SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.

Quelle von IL-3 und Herstellung von WEHI-3D-konditioniertem Medium Hinweis: Die Maus granulocytic Leukämiezelllinie WEHI-3D ​​kultiviert wird ein konditioniertes Medium, das IL-3 zu erzeugen. <ol><li> Kultur WEHI-3D ​​in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS), 1% langlebige Glutaminergänzung, 50 ug / ml Gentamicin. Beimpfen von 5 × 10 6 Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase in 50 ml frischem Kulturmedium in einem T175 cm 3 Gewebekulturflasche und wachsen etwa 7 Tage , oder bis die Zellen die log - Phase des Wachstums vergingen etwa 24 bis 48 hr (übermäßige Zelltod in der Kultur zu vermeiden). Konditioniertes Medium ist in der Lage für mehrere Jahre bei -20 ° C gelagert werden, so Chargen von 200-500 ml auf einmal hergestellt werden. </li><li> Dekantieren Flüssigkeit und Zellen aus den Kolben und Schleudern bei 1000 x g für 15 min Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Entfernen Sie die obere 90% der supernatant. Man filtriert durch ein 0,22 um-Filtereinheit. </li><li> Aliquot WEHI-3D-konditioniertem Medium (CM) in 1 ml, 50 ml und 200 ml-Volumina für die Lagerung bei -20 ° C oder -70 ° C. Kleiner Aliquots sind nützlich für die Probenaufbereitung, Zwischenvolumen zur Herstellung von Kulturmedium für den Durchtritt von faktorabhängigen Zelllinien und größere Volumina für die Langzeitlagerung. IL-3 ist relativ stabil bei 4 ° C so aufgetauten Medium kann, wenn unter sterilen Bedingungen für einige Wochen gelagert werden. </li><li> Alternativ verwenden, rekombinantes Maus-IL-3 auf einem Niveau von 50 ng / ml in Kulturmedium verdünnt, nachdem sie durch ein 0,22 um-Filtereinheit gefiltert wird. </li></ol> 2. Kultur und Evaluierung von VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 und die Kontrolle von Ba / F3-Zelllinien <ol><li> Kulturkontrolle Ba / F3-Zellen in DMEM, 10% FBS, 50 &amp; mgr; g / ml Gentamicin oder Penicillin / Streptomycin Ergänzungsmittel, 1% stabilisiert L-Glutamin und 10% WEHI-3D-CM. Passage-Zellen um 1:15 Verdünnungen etwa alle drei Tage von Zellenin der log-Phase wachsen. </li><li> Kultur VEGFR2-EpoR-Ba / F3-Zellen in DMEM, 10% FBS, 50 &amp; mgr; g / ml Gentamycin, 1% stabilisiert L-Glutamin und 10% WEHI-3D-CM und 1 mg / ml G418. Passage-Zellen um 1:15 Verdünnungen von Zellen in der log-Phase wachsen. Siehe 24 für mehr Details über die Konstruktion und Expression des chimären Rezeptors. </li><li> Erntesteuerung Ba / F3 oder VEGFR2-EpoR-Ba / F3-Zellen, die aus der mittleren logarithmischen Phase Kulturen. Vorsichtig pipettiert, diese nicht-adhärenten Zellen aus dem Boden des Kolbens zu entfernen. Waschen dreimal in Maus Tonizität phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,3 (PBS) (10 ml, Zentrifugieren bei 750 x g für 5 min Zellpellet wiederherzustellen) Medium , enthaltend IL-3 zu entfernen. </li><li> Wasche die Zellen einmal mit DMEM und Zusatzstoffe, ohne die WEHI-3D-CM oder rekombinantem IL-3, und dann in diesem Medium bei einer Konzentration von 7,4 × 10 4 Zellen / ml (dh 1.000 Zellen pro 13,5 &amp; mgr; l resuspendieren; 10.000 Zellen pro 135 &amp; mgr; l, wie durch Zählen mit einem Hämozytometer bestimmt) fürverwenden in den semi-quantitative oder quantitative Versionen des Assays sind. </li><li> Beurteilen Sie Zellen für die Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss (ACHTUNG). Mischungs Trypan-Blau in PBS (0,4%) 1: 1 mit der Zellpopulation und zählen ein Minimum von 100 Zellen auf einem Hämozytometer. Zellen, die den Farbstoff aufzunehmen sind tot oder sterbend betrachtet. Lebensfähigkeit von mehr als 98% erforderlich, um den Test durchzuführen. </li></ol> 3. Halb quantitative Assay <ol><li> Hinzufügen gewaschenen Zellen (1000 Zellen) enthielt in 13,5 &amp; mgr; l IL-3-defizienten Medium zu den Vertiefungen einer 72-well Mikrotiterplatte bei RT. Achten Sie darauf, die Zellsuspension zu mischen während Aliquotierung Zelle Einschwingzeit, um sicherzustellen, durch die Schwerkraft nicht Bias Zellkonzentration. Verwenden Sie einen gut kalibrierten P20 automatisierte Pipette und autoklavierten Spitzen. </li><li> Hinzufügen Testproben und Kontrollen in die Vertiefungen bei 10% Volumen (1,5 &amp; mgr; l, um ein Endvolumen von 15 ul, enthaltend 1.000 Zellen pro Vertiefung zu machen), um eine kalibrierte P20 Pipette oder bevorzugt P2 Pipette. Nehmen care, um sicherzustellen, dass die Proben mit den Kulturbedingungen für die Ba / F3-Zellen im Hinblick auf pH, Salz und anderen potentiell cytotoxische / cytostatische Substanzen kompatibel sind. Wo es möglich ist , verwenden Sie ein kompatibles Medium oder Puffer (zB DMEM oder PBS, jeweils) oder in einem solchen Medium oder Puffer verdünnen. Verreiben mit der gleichen Spitze wird das Mischen zu gewährleisten. </li><li> Für die Kontrollproben, umfassen (i) Medium allein enthaltenden kein IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM hinzugefügt Medium allein bei 10% Endvolumen; und / oder (iii) VEGF-A allein zu 100 ng / ml in Medium verdünnt, die kein IL-3. </li><li> Füllen Sie alle nicht verwendeten Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit sterilem Wasser, PBS oder Medium und legen Sie die Platte in einem befeuchteten Behälter (mit Wasser getränkt Seidenpapier) ermöglicht Gasaustausch. Inkubiere Zellen innerhalb der Behälter in einer befeuchteten Atmosphäre von 10% CO 2. Dieser Test kann bequem in 3 Stunden von einer Person aufgebaut werden, wenn die Testproben und Media-Komponenten zur Verfügung stehen. </li><li> Beurteilen Sie Platten typischerweise nach 16 hInkubation bei welcher Zeit die Unterscheidung zwischen positiven und negativen Proben offensichtlich. Siehe Abbildung 3 für Beispiele, wie Zellen in Kultur erscheinen. Analysieren Platten mit einem Standard-invertierten Phasenkontrastmikroskop bei 40 bis 100-facher Vergrößerung. Anmerkung: Wells stützende Wachstumsfaktoren wie IL-3 oder VEGF-A enthält, enthalten Zellen, die rund und durchscheinend erscheinen. Wells ohne unterstützende Wachstumsfaktoren oder mit Medium wird allein eine verringerte Anzahl von runden Zellen, sowie tote oder sterbende Zellen und Zelltrümmer (zB 3C). Auswertung des Tests bei 24 bis 48 Stunden nach der Inkubation ist das Optimum für Empfindlichkeit. </li></ol> 4. Quantitative Bioassay <ol><li> Hinzufügen gewaschenen Zellen (10.000 Zellen in 135 ul) in IL-3-defizienten Medium zu den Vertiefungen einer Standard-96-Well-Mikrotiterplatte bei RT. Achten Sie darauf, die Zellsuspension zu mischen während Aliquotierung Zelle Absetzen durch Schwerkraft, um sicherzustellen, nicht ce beeinflussenll Konzentration. </li><li> In Testproben und Kontrollen in die Vertiefungen bei 10% Volumen (15 ul) mit einer kalibrierten Pipette (P20). Achten Sie darauf, um sicherzustellen, dass die Proben mit den Kulturbedingungen kompatibel sind für Ba / F3-Zellen in Bezug auf pH-Wert, Salz oder andere potenziell zytotoxischen / zytostatischen Substanzen. Wo es möglich ist , verwenden Sie ein kompatibles Medium oder Puffer (z. B. DMEM oder PBS) oder in einem solchen Medium oder Puffer verdünnen. Filter sterilisieren kleine Volumina mit einem 0,22 um Poren Celluloseacetat Zentrifugenröhrchen Filtereinheit. </li><li> Inkubieren der Mischung von Zellen, Wachstumsfaktoren und / oder Inhibitor Mittel in einer befeuchteten Atmosphäre von 10% CO 2 für 48 Stunden. Führen Sie den Test in einem befeuchteten Behälter, die mit Wasser getränkten Tissue-Papier und ermöglicht Gasaustausch hat. Bei der Beendigung der Inkubationsperiode bewerten Assay eines der alternativen Verfahren unter Verwendung der unten aufgeführten und Surrogatmarker der Lebendzellzahl in dem Bohrloch. </li><li> Alternative # 1: 3 H-thymidine Incorporation Anmerkung: Diese Quantifizierung der 96-Well-Plattenformat ausgelegt ist. <ol><li> Nach der Inkubation der Testplatten für 48 Stunden bei 37 ° C (150 &amp; mgr; l Volumen pro Napf), fügen 3 H-Thymidin in einem Volumen von 50 ul Testmedium (Ba / F3 Kulturmedium ohne IL-3 / WEHI-3D ​​- CM) pro Vertiefung in einer Konzentration von 20 &amp; mgr; Ci / ml, eine letzte Dosis von 1 uCi pro Vertiefung ergibt. </li><li> Inkubieren Platten für weitere 4 Stunden bei 37 ° C vor der Zellen unter Verwendung eines Zellernters der Ernte. Extrahieren von einzelnen Proben, die durch die Filter in scintillant platzieren und zu quantifizieren, mit einem Flüssigszintillationszähler. </li></ol></li><li> Alternative # 2: Biolumineszenz Detektion von Cellular ATP Anmerkung: Dieser Ansatz verwendet ein ATP Überwachung Reagenz, welches, wenn es mit Zelllysat kombiniert können ein Biolumineszenz-Signal erzeugen, das die lebensfähigen Zellen in der Population widerspiegelt. <ol><li> Lyse Zellen ATP zu extrahieren und ein ATP-Monitoring-Reagens verwenden, um eine generierenLumineszenzsignal gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lesen Lumineszenz eines Luminometers kompatibel mit einer 96-Well-Platte-Format. </li></ol></li><li> Alternative # 3: Enzymatische Reduktion eines Indikatorfarbstoffes durch Viable Cells Hinweis: Resazurin basierte Assays gute Korrelation zu der Lebensfähigkeit der Zellen zeigen. <ol><li> Kombinieren Sie kultivierten Zellen mit dem Resazurin Farbstoff auf der Basis und zu quantifizieren Assays ein Fluoreszenz-Plattenleser gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li></ol>

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Steven A. Stacker und Marc M. Achen sind Aktionäre in Circadian Technologies Ltd., ein Unternehmen der Entwicklung Therapeutika durch die VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren abzielen.

Der Test hier beschriebenen beruht auf Zellen hoher Lebensfähigkeit mit Hilfe der für Wachstumsfaktoren abhängig sind. Zellen müssen daher sorgfältig kultiviert werden sie Faktor abhängig zu gewährleisten, und die Expression des chimären Rezeptors binden. Um sicherzustellen, dass das Medium frisch hergestellt ist und nicht für einen zu langen Zeitraum gespeichert und dass WEHI-3D-CM ist hochaktiv ist wichtig. Zellen benötigen, von IL-3 enthaltendem Medium in das Assaymedium gründlich gewaschen werden, um sicherzustellen, daß kein restliches IL-3, um den Assay verunreinigen, wenn die Zellen auf die Rettung von Liganden ausgesetzt wird. Als Liganden in einer Reihe von verschiedenen Formen kommen kann, muss darauf geachtet werden, wenn diese zur Untersuchung vorbereitet. Konservierungsmittel, antibakterielle Mittel, Salz oder Puffer verschiedener pH kann der Assay beeinflussen, und deshalb parallel Prüfung von nicht-transfizierten Ba / F3-Zellen zu pufferbezogenen Fragen informieren kann. Wir verwenden sowohl die semi-quantitative und quantitative Protokolle. Der semi-quantitative-Assay ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Aktivität der Proben vor einer vollständig quantitative Assay zu begehen, die mehr Zeit und Probe erfordert. Die quantitative Methode wird ausschließlich verwendet, wenn Daten für die Veröffentlichung zu erzeugen. Die alternativen Verfahren zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Kultur Erfassungs sind relativ unkompliziert. Die quantitative Bestimmung wurde auf eine Anzahl von unterschiedlichen Formaten zur Quantifizierung der Proliferation angepasst worden, und wir verwendet haben (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) MTT 30, Biolumineszenz Nachweis von zellulären ATP (nicht veröffentlicht), Resazurin Farbstoff auf (Abbildung 2) und 3 H-Thymidin 31 mit Erfolg. In den letzten Jahren haben sich weiterentwickelt wir von der Verwendung von Strahlung weg Biolumineszenz Ansätze anzupassen und haben die Resazurin-basierten Farbstoff aufgrund seiner Wirtschaftlichkeit eingesetzt. Alle Ansätze geben entsprechende Ergebnisse und die Auswahl über die Verfügbarkeit von Reagenzien und ein abhängenssociated spezialisierte Plattenleser in einem bestimmten Labor / Institut oder Vertrautheit mit bestimmten Ansätzen. Fehlerbehebungs dreht sich um die Aktivität der drei Hauptkomponenten des Assays, i) IL-3 CM, ii) VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-Zellen und iii) stimulierenden Liganden. Schlechte Konzentrationen von IL-3 in CM aufgrund unzureichender WEHI 3D-Zellen in der ursprünglichen Kultur, schlechte Lagerungsbedingungen, übermäßige Gefrier-Auftau-Zyklen oder bei einer zu hohen Verdünnung verwendet, kann schlecht wachsenden Kulturen schaffen, die den Test behindern. Dies wird in der Regel in den Kontrollvertiefungen nachgewiesen, wie Zellpopulationen langsam wächst, ihre normalen hellen und runden Aussehen zu verlieren. Die VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-Zellen-Assay können Zelloberflächenexpression des chimären Konstrukts im Laufe der Zeit verlieren, wenn in Kultur für ausgedehnte Zeiträume gehalten. Das Beibehalten der guten Zahlen von flüssigem Stickstoff Bestände ermöglicht frischen Kulturen von Zellen in hohem Grade den chimären Rezeptor exprimieren jederzeit zur Verfügung stehen. Bei Bedarf kann eine hohe exprimierenden Bevölkerung seinerreicht, indem Zellen in VEGFR-2-Liganden und Auswählen der Bevölkerung exprimieren große Mengen des chimären Rezeptors durch Durchflusszytometrie Sortier wächst. Diese Zellen werden dann weiter in Kultur expandiert zum Einfrieren. Während die Technik zur Analyse von Interaktionen mit dem VEGFR-2 extrazelluläre Domäne eine bequeme und einfache Alternative ist, kann es nicht zu ersetzen kompliziertere Experimenten gesehen werden, wo die nativen Rezeptor auf primären Endothelzellen in Gegenwart anderer VEGFRs sondiert wird, co-Rezeptoren, wie Neuropiline. Die Zellen, auf denen dieser Test basiert (B-Zellen) unterscheiden sich von Endothelzellen und sollten deshalb nicht verwendet werden, um die cytoplasmatische Signalwege und Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die an VEGFR-2-Aktivierung in Endothelzellen reagieren. Dennoch liefert das Verfahren einen nützlichen Ansatz Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zu analysieren, die zwischen einem einfachen Bindungsassay liegt, die mit einem immobilisierten recep Wechselwirkung eines Liganden untersuchttor-Konstrukt (beispielsweise ein löslicher Rezeptor extrazelluläre Region oder einen Rezeptor extrazellulären Region zu Immunglobulins fusioniert) und die Analyse der Rezeptorbindung und stromabwärts in Bindungsassays auf primären Endothelzellen gesehen Wirkungen. Es stellt ein System Bindung und Vernetzung von Rezeptoren zu ermöglichen, wobei die ersten zwei Stufen, mit denen viele Rezeptor-Tyrosin-Kinasen ihre Signaltransduktionskaskade häufig initiieren. Ihre Anwendung in einer Reihe von wissenschaftlichen und kommerziellen Einstellungen wurde gezeigt für die Prüfung Bindungseigenschaften als nützlicher Test angenommen wird, insbesondere, wenn Variante Liganden oder Inhibitoren der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zu bewerten. Der Test ist auch nützlich für die Analyse von neuen Inhibitoren des Rezeptors extrazelluläre Domäne oder dessen Liganden. Der Assay weiter schnell verwendet werden, um Varianten der Liganden screenen oder extrazelluläre Rezeptorregionen in Zusammenhang mit der genomischen Mutationen gesehen (beide geerbt und somatische) in menschlichen ge gefundennes in Krankheiten wie Krebs 32,33 auf ihre funktionelle Konsequenz bestimmen. Daher sind die Anwendungen dieser VEGFR-2-Test sind wahrscheinlich in der Zukunft zu erweitern. Ferner kann der allgemeine Ansatz diesen Test zugrunde liegenden breiter Kinasen für die Zelloberflächen-Rezeptor-Tyrosin verwendet werden, die von Signalmolekülen in Gesundheit und Krankheit eine große und wichtige Familie bilden.

Die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) -Familie von sekretierten Protein Wachstumsfaktoren und ihre verwandten Zelloberflächenrezeptoren eine wichtige und vielfältige Gruppe von löslichen Liganden und Membran eingebettetem Rezeptoren bzw. diese Funktion in Signale über Zellmembranen transduzieren. Sie funktionieren vorwiegend in Endothelzellen , sondern auch in Zellen epithelialen Ursprungs und diejenigen des Immunsystems 1,2. Signalisierungs Eingriff Wege durch Liganden-aktivierte VEGF-Rezeptoren (VEGFRs) sind kritisch in großen Pathologien, wie altersbedingte Makuladegeneration und Krebs und Therapeutika ihnen sind in häufigen klinischen Gebrauch (zum Beispiel der monoklonale Antikörper Bevacizumab, die VEGF-A Targets) Targeting 3,4. Einer der Komplexität der VEGF-Familie ist die Vielfalt der löslichen Liganden in der Natur (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-Proteine ​​durch die Parapockenvirusfamilie orf und Schlangengift VEGF codiert, plus andere hemmendIsoformen von VEGF-A) 2. Diese Liganden interagieren mit drei Mitgliedern der Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Familie, nämlich VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3. Diese Rezeptoren sind variabel auf verschiedenen Zelltypen exprimiert werden jedoch oft coexprimiert auf der Oberfläche von endothelialen Zellen , die Blut und Lymphgefäße aller Größen 5 auskleiden. VEGFR-2 binden kann die Säugetier-VEGF-A 6, VEGF-C - 7 und VEGF-D 8,9 sowie orf - Virus VEGF 10 und Schlangengift VEGF 11 - Liganden. VEGFR-2 spielt eine wichtige Rolle der Angiogenese (das Wachstum neuer Blutgefäße aus bestehenden Gefäßen) in der Embryonalentwicklung, Wundheilung, Krebs und Augenkrankheiten in Fahrt. In diesen Zusammenhängen Liganden wie VEGF-A, -C und -D binden und aktivieren den Rezeptor auf den Blut vaskulären Endothelzellen 12-15. Auf lymphatischen Endothelzellen spielt VEGFR-2 eine Rolle bei der Lymphangiogenese, die Bildung neuer Lymphgefäße 16. VEGFR-2 kann auch 17 Erweiterung und den Ausbau der großen Arterien und Lymphgefäße in gesunden Geweben und Krankheiten zu fördern. Ein vollständiges Verständnis von VEGFR-2: Ligand - Wechselwirkungen ist daher wichtig für die Entwicklung von Inhibitoren für die Verwendung in 18 - Angiogenese-abhängigen Erkrankungen zu behandeln. Während die meisten Isoformen von VEGF-A - Bindung an VEGFR-2 wird proteolytische Spaltung von VEGF-C und VEGF-D erforderlich , der VEGF-Homologiedomäne ein Fragment freizusetzen , besteht, die die Bindung an VEGFR-2 19,20 eine hohe Affinität aufweist. Wir haben ein Bioassay entwickelt Liganden von VEGFR-2 zu überwachen , die ausgelegt ist , die Notwendigkeit einer primären Endothelzellen zu umgehen, die für den Durchgang technisch schwer, teuer in der Anschaffung und die Kultur (erfordern spezielle Medium) 21 und mehrere VEGFRs exprimieren und co- assoziierten Rezeptoren 22. Heterodimerisierung von VEGFR-2 mit anderen VEGF-Rezeptoren oder Co-Rezeptoren können unerwünschte Komplexität verursachen, wenn sie zu dem Ziel Bolzeny binäre Rezeptor-Ligand - Wechselwirkungen, Aktivität zurückzuführen auf einen spezifischen Rezeptor bewerten, oder die Wirkung von hemmenden Reagenzien zu beurteilen. 23. Der Bioassay behält Beweglichkeit des entsprechenden Rezeptor in der Zellmembran und erlaubt die Bewertung der Fähigkeit eines Liganden zu binden und zu vernetzen, das VEGFR-2-extrazelluläre Region. Der Bioassay beruht auf der Schaffung eines chimären Rezeptors, in dem die extrazelluläre Region eines VEGF-Rezeptors (in diesem Fall VEGFR-2) an die Transmembran- geschmolzen und intrazellulären Regionen des Erythropoietin-Rezeptor (EpoR), ein Mitglied der Zytokin-Rezeptor-Familie 8,24. Dieses Fusionsprotein wird dann in der faktorabhängigen Pro-B-Zelllinie Ba / F3, auf die Stimulation mit einem Liganden, die zur Bindung und Vernetzung der extrazellulären Domäne des Rezeptors verursacht die Aktivierung der cytoplasmatischen Effektorregion exprimiert, die fähig ist, von ein Überlebenssignal über Janus-Kinasen (JAKs) Umwandlungs-Zelle zu fördernÜberleben und / oder Proliferation. Im Gegensatz dazu ist die Expression von Volllängen-VEGFR-2 in dem gleichen Zelltyp, und die Stimulation mit dem Liganden, was anzeigt, nicht das Überleben der Zelle und die Proliferation fördert, dass der proximale Signalisierungs Effektoren des VEGFR-2-Weg in diesem Zelltyp nicht verfügbar sind. Wir haben den Test in einer Vielzahl von Kontexten verwendet zu erforschen Bindung von neuartigen VEGFR-2 - Liganden 10,19,20,24-29. In Kombination mit einer VEGFR-3-EpoR-Ba / F3 - Assay haben wir die relativen Aktivitäten der VEGF-C und VEGF-D - Wachstumsfaktoren für die Bindung und Vernetzung VEGFR-2 und VEGFR-3 30 verglichen. Der Test wurde durchgeführt 31 , um die inhibitorische Aktivität von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern gegen VEGFR-2 oder VEGF-D, VEGFR-2 lösliches Falle und Peptidomimetika Targeting der VEGF - Familie zu charakterisieren. Der Test wurde auch in primären Endothelzellen zu zeigen, die Fähigkeit von VEGF aus verschiedenen orf-Virus-Stämme zu binden und zu vernetzen, VEGFR-2 vor dem Test verwendet <sup&gt; 10,26. Der Test ist besonders nützlich für das schnelle Screening von Mutanten von VEGFs , die schnell auf ihre Aktivität untersucht werden können , bevor sie den mühsamer Endothelzelle Assays eingeführt werden , 25 oder bei der Beurteilung Protokolle zur Reinigung von Wachstumsfaktoren 27. Der Test wir beschreiben, ist einfach durchzuführen, und die semi-quantitative Version ermöglicht eine schnelle Bestimmung, die manchmal erforderlich sind, wenn die Herstellung oder Reinigung von Wachstumsfaktoren überwacht wird, Antikörper oder löslicher Rezeptordomänen für andere Experimente. Die einfache Bedienung des Assays ist es eine ideale Ergänzung zu weiteren und umfassendere Studien mit primären endothelialen Zellen aus Blut oder Lymphgefäße aus bestimmten Geweben oder Organsysteme abgeleitet durchgeführt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1110">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">T8154</td>
			<td style="width:424px;">0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulphate (Geneticin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3H-Thymidine</td>
			<td style="width:183px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:181px;">NET-027</td>
			<td>This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vialight Plus Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-221</td>
			<td>Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prestoblue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13261</td>
			<td>Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136528</td>
			<td>Small microtitre plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">96 well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:183px;">Falcon, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">DMEM (1X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">11965-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Foetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">&#160;10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Harvester</td>
			<td style="width:183px;">Tomtec Life Sciences</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid Scintillation Counter</td>
			<td style="width:183px;">LKB Wallac</td>
			<td style="width:181px;">1205</td>
			<td>LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">UniFilter-96 GF/B</td>
			<td style="width:183px;">Perkin Elmer</td>
			<td>6005177</td>
			<td>White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 &#181;m poresize</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:323px;">0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit</td>
			<td style="width:183px;">Costar, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">8160</td>
			<td>Centrifuge tube filters have a 0.22&#181;m pore CA membrane-containing filter unit within a 500&#181;l capacity polypropylene microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fluorescence Reader</td>
			<td style="width:183px;">BioTek</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors

Die Analyse von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und ihre Interaktion in vaskulären biology beteiligt Liganden ist oft eine Herausforderung aufgrund der konstitutiven Expression von Familien von verwandten Rezeptoren, ein breites Spektrum von verwandten Liganden und der Schwierigkeit, mit primären Kulturen von spezialisierten Endothelzellen handelt. Hier beschreiben wir einen Bioassay zum Nachweis von Liganden an den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (VEGFR-2), einem Schlüssel Wandler von Signalen, die Angiogenese und Lymphangiogenese fördern. Eine cDNA, die eine Fusion des extrazellulären (Liganden-bindenden) -Region von VEGFR-2 mit der Transmembran- und cytoplasmatischen Regionen des Erythropoietin-Rezeptor (EpoR) ist in der faktorabhängigen Zelllinie Ba / F3 ausgedrückt. Diese Zellinie wächst in Gegenwart von Interleukin-3 (IL-3) und Entnahme dieses Faktors führt zu dem Tod der Zellen innerhalb von 24 Std. Die Expression des VEGFR-2 / EpoR-Rezeptor-Fusions stellt einen alternativen Mechanismus Überleben und Potentia zu fördernlly Proliferation von stabil transfizierten Ba / F3 - Zellen in Gegenwart eines Liganden, die zur Bindung und Vernetzung der extrazellulären Teil des Fusionsproteins (dh eine , die kann vernetzen die VEGFR-2 extrazellulären Region). Der Test kann in zwei Arten durchgeführt werden: eine semi-quantitative Ansatz, bei dem kleine Mengen von Ligand und die Zellen in 24 Stunden ein schnelles Ergebnis ermöglichen und eine quantitative Ansatz, der Surrogatmarker einer Lebendzellzahl. Der Test ist relativ einfach durchzuführen, ist in hohem Maße reaktions bekannten VEGFR-2-Liganden und extrazellulären Inhibitoren der VEGFR-2-Signalisierungs wie monoklonale Antikörper gegen den Rezeptor oder Liganden und lösliche Ligandenfallen aufnehmen kann.

In diesem Abschnitt zeigen wir die Ergebnisse eines Experiments , die wesentlichen Merkmale eines VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Bioassay zeigt (Abbildung 1 für Prinzipien des Tests sehen). Andere veröffentlichte Studien zeigen , breitere Anwendungen des Assays für alternative VEGFR-2 - Liganden, mutierten VEGF - Moleküle und hemmenden monoklonalen Antikörpern 8,10,19,24-30. Die hier dargestellten Daten stellen einen Assay , bei dem das VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Bioassay verwendet wird , um die Aktivität der drei rekombinanten humanen Liganden (VEGF-A 165, VEGF-C und VEGF-D) mit einer Spezifität für VEGFR zu quantifizieren -2 in Gegenwart eines inhibitorischen monoklonalen Antikörpers (Bevacizumab) an VEGF-A 165. die Daten wurden in Abhängigkeit von der Reaktion auf VEGF-A 165 allein (Figur 2) normalisiert. Wie erwartet, blockiert Bevacizumab die Wirkung von VEGF-A in dem Test 165, aberhatte keinen Einfluss auf die Aktivität von VEGF-C und VEGF-D. In der semi-quantitative Version des Assays oder wenn der Test während seiner Entwicklung zu beobachten, die Anzeige der Assay eine Standard invertierten Phase Mikroskop können wertvolle Informationen über den Fortschritt des Tests zur Verfügung stellen. Eine Analyse eines Assays (Figur 3) zeigt die gute Lebensfähigkeit von VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Zellen , wenn Bioassay mit Medium , das IL-3, oder einen Liganden für VEGFR-2, beispielsweise VEGF-A inkubiert. Diese Zellen sind groß und durchscheinend, und es besteht keine oder nur minimale Anzeichen von Körnigkeit in dem zellulären Zytoplasma oder Zelltrümmer in der Kultur. In der gut ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren gibt es bereits Hinweise auf eine schlechtere Zellzahlen und wenige gesunde Zellen. Zellen, die erhebliche Granularität in ihrem Zytoplasma und Zelltrümmer ist ein konsistentes Merkmal der Kultur. Nach 48 Stunden gibt es keine Anzeichen von lebenden Zellen. Abbildung 1 Schematische Darstellung der Prinzipien der VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Bioassay. (A) Ba / F3 - Zellen faktorabhängig und erfordern einen exogenen Wachstumsfaktor, wie IL-3 beschreiben das Zellwachstum zu stimulieren / Lebensfähigkeit via endogene IL-3 Rezeptoren und die JAK-Signalweg. Wenn EpoR können in diesen Zellen exprimiert wird rescue auch über den JAK-Weg auftreten. Die Expression eines Rezeptor-Tyrosinkinase in voller Länge wie VEGFR-2 führt zu einer minimalen Signalisierung als Downstream-Targets von VEGFR-2-Aktivierung engagieren nicht die JAK-Weg. Ein chimärer Rezeptor mit der extrazellulären Region des VEGFR-2, fusioniert an die Transmembran- und cytoplasmatischen Regionen EpoR, wenn sie in Ba / F3-Zellen transfiziert und mit spezifischen VEGFR-2-Liganden stimuliert wird, ist in der Lage, die JAK Weg der Aktivierung und ZellantriebsÜberleben und die Proliferation. (B) VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Zellen exprimieren bedeutende Mengen des chimären VEGFR-2-EpoR - Rezeptor, der Zytometrie verwendet werden kann quantifiziert fließen. Einmal gewaschen aus IL-3 enthaltendem Medium werden die Zellen in einer Vielzahl von Kulturbedingungen gegeben, die entweder das Überleben / Proliferation von Zellen antreiben. Nicht transfizierte Ba / F3 - Zellen oder VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Zellen ohne spezifische Wachstumsfaktoren nicht zu wachsen / überleben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53867/53867fig2.jpg" /> Figur 2. Bewertung von VEGFR-2 - Liganden in den VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Bioassay. IL-3-abhängigen Ba / F3 - Zellen , eine Maus VEGFR-2-EpoR - Chimäre exprimieren , wurden in Medium ausgesät , ohne IL-3 ( mit Ausnahme von fürdie + IL-3 Teilmenge, wie angegeben) sowie menschliche VEGF-A 165, VEGF-CΔNΔC (VC) (dies ist eine Form von VEGF-C , die von dem zentralen Bereich besteht, aber ohne die N und C-terminalen Propeptide) oder VEGF-DΔNΔC (dies ist eine Form von VEGF-D, die die zentrale Region umfasst, aber ohne die N und C-terminalen Propeptide (VD)) bei 100 ng / ml und humanisierte neutralisierenden monoklonalen Antikörper Bevacizumab (was bindet und hemmt VEGF-A, aber nicht VEGF-C oder VEGF-D) oder die Kontrolle nicht-neutralisierende Antikörper Trastuzumab, wie bei 0,75 uM angegeben. NF = mittel keine zusätzlichen Wachstumsfaktoren enthält. Achtundvierzig Stunden später wurde die relative Lebendzellzahl unter Verwendung von Biolumineszenz Detektion von zellulären ATP quantifiziert. Die vertikalen Balken stellen Mittel (normalisiert gegen die Reaktion auf VEGF-A 165 allein, erste bar) und Standardfehler des Mittelwerts von drei unabhängigen Experimenten. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig2large.jpg" target="_blank">um</a> die <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig2large.jpg" target="_blank">v</a>IEW eine größere Version dieser Figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53867/53867fig3.jpg" /> Abbildung 3. VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Zellen sind abhängig von externen Wachstumsfaktoren für das Überleben. Beispiele für VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Bioassay , in denen IL-3-abhängigen Ba / F3 - Zellen, die eine Maus VEGFR- 2-EpoR - Chimäre wurden in einem Medium (A) mit 10% WEHI-3D ​​- konditioniertes Medium ausgesät, zur Verfügung stellt IL-3, (B) 100 ng / ml humanen VEGF-A 165 (kein IL-3) oder (C) -Medium mit kein IL-3 oder zusätzliche Wachstumsfaktoren. Kultur dargestellt wird 24 h in den Assay sehr lebensfähige Zellen in Gegenwart von IL-3 (A) oder VEGF-A 165 (B), während die in der Kultur ohne IL-3 oder zusätzliche Wachstumsfaktoren (C) Zelltod darstellt und rotuced Lebensfähigkeit sind deutlich zu erkennen. Waagen Bars sind 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

Wir beschreiben eine einfache zellbasierten Bioassay zum Nachweis, zur Quantifizierung und Überwachung der Aktivität der Mitglieder der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Familie von Liganden. Der Assay verwendet chimären Rezeptoren in einem Faktor-abhängigen Zelllinie exprimiert eine semi-quantitative oder quantitative Bewertung der Rezeptorbindung bereitzustellen, und die Vernetzung durch den Liganden.

Eine einfache Bioassay für die Beurteilung von Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

a-simple-bioassay-for-evaluation-vascular-endothelial-growth

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Aufrufe.  Peter MacCallum Cancer Centre.  Wir beschreiben eine einfache zellbasierten Bioassay zum Nachweis, zur Quantifizierung und Überwachung der Aktivität der Mitglieder der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Familie von Liganden. Der Assay verwendet chimären Rezeptoren in einem Faktor-abhängigen Zelllinie exprimiert eine semi-quantitative oder quantitative Bewertung der Rezeptorbindung bereitzustellen, und die Vernetzung durch den Liganden. 

Serie: A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

A Simple Protocol für das Extrahieren Hämozyten von Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Forschung

Biologie

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of the intact endothelium will provide valuable information for understanding the cellular and molecular events in the dysfunctional endothelial cells. Here, we describe a modified en face immunofluorescence staining technique which enables scientists to obtain clear images of the intact endothelial surface and analyze the molecule expression patterns in situ. The method is simple and reliable for observing the entire endothelial monolayer at different sites of the aorta. This technique may be a promising tool for understanding the pathophysiology of atherosclerosis, especially at an early stage.

Here, we present a protocol for immunofluorescence staining to observe the endothelial cells of the mouse aorta directly. This technique is useful when studying the cellular and molecular phenotype of endothelial cells in different flow patterns and in the development of atherosclerosis.

Verwendung von En Face Immunofluoreszenz Färbung zur direkten Beobachtung von vaskulären Endothelzellen

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic nephropathy, are associated with VEGF dysregulation in the kidney. The factors that govern VEGF under physiologic conditions in the kidney are not well-understood. Luteinizing hormone (LH), a pro-angiogenic hormone, helps regulate physiologic VEGF expression in reproductive organs. Given that LH receptors are found in the kidney, we, at Zietchick Research Institute, hypothesized here that LH also helps regulate VEGF expression in the kidney as well. To provide evidence, we aimed to show that LH levels are able to predict VEGF levels in the mammalian kidney. Most VEGF-related investigations involving the kidney have used lower order mammals as models (i.e., rodents and rabbits). To translate this work to the human body, it was decided to examine the relationship between VEGF and LH in higher order mammals (i.e., bovine and porcine models). This protocol uses the total protein lysate from the kidney cortex. Keys to this method&#39;s success include procurement of kidneys from slaughterhouse animals immediately after death as well as normalization of analyte levels (in the kidney extract) by total protein. This study successfully demonstrates a significant linear relationship between LH and VEGF in both bovine and porcine kidneys. The results are reproducible in two different species. The study provides supporting evidence that the use of kidney extracts from cows and pigs are an excellent, economical, and abundant resource for the study of renal physiology, particularly for examining the correlation between VEGF and other analytes.

Presented here is a protocol for utilizing a cortical kidney extract preparation and total protein normalization to demonstrate the correlation between vascular endothelial growth factor and luteinizing hormone in the mammalian kidney.

Demonstrieren einer linearen Beziehung zwischen vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor und Luteinizing Hormone in Nieren-Cortex-Extrakte

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

Isolierung humaner primärer Klappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...