The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.

1. Bereiten Sie Cell Culture Filterpatronen für Seeding HIBCPP Zellen in einem Inverted Modellsystem <ol><li> Pre-warmen DMEM / F12 (Ham) mit 5 ug / ml Insulin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 10% fötalem Kälberserum (FCS). </li><li> Verwenden einer sterilen Pinzette 0,33 cm² Wachstumsbereich Zellkulturfiltereinsätze mit einer Porengröße von 3 um den Kopf stellen, in eine 12-Well - Platte (Abbildung 1E). </li><li> Füllmedium in das untere Kompartiment der Zellkulturfiltereinsatz (ca. 3 ml) und 100 &amp; mgr; l auf die Oberseite des Filtereinsatzes. Flood die Platte sowie das untere Fach mit Medium. Absaugen übermäßige Medium derart , daß das untere Fach des Filtereinsatzes bleibt gefüllt (Figur 1E). Hinweis: Es wird empfohlen, eine serologische Pipette für diesen Schritt zu verwenden. </li><li> Abdeckung 12-Well-Platte mit dem Deckel und übertragen die vorbereiteten Zellkulturfiltereinsätze in den Inkubator, 37 ° C,5% CO 2 bis zur Zugabe der Zellen. </li></ol> 2. Kultivierung und Passagierung von HIBCPP Zellen <ol><li> Bereiten DMEM / F12 (Ham), ergänzt mit 5 ug / ml, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 10% FCS. </li><li> Vorwärmen Medium und PBS in einem 37 ° C Wasserbad. Absaugen Medium von Kolben. 10 ml PBS in den Kolben und wirbeln. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. </li><li> 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA in den Kolben und wirbeln. Legen in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Nach etwa 20 Minuten wird der Kolben aus dem Inkubator entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen aus dem Boden des Kolbens abgelöst werden und zeigen eine runde Form, wenn sie mit dem Mikroskop vermessen. Anmerkung: Die Zellen lösen sich nicht vollständig voneinander und werden oft in Agglomerate gefunden. Es wird empfohlen, die Zellen 38 bis Passage zu verwenden. </li><li> So stoppen Sie Trypsinierung 17 ml Medium hinzu. Resuspendieren der Zellen durch Pipettieren auf und ab und übertragen die Aussetzungin einen 50-ml-Tube. Zentrifuge bei 50 × g für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen Medium und die Zellen durch Zählen unter Verwendung eines Hämozytometers. Anmerkung: Die Konzentration der resuspendierten Zellen HIBCPP sollte 1 x 10 6 Zellen / ml sein. Für die Versorgung der Zellen HIBCPP wird vorgeschlagen , eine Menge von 1-6 x 10 6 Zellen in 10 ml Medium zu einem T75-Kolben zu übertragen. Ändern Medium jeden zweiten Tag. </li></ol> 3. Seeding Inverted Zellkulturfilterpatronen mit HIBCPP Zellen <ol><li> Auf der jeweils invertierte Filtereinsatz (dh der unteren Seite des Filters) 80 &amp; mgr; l der Zellsuspension hinzu (dh. 8 x 10 4 Zellen) (1E). Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Zellen gleichmäßig in der Suspension verteilt werden durch das Rohr vor der Aussaat zu invertieren. </li><li> Decken Sie die ausgesäten-Zellkulturfiltereinsätze mit dem Deckel der 12-Well-Platte und den Transfer in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Am ersten Tag, füllen 1 ml Medium in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Heben Sie die Zellkulturfiltereinsätze mit einer Pinzette aus der 12-Well - Platte verwenden, entsorgen Sie das Medium nach innen, drehen Sie die Filtereinsätze und legen Sie sie in der Standard - Orientierung in die vorbereitete 24-Well - Platte (Abbildung 1E). </li><li> jeden zweiten Tag Legen Sie die Zellen in frisches Medium. Bereiten Sie 24-Brunnen mit frischem Medium und übertragen Sie die Filtereinsätze zu. Füllen Einsätze mit 0,5 ml frisches Medium. Überprüfen Sie TEER jeden Tag, wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Wenn TEER-Werte von HIBCPP ausgesät-Zellen auf Zellkultureinsätzen über 70 Ω x cm² (etwa 4 Tage nach dem Aussäen), dann wird der Zellkultur in Medium weiterhin enthaltend 1% FCS und 5 &amp; mgr; g / ml Insulin. Bereiten Platten mit 24 Vertiefungen mit 1 ml Medium für jede Vertiefung. Übertragen Filtereinsätze auf die vorbereiteten Kavitäten und Austauschmedium in der oberen Kammer. Anmerkung: Diese Serumentzug nach Konfluenz führt zur Bildung voneine höhere Membranpotential. </li><li> Absaugen Medium aus dem Filterfach, Transfer zum gut vorbereitet und mit 500 &amp; mgr; l Medium zu füllen. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. Setzen Sie die Zellen über Nacht in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 4. Messung der transepitheliale Elektrischer Widerstand (TEER) <ol><li> Tauchen Sie die Elektrodenspitzen von Epithelgewebe Cell 15 min in 80% Ethanol. Übertragen Cell unter der Haube und lassen Elektrode trocken für einen Moment. Platzieren Elektrode in entsprechende Kulturmedium für die Zellen für weitere 15 min verwendet zu äquilibrieren. </li><li> Messungen durchführen, indem Sie den längeren Arm der Elektrode so, dass sie den Boden der unteren Kammer jedes Mal berührt, stellen Sie den kürzeren Arm in den Filtereinsatz Fach. Hinweis: Die Widerstandswerte von Zellkulturfiltereinsätze ohne Zellen in Medium sollte als Blindwerte verwendet werden ((Messwert (Ω) - Blindwert (Ω)) x FilterOberfläche (dh 0,33 cm²)). </li><li> Ort der Elektrode wieder in 80% Ethanol für 15 min Nach der Messung. An einem trockenen Rohr. </li></ol> 5. Bestimmung der parazelluläre Permeabilität <ol><li> Man löst 1 g FITC-Inulin in 200 ml Kulturmedium mit 5 ug / ml Insulin 1% FCS ergänzt. Anwenden 50 ug / ml der Lösung in das obere Filterabteil vor der Infektion der Zellen. </li><li> Nach der Infektion sammeln Mediumproben aus dem unteren und um zu bestimmen, wie viel Inulin aus der Filterkammer durch die Zellschicht geleitet. </li><li> Bereiten Sie eine FITC-Inulin Standardlösung und führen 1: 2-Verdünnungen, 10-mal (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% und 0%) . Bestimmen Sie Fluoreszenz durch Messung aller Proben in Mikrotiterplatten-Lesegerät. </li></ol> 6. Herstellung von Bakterien zur Infektion von HIBCPP Zellen auf Zellkulturfilterpatronen <ol><li> Einen Tag vor dem Experiment, schaben ter gefroren N. meningitidis - Stämme mit einem Glycerin-Lager und Streifen aus auf Schokolade - Agar mit Vitox ab. Wachsen über Nacht in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Auszug 20-30 Kolonien aus der Nachtkultur und Transfer in ein Röhrchen mit 8 ml Proteosepepton Medium ergänzt mit 0,042% NaHCO 3, 0,01 M MgCl 2 und 1% PolyViteX. </li><li> Schütteln, um die Bakterien für 1,25 Stunden bei 220 rpm, 37 ° C. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 2.684 g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und resuspendieren das Bakterienpellet mit 8 ml serumfreiem Medium. Vortex eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten. </li><li> Zu Kulturdichte bestimmen, wird eine Verdünnung von 1:10 bei einer optischen Dichte (OD) von 600 nm zu messen. Stellen Sie die Bakteriensuspension auf eine OD 600 von 0,1. Hinweis: Diese Suspension ca. enthält. 1 x 10 8 CFU / ml. </li><li> Um die Bakterienzellkonzentration bestätigen, verdünnte die Suspension schrittweise (1:10) bis zu einerVerdünnung von 10 -5 und Platte auf Schokoladen - Agar - Platten. Anmerkung: Ähnliche Verdünnungsreihen durchgeführt werden müssen Bakterienwachstumskurven zu berechnen. </li></ol> 7. Die Infektion von HIBCPP Zellen auf Zellkulturfilterpatronen und Bestimmung der bakteriellen Invasion durch Doppelimmunfluoreszenz <ol><li> Nachdem weiterhin eine epitheliale Gewebe unter Verwendung Cell-Zellkultur in Medium mit 1% FCS und 5 &amp; mgr; g / ml Insulin, täglich Zellen messen. Wenn Zellen, die einen TEER von etwa 500 Ω x cm² erreicht haben, tragen die Infektion aus. </li><li> Infizieren , die Zellen mit der hergestellten Bakteriensuspension bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10. Bewahren die infizierten Zellen in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für den angegebenen Zeitraum. Hinweis: Das MOI kann durch Berücksichtigung der Anzahl der Zellen pro Zellkulturfiltereinsatz bei Konfluenz (1,21 x 10 6 Zellen / cm 2) berechnet werden. </li><li> Stoppen Sie den InfektIons durch dreimal mit 500 &amp; mgr; l serumfreiem Medium (SFM), enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) in die Filterkammer Waschen angewendet, 1 ml zu dem unteren Abteil. </li><li> Blockieren mit 500 ul SFM, das 1% BSA-Puffer in dem Filterfach und 1 ml in der unteren Kammer 20 min bei Raumtemperatur Anhaftung von Antikörpern gegen unspezifische Bindungsstellen zu verhindern. </li><li> Inkubieren mit 100 &amp; mgr; l primärer Antikörper anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) in dem Filterraum und 500 &amp; mgr; l in der unteren Kammer für 20 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss. </li><li> Waschen Sie die Zellen, die durch das Medium aus dem Filterfach Absaugen, übertragen Sie den Filtereinsatz mit einem gut vorbereitet mit 1 ml SFM, die 1% BSA und füllen Sie den entleerten Filterfach mit 500 &amp; mgr; l SFM 1% BSA enthielt. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Fix-Zellen mit 500 ul 4% Formaldehyd in dem Filter compartment, 1 ml in der unteren Kammer für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Zellen, die durch das Medium aus dem Filterfach Absaugen, übertragen Sie den Filtereinsatz mit einem gut vorbereitet mit 1 ml PBS und füllen Sie den entleerten Filterfach mit 500 ul PBS. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. Anmerkung: Die Proben können über Nacht in PBS bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Cut feste Zellkultur filtert der Einsätze aus und waschen mit 250 ul PBS 1% BSA enthält. Inkubiere Zellen für 15 min bei Raumtemperatur mit 250 ul markiertem fluoreszierend (Anregungswellenlänge 594 nm) sekundären Antikörper Huhn-anti-Kaninchen (1: 500), extrazelluläre Bakterien zu färben. Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss. </li><li> Permeabilisieren Zellen mit 250 ul PBS, enthaltend 1% BSA und 0,5% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Zellen dreimal mit 250 ul PBS, das 1% BSA enthält. </li><li> Inkubieren mit 250 &amp; mgr; l primärer Antikörper anti N. meningitidis </em&gt; α-OMP (1: 200) für 30 min extra- und intrazellulären Bakterien zu färben. Waschen Zellen dreimal mit 250 ul PBS, das 1% BSA enthält. </li><li> Anwenden 250 ul fluoreszenzmarkierten (Anregungswellenlänge 488 nm) sekundärer Antikörper (1: 500), gekennzeichnet fluoreszierend (Anregungswellenlänge 660 nm) Phalloidin (1: 250) und 4&#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI) ( 1: 50.000) 1 h lang bei Raumtemperatur zu färben extra- und intrazellulären Bakterien, Aktin-Zytoskelett und Kerne. Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss. </li><li> Waschen Zellen dreimal mit 250 ul PBS, das 1% BSA enthält. Einbetten der Zellen Medium und lagern bei 4 ° C bis zur Untersuchung über Mikroskop bei der Montage. </li><li> Bestimmen Sie Anzahl der Invasion Bakterien pro vordefinierten Feld. Tun Sie dies durch 20 Felder pro Filtermembran zu zählen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Invasion Bakterien. Hinweis: Multiplizieren Sie die mittlere Keimzahl in den 20 mikroskopischen Feldern mit einer Fläche zientient. Das Ergebnis drückt die Menge der gesamten Bakterien in einer 0,33 cm² Zellkulturfiltereinsatz. Diesen Wert durch die Menge der Bakterien in Medien während der Dauer der Infektion gezüchtet. </li></ol>

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USA. 94, 3094-3099 (1997).</li><li>Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+may+be+an+underestimated+site+of+tumor+invasion+to+the+brain:+an+in+vitro+study+using+neuroblastoma+cell+lines.">The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines.</a> Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Epithelzellen des CP bilden die BCSFB, die die CSF aus dem Blut 2,3 trennt. Wir stellten kürzlich die HIBCPP Zelllinie als funktionelles menschliches Modell des BCSFB. Die Zellen zeigen wichtige Barrierefunktionen der BCSFB in vitro, einschließlich der Entwicklung eines hohen Membranpotential, eine geringe Permeabilität für Makromoleküle sowie die Anwesenheit von kontinuierlichen Strängen von TJs 5. Die TJ-Proteine ​​tragen zu einem apikalen / basolateralen Polarität der Zellen. Die Polarität ist von hoher Bedeutung für eine gezielte Lokalisierung von Oberflächenrezeptoren sowie spezifische Transportproteine. Wir haben sowie Mitglieder der ATP-bindenden Kassette (ABC) Transporterfamilie polare Lokalisation der Rezeptoren Ecad und Met gezeigt , die eine stark kontrollierte Mikroumgebung innerhalb des ZNS 6,7 aufrechterhält. Es gibt mehrere Mikroorganismen in der Lage sind den Eintritt in das ZNS zu gewinnen, indem sie die BCSFB überwinden, leading schwere Erkrankung einschließlich Meningitis 8. Einer der Pathogene , die von eindringenden in CP Epithelzellen fähig sind , ist der menschliche spezifische Gram-negative Bakterium N. meningitidis 9,10, die HIBCPP Zellen in einem polaren Art und Weise gezeigt wurde , von der basolateralen Zell Seite 5 speziell einzugeben. Dies ist der physiologisch relevanten Richtung zur Infektion des Gehirns über die BCSFB wenn Bakterien verbreiten und Begegnung epithelialen Zellen CP aus dem Blut im Verlauf von Meningitis. Um diese Situation in vitro reflektiert werden HIBCPP Zellen auf der unteren Seite des Filters angewachsen. Im Gegensatz zu den Standardeinsatz Modellfilter, wo Zellen in der oberen Kammer ausgesät werden, dieser Satz aus einem umgekehrten Kultursystem ermöglicht Epithelzellen spezifisch von der basolateralen Zellseite 5,21 zu infizieren. Basolateralen Invasion in HIBCPP Zellen wurde für die beiden pathogenen N. beobachtet meningitidis </em&gt; Stämme MC58 und MC58siaD -, während die nicht-pathogenen Träger isolieren angezeigt α14 nur marginal Invasion 15. Dies zeigt, dass die HIBCPP Zellmodell die Möglichkeit bietet, zur Verfügung Mutantenbibliotheken für neue Virulenzfaktoren während der Invasion beteiligt zu scannen. Bemerkenswert ist es , dass auch andere Krankheitserreger einschließlich L. nachgewiesen monocytogenes und Streptococcus suis (S. suis) HIBCPP Zellen in einem polaren Art und Weise 5,7 einzudringen. Um eindringende Mikroorganismen in das ZNS, die Epithelzellen des CP exprimieren PRRs 22,23 zu erkennen und darauf zu reagieren. TLRs sind eine wichtige Familie innerhalb der PRRs. Qualitative RT-PCR - Analysen zeigten , dass HIBCPP Zellen mehrere TLR sowie verwandten Co-Rezeptoren und das Adaptermolekül MyD88 15 auszudrücken. Es wurde beobachtet , dass die Rezeptoren TLR2 und TLR4 in der zellulären Abwehrreaktion beteiligt sind N. meningitidis Kapselpolysaccharide 24. Weitere Ergebnisse eines Mikroarrays Ansatz ergab , dass HIBCPP Zellen mit N. infiziert meningitidis eine Induktion von Signaltransduktionswege zeigen, was unter anderem auch den Transkriptionsregulator Einbeziehung IκBζ 15, obligatorisch für die Expression bestimmter Zielgene einschließlich IL - 6 25,26, pro-inflammatorischen Zytokins. Um zu bestätigen diese Ergebnisse, infizierte HIBCPP Zellen mit N. meningitidis in einer umgekehrten Kultursystem benutzt wurden , um die Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen zu untersuchen. Es ist bekannt , daß dieses Verfahren zielt darauf ab , eine Entzündungsreaktion durch Aktivierung des angeborenen Immunsystems 13,14 einzuleiten. HIBCPP Zellen produzieren und Zytokine und Chemokine, einschließlich CXCL1-3, IL6, IL8 und TNFa 15,16, die beschrieben wurden , zu gewinnen Neutrophilen und Monozyten 27 sezernieren. Mit unserem Modellsystem verwendet wirdfestgestellt , dass polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten, Monozyten und auch T - Lymphozyten wandern durch HIBCPP Zellen 16,28 und betonte , dass HIBCPP Zellen für die Entschlüsselung Mechanismen der transepithelialen Migration von Immunzellen geeignet sind. Die hier vorgestellten Modellsystem bietet auch die Möglichkeit für Änderungen. HIBCPP Zellen können mit Antikörpern oder chemischen Inhibitoren vorbehandelt werden, Rezeptoren zu identifizieren und Signalwege Transduktion bei der Infektion beteiligt sind. DMSO, ein gemeinsames Lösungsmittel für zellstimulierenden Reagenzien können in geeigneten Mengen zu den HIBCPP Zellen, die Funktionen stabile Barriere Anzeige angelegt werden, die nicht durch die chemische im gesamten untersuchten Zeitverlauf beeinflusst. Diese Eigenschaft ist auch relevant für die Verwendung des Modells in pharmazeutischen Studien. Obwohl wir , dass HIBCPP Zellen einen gewissen Grad an Polarität zeigen unter Beweis gestellt haben, werden sie natürlich nicht jedes einzelne Detail eines in - vivo - Modell reflektieren. &lt;em&gt; zB die Lokalisation von ABC - Transporter Familienmitglieder entspricht nur zum Teil die erwarteten Muster 6, warum pharmazeutische Anwendungen können sich wahrscheinlich nur in eingeschränktem Umfang angewendet werden. Auch scheinen die HIBCPP Zellen nicht CSF (Daten nicht gezeigt) zu erzeugen. Trotzdem haben wir festgestellt , dass HIBCPP Zellen , die Proteine ​​Transthyretin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 2 (IGF2) und forkhead box J1 (FOXJ1) auf RNA - Ebene 5, exprimieren , die 29,30,31,32 charakteristische Markerproteine ​​für CP Epithelzellen . Diese Beobachtung unterstützt, dass HIBCPP Zellen typische Eigenschaften von CP Epithelzellen beibehalten haben. Wichtig ist, darauf hinzuweisen, dass HIBCPP Zellen nicht vorhanden Kontakthemmung tun. Es ist daher entscheidend, um die Zellen für Experimente zu verwenden, wenn entsprechende TEER-Werte erreicht werden. Darüber hinaus sollte die HIBCPP Zellen nicht über Durchgang 38, da das Potential verwendet werden, um eine Sperrfunktion zu entwickeln scheint mit höheren Durchgänge fallen. Schließlich studieren die impAkt der Zell-Zell-Interaktionen bei Infektionen an der BCSFB eine Co-Kultur-Modell CP epithelialen und endothelialen bestehend wäre von großem Interesse sein, aber ein solches Modell muss noch weiterentwickelt werden. Abschließend kann die HIBCPP Zellkulturmodell verwendet werden, um Schlüssel Invasion Wege und die zugrunde liegenden Signalwege, insbesondere von menschlichen spezifischen Krankheitserreger an der BCSFB offenbaren. Da bekannt ist , dass die Epithelzellen des CP sind auch bei neurologischen degenerativen Erkrankungen wie Alzheimer - Erkrankung sowie Multiple - Sklerose - 2 beteiligt, und auch in Gehirn Metastasierung von Tumorzellen 33, bietet das System im Allgemeinen eine große Vielfalt an Möglichkeiten zur Untersuchung von krankheitsbezogenen Mechanismen und bietet das Potenzial, neue therapeutische Targets zu finden.

Die Blut-Liquor - Schranke (BCSFB) ist einer der drei Sperrstellen zwischen Blut und Gehirn 1. Seine morphologische Korrelat sind die Epithelzellen des Plexus (CP) 2,3, eine endotheliale-epithelialen Konvolut, das in den Ventrikeln des Gehirns stark gefäß und befindet. Der CP dient der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), sowie zur Trennung der letzteren aus dem Blut zu erzeugen. Um die Barrierefunktion, die CP - Epithelzellen zeigen eine geringe pinozytotische Aktivität exprimieren spezifische Transporter und sind dicht verbunden durch ein kontinuierliches Netzwerk von Tight Junctions (TJs) 2,3 zu erreichen. Menschliche Plexuspapillom (HIBCPP) Zellen, abgeleitet von einem bösartigen Plexuspapillom einer japanischen Frau 4, wurden verwendet , um einen funktionellen in vitro - Modell des BCSFB zu konstruieren. HIBCPP Zellen zeigen einige Eigenschaften eines funktions BCSFB wie die Bildung von TJStränge, die Entwicklung eines hohen transepithelialen Membranpotential, die als transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) und kleinere Permeabilitäten für Makromoleküle bestimmt werden kann. Darüber hinaus exprimieren HIBCPP Zellen charakteristische Transporter, die die ionische Mikro regulieren dienen können, und apikal / basolateralen Polarität 5,6,7 zeigen. Die BCSFB wurde für Krankheitserreger (Bakterien, Viren und Pilze) in das zentrale Nervensystem (ZNS) 8 als Eintrittsstelle dargestellt funktionieren. Die Invasion von Krankheitserregern, einschließlich Neisseria meningitidis (N. meningitidis), ein gramnegative Bakterium, können schwere Krankheiten wie Meningitis verursachen. Der Nachweis , dass sie die Schutz epitheliale Barriere des CP überwindet , ist von histopathologischen Beobachtungen bei Patienten unterstützt mit Meningokokken - Erkrankung in den Gefäßen erhöhte Mengen an Meningokokken aufweisen und CP Epithelzellen 9,10. Um sich den Eintritt in die Wirtszellen bacteria fallen oft endozytotischen Mechanismen, die vermittelt werden, oder ausgelöst durch spezifische Oberflächenrezeptoren auf den Wirtszellen. Da Interaktionen von Pathogenen mit diesen Rezeptoren Spezies sein können spezifische 11, Tiermodelle können nur in beschränktem Umfang zu Rate gezogen werden. Die HIBCPP Zelllinie bietet die Möglichkeit, den Invasionsprozess sowie die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen im menschlichen Modellsystem zu studieren. Zellkultur-Einsätze Einsatz ermöglicht es uns, aus zwei verschiedenen Zellseiten Interaktionen von Pathogenen mit Wirtszellen zu analysieren. Viele Bakterien, einschließlich N. meningitidis, sind die Auswirkungen der Schwerkraft während der Infektion Assays stark unterworfen. Für eine optimale Wechselwirkung der Pathogene mit den HIBCPP Zellen während des Assays werden die Bakterien zunächst in das obere Kompartiment der Zellkulturfiltereinsatz System hinzugefügt. Zur Infektion von der apikalen oder der basolateralen Zellenseite ermöglichen jeweils zwei Varianten der in vitro - System gewesen ESTAblished: Im Standardsystem HIBCPP Zellen der oberen Kammer des Filtereinsatzes ausgesät, imitiert die Situation , wenn Mikroorganismen auf der CSF-Seite angeordnet sind und in Kontakt mit der apikalen Seite der Zellen (1A, C) erhalten. Im Gegensatz dazu spiegelt unter Verwendung der HIBCPP Zellen in einer umgekehrten Zellkulturfiltereinsatz System die Bedingungen, wenn Bakterien in den Blutstrom eingegeben haben. Mikroorganismen Verbreitung im Blut und Begegnung CP Epithelzellen aus der basolateralen Seite (1B, D). Bemerkenswert ist es in diesem Modellsystem wurde gezeigt , daß Bakterien eindringen HIBCPP Zellen in einem polaren Mode gezielt von der basolateralen Zellenseite 5,7. Anschließend auf eine Infektion des CP können die Invasion von Krankheitserregern des angeborenen Immunsystems durch Ligation an Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) erkannt werden. Nun beschriebenen Mitglieder der PRRs gehören zu den Toll-like Rezeptor (TLR) -Familie. TLRs kann bind charakteristische Strukturen von infektiösen Mikroorganismen, die genannte pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) sind. Ligierung der Rezeptoren führt zur Aktivierung von Wirtszellsignalkaskaden , die Expression auslösen von Zytokinen und Chemokinen 12, die wiederum Transmigration von Immunzellen über den BCSFB 13,14 stimulieren. Es hat sich gezeigt , dass HIBCPP Zellen mehrere TLR auf mRNA - Ebene und , dass eine Infektion mit N. ausdrücken meningitidis resultiert in der Sekretion von mehreren Cytokinen und Chemokinen, einschließlich CXCL1-3, IL6, IL8 und TNFa 15,16. Hier beschreiben wir Kultivierung und Infektion der menschlichen Zelllinie HIBCPP in einer umgekehrten Zellkultureinsatz System, das die BCSFB nachahmt. Dieses Modellsystem ermöglicht Interaktionen von Pathogenen mit der in vivo relevant basolateralen Zellenseite sowie die nachfolgende zelluläre Antwort zu studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#180;,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-well plates</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well plates</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti Neisseria meningitidis &#945;-OMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of W&#252;rzburg, Germany)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 660 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>12659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chocolate agar plates</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>43109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-Inulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>19278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS + Mg +Ca</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvitex</td>
			<td>Biomerieux</td>
			<td>55651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteose peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10902-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture flask 75 cm&#178; red cap sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERSSTX00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a choroid plexus epithelial cell-based model of the human blood-cerebrospinal fluid barrier to study bacterial infection from the basolateral side

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.

Hier beschreiben wir die Kultivierung und Infektion von HIBCPP Zellen in einer umgekehrten Zellkultureinsatz System. Dieses Modell ermöglicht es uns Invasionsmechanismen und die zugrunde liegenden molekularen Signalwege von der basolateralen Zellseite zu studieren, eine physiologische Situation von Bakterien reproduzieren Verbreitung und Epithelzellen über den Blutstrom (Abbildung 1) eingeben. Die HIBCPP Zellen zeigen gewisse Barrierefunktionen, die es ihnen ermöglichen molekularen Austausch auf ein minimales Niveau zu beschränken. Dies wird durch die Expression von adherens junction (AJ) und Tight junction (TJ) Proteine ​​erreicht. Immunofluoreszenz - Analyse der TJ-assoziierten Proteinen Occludin, Claudin und ZO-1 ergab ein ununterbrochenes Signal an den Stellen der Zell-Zell - Kontakt, was zeigt , dass die Zellen durch kontinuierliche Stränge TJs (2A, B, C) ​​miteinander verbunden sind. Eine detaillierte Eindruck von ter TJ Morphologie wurde durch Übertragung (2D) und Gefrierbruch - Elektronenmikroskopie (Abbildung 2E) erhalten, was zeigt , dass TJs zwischen den Zellen angeordnet sind und bilden breite, vermaschten kabelartigen Strukturen. TJs von Epithelzellen wirken auch als Zaun apikalen und basolateralen Membrandomänen zu trennen, damit die zelluläre Polarität beitragen. Unter den Proteinen, die ausschließlich auf der basolateralen Zellseite HIBCPP Zellen exprimiert werden, sind die AJ - Protein E-Cadherin (Ecad) und Hepatozyten - Wachstumsfaktor - Rezeptor (HGF ​​/ Met) als 3 durch Immunofluoreszenz - Analyse gezeigt wird , um eine Zeige gewisses Maß an Polarität. Wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert HIBCPP Zellen weisen auch typischen Barrierefunktionen der BCSFB wie Bildung eines Membranpotentials sowie eine geringe Durchlässigkeit für macromolecules. Bestimmung der Membranpotentials kann durch Messung des TEER mit der Verwendung eines Cell erreicht werden. Die Durchlässigkeit der Zellschicht durch Anwendung von FITC-markiertem Inulin, einem Zucker quantifiziert, die die Schicht in einem parazellulären Mode übergeht. Hier zeigen wir Ergebnisse einer repräsentativen Experiment, das zeigt, dass diese Barrierefunktionen bleiben stabil und zeigen keine Neigung von Standard-Konzentrationen von Dimethylsulfoxid (DMSO), einem gemeinsamen Lösungsmittel für zellstimulierende Chemikalien. Wie in 4A zu sehen ist, wurden TEER - Werte vor und nach der Exposition der Zellen zu HIBCPP DMSO aufgezeichnet. Die Zellen zeigten eine hohe Membranpotential, die für alle Bedingungen zu Beginn des Experiments bis etwa 500 Ω x cm² erreicht werden. Die gemessene TEER nicht für Zellen nach 2 Stunden ändern mit bis zu 0,2 Vol% DMSO behandelt. Im Gegensatz dazu verringerte TEER-Werte in einer dosisabhängigen Weise when höhere Volumina (4A) angewendet wurden. Diese Verringerung der Membranpotential war gleichzeitig mit einer erhöhten Permeabilität für Makromoleküle. Während die Zugabe von DMSO zu HIBCPP Zellen bis zu 0,5 Vol-% nicht in einer Permeabilität für Inulin Anstieg geführt haben, 1 vol% bis 2 vol% zeigte einen Effekt, wenn auch in einem begrenzten Ausmaß (4B). Weiterhin überprüften wir den Einfluss von Cytochalasin D, ein potenter Inhibitor der Aktin-Polymerisation, auf das Membranpotential und die Permeabilität von HIBCPP Zellen. Behandlung der Zellen mit 1 &amp; mgr; g / ml Cytochalasin D bewirkt einen deutlichen Abfall der TEER - Werte sowie eine Erhöhung der FITC-Inulin Flußmittel (4A, B). Dieser Effekt kann durch Cytochalasin D., die durch die Öffnung der TJs erklärt werden Die HIBCPP Zelllinie als Modell des BCSFB kann zu studieren Interaktionen von Pathogenen verwendet werden und die Barriere bildenden Epithelzellen. Es gibt Beweisedass das Bakterium N. meningitidis gewinnt den Eintritt in das ZNS durch die BCSFB Kreuzung. Es hat sich gezeigt , daß Neisseria HIBCPP Zellen von der basolateralen Seite Zelle spezifisch eindringen, die in vivo relevant ist. Während dieses Prozesses spielt die bakterielle Kapsel eine wichtige Rolle: Kapsel fehlt Mutanten zeigen eine erhöhte Invasion in HIBCPP Zellen 5. Im Folgenden werden wir basolateralen Invasion der MC58 - Stamm 17, seine isogene Mutante MC58siaD verglichen - defizienten für die Kapselproduktion 17 und dem nicht eingekapselten Träger isolieren α14 19,20. HIBCPP Zellen wurden mit den Stämmen infiziert oben erwähnt über einen zeitlichen Verlauf von 4 Stunden bei einer MOI von 10. Immunofluoreszenz - Analyse ergab signifikante invasion für die beiden pathogenen Stämmen MC58 und MC58siaD -, wohingegen nur geringe Invasion Raten für die apathogenen α14 Stamm beobachtet wurden ( 5A). Ein repräsentatives Bild des Doppel immunofluFluoreszenz - Mikroskopie von HIBCPP Zellen mit dem jeweiligen Stamm infiziert ist in 5A, B und C gezeigt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54061/54061fig1.jpg" /> Abb . 1: Standard and Inverted Zellkultur in einem Standardzellkultursystems (A, C) Interaktion von Bakterien mit den CP Epithelzellen an der apikalen Zellseite untersucht werden, die von Mikrovilli angedeutet ist. Das invertierte Zellkultursystems (B, D) ermöglicht es uns , bakterielle Wechselwirkung mit der basolateralen Zellmembran zu untersuchen, die während einer bakteriellen Invasion über den Blutstrom in das ZNS beteiligt ist. Für das invertierte Zellkultur (E) HIBCPP Zellen werden auf der Bodenseite der Filtereinsätze beimpft. Die untere und einschließlich der inneren Kammer des Filtereinsatzes sind mit Medium geflutet. Subsequhängig wird die übermäßige Medium so angesaugt, daß der Innenraum des Filtereinsatzes gefüllt bleibt. Am ersten Tag nach dem Aussäen Zellkulturfiltereinsätze werden umgedreht und mit Medium gefüllt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54061/54061fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54061/54061fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54061/54061fig2.jpg" /> Abbildung 2:. HIBCPP Zellen anzeigen Kontinuierliche Strands von TJs Die TJ - Proteine ​​ZO-1 (A), Occludin (B) und Claudin-1 (C) wurden in HIBCPP Zellen nachgewiesen. Panels AC zeigen Apotome Bilder. Mitte jeder Platte: xy en face Ansicht der Zellen; oben und rechts: Querschnitte mehrerer optischer Schnitte durch das z -Ebene. Maßstabsbalken zeigen 10 &amp; mgr; m. Die TJ Struktur von HIBCPP Zellen wurde durch Übertra analysiertsion Elektronenmikroskopie. Zellen sind miteinander verbunden durch TJs, die durch die Pfeile (D) angegeben sind. Der Maßstab zeigt 1 um. Gefrierbruch - Elektronenmikroskopie Studien visualisieren engmaschiges TJ - Stränge (E). Der Maßstabsbalken = 0,5 um. Die Bilder in dieser Figur wurden ursprünglich in Schwerk veröffentlicht et al, PLoS One 7: e30069, doi:. 10.1371 / journal.pone.0030069 (2012); Re-Print mit freundlicher Genehmigung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54061/54061fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54061/54061fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54061/54061fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die Expression von Rezeptorproteinen beteiligt Während Invasion von Bakterien in HIBCPP Zellen Immunfluoreszenz - Analyse zeigt die Expression von Ecad (A) und Met (B) an der basolateralen Zellseite.. Die pictures zeigen Apotome Bilder. Mitte jeder Platte: xy en face Ansicht der Zellen; oben und rechts: Querschnitt mehrerer optischer Schnitte durch das z -Ebene. Der apikalen Membran der HIBCPP Zellen (durch Pfeile angedeutet) wird in Richtung der Oberseite des Oberteils als auch gegenüber der rechten Seite der rechten Seite positioniert ist, jeweils eines jeden Rahmens. Maßstabsbalken = 10 um. Die Daten in dieser Figur wurden auch vorher in Gründler et al, Microbes Infect 15: 291-301, doi:.. 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); Re-Print mit freundlicher Genehmigung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54061/54061fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54061/54061fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54061/54061fig4.jpg" /> Abbildung 4: Einfluss von DMSO und Cytochalasin D auf Barrierefunktion HIBCPP Zellen Auswirkungen auf die Barriere - Funk.tion werden durch Messung der TEER-Werte und FITC-Inulin-Flux bestimmt. Ergebnisse werden für ein repräsentatives Experiment gezeigt, die in dreifacher Ausführung durchgeführt wurde. HIBCPP Zellen wurden mit DMSO sowie Cytochlalasin D in den angegebenen Mengen für 2 Stunden behandelt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54061/54061fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54061/54061fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Wenn sie in Konzentrationen bis zu 0,2 Vol-% aufgetragen, DMSO hat keine Auswirkung auf das Membranpotential (4A). Konzentrationen im Bereich von 0,1 vol% bis 0,5 vol% des DMSO beeinflussen auch nicht parazelluläre Permeabilität der Zellen (4B). Im Gegensatz, 1 &amp; mgr; g / ml Cytochalasin D verursacht eine Abnahme in TEER gleichzeitig mit einem Anstieg in FITC-Inulin-Flux durch die Zellschicht (4A, B). <img alt="Abbildung 5" src = &quot;/ files / ftp_upload / 54061 / 54061fig5.jpg&quot; /&gt; Abbildung 5: Invasion von N. meningitidis in HIBCPP Zellen. Doppelimmunfluoreszenzmikroskopie zeigt eingedrungen (grün) und verklebt (gelb) Bakterien. Weiße Kästen innerhalb von Bildern repräsentieren den vergrößerten Bildausschnitt auf der rechten Seite. Basolateralen Invasion wurde für die N. beobachtet MC58 meningitidis - Stämme (A) und MC58siaD -, mangelhaft für die Kapselproduktion (B), während nur eine geringe Invasion Rate für α14 (C) bestimmt. Das Diagramm zeigt , dass die Invasion Raten von MC58 und MC58siaD - von großer Bedeutung sind , wenn sie im Vergleich zu α14 (**, p &lt;0,01). Extreme Bedeutung wird angezeigt, wenn MC58 oder MC58siaD - jeweils mit α14 verglichen wurden (***, p &lt;0,001) und MC58siaD - wurde im Vergleich zu MC58 (###, p &lt;0,001). Maßstabsbalken indicate 10 um. . Das Diagramm in D wurde ursprünglich in Borkowski veröffentlicht et al, J Neuroinflammation 11: 163, doi: 10.1186 / s12974-014-0163-x (2014); Re-Print mit freundlicher Genehmigung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54061/54061fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54061/54061fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

Ein Choroidplexus Epithelial Zell-basierte Modell des menschlichen Blut-Liquor-Schranke Bakterielle Infektion von der basolateralen Seite zu studieren

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

a-choroid-plexus-epithelial-cell-based-model-human-blood

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

14.1K Aufrufe.  Heidelberg University. The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

Serie: A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Forschung

Medizin

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

Mit Hilfe Transkranielle Magnetstimulation auf die menschliche neuromuskuläre System zu studieren

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

Menschliche Arteria mammaria interna (IMA) Transplantation und Stenting: A Human Model um die Entwicklung von In-Stent Restenose Studie

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

A Human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Atherosklerotischen Plaque Modell zur Läsion Biologie studieren

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Mit Saccadometry mit Deep Brain Stimulation Normale und Pathologische Funktion des Gehirns zu studieren

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic differentiation and immune function of the genetically modified cells. The humanized Bone-marrow/Liver/Thymus (BLT) mouse model allows for full reconstitution of a human immune system in the periphery, which includes T cells, B cells, NK cells and monocytes. The human thymic implant also allows for thymic selection of T cells in autologous thymic tissue. In addition to the study of HIV infection, the model stands as a powerful tool to study differentiation, development and functionality of cells derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Here we outline the construction of humanized non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient (SCID)-common gamma chain knockout (c&#947;-/-)-Bone-marrow/Liver/Thymus (NSG-BLT) mice with HSCs transduced with CD4 chimeric antigen receptor (CD4CAR) lentivirus vector. We show that the CD4CAR HSCs can successfully differentiate into multiple lineages and have anti-HIV activity. The goal of the study is to demonstrate the use of NSG-BLT mouse model as an in vivo model for engineered immunity against HIV. It is worth noting that, because lentivirus and human tissue is used, experiments and surgeries should be performed in a Class II biosafety cabinet in a Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+) facility.

This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.

Stammzellen Basierend Engineered Immunität gegen HIV-Infektion in der humanisierten Maus-Modell

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...