Einige der Figuren in diesem Manuskript wurden großzügig durch das Labor von Bart O. Williams zur Verfügung gestellt. Die Autoren werden vom National Cancer Institute gewährt U54CA143803, CA163124, CA093900 UND CA143055 unterstützt.

Dieses Protokoll erfüllt und folgt den Richtlinien festgelegt von der Johns Hopkins University Institutional Animal Care und Use Committee. 1. Mikro-Dissektion einer Maus Prostata <ol><li> Euthanize die Maus durch Erstickung mit Kohlendioxid oder einem alternativen genehmigten Verfahren in Einklang mit den institutionellen Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung. </li><li> Pin der Maus in Rückenlage auf eine Dissektion Bord durch einen Stift, der durch jede der vier Pfoten setzen. </li><li> Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. </li><li> Halten Sie die Haut des Unterleibs mit einer Pinzette, und mit einer Schere durch die Haut zu schneiden und ca. 1 cm vor der Öffnung des Penis, vorsichtig, nicht zu schneiden alle Organe Bauchfell. </li><li> Schneiden Sie die Haut und Bauchfell von den unteren Bauch weg, bis beide Seiten des Bauches auf den Brustkorb, die Bauchhöhle ausgesetzt wird. </li><li> Identifizieren Sie die Blase und Urogenitaltrakt, und setzen sie durch leichtes Fett und andere Organe zur Seite bewegt. </li><li> Using Pinzette greifen die Samenleiter an der Basis in der Nähe der Harnröhre, und reißen sie weg. </li><li> Wiederholen Sie mit den gegenüberliegenden Samenleiter. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig in die Blase Griff und nach oben ziehen, während gleichzeitig der Schere unter der Blase und ventralen Prostata (ungefähr 1 cm unterhalb der Basis der Blase) durch die Harnröhre zu schneiden. Hinweis: Da die Blase nach oben gezogen wird, die gesamte Urogenitaltrakts (mit Blase, einen Abschnitt der Harnröhre, alle Prostatalappen und den Samenbläschen) mit ihm kommen. Es kann eine gewisse Resistenz sein. </li><li> Platzieren Sie den Urogenitaltrakt (UGT) in eine 60-100 mm Petrischale, die etwa 5-10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Führen Sie den verbleibenden Teil des Protokolls unter einem Präpariermikroskop. Verwenden Sie zwei feinen Pinzette, eine in jeder Hand. Halten Sie die Zange &quot;wie ein Bleistift&quot; und die Unterarme auf der Tischplatte ruhen, um sie zu beruhigen. </li><li> Verwenden feinen Pinzette die UGT so zu positionieren, dass die Blaseoben, wird die Harnröhre nach unten gerichtet, und die Samenbläschen sind auf beiden Seiten der Harnblase angeordnet. </li><li> Fassen Sie die Harnröhre mit einer Zange und ziehen Sie sie vorsichtig Fett weg mit den anderen Zange, ohne Prostatagewebe Abreißen. Hinweis: Fat &quot;glänzend&quot; in Bezug auf das umgebende Gewebe erscheint. </li><li> Sobald das Fett entfernt worden ist, Pinzette das Bindegewebe zwischen den beiden ventralen Lappen der Prostata und trennen sie zu zerreißen. </li><li> Um einen der Bauchlappen entfernen, verwenden Sie eine Zange zum Greifen eines einzigen Bauchlappen in der Nähe der Spitze, und verwenden Sie die andere Zange zu greifen, daß Lappen an der Basis so nah an der Harnröhre wie möglich. Während noch die Basis des Lappens Greif, verwenden Sie die andere Zange die Harnröhre zu greifen. Ziehen Sie den Lappen weg von der Harnröhre mit einer festen, glatten Bewegung. Achten Sie darauf, kein Prostatagewebe bleibt an der Harnröhre befestigt. Platzieren Sie den Lappen in dem geeigneten Medium, in Abhängigkeit von der nächsten Versuchsstufe. <ol><li> Um dies zu beheben und in Paraffin eingebettet werden, die sausreichend für die histologische Analyse, setzen Sie den Lappen in 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) 8. </li><li> Platzieren Sie den Lappen in Gefriermedium, wie OAT für die Kryokonservierung und sectioning 8. </li><li> Platzieren Sie den Lappen in kaltem PBS für Einzelzellisolierung für Kultur oder Durchflusszytometrie 9. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.15 mit der anderen Bauchlappen. </li><li> Um einen der Vorderlappen zu entfernen, verwenden Pinzette vorsichtig auf die Lappen ziehen weg von der Samenblase, so dass Sie sicher, dass nicht die Samenblase zu durchstechen. Sobald der Lappen unabhängig von der Samenblase, entfernen Sie sie in der gleichen Weise wie die Bauchlappen in Schritt 1.15. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.17 mit dem anderen Vorderlappen. </li><li> Klappen Sie den restlichen Urogenitaltrakt über, so dass die Rücken Prostata sichtbar ist. </li><li> Um einen der dorsolateralen Lappen entfernen, Zangen verwenden das Bindegewebe zwischen den beiden dorsolateralen Lappen und auch das Bindegewebe zwischen den Lappen und t zu reißener posterioren Bereich der Samenblasen. Entfernen Sie die Lappen in ähnlicher Weise wie die Bauchlappen in Schritt 1.15. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.20 mit dem anderen dorsolateralen Lappens. </li></ol> 2. Chirurgische Kastration Hinweis: Dies ist ein Überleben der Operation, so asepsis, Anästhesie und Schmerztherapie sind wichtig, um die ethischen und erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls. Folgen Sie alle institutionellen Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung. Eine externe Wärmequelle, wie beispielsweise einem rezirkulierenden Wasserdecke, während des chirurgischen Eingriffs Hypothermie zu verhindern. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt. Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor dem Gebrauch in der Chirurgie. <ol><li> Auf einem sauberen, sterilen Oberfläche der Maus durch geeignete Maßnahmen (zB 2% inhaliert Isofluran) betäuben und die Position mOuse in Rückenlage. Hinweis: Alternative Anästhesieverfahren, wie Ketamin, kann auch verwendet werden, abhängig von dem zugelassenen Tier Protokoll. </li><li> Überprüfen Sie die Reflexe der Maus durch die Zehen einklemmen. Wenn die Maus nicht reagiert, gehen Sie zum nächsten Schritt. Wenn es nicht reagiert, warten 1-3 min und erneut prüfen. Rasieren Sie den OP-Bereich mit einem elektrischen Rasierer. </li><li> Aseptisch bereiten den Bauch der Maus durch die institutionellen Tierärzten oder IACUC empfohlen scheuert von 70% Ethanol und Jod oder Verfahren anwenden abwechseln. </li><li> Mit einem sterilen Skalpell, machen Sie eine 1 cm vertikalen Schnitt durch die Haut in der Mittellinie der Unterbauch, ca. 1,5 cm vor den Penis. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt (&lt;1 cm) durch das Peritoneum, vorsichtig keine Organe zu schneiden. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette, greifen die Schnittkante des Peritoneum und heben Sie sie vorsichtig nach oben so in der Lage sein, unter die Bauchhöhle zu sehen. </li><li> Unter Verwendung eines anderen sterilen Zange greifen in the Peritonealhöhle und Griff entweder die linke oder rechte Hodenfettpolster, lateral in die Blase. Ziehen Sie die Fettpolster durch die Öffnung in das Peritoneum und die Haut, bis die Hoden als auch herauskommt. Seien Sie nicht vorsichtig alle anderen Geweben oder Organen bei diesem Schritt zu verletzen. </li><li> Mit einem Kauter Stift, schneiden durch die Fettpolster, die die Hoden hält. Schneiden Sie langsam durch die Hodenarterie mit dem Kauter Stift Hinweis: Wenn die Hodenarterie zu schnell geschnitten wird, kann es zu viel Blutungen und die Maus kann eingeschläfert werden. </li><li> Sobald die Fettpolster und Arterie geschnitten werden, entfernen Sie den Hoden und Fettpolster. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,6-2,9 mit dem anderen Hoden. Hinweis: Ein alternatives Verfahren zur Entfernung der Hoden ligieren die Hodenarterie operativ ist, worauf das Schiff mit einer Schere schneiden. </li><li> Vernähen das Peritoneum mit resorbierbaren Naht verschlossen. </li><li> Staple die Haut geschlossen mit chirurgischen Wundklammern. </li><li> Verwalten Sie eine analgetische Schmerzen zu verwalten, und Platzdie Maus in einem sauberen Käfig auf einem Käfig Wärmer für 5-10 min. Überwachen Sie die Maus auf Anzeichen von Schmerzen oder Blutungen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Prostate Mikrodissektion ermöglicht lappen spezifische Experimente und die Analyse der Maus Prostata (Abbildung 1). In gentechnisch veränderten Maus-Modellen, in einem Lappen kann Phänotypen gesehen, die nicht in anderen gesehen wird. Auch für die histologische Analyse, versichert dieses Protokoll, dass die maximale Menge an reinem Prostatagewebe kann, ohne andere Urogenitaltrakt Gewebe in dem Abschnitt geschnitten und gefärbt werden. Schließlich ist für Single-Cell-Experimente ermöglicht dieses Protokoll für die Isolierung von fast reinen Prostatazellen. Epithelial Zellanreicherung Kits können weiter Prostatazellen von Stromazellen zu reinigen. Einschränkungen bei der Mikro-Dissektion schließen die Verwendung eines Präpariermikroskop, und die Lernkurve notwendig feinen Pinzette zu verwenden, während er durch das Aufschneiden Mikroskop. Alternativ kann Prostatagewebe für die Histologie als Teil des UGT geschnitten werden, Mikrodissektion überflüssig macht. Doch der Nachteil die gesamte UGT sectioning ist, dassandere Gewebe wird in dem Abschnitt vorhanden sein, ist es nicht so sauber zu machen. Darüber hinaus ist für einzelne Prostatazellpopulationen zu erzeugen, müssen die Lappen von der UGT getrennt werden Kontamination zu vermeiden. Chirurgische Kastration ist eine grundlegende Operation für viele Prostata-Forschungslabors und ist für die Studie über die Auswirkungen von Testosteron auf Prostata-Entwicklung und Krankheit wesentlich. Dieses Protokoll ist schnell (typische Zeit der Operation für einen erfahrenen Benutzer ist ca. 5 min) und entfernt fast 100% des Testosterons aus dem Verkehr (Abbildung 3). Zu beachten ist , unterscheiden sich signifikant in Mäusen Testosteronspiegel und 10 um so viel wie das 30-fache von Maus zu Maus variieren. Die Kastration beseitigt diese Variation. Im Anschluss an die Kastration können Forscher entscheiden Testosteron zurück in hinzufügen , um die Prostata (Abbildungen 3-4) zu regenerieren. Dies kann durch subkutane Implantieren einer Quelle von Testosteron, wie beispielsweise eine osmotische Pumpe, einem Testosteron geschehenPellets oder eine semipermeable Silastic Röhre Testosteron Pulver enthaltend 8. In Abhängigkeit von der Menge an Testosteron zugegeben, kann dieses Verfahren physiologischen liefern zu Testosteronspiegel in dem Kreislauf (Figur 3) superphysiological. Dieses Protokoll kann auch Prostata - Zelllinie verwendet werden und Biologie Stammzellen 11 zu studieren. Eine andere Möglichkeit ist die chemische Kastration oder Androgenentzugtherapie, über die Behandlung von Mäusen mit Verbindungen, die die Produktion von Testosteron, wie dutasteride 12 hemmen. Dies ahmt auch eine gemeinsame Behandlung von Patienten mit Prostatakrebs, die selten chirurgisch kastriert werden. Jedoch stellt chirurgische Kastration eine zuverlässige, dauerhafte Methode zur Entfernung von praktisch allen Testosteron. Es ist wichtig, zu berücksichtigen, dass die Nebennieren auch androgen-Arten, wie Androstendion und Dehydroepiandrosteron, synthetisieren, die in Testosteron umgewandelt werden können, wenn auch in viel kleineren Mengen, bezogen auf den Hoden13. In einigen Fällen können die Nebennieren auch chirurgisch entfernt werden, obwohl dieses Verfahren ist schwieriger. Insgesamt sind diese beiden Protokolle für eine Vielzahl von Forschung in Prostataerkrankungen nützlich, sowie hormonellen Studien. Diese Protokolle sind eine zuverlässige und konsistente Weise Prostata Biologie in hormonell normal, kastriert oder hormonell regenerierten Bedingungen zu analysieren.

Die Prostata ist die häufigste Stelle von Krebs bei Männern in den USA. Fast 220.000 Menschen jedes Jahr wird mit Prostatakrebs diagnostiziert und etwa 27.000 Menschen werden auf ihre Krankheit 1 erliegen. Männer haben eine 1 in 7 Lebensdauer Risiko einer Prostatakrebsdiagnose in den USA 1. Benigner Prostatahyperplasie (BPH), eine altersbedingte noncancerous Vergrößerung der Prostata, ist ebenfalls ein weitverbreiteter Zustand, beeinflussen über 80% der Männer über 80 2. Als solche kann die Prostata ist im Mittelpunkt der Beträchtliche Forschung. Mausmodelle wurden weitgehend zu studieren Erkrankungen der Prostata 3 verwendet. Insgesamt ist die Maus Prostata eine ausgezeichnete Vertreter der menschlichen gland 4, aber es gibt Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Maus und menschlichen Prostata Anatomie und Physiologie 5. Bei beiden Arten wird die Prostata an der Basis der Blase, umgibt die Harnröhre entfernt. Die menschliche Prostata ist eine einzige losein, aufgeteilt in vier Zonen: zentral, Übergang, periphere und vordere fibromuskuläre Stroma. Im Gegensatz dazu besteht die Maus Prostata von drei gekoppelten Lappen an verschiedenen Positionen um die Harnröhre: vordere, ventralen und dorsolateralen. Auf zellulärer Ebene ist der Hauptunterschied , dass die basalen Zelle luminalen Zellverhältnis in menschlichen etwa 1: 1, aber es beträgt 1: 4 in Mäusen 6. Die murine Stroma unterscheidet sich auch bei Mäusen auf den Menschen - Menschen weitergehende glatte Muskulatur haben, während die Muskelschicht viel dünner in murinen Prostata ist. Die richtige Identifizierung, Präparation und Handhabung der Maus Prostata sind unerlässlich, um Maus Prostata Forschung. Hormonspiegel beeinflussen stark die Entwicklung und die Homöostase der Prostata in Menschen und Mäusen. Während Östrogen 7 eine Rolle bei Prostata - Entwicklung zu spielen scheint, ist das wichtigste Hormon , das in der Prostata Testosteron. Testosteron ist für Drüsenentwicklung eind Wartung. Im Anschluss an entweder physikalische oder chemische Kastration, etwa 90% der luminalen Zellen im adulten Prostata apoptose und die Drüse schrumpft. Wenn Testosteron an ein Individuum unter Kastrationsbedingungen wieder eingeführt wird, ist die Prostata kann sich der vollen Kapazität zu regenerieren. Testosteron scheint auch Prostatakrebs zu fahren, weshalb Androgenentzugtherapie eine häufig verwendete therapeutische Strategie ist. Allerdings werden viele Prostatakarzinome auf Androgen Deprivation resistent. Darüber hinaus Männer Androgenentzugtherapie für die Behandlung von Prostatakrebs unterziehen laufen Zyklen kastriert und regeneriert Bedingungen. Bei der Maus chirurgische Kastration, zusammen mit hormonellen Regeneration der Prostata durch Testosteron wieder einzuführen, ist ein wichtiges Werkzeug, mit dem Kastrationsbeständigkeit und die Wirkung von Testosteron-cycling auf die Prostata zu studieren. In diesem Artikel werden wir die richtigen Techniken, mit denen zu diskutieren und demonstrieren zu LOCATe und Mikro sezieren eine Maus Prostata sowie chirurgisch kastriert eine Maus.

<table><tbody><tr><td>Surgical tools</td><td>Roboz</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Johns Hopkins</td><td></td><td>Also available from vendors online</td></tr><tr><td>Cautery Pen</td><td>Medline</td><td>ESCT002</td><td></td></tr><tr><td>Silk suture</td><td>AD Surgical</td><td>M-S330R19</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Wound Clips</td><td>Roboz</td><td>RS-9265</td><td></td></tr></tbody></table>

murine prostate micro-dissection and surgical castration

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has been used as a surrogate for discoveries in human prostate development and disease. Prostate micro-dissection allows consistent study of lobe-specific prostate anatomy, histology, and cellular characteristics in the absence of contamination of other tissues. Testosterone affects prostate development and disease. Androgen deprivation therapy is a common treatment for prostate cancer patients, but many prostate tumors become castration-resistant. Surgical castration of mouse models allows for the study of castration resistance and other facets of hormonal biology on the prostate. This procedure can be coupled with testosterone reintroduction, or hormonal regeneration of the prostate, a powerful method to study stem cell lineages in the prostate. Together, prostate micro-dissection and surgical castration opens up a multitude of opportunities for robust and consistent research of prostate development and disease. This manuscript describes the protocols for prostate micro-dissection and surgical castration in the laboratory mouse.

Alle sechs Prostatalappen wurden aus einer Maus über Prostata Mikrodissektion (Abbildung 1) entfernt wird . Der komplette Urogenitaltrakt (UGT) aus allen Prostatalappen besteht, die Harnblase, Samenbläschen und der Harnröhre (Abbildung 1a). Die Samenleiter wird an der Harnröhre, ist aber für Prostata - Mikrodissektion unnötig, und somit vor dem Entfernen des UGT gelöst werden kann durch die Harnröhre (1b-1c) zu schneiden. Der Urogenitaltrakt bleiben zusammen einmal aus dem Bauch (Abbildung 1d) entfernt. Zu diesem Zeitpunkt bleibt der UGT im Fettgewebe bedeckt, die entfernt werden muss , den Zugang zu den Prostatalappen zu gewinnen (Abbildung 1e). Alle sechs Lappen (ventral, anterioren und dorsolateralen Paare) kann an der Basis der Blase umgibt die Harnröhre zu sehen. Reines Prostatagewebe kann dann oben (Abbildung 1f) nach dem Protokoll entfernt werden. Diese Lappen könnenin dem entsprechenden Medium für die weitere Analyse aufgestellt werden. Kastration ist die Entfernung der Hoden, die die Primärproduzenten von Testosteron sind. Testosteron ist in der Maus , bis Kastration auftritt, an welchem ​​Punkt der Prostata zurückbildet (Abbildung 2a). Hormonal Regeneration über die Wiedereinführung von Testosteron kann Kastration (Abbildung 2b) folgen. Wir führten Kastration, gefolgt von zwei Zyklen der hormonellen Regeneration und Testosteronspiegel wurden in Maus - Serum durch ELISA (Figur 3) überwacht. Unter Kastration Bedingungen verschwinden Testosteronspiegel praktisch. Alternativ zeigt Tamoxifen (ein selektiver Östrogenrezeptor-Modulator) keinen signifikanten Unterschied zu den hormonell normalen Zustand. Nach der Kastration wurde Testosteron an die Maus wieder eingeführt, so dass der Testosteronspiegel dramatisch Dorn (Abbildung 3). Wir haben dann die Prostata l Mikro-seziertobes der Mäuse und abgebildet , sie als einzelne Vorderlappen (Abbildung 4a). Wir haben auch in Formalin fixierten, in Paraffin eingebettet und geschnitten das Gewebe. 4b zeigt Hämatoxylin und Eosin gefärbt anterioren Prostatagewebe unter normalen, sterilisierten, Bedingungen regeneriert. Kastrierte Prostatalappen schrumpfen ein Zehntel der Größe eines normalen Prostata zu nähern, und dass hormonelle Regeneration stellt die Prostata auf seine ursprüngliche Größe. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53984/53984fig1.jpg" /> Abbildung 1: Brutto Histologie der Prostata Micro-Dissektion Protokoll. (A) Der Urogenitaltrakt (UGT) in seinem natürlichen Zustand, in dem murinen Bauch ausgesetzt. Die gepunkteten Linien umfassen, die verschiedenen Teile des UGT, einschließlich der Samenblasen (SV), Prostata-Lappen (anterior Prostata (AP) und die ventrale Prostata (VP) sind hier sichtbar), der Blase (B), und der Harnröhre (angeordnet seinneath die Blase). Die vas deferens (VD) ist ebenfalls sichtbar. (B) Die Samenleiter entfernt wurden. Der Pfeil zeigt auf die Region, aus denen die Samenleiter entfernt wurde. (C) Die UGT wurde durch Schneiden der Harnröhre unterhalb der ventralen Prostatalappen aus dem Abdomen entfernt werden . (D) Die UGT wurde in PBS gelegt und unter einem Präpariermikroskop gesehen. (E) Fett wurde aus dem UGT entfernt, so dass für die Sichtbarkeit aller sechs Lappen der Prostata. Die Pfeile zeigen auf die beiden Vorderlappen, die Bauchlappen und den dorsolateralen Lappen. (F) Alle sechs Einzelprostatalappen entfernt wurden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53984/53984fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53984/53984fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53984/53984fig2.jpg" /> Abbildung 2: Timeline für Kastration und Hormonal Regeneration. (a) Testosteron bei physiologischen Konzentrationen bis Kastration vorhanden ist, wenn Testosteron verschwindet und Regression der Prostata beginnt. (B) Die Kastration entfernt Testosteron, bis Testosteron wieder eingeführt wird, so dass hormonelle Regeneration der Prostata. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53984/53984fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53984/53984fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53984/53984fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Testosteronspiegel in verschiedenen Hormonelle Bedingungen Testosteron ELISA unter Tamoxifen behandelt, hormonell normal, kastriert und hormonell Bedingungen regeneriert. Regenerierte x 2 bezieht sich auf die Implantation und Entfernung des synthetischen Testosteron, gefolgt von der Implantation einer zweiten Runde von synthetischen Testosteron. Fehlerbalken stellen standardabweichung. Diese Zahl wurde von 5 geändert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53984/53984fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53984/53984fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53984/53984fig4.jpg" /> Abbildung 4: Prostata Aussehen unter Kastration und Regenerationsbedingungen (a) Brutto Aussehen vorderen Prostatalappen unter kastriert, hormonell normal, und hormonell Bedingungen regeneriert.. Regenerierte x 2 bezieht sich auf die Implantation und Entfernung des synthetischen Testosteron, gefolgt von der Implantation einer zweiten Runde von synthetischen Testosteron. (B) Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete vorderen Prostatalappen geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53984/53984fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um ein großes zu sehen</a>r Version dieser Figur.

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Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration

Dieses Manuskript beschreibt die Protokolle für Prostata-Mikrodissektion und chirurgische Kastration im Labor Maus. Wir zeigen auch Vertreter von diesen Protokollen erzeugt Ergebnisse. Schließlich diskutieren wir die Vorteile und die Nutzung dieser Protokolle.

Murine Prostata Micro-Dissektion und chirurgische Kastration

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has ...

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Nanyang Technological University

Research

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Serie: Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Forschung

Krebsforschung

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) for prostate cancer are hampered by tumor heterogeneity and its complex microevolution dynamics. Traditional prostate cancer mouse models include, amongst others, germline and conditional knockouts, transgenic expression of oncogenes, and xenograft models. Generation of de novo mutations in these models is complex, time-consuming, and costly. In addition, most of traditional models target the majority of the prostate epithelium, whereas human prostate cancer is well known to evolve as an isolated event in only a small subset of cells. Valuable models need to simulate not only prostate cancer initiation, but also progression to advanced disease.
Here we describe a method to target a few cells in the prostate epithelium by transducing cells by viral particles. The delivery of an engineered virus to the murine prostate allows alteration of gene expression in the prostate epithelia. Virus type and quantity will hereby define the number of targeted cells for gene alteration by transducing a few cells for cancer initiation and many cells for gene therapy. Through surgery-based injection in the anterior lobe, distal from the urinary track, the tumor in this model can expand without impairing the urinary function of the animal. Furthermore, by targeting only a subset of prostate epithelial cells the technique enables clonal expansion of the tumor, and therefore mimics human tumor initiation, progression, as well as invasion through the basal membrane.
This novel technique provides a powerful prostate cancer model with improved physiological relevance. Animal suffering is limited, and since no additional breeding is required, overall animal count is reduced. At the same time, analysis of new candidate genes and pathways is accelerated, which in turn is more cost efficient.

This protocol describes a newly established method for virus delivery to the murine prostate. Using either CRISPR/Cas9 technology, gene overexpression, or Cre recombinase delivery, the technique allows orthotopic alteration of gene expression and implements a novel mouse model for prostate cancer.

Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) are a rigorous method for studying mammalian development and disease. Our laboratory has developed several GEMMs of prostate cancer (PCa) that lack expression of one or multiple tumor suppressor genes using the site-specific Cre-loxP recombinase system and a prostate-specific promoter. In this article, we describe our method for necropsy of these PCa GEMMs, primarily focusing on dissection of mouse prostate tumors. New methods developed over the last decade have facilitated the culture of epithelial-derived cells to model organ systems in vitro in three dimensions. We also detail a 3D cell culture method to generate tumor organoids from mouse PCa GEMMs. Pre-clinical cancer research has been dominated by 2D cell culture and cell line-derived or patient-derived xenograft models. These methods lack tumor microenvironment, a limitation of using these techniques in pre-clinical studies. GEMMs are more physiologically-relevant for understanding tumorigenesis and cancer progression. Tumor organoid culture is an in vitro model system that recapitulates tumor architecture and cell lineage characteristics. In addition, 3D cell culture methods allow for growth of normal cells for comparison to tumor cell cultures, rarely possible using 2D cell culture techniques. In combination, use of GEMMs and 3D cell culture in pre-clinical studies has the potential to improve our understanding of cancer biology.&#160;

We show a method for necropsy and dissection of mouse prostate cancer models, focusing on prostate tumor dissection. A step-by-step protocol for generation of mouse prostate tumor organoids is also presented.

Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Genetik

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Medizin

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

Mikrodissektion primäre renale Gewebe Segmente und Einbindung mit neuartigen Gerüst-freie Konstrukt-Technologie

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Biotechnik

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Präklinische Orthotopische Mausmodell der menschlichen Prostata-Krebs

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Murine Orchiectomy and Ovariectomy to Reduce Sex Hormone Production

Sex hormone signaling plays a critical role in multiple organ systems as well as in the progression of various diseases, including neurodegenerative disease. The manipulation of sex hormone levels in the murine model system allows for the study of their impact on organs/tissues and within disease progression. Orchiectomy - the surgical removal of the testes - and ovariectomy - the surgical removal of the ovaries - provide a method to deplete the endogenous sex hormones so that the precise hormone levels can be provided through drug or other delivery methods. Here, we provide rapid and minimally invasive methods for both orchiectomy and ovariectomy in the murine model system for the reduction of sex hormones. This protocol details the surgical preparation and excision of the testes through the scrotal sac, and excision of the ovaries via two incisions in the right and left lateral dorsum.

This manuscript describes a consistent way to quickly perform survival rodent orchiectomies and ovariectomies.

Orchiektomie und Ovariektomie bei Mäusen zur Verringerung der Sexualhormonproduktion

Sex hormone signaling plays a critical role in multiple organ systems as well as in the progression of various diseases, including neurodegenerative ...

Modeling Prostate Cancer in Genetically-engineered Mouse Models: A CRISPR/Cas9-mediated Localized Gene Editing Technique in Mouse Anterior Prostate Lobe Cells

Source: Riedel, M. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57525" target="_blank">Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method for editing specific genes in prostate gland cells using an adenovirus-based delivery system. The approach allows for orthotopic and localized alteration of gene expression utilizing CRISPR technology to develop novel mouse models for prostate cancer.

Modellierung von Prostatakrebs in gentechnisch veränderten Mausmodellen: Eine CRISPR/Cas9-vermittelte lokalisierte Gen-Editing-Technik in vorderen Prostatalappenzellen der Maus

Source: Riedel, M. et al. Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration. J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Prostate Cancer

Animal model studies

Intra-prostatic Injection of Cancer Cells: A Technique to Deliver Cancer Cells for Establishing Orthotopic Prostate Cancer Mouse Model

Source: Anker, J. F. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57301" target="_blank">Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate the procedure for administering intra-prostatic injection of prostate cancer cells into a mouse model. Orthotopic murine models can be used to study the disease origin and response to treatment therapies in a non-invasive and clinically relevant environment.

Intraprostatische Injektion von Krebszellen: Eine Technik zur Verabreichung von Krebszellen zur Etablierung eines orthotopen Prostatakrebs-Mausmodells

Source: Anker, J. F. et al. Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate ...