sind, und Analysen können zur Visualisierung und Quantifizierung von epidermalen und Melanozyten (Stamm-) Zellmarker erweitert werdens und dermalen Proteinen. Diese Technik wird auch eine grundlegende Rolle bei der 3D-Studien der Haut Pathologie und Anatomie, und Hilfe bei der Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen zugrunde liegenden abnormen und normalen epidermalen Biologie in der Haut von mutierten Mäusen und transgenen Reporter Mausmodellen, einschließlich Signalisierung Wechselwirkungen zwischen Dermis spielen und die Epidermis. Das CUBIC - Protokoll 5-7 ist wahrscheinlich auf die Haut von anderen Wirbeltiermodellen anwendbar zu sein, und für die menschliche Haut Stanzbiopsien. Lichtbogen-Mikroskopie ermöglicht die Visualisierung von epidermalen Anatomie, Proteinexpressionsmuster, und das Fortschreiten der Haarfollikel Zyklusstadien, in größeren Hautproben.

Die Haut ist wichtig für unser Überleben. Es besteht aus drei Hauptschichten die äußeren Epidermis, die Dermis und die Hypodermis. Die Epidermis ist ein hoch regenerative Gewebe. Es ist ein Plattenepithelkarzinom geschichteten Epithels, bestehend hauptsächlich aus Keratinozyten. Keratinozyten sind in der basalen Schicht geboren und nach oben durch die Suprabasalschichten bewegen, während Differenzierung, und schließlich werden sie in der äußeren Hornschicht etwa einen Monat nach ihrer Geburt zu vergießen. Die Epidermis entsteht eine Reihe von Anhängsel einschließlich der Haarfollikel und Talgdrüsen. Die Haarfollikel regenerieren auch in einer zyklischen Art und Weise während des gesamten Lebens 1. Die regenerative Kapazität der Epidermis wird durch die Anwesenheit von Stamm- und Vorläuferzellen aktiviert , die in der Basalschicht der Epidermis und interfollikulären Haarfollikel 2 befinden. Viele Signalwege wurden in epidermalen Entwicklung und Regeneration gebracht. Einige davon treten innerhalbdie Epidermis nur, wie das Hedgehog-Weg. Andere Signalereignisse stattfinden zwischen Dermis und Epidermis 3. Zum Beispiel Wnt - Signale von der Dermis sind gedacht für Haarfollikel - Entwicklung wichtig zu sein, und sie werden von der dermalen Papille zu Beginn der anagenen sekretiert Haarfollikel Ausbuchtung Stammzellen / Vorläuferzellproliferation und Haarfollikel Wachstum 4 aktivieren. Es ist wichtig, die zellulären und molekularen Mechanismen zu verstehen, die den epidermalen Entwicklung und Regeneration zu steuern, besser zu verstehen, wie sie in der regenerativen Hautkrankheit gestört werden kann, wie Hautkrebs. Dieser Artikel beschreibt eine C lear, nobstructed U B regen I maging Cocktails und C omputational Analyse (kubisch) Protokoll 5-7 ganze Berg Hautpräparate zu klären und Proteinexpressionsmuster in drei Dimensionen auf Einzelzellauflösung durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Die CUBIC Verfahren beinhaltet das Eintauchen HautGewebe in zwei Aminoalkohol-basierten chemischen Cocktails. Diese Lösungen stellen Sie die Brechungsindizes in der Hautprobe, so dass das Gewebe transparent und die Proteine ​​intakt, so dass Immunnachweis auf Einzelzellauflösung. Mit diesem CUBIC-Protokoll, die basale und wuchernden Keratinozyten-Populationen in den interfollikulären Epidermis und im Haarfollikel wurden in Vollhautbiopsien von Wildtyp-Mäusen unter Verwendung von Anti-Keratin14 (K14) und Anti-Ki67-Antikörper abgebildet. Talgdrüsen in Wildtyp- Hautbiopsien wurden auch Färbung mit Nile Red sichtbar gemacht. Schließlich wurden 8 verglichen die basalen Keratinozyten - Populationen in Wildtyp- und hyperplastischem YAP2-5SA-&amp; Delta; C Hautbiopsien. Dieses CUBIC-Protokoll ermöglicht die visuelle Beurteilung der Proteinexpression in Vollhautbiopsien bei Einzelzellauflösung und ist ein wichtiges Instrument epidermalen Anatomie und morphologische Defekte in der Haut von gentechnisch veränderten zu schätzenMäuse und die zellulären und molekularen Mechanismen der epidermalen Entwicklung und Regeneration zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1082">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">P6418</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ethanol 96% (undenaturated)</td>
			<td style="width:195px;">Chem-supply</td>
			<td style="width:229px;">UN1170</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Nile Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">821940</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">648462</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">648462</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sucrose</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">S0389</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td>
			<td style="width:195px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:229px;">4583</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">anti-Keratin14 antibody</td>
			<td style="width:195px;">Covance</td>
			<td style="width:229px;">PRB-155P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">anti-Ki67 antibody&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:229px;">ab16667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:423px;">Donkey anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:229px;">A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Urea</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">66612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8242;,2&#8242;&#8217;-nitrilotriethanol</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">137002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:423px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon Instruments Inc</td>
			<td style="width:229px;">Nikon A1 - Confocal Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">cruZer6 Face Trimmer</td>
			<td style="width:195px;">Braun</td>
			<td style="width:229px;">Braun cruZer6 Face</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">438456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations

Die Haut ist wichtig für unser Überleben. Die äußere Schicht der Epidermis besteht aus den interfollikulären Epidermis, die eine geschichtete Plattenepithel ist die meisten unserer Körper abdeckt und epidermalen Anhangs wie die Haarfollikel und Schweißdrüsen. Die Epidermis erfährt Regeneration während des Lebens und in Reaktion auf eine Verletzung. Dies wird ermöglicht durch K14-exprimierenden basal epidermalen Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen, die von mehreren Regulationsmechanismen streng reguliert werden aktiv in der Epidermis und zwischen Epidermis und Dermis. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, mit voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und K14-Protein-Expressionsmuster visualisieren, Ki67 Zellen markiert wuchernden, Nile Red markierten Sebozyten und DAPI Kern Kennzeichnung auf Einzelzell Auflösung in 3D. Diese Methode ermöglicht eine genaue Bewertung und Quantifizierung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien. Das CUBIC-Protokoll ist the beste Methode bisher verfügbaren molekularen und zellulären Wechselwirkungen in Vollhautbiopsien bei einzelnen Zelle Auflösung zu untersuchen.

Volle Dicke dorsalen Hautbiopsien von erwachsenen Wildtyp - Mäuse wurden geklärt, gefärbt mit einem Antikörper - Bindung basalen Keratinozyten Marker Keratin14 (K14) und Kerne wurden counterstained mit DAPI - Färbelösung (Abbildung 2 und Film 1). DAPI-positiven Kerne sichtbar waren in der gesamten Probe (2A, C) und K14 - Färbung sichtbar war ausschließlich in der Ein-Zelle dick Basalschicht der interfollikulären Epidermis, und umreißt die Talgdrüsen (schwarze Sternchen), die äußeren Wurzelscheiden Haarfollikel und in den sekundären Haar Keime (2B, C), wie zuvor 9 veröffentlicht. K14 Färbeintensität war hoch in den interfollikulären Epidermis, das distale Haarfollikel und die sekundären Haar Keime (weiße Sternchen), und es war in der Ausbuchtung Bereich des Haarfollikels (Bu in 2C) relativ gering. Die dermale Papillen waren auch deutlich Einsehbaree durch DAPI Markierung (Pfeil in Abbildung 2C). Zur Visualisierung Zellen, volle Dicke dorsalen Hautbiopsien in Telogen von erwachsenen Wildtyp - Mäuse wurden geklärt und gefärbt mit einem Anti-Ki67 - Antikörper wuchernden und Kerne wurden counterstained mit DAPI - Lösung (Abbildung 3, und Movie 2). Proliferierende Keratinozyten wurden in den basalen interfollikulären Epidermis (IFE in 3C) und in dem Isthmus (ist in 3C) der Haarfollikel, aber nicht in der Wulstregion (Bu in 3C) nachgewiesen. Um Talgdrüsen, volle Dicke dorsalen Hautbiopsien in Anagen der erwachsenen Mäuse Wildtyp- visualisieren wurden mit Nile Red geklärt und gefärbt, die den Fettgehalt von Sebozyten Etiketten und Kerne wurden counterstained mit DAPI - Färbelösung (Abbildung 4 und Movie 3). Nile Red-positive sebaceous Drüsen wurden in den Isthmus Bereich der Haarfollikel (SB in 4C) beobachtet, was zeigt , dass die kubischen Protokoll nicht signifikant die Morphologie dieser fetthaltigen Strukturen beeinflussen. Unerwarteterweise Haarschäfte wurden auch mit Nile Red (HS in 4C) markiert. Um die morphologischen Veränderungen in der Epidermis von YAP2-5SA-&amp; Delta; C transgenen Mäusen, die eine hyperaktiv YAP mutierte Protein in Basalkeratinocyten 8, volle Dicke dorsalen Hautbiopsien von erwachsenen Wildtyp und YAP2-5SA-&amp; Delta; C transgenen Mäusen littermate sichtbar wurden mit der geklärte und gefärbt Anti-K14 - Antikörper und Kerne wurden mit DAPI - Lösung (Abbildung 5 und Film 4 (Wildtyp) und Film - 5 (YAP2-5SA-&amp; Delta; C)) gegengefärbt . Im YAP2-5SA-&amp; Delta; C transgenen Haut, die Hyperplasie der interfollikulären Epidermis (obere Doppelpfeile in 4F </strong&gt;) War deutlich sichtbar, und die Haarfollikel waren länger und die K14-markierten Zellmassen proximal in den abnormen Haarfollikel (untere Doppelpfeile in Figur 5F) angezeigt wird , um die vergrößerte Stammzellpopulationen darstellt, wie zuvor 8 beschrieben. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54401/54401fig1.jpg" /> Abbildung 1: Herstellung der Imaging - Kammer. A: Verbrauchsmaterialien für die Herstellung der Abbildungskammer erforderlich sind blau tack, Knete oder ähnlich, und zwei Deckgläser (24 x 50 mm) . B: zwei dünne Streifen blau tack vorbereitet (Durchmesser ca. 2 mm x 2 cm) und zwei Deckgläser . C: Platz blau tack Streifen auf einem Deckglas, genügend Platz für die Hautbiopsie ermöglicht. Legen Sie die Hautbiopsie in einem Tropfen CUBIC2 Lösung zwischen den beiden Streifen . D: Platz zweites Deckglas auf blauem tack Streifen der Hautbiopsie zur Deckung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/54401fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/54401fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54401/54401fig2.jpg" /> Abbildung 2: K14 / DAPI Label - ing von Dorsalhaut in Telogen von Adult Wildtyp - Mäuse 3D - Volumenrekonstruktion einer dorsalen Hautbiopsie in Telogen eines erwachsenen Wildtyp - Maus mit einem K14 - Antikörper (rot in B, C) ​​bezeichnet, und DAPI Kern counterstain. (blau in A, C). K14-Färbung ist stark in den interfollikulären Epidermis (IFE), Isthmus und die Talgdrüsen (schwarze Sternchen), und die sekundären Haar Keime (weiße Stern), und relativ niedrig in der Ausbuchtung<html> Bereich (Bu). Maßstabsbalken 50 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/54401fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/54401fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54401/54401fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Ki67 Kennzeichnung von Dorsalhaut in Telogen von Adult Wildtyp - Mäuse 3D - Volumen - Rekonstruktionen von einer dorsalen Hautbiopsie eines erwachsenen Wildtyp - Maus mit einem Ki67 - Antikörper (rot in B, C) ​​bezeichnet, und DAPI Kern counterstain (blau in A, C). Proliferierende Ki67-positive Keratinocyten sind offensichtlich in der basalen Epidermis interfollikulären (IFE), und in dem Isthmus-Bereich (Is), aber nicht in die Ausbuchtung (Bu) des Telogens Haarfollikel. Maßstabsbalken 50 um.rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54401/54401fig4.jpg" /> Abbildung 4: Nil - Rot - Färbung der dorsale Haut in Anagen von Adult Wildtyp - Mäuse 3D - Volumenrekonstruktion einer dorsalen Hautbiopsie in Anagen eines erwachsenen Wildtyp - Maus mit Nile Red (rot in B, C) ​​bezeichnet, und DAPI Kern counterstain (blau in. A, C). Nile Red-Färbung sichtbar in den Sebozyten (SB) und in den Haarschaft (HS). Maßstabsbalken 50 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/54401fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/54401fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54401/54401fig5.jpg" /> Zahl5: Morphologische Abnormitäten in der YAP2-5SA-&amp; Delta; C Epidermis 3D - Volumen - Rekonstruktionen von dorsalen Hautbiopsien von erwachsenen Wildtyp (A - C) und YAP2-5SA-&amp; Delta; C transgenen littermate Mäuse (D - F) mit einem K14 - Antikörper (rot markiert in. B, C, E, F) und DAPI Kern counterstain (blau in A, C, D, F). Die epidermale Hyperplasie der Epidermis YAP2-5SA-&amp; Delta; C ist offensichtlich in den interfollikulären Epidermis (top Doppelpfeile in F) und in den Haarfollikeln, die die charakteristischen Stammzellen / Vorläuferzellmassen proximal anzuzeigen (untere Doppelpfeile in F) 8. Maßstabsbalken 50 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/54401fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/54401fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen</a><html> dieser Figur. <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/54401/54401movie1.jpg" /> Film 1. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/Movie_1.mov" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/Movie_1.mov" target="_blank">diesen Film zu downloaden.</a> <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/54401/54401movie2.jpg" /> Film 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/Movie_2.avi" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/Movie_2.avi" target="_blank">diesen Film zu downloaden.</a> <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/54401/54401movie3.jpg" /> Film 3. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/Movie_3.mov" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/Movie_3.mov" target="_blank">diesen Film zu downloaden.</a> 01movie4.jpg &quot;/&gt; Film 4. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/Movie_4.mov" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/Movie_4.mov" target="_blank">diesen Film zu downloaden.</a> <img alt="Film 5" src="/files/ftp_upload/54401/54401movie5.jpg" /> Film 5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/Movie_5.mov" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54401/Movie_5.mov" target="_blank">diesen Film zu downloaden.</a>

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CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

Dieser Bericht beschreibt ein kubischer Protokoll voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und Proteinexpressionsmuster, wuchernden Zellen und Sebozyten auf Einzelzell Auflösung in 3D visualisieren. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien.

CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

cubic-protocol-visualizes-protein-expression-at-single-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K Aufrufe.  University of New South Wales Australia.  Dieser Bericht beschreibt ein kubischer Protokoll voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und Proteinexpressionsmuster, wuchernden Zellen und Sebozyten auf Einzelzell Auflösung in 3D visualisieren. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien. 

Serie: CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...