Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&amp;D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health &amp; Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).

1. Markierung von Sonden mit Digoxigenin-dUTP durch PCR <ol><li> Führen Sie die PCR - Markierung mit 10x dNTP - Mix enthält Digoxigenin-dUTP wie zuvor 13 beschrieben. </li><li> Reinige PCR-Produkt mit Spin-Säulenreinigung nach Herstelleranleitung. <ol><li> Wenn die Sonde kürzer als 200 bp ist, entfernen freie Digoxigenin-dUTP mit Spin-Säulenchromatographie aus der Reaktionsmischung statt Spin-Säulenreinigung. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung Polylysin beschichteten Objektträger Anmerkung: Die gesamte Prozedur dauert etwa 2 Stunden. Die meisten Schritte werden bei Raumtemperatur mit Ausnahme der Trocknungsschritt durchgeführt. <ol><li> Die Reinigung der Folien <ol><li> Legen Sie die Folien in einem Plastikbehälter und spülen Sie die Objektträger kurz mit destilliertem Wasser (DW). Entfernen Sie das Wasser und füllen Sie den Behälter mit DW 1% Glasreiniger enthalten. </li><li> Agitieren die Objektträger für 15 min bei 50 UpM bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die Folien mit DW 3mal für 5 min bei RT jeweils. </li><li> Waschen der Objektträger mit 70% Ethanol für 15 min unter Rühren. Entsorgen Sie 70% Ethanol und Objektträger auf einem 65 ° C trocken Block und der Luft trocknen für 15 min. </li></ol></li><li> Polylysin Beschichtung von Multi-Well-Objektträger aus Glas Hinweis: Polylysin Beschichtung von Glasobjektträger ist ein wichtiger Schritt, da es die Probe Adhäsion während des gesamten Färbeverfahrens liefert. Unzureichend beschichtete Folie in der Probenverlust führen wird. <ol><li> Verdünne die Polylysin-Stammlösung auf 0,01% (w / v) in destilliertem Wasser. Geben Sie 20 &amp; mgr; l der verdünnten 0,01% (w / v) Polylysin in die Vertiefungen einer sauberen Glasobjektträger. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger aus Glas für 5 min bei RT. </li><li> Legen Sie die Dias auf einer 65 ° C trocken Block und der Luft trocknen für 1 Stunde. </li><li> Bewahren Sie die Polylysin Folien in der staubfreien Feld. </li></ol></li></ol> 3. Fixierung von Worms auf dem Folie-Glas (Abbildung 1) <ol><li> Vorbereiten von Embryonen für FISH Hinweis: Ernte Würmer vor allem ter bakterielle Nahrung wird durch die Beobachtung der Wachstumsmedien unter dem Mikroskop verbraucht. Starvation reduziert Eierproduktion von erwachsenen Würmer und erhöht Ei schlüpft. Detaillierte Verfahren sind in 14,15 beschrieben. <ol><li> Wachsen die Würmer in 50 mm Petrischale nach Standardverfahren 14. </li><li> Nachdem das gesamte bakterielle Nahrung verbraucht wird, schneiden Sie die Agar-Medien in Quartal mit Spachtel. Sterilisieren Sie den Spachtel vor dem Schneiden eine Kontamination zu verhindern. </li><li> Legen Sie die gesamte Stück Agar auf der 100 mm Nematoden Nährmedien (NGM) Platte. Drehen Sie den Agar Stück den Kopf für die Würmer die frische Bakterien Nahrung zu erreichen. </li><li> Nach 48 bis 72 Stunden, die Würmer mit M9-Puffer zu sammeln. In 3 bis 5 ml M9-Puffer auf der NGM-Platte. Pipette M9-Puffer auf der Oberfläche der NGM die Würmer zu waschen. </li><li> Sammeln Sie die Flüssigkeit mit Würmern und fügen Sie in ein 15-ml-Tube. Hinweis: Wenn es Agar Trümmer nach der Ernte, Zentrifuge die Würmer in einer 30% igen Saccharoselösung. Während Trümmer pelletiert werden, Würmer schwimmen aufdie Oberfläche. </li><li> In M9 Puffer um das Volumen auf 15 ml zu bilden. Pellet die Würmer durch Zentrifugation bei 300 g für 3 Minuten und entfernen Sie die meisten der M9-Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male. Hinweis: Wenn die Würmer noch nach dem Zentrifugieren schwimmend, stellen die Bremse Niveau der Zentrifuge = 1 zu bewerten. </li><li> Absaugen M9-Puffer. Hinzufügen Bleichlösung auf die Würmer. Pro 0,5 ml Würmer, 6,5 ml DW, 2 ml Hypochlorit, 1 ml 5 M KOH hinzu. </li><li> Inkubiere die Würmer mit 3 min bei 50 Upm bei RT rocking. Vortex Würmer für 15 Sekunden, um mechanisch die Würmer abzuscheren und die Eier aus. </li><li> Beachten Sie die Röhre unter einem Präpariermikroskop während der Bleiche. Stellen Sie sicher, dass Würmer in zwei Hälften geschnitten und Eier freigesetzt werden. Wenn die meisten der erwachsenen Körper gelöst ist, fügen M9 Puffer das Volumen auf 15 ml zu bilden. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 3 min. Aspirieren die meisten der M9 und fügen Sie frisches M9 Puffer um das Volumen auf 15 ml zu bilden. Wiederholen Waschschritt 3 mal. Hinweis:Vermeiden Sie übermäßige Menge an Würmer verwenden, da sie den Bleichprozess behindern. Halten Sie die Gesamtreaktionszeit von weniger als 8 Minuten, bis die Wäsche. Über gebleichten Eier produzieren starke Autofluoreszenz. </li><li> In phosphatgepufferter Salzlösung mit Polysorbat-20 (PBST) bis zu 200 &amp; mgr; l und 200 &amp; mgr; l von 4% Paraformaldehyd (PFA) 2% PFA zu machen. Achtung: Da PFA krebserregend ist, tragen Schutzkleidung, Handschuhe und Augenschutz vor PFA. </li><li> In 40 ul der Eier in 2% PFA auf den gut Polylysin beschichteten Folie. </li><li> Legen Sie die Folien in einer feuchten Kammer und Inkubation für 15 min bei RT. Schließen Sie die feuchte Kammer direkt nach dem die Dias nach innen gesetzt werden. Hinweis: Die Eier an der Unterseite des Schlittens absetzen, während fixiert wird. </li></ol></li><li> Vorbereiten seziert Gonaden für FISH <ol><li> Ernte erwachsenen Würmer auf 50 mm NGM Platte gewachsen durch Pipettieren 1 ml M9-Puffer. Ernte Würmer vor Bakterien Nahrung ist erschöpft. </li><li> Waschen Sie die Würmer aus allen Bakterien Witzh M9-Puffer, 2 Mal. Hinweis: Rest Anhaften von Bakterien an Polylysin beschichteten Objektträger mit den seziert Gonaden stören können. </li><li> Pellet die Würmer durch Zentrifugation bei 300 x g. Entfernen M9 und übertragen Sie die Würmer auf die leere NGM Platte von Mikropipette. </li><li> In 30 ul M9-Puffer, der 2 mM Levamisol auf einem gut Polylysin behandelten Folie. </li><li> Hinzufügen 500 ul M9-Puffer auf eine 1-ml-Röhrchen. Verwenden Sie diese Puffer die Würmer durch den Mund Pipette zu übertragen. </li><li> Füllen Sie die Spitze des Mundpipette mit M9-Puffer durch eine Kapillare in der 1-ml-Röhrchen Platzieren der M9-Puffer enthält. </li><li> Unter Binokular, legte die Spitze Mund Pipette direkt vor dem Kopf der erwachsenen Wurm und ziehen Mund Pipette so dass der Kopf von Würmern die Pipette den Mund gelangt. Sobald der Kopf von Würmern in die Spitze eintritt, wird der gesamte Körper der Wurm in die Spitze gezogen werden. </li><li> Übertragen Sie die Würmer an die Polylysin beschichteten Objektträger mit Mund Pipette. </li><li> Mit einer Rasierklinge geschnitten vonf den Kopf oder die Spitze des Schwanzes von Würmern auf der Folie. Wenn der Wurm geschnitten wird, erscheint die Gonaden aus. Gonaden wird auf den Folien kleben. <ol><li> Bereiten Sie mindestens 30 Würmer in einem gut. Weitere Brunnen kann für weitere 30 Würmer verwendet werden. </li></ol></li><li> Legen Sie die Folie in der feuchten Kammer und absaugen M9-Puffer mit Mund Pipette aus. </li><li> Fixieren Sie die Probe durch Zugabe von 20 ul 2% PFA bei RT für 15 min in der feuchten Kammer. </li></ol></li></ol> 4. Fixierung und Permeabilisierung <ol><li> Platzieren Sie ein Aluminiumblock auf Trockeneis und speichern sie in einem Tiefkühlschrank (-80 ° C). Store Methanol und Aceton in -20 ° C. </li><li> Nach PFA Fixierung Schritt 3.1.15 oder 3.2.11, entfernen Fixiermittel mit Mikro verlassen ~ 5 ul des Fixiermittel. </li><li> Mit anderen Polylysin beschichtete Folie auf dem Probenträger. Entfernen Sie die Fixiermittel mit einem Papiertuch, wenn die Lösung zu hoch ist. Sie nicht, die Dias zu bewegen, sobald sie aneinander haften. </li><li> Frieren Sie die Folienauf dem Aluminiumblock mindestens 15 min. Hinweis: Die Proben können für mindestens 2 gelagert werden - 3 Tage. </li><li> Während die Folien eingefroren werden, setzen die Gläser kaltes Methanol und Aceton auf Eis enthält. </li><li> Nehmen Sie die Folien aus und drehen sie die Probe zu gefrier knacken. Entsorgen Sie die obere Folie. einweichen sofort die Folie in die eiskalten Methanol für 5 min. </li><li> Die Objektträger in eiskaltem Aceton für 5 min. </li><li> Waschen Sie die Folien 3-mal mit PBST für 5 min Rest Fixiermittel zu entfernen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt oder speichern Sie die Folien in 100% Ethanol bei 4 ° C. Hinweis: Die Proben können für mindestens 2 gelagert werden - 3 Tage. </li></ol> 5. Die Hybridisierung von fixierten Zellen <ol><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l RNase-Lösung (PBST 10 ug / ml RNase A enthält). Inkubiere die Folie in der feuchten Kammer bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Waschen Sie die Folie zweimal in 2x Kochsalzlösung und mit Natriumcitrat Polysorbat-20 (2x SSCT) für 15 min jeweils. </li><li> In 20ul Hybridisierungslösung und setzen Sie die feuchte Kammer in den Inkubator 37 ° C. Nach 1 Stunde, entfernen Sie die Hybridisierungslösung durch Pipettieren. </li><li> Vor Hybridisierungslösung zu entfernen, bereiten Sie die Sonde. Wenn die Sondendoppelstrang-DNA ist, denaturieren die Sonden durch Erhitzen bei 95 ° C für 5 min auf einer trockenen Block. Nach dem Erhitzen kühlen, um die Sonde auf Eis kurz. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Hybridisierungslösung Sonden an die Probe enthält. Für PNA-Sonde, Einsatzkonzentration bei einem Verhältnis von 1: 2000 und für die DIG-markierte Sonde, Einsatzkonzentration bei einem Verhältnis von 1: 200. Decken Sie die Probe mit Deckglas. </li><li> Setzen Sie ein Papiertuch mit Wasser auf dem Wärmeblock getränkt (80 ° C). Legen Sie eine Kunststoff-Box Abdeckung auf dem Wärmeblock die Feuchtigkeit und die Temperatur zu erhalten. </li><li> Nachdem die Temperatur des Wärmeblocks (bis 80 ° C) stabilisiert hat, stellen Sie den Probenträger auf dem erhitzten Papiertuch und decken die Proben mit dem Kunststoff-Box-Abdeckung. Denaturieren die Probe für 3 min. </li><li> IncUbate die Folien in einer feuchten Kammer über Nacht bei 37 ° C. </li></ol> 6. Wäscht und Immunofluoreszenz <ol><li> Warm up der Hybridisierungswaschlösung (2 × SSC, 50% Formamid) bis 37 ° C. </li><li> Waschen Sie die Probe in dem PBST zweimal bei RT für 5 min. Entfernen Sie das Deckglas. </li><li> Waschen Sie die Probe in Hybridisierungswaschlösung bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Waschen Sie die Probenträger in PBST 3 mal bei RT. Hinweis: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in feuchten Kammer bei RT. </li><li> In 20 ul Blockierungslösung und Inkubation für 1 h bei RT in der feuchten Kammer. </li><li> Entfernen Blockierungslösung und fügen FITC konjugiertem anti-Digoxigenin-Antikörper-Lösung (1: 200) für 3 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> 7. Montage und Beobachtung <ol><li> Waschen Sie den Probenträger mit PBST 2-mal für jeweils 15 min. </li><li> In 10 ul Lösung mit DAPI Montage. Legen Sie das Deckglas und drücken Sie vorsichtig. Entfernen Sie überschüssige Lösungmit einem Papiertuch. </li><li> Zum Verdampfen von Montagelösung, die Ränder des Deckglases mit Nagellack verhindern. </li><li> Beobachten Sie unter konfokalen Mikroskop. Ausschließen Embryonen mit hohem Hintergrund. Konzentrieren Sie sich auf ein Feld mit 4 - 20 Kernen. </li><li> Nehmen Sie Bilder nach den Anweisungen des Herstellers mit 100X Objektiv. Hinweis: Excite Probe mit 405-nm-Laser für DAPI, mit 555-nm-Laser für cy3, mit 488-nm-Laser für FITC. </li></ol> 8. Quantifizierung der Telomere Signal Anmerkung: Die Quantifizierung erfolgte wie zuvor beschrieben 16. Alle Bilder, die verglichen werden sollte mit derselben Einstellung einschließlich Belichtungszeit und Lichtquelle genommen werden. <ol><li> Exportieren Sie das Bild in .tif-Format. </li><li> Downloaden und die Bildanalyse-Software zu installieren. </li><li> Führen Sie die Bildanalyse-Software und klicken Sie stimmen Taste. </li><li> Klicken Sie auf Öffnen-Taste. Öffnen Sie die Bilder mit Telomer FISH durch einen Doppelklick auf die Bilddatei. </li><li> Klicken[Bearbeiten] - [select Verarbeitungsbereich], wählen Sie eine Region von Interesse mit der linken Maustaste und ziehen. Ausschließen alle die nicht-spezifische Färbung. </li><li> Klicken Sie auf [Maßnahme] - [optischen Dichten vor Ort], wählen Sie den Kanal mit Telomer-Signal und geben Sie den Dateinamen, um die Ergebnisse in TXT-Datei zu speichern. Hinweis: Die Spalte der Ergebnisse sind in der folgenden Reihenfolge: Fluoreszenz von Spot, Hintergrund-Intensität von Spot und Bereich der Stelle. </li><li> Kopieren Sie die Werte und subtrahieren Hintergrund Intensität der Spot von Fluoreszenz von Spot. Die Werte können nun statistisch ausgewertet werden. </li></ol>

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	<li>Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+cells+with+no+detectable+telomerase+activity.+A+review.">Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review.</a> Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).</li><li>Seo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+maintenance+through+recruitment+of+internal+genomic+regions.">Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions.</a> Nat Commun. 6, 8189 (2015).</li><li>Cesare, A. J., Reddel, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+models,+mechanisms+and+implications.">Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications.</a> Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).</li><li>Meier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=trt-1+is+the+Caenorhabditis+elegans+catalytic+subunit+of+telomerase.">trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase.</a> Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).</li><li>Cawthon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+measurement+by+quantitative+PCR.">Telomere measurement by quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).</li><li>Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+longevity+and+telomere+length+in+C.+elegans.">Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans.</a> PLoS Genet. 1, 30 (2005).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Specific+Sequences+among+DNA+Fragments+Separated+by+Gel-Electrophoresis.">Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+extension+by+telomerase+and+ALT+generates+variant+repeats+by+mechanistically+distinct+processes.">Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes.</a> Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).</li><li>Cheung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+telomere+length+revealed+by+single+telomere+length+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).</li><li>Shtessel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+POT-1+and+POT-2+repress+telomere+maintenance+pathways.">Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways.</a> G3. 3, 305-313 (2013).</li><li>Duerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry.">Immunohistochemistry.</a> WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).</li><li>Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+meiosis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans.</a> Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , 171-195 (2009).</li><li>Emanuel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+system+for+synthesis+of+non-radioactive+nucleic+acid+hybridization+probes+using+PCR.">Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR.</a> Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J Vis Exp. , e4019 (2012).</li><li>Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+measurements+using+digital+fluorescence+microscopy.">Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy.</a> Cytometry. 36, 267-278 (1999).</li><li>Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shelterin+protein+POT-1+anchors+Caenorhabditis+elegans+telomeres+through+SUN-1+at+the+nuclear+periphery.">The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery.</a> J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).</li><li>Lee, M. H., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+in+situ+hybridization+of+dissected+gonads.">RNA in situ hybridization of dissected gonads.</a> WormBook. , 1-7 (2006).</li><li>Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-well+version+of+in+situ+hybridization+on+whole+mount+embryos+of+Caenorhabditis+elegans.">A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+(Q-FISH).">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH).</a> Curr Protoc Cell Biol. 18, 14 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Der Hauptvorteil unserer Protokolls ist die Einfachheit des Verfahrens ohne nennenswerte Beschädigung der Morphologie der Zellstruktur. Wurden mehrere Schritte für C optimiert elegans FISH in diesem Protokoll. Die entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche FISH umfassen Kennzeichnung von Sonden, die Fixierung von Embryonen und Penetration. Digoxigenin-dUTP Markierungsverfahren bietet eine einfach zu bedienende Markierungsverfahren durch PCR oder Nick-Translation. Zur Kennzeichnung wird lange Zielsequenz, Nick-Translation bevorzugt. In diesem Fall sollten die Sonden mit geeigneten Restriktionsenzym verdaut werden, um das Eindringen von Sonden zu erleichtern. Biotin-dUTP-Tag wird nicht empfohlen, da Biotin-markierten Sonden überschüssige Menge an Hintergrundsignal aus dem Cytoplasma produziert. Obwohl endogenes Biotin Blockierungsreagenz im Handel erhältlich ist, wurde es nicht versucht. Dieses Protokoll verwendet isolierte Embryonen, die Dichte der Zellen für eine effiziente Quantifizierung zu erhöhen. Intestinale Kerne von C. elegans sind groß und polyploiden sind, die dem Rest der somatischen Zellkerne gegenübermäßiger Anzahl und Intensität der telomere Flecken beitragen. Aus diesem Grund ist ganze Wurm für die Quantifizierung von Telomeren in C nicht geeignet elegans. Im Gegensatz dazu sind Embryonen für die Bewertung der Telomerlänge geeignet, da sie homogene Zellen ohne Polyploidie der Effekt. Dieses Protokoll verwendet 2% PFA Fixiermittel für Telomer FISH fein gearbeitet. Obwohl Glutaraldehyd berichtet , ist in einem unteren Hintergrundsignal und härter Fixierung in RNA in situ Hybridisierung zu führen, erhöht Glutaraldehyd Autofluoreszenz deutlich 18. Dieser Überschuss Hintergrund wurde nicht nach der Behandlung von Natriumborhydrid abgeschafft, die nicht umgesetzten Aldehyd-Gruppe reduziert. Aus diesem Grund wurde Glutaraldehyd nicht verwendet. Wenn das Signal-zu-Rausch-Verhältnis niedrig ist, die Zeit der Vorhybridisierung kann auf mehrere Stunden verlängert werden unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. ImAußerdem Zeit stringenten Wasch erhöht werden Hintergrundpegel zu verringern. Färbetechnik in C. elegans kann eine Herausforderung für die richtige Permeabilisierung Behandlung. C. elegans enthält dicke kutikulären Exoskelett , das Eindringen von Antikörpern und Sonden verhindert. Traditionellen Antikörperfärbung Verfahren beinhaltet die Behandlung von Kollagenase, was viel Zeit und Optimierungsprozess erfordert. Die enzymatische Penetrationsverfahren auch für Schäden, die Morphologie der Würmer im Austausch von Penetrationseffizienz. Gefrier Riss und Methanol-Aceton-Behandlung wurde verwendet, Sonde Eindringen zu erleichtern. Gefrier Riss ist einfach und schnell im Vergleich zu Chitinase oder Yatalase Behandlung 19. Dehydration oder Rehydrierung Methanol Serie schien nicht die Qualität der Fische zu beeinflussen. Diese Schritte wurden in diesem Protokoll vereinfacht. Obwohl berichtet wurde , dass die Proteinase K - Verdau für RNA in situ Hybridisierung erforderlich war19, offensichtliche Unterschied nicht zwischen Telomer FISH Ergebnisse mit und ohne Proteinase K - Behandlung beobachtet. Zusätzlich gefrier Cracken von Embryonen eine einfach zu bedienende Verfahren zum viele Zellen gleichzeitig auf einem einzigen Brennebene für große quantitative Analyse zu visualisieren. Durch die Verwendung von PNA-Sonde wurde Telomer-Signal deutlich erhöht im Vergleich zu dem mit einer DNA-Sonde erhalten. Dies könnte für seine komplementäre Ziel und seiner geringeren Größe (3 Wiederholung im Vergleich zu 4 Wiederholung) zu einer höheren Bindungsaffinität fällig. Fluoreszierend markierten PNA-Sonde bindet auch direkt an sein Ziel, die Minimierung nachfolgenden Schritten. Starke Affinität in den folgenden Immunofluoreszenz Schritte beibehalten macht die Postfixierung überflüssig, die Hintergrundgeräusche zu vermeiden. Es existieren jedoch einige Einschränkungen in dieser Technik. Einer ist, dass die Permeabilisierung leicht Schäden, die Morphologie bei den Kosten der effizienten Sonde Eindringschritt. Die Behandlung der Gonadens und Embryonen mit Methanol und Aceton verzerrt Kreisförmigkeit der Kerne im Vergleich zu unbehandelten Kontrolle. Für Experimente, die perfekt erhaltene Morphologie erfordern, sollten unterschiedliche Permeabilisierung Methode versucht werden. Ein weiterer Grund ist, dass die Telomer-Signal in willkürlichen Einheiten quantifiziert. Dies ist vor allem aufgrund von Variationen unter den unabhängigen Experimenten. Ribosomalen DNA kann als eine interne Kontrolle zur Normalisierung jeder Probe betrachtet werden. Weitere nützliche Methoden können in Bezug 20 gefunden werden. Ein einfaches Telomer-FISH-Protokoll wird hier beschrieben, die minimale Schritte erfordert. Viele Schritte sind für die Analyse von großen Menge von Embryonen reduziert. Allerdings können weitere Modifikation für ein stärkeres Signal, wie Chitinase Behandlung für die Penetration und andere innovative Studien gemacht werden. In Kombination mit Zellkulturverfahren, bildgebenden Superauflösung möglich. Dieses Protokoll kann dazu beitragen , die neuen Telomererhaltung Mechanismus in C zu entdecken elegans.

Telomere schützt Chromosomenenden von anomalen Fusion und Abbau. Mammalian Telomer besteht aus G-reichen hexameren wiederholt, TTAGGG und Shelterin Komplexe. Die telomere Wiederholungssequenz des Nematoden ist ähnlich zu denen von Säugetieren (TTAGGC). Die meisten Eukaryoten nutzen Telomerase Telomerwiederholungen zu ihrer chromosomalen Enden hinzufügen. Allerdings, 10 - 15% der Krebszellen nutzen Telomerase unabhängigen Mechanismus, bekannt als Alternative Verlängerung von Telomeren (ALT) 3. Zuvor berichteten wir , dass Telomerwiederholungen und die damit verbundenen Folgen, wie TALT genannt, in den Telomeren der Telomerase Mutantenlinien verstärkt wurden , die zwei kritische Sterilität überlebt. Telomerlänge wurde durch quantitative PCR oder durch Southern - Blot gemessen, die 4,5,6,7 durchschnittliche Länge von insgesamt Telomere zur Verfügung stellt. Lesen Anzahl der Telomer - Repeat in Genomsequenzierungsdaten ist auch ein Indikator für insgesamt Telomer Inhalt 8. Obwohl Single Telomerlänge Analysis (STELA) könnte die Länge eines einzelnen Telomere liefern, es 9 räumliche Informationen der Telomere nicht zur Verfügung stellen kann. Während POT-1 :: mCherry Reporterprotein die räumliche Information der Telomere in vivo liefert, kann sie nicht Längen von doppelsträngigen Telomere darstellen, als POT-1 ein Einzelstrang ist Telomer - bindendes Protein 10. Während zuvor genannten Verfahren der gemittelten Daten von repetitiven Sequenzen bereitzustellen, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ermöglicht , die Menge und räumlichen Muster von individuellen Sequenzen von Interesse auf einer chromosomalen Skala zu beobachten. Anstelle der Reinigung von DNA werden Gewebe oder Zellen fixiert die native räumliche Informationen in FISH zu bewahren. Somit ist FISH eine sowohl quantitative als auch qualitative Werkzeug zur Beobachtung der einzelnen Wiederholungssequenzen, wie beispielsweise Telomerwiederholungen. Dieses Protokoll liefert ein effizientes Verfahren zur gleichzeitigen Nachweis beider teloC. bloße und andere Wiederholungen von zuvor beschriebenen Methoden 11,12 auf Verbesserungen basieren. elegans Larven oder Erwachsene sind vielzelligen Organismus mit hoch differenzierten Zellen. Die Heterogenität von Zellen hemmt auf die quantitative Analyse einer großen Anzahl von Telomer Flecken. Um die Anzahl der analysierten Zellen zu maximieren, Embryonen isoliert und verteilt auf die Polylysin-beschichteten Objektträger für die Fische. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch mit Immunofluoreszenz kombiniert werden. Als Beweis dafür, dass das Protokoll funktioniert, zeigen wir, dass es möglich ist, zwei unterschiedliche repetitive Sequenzen zu beobachten und zu quantifizieren. DNA-Sonde gegen TALT1 wurde erzeugt mit einfachen PCR-Digoxigenin-dUTP enthält. Dann ist diese TALT1 Sonde und Fluoreszenz-markierten Telomere PNA-Sonde wurden gleichzeitig hybridisiert. Anschließend wurde Digoxigenin durch kanonische Immunofluoreszenz Methoden nachgewiesen. Wir stellen Ihnen hier die repräsentativen Bilder , in denen TALT1 mit der Telomere in trt-1 kolokalisiert </em&gt; Überlebenden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PNA probe</td>
			<td>PANAGENE</td>
			<td>custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11207741910</td>
			<td>use 1:200 diluted in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11573152910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridizaiton solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridizaiton wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2X SSC, 50% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>BIONEER</td>
			<td>C-9012</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H3393</td>
			<td>make 10 mg/ml for stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>67578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P-2287</td>
			<td>Commercial name is Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P-8920</td>
			<td>prepare fresh 0.01 % w/v solution before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra Microspin G-50</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>27-53310-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2X SSC, 0.1 % tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x digoxigenin-dUTP mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification columns</td>
			<td>Cosmo genetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cleaner / ULTRA CLEAN</td>
			<td>Dukssan pure chemicals</td>
			<td>8AV721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well glass slide</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>96041205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>196142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>Feather</td>
			<td>blade No. 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microsope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block / aluminum block</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LBH-T03</td>
			<td>Set temperature to 80&#8451;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plastic box filled with paper towel soaked in DW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software&#160;</td>
			<td>Dr. Peter Landsdorp</td>
			<td>TFL-telo</td>
			<td><a href="http://www.flintbox.com/public/project/502">http://www.flintbox.com/public/project/502</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observation and quantification of telomere and repetitive sequences using fluorescence in situ hybridization (fish) with pna probes in caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Es wurde bereits berichtet , dass ALT Überlebende von Telomerase-defiziente Mutante entstehen kann, trt-1 (ok410), in niedriger Frequenz durch Replizieren intern lokalisierte &#39;Vorlage von ALT (TALT) Sequenzen für Telomererhaltung 2. Mit PNA - Sonde konnten wir Telomere in den sezierten Gonaden (2A) zu visualisieren. Das schwache Telomer - Signal wurde sowohl in trt-1 (ok410) und ALT Überlebende entdeckt. Die Fuzzy-Signal wurde überlappt nur mit DAPI, was darauf hindeutet, dass sie nicht Autofluoreszenz sein kann. Interstitial Telomer-like repeat (ITR) im TRF - Test in der Studie von C. konsequent beobachtet elegans Telomer 4,10. hohe Spezifität der PNA-Sonde unter Berücksichtigung, sind sie wahrscheinlich über das Genom der ITR dispergiert werden. Die Anzahl der Telomer - Spots betrug etwa 9 pro pachytänen Kern in trt-1 (ok410).In der vorangegangenen Studie wurden 12 Herde von POT-1 beobachtet :: mCherry Protein, das 10 bis einsträngige Telomer - DNA bindet. Maximal 24 Foci pro Kern wurde in den Wildtyp - Embryonen 17 beobachtet. Das Ergebnis legt nahe, dass mCherry reporter Verfahren für das Experiment besser ist, wo die Anzahl der Telomere gezählt werden sollte. PNA FISH jedoch in der Lage, mit der Telomerlänge doppelsträngigen Telomer-DNA sowie einsträngige telomere DNA im Verhältnis zu detektieren. Im Gegensatz dazu die Zahl der Überlebenden telomere spots war ungefähr 7 in ALT, die Chromosomen fusioniert haben (N = 3) 2. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Vorhersage, daß telomere Flecken 6 in ALT Überlebenden wäre. Wir schlossen daraus, dass die Signalintensität von ALT Überlebenden ausreichend war zu beobachten. Telomere Signal wurde mit TALT1 im ALT survivor colocalized, was darauf hindeutet, dass TALT1 als Kopiervorlage für Telomer in Abwesenheit von Telo verwendet wirdmerase (Abbildung 3). Telomere von ALT - Signal - Überlebenden erhöht , die der parentalen trt-1 (ok410) Mutante verglichen, was anzeigt , daß telomere robust in ALT Überlebenden ohne Telomerase (Abbildung 4) gehalten wird. Das Signal von PNA - Sonde war größer als die von Digoxigenin-markierten Sonde (Abbildung 4). Entwerfen Sonden mit PNA Oligomere könnten in stärkeres Signal als Digoxigenin-Markierung resultieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig1.jpg" /> Abb . 1: Übersicht der FISH - Experiment Die Eier werden durch Bleichen erwachsenen Würmer und fixiert in 2% PFA auf einem Polylysin-beschichteten Objektträger geerntet. Die Proben werden gefrier rissig und mit Methanol und Aceton für die Sondenpenetration permeabilisiert. Sonden werden zu der Probe gegeben und über Nacht hybridisiert bei 37 ° C. Digoxigenin-markierte Sonde wird durch Immunofluoreszenz nachgewiesen. Die Proben werden abgebildet und dann quantified durch die Bildanalyse - Software. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig2.jpg" /> Fig . 2: Telomere FISH in den Dissected Gonads (A) Telomere (rot) wurde von Cy3-PNA- (TTAGGC) 3 in der distalen Spitze der Gonaden (Pfeilspitze) nachgewiesen. Die Intensität der ALT Überlebende ist größer als die der trt-1 (ok410). Z-Stapel-Bild wurde mit einer maximalen Projektion gemacht. Nuclei von weißen Pfeil angedeutet ist auf der oberen rechten Ecke gesprengten. Maßstabsbalken, 10 &amp; mgr; m. (B) Anzahl der telomere Spots pro Kern in Pachytän Phase wurde durch visuelle Inspektion gemessen. N = 50. Die Fehlerbalken, SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig2large.jpg" target="_blank">um</a>eine größere Version dieser Figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Telomere und TALT1 FISH in der Embry Ein repräsentatives Bild von der Telomere (rot) und TALT1 (grün) FISH. Telomere und TALT1 Sonde wurden gleichzeitig an Embryonen hybridisiert. DNA wurde mit DAPI (blau) gegengefärbt. Maßstabsbalken, 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig4.jpg" /> Abb . 4: Die Quantifizierung von FISH Daten Telomere und TALT1 Intensität von 3 wurden in der Bildanalyse - Software (ein Geschenk von Dr. Peter Landsdorp) quantifiziert. Jeder Spot wurde mit Schwellenwert ov quantifizierter 15 auszuschließen, nicht-spezifischen Hintergrund. T-Test wurde zur Bewertung der statistischen Signifikanz verwendet. (* P &lt;0,001). Die Fehlerbalken, SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans at

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

observation-quantification-telomere-repetitive-sequences-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

10.3K Aufrufe.  Seoul National University. We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT). 

Serie: Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Forschung

Biologie

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.