Wir danken unseren Kollegen Stephen Hughes und Henry Levin für Ratschläge, die kritisch war die NGS-Protokoll für retrovirale Integrationsstelle Sequenzierung im Engelman Labor zu etablieren. Diese Arbeit wurde von der US National Institutes of Health gewährt AI039394 und AI052014 (bis ANE) und AI060354 (Harvard University Center for AIDS Research) unterstützt.

The authors have nothing to disclose.

Ein Protokoll für die Analyse der retroviralen Integrationsstellen von der ersten Virusinfektionsschritt durch Kartierung von genomischen Verteilungsmuster, beschrieben. Dieses Protokoll ist anwendbar auf jeden beliebigen Retrovirus und infizierbare Zelltyp. Darüber hinaus ist der Test sehr empfindlich Pipeline, mit dem Potential , eine zufriedenstellende Anzahl von einzigartigen Integrationsstellen von seriellen Verdünnungen der genomischen DNA äquivalent zu einer Infektion mit einer MOI von 6,4 x 10 -5 initiiert zu erholen. Diese Empfindlichkeit macht das Protokoll besonders nützlich, wenn Proben von infizierten Patienten angewendet, die eine niedrige Viruslast enthalten kann, in denen nur ein kleiner Teil der Zellen wird ein integriertes Provirus beherbergen. Im Einklang mit früheren Methodik Papiere in diesem Bereich 36,38,41-43, mehrere Schritte in der Bioinformatik Teil dieses Protokolls wird für die Verarbeitung von großen Dateien von Sequenzdaten von der Entwicklung individueller Skripte profitieren. Während 58 BLAT ist die mapping Dienstprogramm in diesem Protokoll beschrieben, können Benutzer finden Bowtie 67 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) eine geeignete Alternative zu sein. Eine alternative Bioinformatik Pipeline wurde zur Bestimmung von Moloney - Maus - Leukämie - Virus (MoMLV) Integrationsstellen 19 vor kurzem berichtet. Diese Pipeline ist nützlich, da es in Standalone-Software entwickelt wurde, die öffentlich zugänglich ist, und ist ganz in mächtig, dass es wurde ursprünglich verwendet, Hunderttausende von einzigartigen MoMLV Integrationsstellen abzubilden. Allerdings wurde die zur Verfügung stehende Software ursprünglich entwickelt, um speziell die gemeldete MoMLV-Datensatz neu analysieren, und so wäre die Neuprogrammierung notwendig, um die Pipeline zu gestalten experimentelle Designs (die Funktionalität des Werkzeugs zu wechseln wurde vor kurzem erweitert, um Adeno-assoziierten Virus und Tol2 umfassen und Ac / Ds - Transposon - Vektoren 68). Darüber hinaus beschrieben, dass das Protokoll die Erzeugung der vorläufigen Integrationsstelle .bedDatei, aber nicht spezifische Schritte erforderlich sind, um den Karten Websites Layout genomische Annotationen relevant. Leser können die &quot;Vector Integration Site - Analyse&quot; finden Server 69, die bei der Überprüfung des aktuellen Manuskript, nützlich zu analysieren , um die NGS - Sequenzen erzeugt unter Verwendung der hier beschriebene Protokoll veröffentlicht wurde. Bestimmte Punkte sollten hervorgehoben werden, wenn ein beliebiges Protokoll mit Hilfe retroviraler Integrationsstelle Datensätze zu analysieren. Wenn mehrere Bibliotheken in Tandem Vorbereitung besteht ein erhebliches Potenzial für eine Probe Kreuzkontamination. Selbst eine sehr geringe Höhe der Probenübersprechens können die Ergebnisse auf das Niveau verschleiern eine NGS Lauf unbrauchbar zu leisten. Deshalb sind alle Nassbank Arbeiten sollten in einem sterilisierten, gewidmet Laminarströmungsabzug oder PCR-Workstation abgeschlossen sein. Eine Reihe von Pipetten und Reagenzien wie nukleasefreiem Wasser sollte nur auf Integrationsstelle Verstärkung gewidmet sein. Die Verwendung von einzigartigen Linker für jede Bibliothek Vorbereitung kann das Potenzial begrenzenfür Querverstärkung und auch für die Identifizierung von Crossover erlauben liest in jeder Bibliothek in den rohen FASTA-Dateien. Es ist wichtig, die Vor-und Nachteile der Verwendung von Ultraschall-Behandlung im Vergleich zu Restriktionsendonukleaseverdau zu fragmentieren genomische DNA zu betrachten. Auf der einen Seite stellt Beschallung eine relativ zufällige Verteilung der Scherpunkte, aber die anschließend erforderlichen DNA-Reparatur und A-tailing Schritte konsequent die Ausbeute an Linkerligationsprodukte zu reduzieren, im Vergleich zu Ligationen mit dem Restriktionsenzym-erzeugten sticky ends durchgeführt. Auf der anderen Seite stellt Restriktionsenzymverdau eine weniger ausgezahlt Population von Scherstellen, die immer eine gewisse Tendenz in den gewonnenen Daten einführen. Verwendung einer Restriktions - Endonuclease stromaufwärts LTR - Sequenzen zu verwerfen wird in beiden Fällen (Figur 1) führen in dem Verlust eines kleinen Bruchteil der Integrationsstellen , die von dieser Stelle in dem Genom stromaufwärts liegen. Alle Daten, Bias, die zur Folge haben können, können ad seingekleidet durch die enzymatische Verdauung aus dem Protokoll während Bibliothek Vorbereitung weggelassen und die Vielzahl Herausfiltern von den Sequenzierungsdaten Upstream-LTR-Sequenzen von führt. Obwohl das aktuelle Protokoll sehr empfindlich ist und in der Lage Millionen von Integrationsstellen 21,40, nur etwa ein Drittel aller verfügbaren Integrationen zu erzeugen könnte erwartet werden , in einem bestimmten Experiment verstärkt werden , auch mit den besten der Bibliothek Zubereitungen (Ref. 70 und nicht veröffentlichte Beobachtungen). Dies kann zu Komplikationen führen, wenn die Proben aus niedrigen MOI Infektionen oder Patienten zu analysieren, die niedrige Viruslast beherbergen. Diese Einschränkung kann durch wiederholtes Sequenzierung der gleichen Bibliothek Vorbereitung und / oder Sequenzierung mehrere Bibliotheken abgeleitet von der gleichen DNA-Probe parallel im Teil überwunden werden. Zukünftige Erhöhungen der Assay-Empfindlichkeit entsprechend sehr vorteilhaft auf die Förderung translationale Anwendungen von retroviralen Integrationsstelle Sequenzierung.

Integration von viraler DNA (vDNA) in das Wirtszellgenom ist ein wesentlicher Schritt in dem retroviralen Lebenszyklus. Die Integration wird durch das virale Enzym Integrase (IN) erreicht, die zwei verschiedene katalytische Prozesse ausführt, die 1 bis zur Gründung des stabil eingeführt Provirus führen. IN - Untereinheiten greifen in die Enden der linearen vDNA , die durch reverse Transkription erzeugt wird, die höhere Ordnung intasome mit vDNA bilden Enden zusammengehalten von einem IN Multimer 2-4. IN spaltet die 3&#39; - stromabwärts gelegenen Enden der vDNA aus invariant 5&#39;-CA-3&#39; - Sequenzen in einem Verfahren , wie 3&#39;-Verarbeitung bekannt, so dass an jedem Terminus vDNA 5-8 mit reaktiven Hydroxylgruppen 3&#39; - Enden ausgespart. Die intasome wird anschließend in den Zellkern als Teil einer großen Anordnung von Host importiert und viralen Proteinen als preintegration Komplexes (PIC) bekannt 9-11. zelluläre Ziel-DNA (tDNA) Nach der Begegnung, verwendet in der vDNA 3&#39;-Hydroxyl groups die tDNA oberen und unteren Stränge in versetzter Weise zu spalten und Phosphatgruppen &#39;die vDNA zu tDNA 5 schließt sich gleichzeitig durch den Prozess der Strangtransfer 12,13. Retroviren zeigen Integration Präferenzen auf dem lokalen und globalen Maßstab. Auf lokaler Ebene bestehen Integrationsstellen Konsens von schwach konserviert Palindrom tDNA - Sequenzen, die von den vDNA Insertionsstellen 14,15 von etwa fünf Minuten vor zehn bp stromaufwärts und stromabwärts erstrecken. Weltweit 16 Retroviren zielen auf spezielle Chromatin Anmerkungen. Es gibt sieben verschiedene retrovirale Gattungen - alpha durch epsilon, lenti und spuma. Die Lentiviren, darunter HIV-1, begünstigen die Integration in den Körpern der aktiv transkribierten Gene 17, während die gammaretroviruses bevorzugt in Websites Transkriptionsstart integrieren (TSS) und aktive Enhancer - Regionen 18-20. In scharfem Gegensatz dazu wird Spumavirus stark in Richtung heterochrom voreingenommenatic Regionen, wie zum Beispiel Gen-armen Lamina-assoziierte Domänen 21. Lokale tDNA Grundeinstellungen sind zu einem großen Teil diktiert durch spezifische Netze von Nukleoprotein Kontakte zwischen IN und tDNA 13,22,23. Für die Lentiviren und gammaretroviruses, Integration in Bezug auf genomische Annotationen ist zum großen Teil bestimmt durch Wechselwirkungen zwischen IN und verwandten zellulären Faktoren 24-27. Eine Änderung , die Besonderheiten der IN-tDNA Interaktion Netzwerk 13,22,23,28 und stören oder Re-Engineering IN-Host - Faktoren - Wechselwirkungen 25-27,29-32 Strategien sind nachweislich Integration auf lokaler und globaler Ebene retargeten sind. Die Macht der DNA-Sequenzierungsverfahren verwendet retroviralen Integrationsstellen zum Katalog immens in den letzten Jahrzehnten zugenommen. Integrationsstellen wurden in Pionierarbeit mit aufwendige Reinigung und manuelle Klonen Techniken gewonnen nur eine Handvoll von einzigartigen Websites pro Studie 33,34 zu ergeben.Die Kombination von LM-PCR - Amplifikation von LTR-Wirt - DNA Junctions mit der Fähigkeit, individuelle Integrationsstellen zu kartieren Mensch und Maus Entwurf das Feld transformiert Genomen, wobei die Anzahl der Seiten von exogenen Gewebekulturzellinfektionen zu mehreren hundert bis tausend 17 zunehmenden gewonnen , 18. Die jüngere Kombination von LM-PCR mit NGS Methodik Bibliothek Tiefe explodierenden gesendet. Im Einzelnen ergab Pyrosequenzierung in der Größenordnung von Zehntausenden von einzigartigen Integrationsstellen 30,35-38, während Bibliotheken durch die Verwendung von DNA - Clustering sequenziert können 19-21,39 Millionen von Sequenzen ergeben. Hier beschreiben wir eine optimierte LM-PCR-Protokoll zur Amplifikation und Sequenzierung von retroviralen Integrationsstellen DNA-Clustering NGS verwenden. Das Verfahren beinhaltet erforderliche Adaptersequenzen in die PCR-Primer und damit direkt in die amplifizierte DNA-Moleküle, wodurch ausgeschlossen ist die Voraussetzung für eine zusätzliche Adaptorligation Schritt vor der Sequencing 40. Die bioinformatische Analyse-Pipeline, von der Analyse der rohen Sequenzdaten für LTR-Wirts-DNA-Kreuzungen zur Kartierung der einzigartigen Integrationsstellen genomische Funktionen relevant, ist auch allgemein beschrieben. In Übereinstimmung mit der Priorität aus früheren methodologischen Protokolle auf diesem Gebiet etabliert 36,38,41-43 können benutzerdefinierte Skripts die Fertigstellung der einzelnen Schritte in der Bioinformatik Pipeline zur Unterstützung entwickelt werden. Die Nützlichkeit und die Empfindlichkeit des Protokolls wird durch Amplifizieren Sequenzierung mit repräsentativen Daten veranschaulicht, und Abbilden HIV-1 Integrationsstellen von Gewebekulturzellen in der ungefähren Multiplizität der Infektion (MOI) von 1,0 infiziert sind, sowie eine Titrationsreihe dieser DNA DNA nicht infizierte Zell Schritte in verdünnten bis 5-fach zu einer maximalen Verdünnung von 1: 15.625 die ungefähre äquivalente MOI von 6,4 x 10 -5 zu erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1326">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">DMEM</td>
			<td style="width:199px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">11965-084</td>
			<td style="width:780px;">Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">SH 30088.03</td>
			<td>Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">30-002-Cl</td>
			<td>Antibiotics to be added to DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:199px;">Mediatech</td>
			<td style="width:111px;">21-040-CV</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">25-053-CI</td>
			<td>Used to detach adherent cells from tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">PolyJet</td>
			<td style="width:199px;">SignaGen Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">SL100688</td>
			<td>DNA transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">0.45 &#181;m Filters</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td>09-740-35B</td>
			<td>Used to filter virus particle-containing cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Turbo DNase</td>
			<td style="width:199px;">Ambion</td>
			<td style="width:111px;">AM2239</td>
			<td>Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">HIV-1 p24 Antigen Capture Assay</td>
			<td style="width:199px;">ABL Inc.</td>
			<td style="width:111px;">5447</td>
			<td>Used to quantify yield of virus production</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td style="width:199px;">Qiagen</td>
			<td style="width:111px;">69506</td>
			<td>Used to purify genomic DNA from cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Sonicator</td>
			<td style="width:199px;">Covaris</td>
			<td style="width:111px;">S2</td>
			<td>With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:199px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">G-3250-125</td>
			<td>Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:199px;">Qiagen</td>
			<td style="width:111px;">28106</td>
			<td>Used to purify DNA during library construction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">End-It DNA End-Repair Kit</td>
			<td style="width:199px;">Epicentre</td>
			<td style="width:111px;">ER81050</td>
			<td>Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Klenow Fragment (3&#39;-5&#39; exo&#8211;)</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs (NEB)</td>
			<td style="width:111px;">M0212S</td>
			<td>Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">dATP</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">R0141</td>
			<td>Deoxyadenosine triphosphate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">MseI</td>
			<td style="width:199px;">NEB</td>
			<td>R0525L</td>
			<td>Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">BglII</td>
			<td style="width:199px;">NEB</td>
			<td style="width:111px;">R0144L</td>
			<td>Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:199px;">NEB</td>
			<td style="width:111px;">M0202L/6218</td>
			<td>Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DNA Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom</td>
			<td>Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs &#60;30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Advantage 2 Polymerase Mix</td>
			<td style="width:199px;">Clontech</td>
			<td style="width:111px;">639202</td>
			<td>Commercial mix containing DNA polymerase for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">dNTPs (100 mM solutions)</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">R0181</td>
			<td>Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Spectrophotometer for determination of DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Qubit Fluorimeter</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">Qubit&#174; 3.0</td>
			<td>Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">2200 TapeStation System</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:111px;">G2964AA</td>
			<td>Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">MiSeq</td>
			<td style="width:199px;">Illumina</td>
			<td style="width:111px;">SY-410-1003</td>
			<td>Used for NGS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

amplification, next-generation sequencing, and genomic dna mapping of retroviral integration sites

Retroviren zeigen Unterschrift Integration Präferenzen auf beiden lokaler und globaler Ebene. Hier präsentieren wir ein ausführliches Protokoll für (1) Erzeugung verschiedener Bibliotheken von retroviralen Integrationsstellen mit ligationsvermittelte PCR (LM-PCR) und Next-Generation-Sequencing (NGS), (2) die Abbildung der genomischen Ort jedes Virus- Host-Junction mit bedtools, und (3) die Daten für statistische Relevanz zu analysieren. Genomische DNA aus infizierten Zellen extrahiert wird durch Verdau mit Restriktionsenzymen oder durch Beschallung fragmentiert. Nach geeigneter DNA end-Reparatur werden doppelsträngigen Linker ligiert an die DNA-Enden, und semi-nested PCR wird unter Verwendung der Primer komplementär zu sowohl der langen terminalen Wiederholung (LTR) Ende des Virus und dem ligierten Linker-DNA durchgeführt. Die PCR-Primer tragen Sequenzen für DNA clustering während NGS erforderlich ist, das Erfordernis für separate Adaptorligation negieren. Qualitätskontrolle (QC) wird durchgeführt, um DNA-Fragment Größenverteilung zu bewerten und anzupassener DNA-Einbau vor NGS. Sequence-Ausgabedateien werden gefiltert für LTR-haltigen liest, und die Sequenzen der LTR und den Linker definieren, werden abgeschnitten entfernt. Getrimmten Wirtszellsequenzen sind mit einem Bezugsgenom kartiert BLAT verwenden und für minimal 97% Identität zu einem eindeutigen Punkt in dem Referenzgenom filtriert. Einzigartige Integrationsstellen sind für benachbarte Nukleotid (nt) Sequenz und Verteilung in Bezug auf verschiedene genomische Merkmale geprüft. Unter Verwendung dieses Protokolls, Integrationsort Bibliotheken von hoher Komplexität kann von genomischer DNA in drei Tagen konstruiert werden. Das gesamte Protokoll, das exogene virale Infektion von empfänglichen Gewebekulturzellen zur Integrationsstelle umfasst Analyse kann somit in etwa ein bis zwei Wochen durchgeführt werden. Neue Anwendungen dieser Technologie beziehen sich auf Langzeitanalyse von Integrationsstellen von HIV-infizierten Patienten.

Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments , die Empfindlichkeit von NGS zu veranschaulichen für die Integrationsstellen von einer Kultur von infizierten Zellen gewonnen wird . Nicht infizierte Zell - DNA wurde in dem im Durchschnitt jede Zelle eine Integration 40 enthaltene genomische DNA von einer Infektion zu seriell verdünnt verwendet. 15.625: Verdünnungen wurden in Schritten von fünf zu einer maximalen Verdünnung von 1 hergestellt. Genomischer DNA in der Titrationsreihe wurde dann durch Beschallung fragmentiert oder durch Verdau mit Restriktionsendonukleasen MseI und BglII, gefolgt von LM-PCR. Die Anzahl der einzigartigen Integrationsstellen, sowie die Anzahl der Stellen Mapping proximal zu ausgewählten genomischen Annotationen, wurden nach dem obigen Protokoll berechnet. Die Datenanalyse ergab, Dutzende von einzigartigen Integrationsstellen (1-2% der Menge erholte sich von ordentlich genomische DNA) aus Bibliotheken aus Zellen hergestellt gewonnen, wo in der Theorie nur eine in 15.625 infiziert war. </p&gt; Wenn Integrationsstelle Datensätze Analyse ist es wichtig, die Daten zu einem aufeinander abgestimmten Satz von zufälligen genomischen Standorten zu vergleichen, die ein angepaßtes zufallsgesteuert oder MRC genannt wird. Da die repräsentative Ergebnisse genomische DNA durch Restriktionsenzym-Verdau oder durch Beschallung geschert werden zwei verschiedene Datensätze MRC wurden konstruiert. MRC enz enthielt 50.000 einzigartige genomische Websites , die durch zufällig Websites von hg19 in der Nähe zu den Standorten der MseI und BglII Restriktionsenzymverdau, während MRC zufällig beherbergte 10.000 Standorte erzeugt ohne Normalisierung für Entfernung von Set genomischen Marker ausgewählt wird . Nur die Websites, die auf einer einzigartigen genomischen Stelle abgebildet zurück werden können, sollten in MRC-Datensätze verwendet werden. Als Beschallungs Scheren genomischer DNA im Wesentlichen frei von Sequenz Bias, MRC zufällig durch Fragmentierung der DNA durch Beschallung hergestellt , wie mehr für Datensätze angezeigt werden. Eine alternative Art der SteuerungsintegrationWebsite - Datenmenge kann durch Umsetzen von rekombinanter Proteingehalt , intasome Nukleoproteinkomplex 21 oder PICs extrahiert aus akut infizierten Zellen 17 mit deproteinierten genomischen DNA und dann im Anschluss an die LM-PCR und NGS Protokolle 21 in vitro erzeugt werden. P - Werte für einen Vergleich der Verteilung der Integrationsstellen gewonnen durch Beschallung gegen Restriktionsverdau (Vergleich zwischen dem ordentlichen Proben), sowie zum Vergleich mit dem MRC enz und MRC Zufalls sind in Figur 2 dargestellt. Die Verteilung der Integrationsstellen gewonnen folgende Beschallen war ähnlich denen durch Restriktions gewonnene Enzym für alle Anmerkungen verdauen sucht, mit der größten Varianz offensichtlich in Bezug auf die Nähe zu CpG islands. Wie erwartet 18,65 beide Datensätze unterschieden sich signifikant von den MRCs in Bezug auf Integrationen innerhalb RefSeq Gene und Gen - dichte rund um die durchschnittliche Integrationsstelle, während beide Datensätze zu den MRCs waren ähnlich in Bezug auf die Verteilung relativ zu CpG-Inseln und TSS. Da relativ wenige HIV-1 Integrationsstellen innerhalb von 2,5 kb einer CpG Insel oder TSS Karte erholte sich die Gesamtzahl der Seiten zu erhöhen , ist wahrscheinlich , um die Variabilität zu verringern , die zwischen Datensätzen (Tabelle 4 und Figur 2) entstehen können. Sequence Logos die Echtheit der Integrationsstelle Daten zu bestätigen , die in 3 gezeigt. Die Consensus - HIV-1 - Integrationsstelle 14,22 (-3) TDG (G / V) TWA (C / B) CHA (+7) ( auf Basis der international Union of Biochemistry Basiscodes geschrieben, der Backslash zeigt die Position des vDNA Plus-Strang verbinden, und die unterstrichenen zeigt die 5-bp-Sequenz nach der HIV-1-Integration und DNA-Reparatur dupliziert) ist offensichtlich für Bibliotheken, die von beiden Fragmentierungstechniken hergestellt, obwohl der Grad der Sicherheit nimmt mit zunehmender Verdünnung der infizierten ZelleDNA. Die zufälligen Stellen aus dem MRC-Datensatz hingegen ausgerichtet ist fehlgeschlagen spürbare Mengen an Basispräferenzen zu erzeugen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53840/53840fig1.jpg" /> Abb . 1: Flussdiagramm Abbildung der Integrationsstelle Bibliothek Vorbereitungen (A) generieren Virusstämme von HEK293T Zellen transfizieren, Ernte und Filterüberstand 48 Stunden später, konzentriert durch Ultrazentrifugation und infizieren Zielzellen mit geeigneten Konzentration des Virus. Mindestens fünf Tage nach der Infektion, extrahieren genomischer DNA. Siehe die Abschnitte 1 und 2 der Haupttext für weitere experimentelle Details. (B und C) Fragment gereinigter genomischer DNA durch Verdau mit Restriktionsenzymen oder durch Beschallung. Das Restriktionsenzym Cocktail sollte ein Enzym (zB BglII) umfassen spaltet stromabwärts von der vorgeschalteten viralen LTR-Zähler wählen , um für LM-PCR Verstärkung der internen vDNA Sequenzen. Grüne Stern und verzweigte Pfeil in (C) bezeichnen , dass BglII sollte nach Linker - Ligation verwendet werden. Rote Highlights Virussequenz, während schwarze Highlights zelluläre Sequenz Host. Implizite DNA Bruchstellen (nicht maßstäblich) durch &quot;X&quot; markiert HIV-1 enthält zahlreiche MseI und BglII-Stellen; nur diejenigen, die für die Protokoll gezeigt. Die Klammern oberhalb der Karten bezeichnen die U5-Zell-DNA Regionen bevorzugt verstärkt durch LM-PCR. (D) Man reinige fragmentierte DNA (dann End-Reparatur und der A-Schwanz im Falle Beschallung) und ligieren bis (E) kompatibel asymmetrischen Linkermoleküle (blau gefärbt). Magenta Kreise in (D) zeigen die Integrationsstelle , die verstärkt werden. Sterne am 3&#39;-Enden der Linker kurzen Stränge bezeichnen Amino Blockierung Modifikationen. (F) Conduct erste Runde der Semi-Nested - PCR unter Verwendung der ersten Runde LTR - Primer (rot) und Linker - Primer (blau). in tseine PCR Runde kodiert die Linker-Primer für die DNA-Clustering und NGS Primer-Bindungssequenzen (zusammengefasst als grüne Anhängsel zum blauen Linker-Primer), während die LTR-Primer solche Sequenzen fehlt. (G) Reinige ersten Runde PCR - Produkt und zweite Runde der Semi-Nested - PCR durchzuführen. In dieser Runde der PCR, verwenden den gleichen Linker-Primer wie in der ersten Runde (Blau + Grün Anhängsel) zusammen mit der zweiten Runde LTR-Primer (rot), die DNA-Clustering und NGS Primerbindungssequenzen sowie einem Barcode zum Multiplexen trägt ( gruppiert als grüne Anhängsel an den roten LTR-Primer). (H) Reinige zweite Runde PCR-Produkt als letzte Bibliothek Integrationsstelle (in Magenta geboxt, mit Integration vor Ort durch Magenta Kreis markiert). Senden aliquoten zu Sequenzierungseinrichtung für QC und NGS. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53840/53840fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53840/53840fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt = &quot;2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53840 / 53840fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2:. P - Werte für einen Vergleich der Integration Seiten Amplified Nach dem DNA - Fragmentation durch Ultraschall - Behandlung oder durch Restriktionsenzymverdau gegen Jeweilige MRCs Zahl der Integrationsstellen innerhalb RefSeq Genen und in der Nähe CpG - Inseln und TSS sowie regionale Gendichte Profile werden aufgelistet in . Tabelle 4 P - Werte ≥ 0,05 in Fett- und Kursivdruck hervorgehoben sind ein P - Werte berechnet , indem exakten Fisher-Test b P - Werte berechnet durch Wilcoxon - Rangsummentest c MRC enz:... angepasst Zufallskontrolle; eine Reihe von 50.000 einzigartige Integrationsstellen wurde durch zufälliges Auswählen Positionen in der Nähe MseI / BglII - Restriktionsstellen in hg Build produziert 19. d MRC random: Zufallssteuerung enthält 10.000 einzigartige Integrationsstellen von zufällig selecti produziert abgestimmtng Positionen in hg19 ohne Normierung auf Restriktionsstelle Nähe. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53840/53840fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53840/53840fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53840/53840fig3.jpg" /> Abbildung 3: Sequenz Logos Depicting HIV-1 - Basiseinstellungen von repräsentativen Experiment Bibliotheken Integration Websites von Bibliotheken hergestellt , indem man (A) Verdauung mit Restriktionsenzymen oder (B) Beschallungs WebLogo Software wurden ausgerichtet.. Jede Verdünnung in der Titrationsreihe dargestellt, aus ordentlich DNA an der Oberseite der Figur zur maximalen Verdünnung von 1: 15.625 an der Unterseite. (C) Sequence Logo für die MRC von 50.000 einzigartigen genomischen Seiten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung im wesentlichen in Baseneinbaus zu einer bestimmten Position. Genauer gesagt ist die total Höhe jeder Fehlerbalken entspricht dem Doppelten der kleinen Probenkorrektur 66, die in relativ kleinen Datenmengen für Unterschätzung der Entropie steuert. Die x-Achse repräsentiert Wirtszelle genomischer DNA nt Positionen relativ zu der Integrationsstelle am Punkt Null. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53840/53840fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53840/53840fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/53840/53840table1.jpg" /> . Tabelle 1: Oligonukleotidsequenzen für Linker Aufbau und PCR Amplification Linker-spezifische und zweiten Runde LTR - Primern codieren DNA clustering Adaptersequenzen, die farbcodiert sind wie folgt: Schwarz, Basen komplementär zu dem Linker oder an die HIV-1 LTR; rot, eindeutigen Index oder Barcode; grün, Sequenzierungsprimer-Bindungsstellen; blau, Adaptersequenzen für DNA-Clustering. Einseitige (SE) Sequenzierung reactions die Sequenzierungsprimer verwenden , die in die zweite Runde LTR - Primer READ1 (grün) Sequenz anlagert, während Paired-End (PE) Reaktionen sowohl verwenden (READ1 und READ2) Sequenzierprimer a . Linker kurze Stränge enthalten 3 &#39;Amino blockiert Modifikation. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53840/53840table1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53840/53840table1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> So fügen Sie pro Reaktion </td></tr><tr><td> Erste Runde LTR-Primer (15 &amp; mgr; M): </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> Linker-spezifischen Primer (15 uM): </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10x PCR-Puffer: </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> dNTPs (jeweils 2,5 mM) </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> DNA-Polymerase-Mix: </td><td> 0,5 ul</td></tr><tr><td> Ligierungsreaktion: </td><td> 100 ng </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser: </td><td> bis zu 25 &amp; mgr; l </td></tr></tbody></table> Tabelle 2:. Rezept für die erste Runde PCR Die Menge jeder spezifizierten Reagenzes an jede einzelne PCR - Röhrchen hinzugefügt werden , ist angegeben. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> So fügen Sie pro Reaktion </td></tr><tr><td> Zweite Runde LTR-Primer (15 &amp; mgr; M): </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> Linker-spezifischen Primer (15 uM): </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10x PCR-Puffer: </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> dNTPs (jeweils 2,5 mM) </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> DNA-Polymerase-Mix: </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> Erste Runde PCR: </td&gt; <td> 100 ng </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser: </td><td> bis zu 25 &amp; mgr; l </td></tr></tbody></table> Tabelle 3:. Zweite Runde PCR Rezept Die Menge jedes Reagenz zu jedem PCR - Röhrchen hinzugefügt werden , ist angegeben. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bibliothek </td><td> #Unique Seiten </td><td> % RefSeq ein </td><td> % CpG +/- 2,5 kb b </td><td> % TSS +/- 2,5 kb c </td><td> Durchschn. Gene Dichte +/- 500 kb d </td></tr><tr><td> Ultraschall-Behandlung, ordentlich </td><td> 3169 </td><td> 71.2 </td><td> 5.1 </td><td> 3.7 </td><td> 15.8 </td></tr><tr><td> Beschallen, 1: 5 </td><td> 366 </td><td> 75.1 </td><td> 2.7 </td><td> 3 </td><td> 16.3 </td></tr><tr><td&gt; Ultraschall-Behandlung, 01.25 </td><td> 254 </td><td> 74 </td><td> 7.1 </td><td> 5.1 </td><td> 16.7 </td></tr><tr><td> Beschallen, 1: 125 </td><td> 430 </td><td> 69,8 </td><td> 6.9 </td><td> 6 </td><td> 14.6 </td></tr><tr><td> Beschallen, 1: 625 </td><td> 314 </td><td> 65,6 </td><td> 5.6 </td><td> 6.7 </td><td> 13.5 </td></tr><tr><td> Beschallen, 1: 3.125 </td><td> 116 </td><td> 73,6 </td><td> 3.5 </td><td> 2.5 </td><td> 13.1 </td></tr><tr><td> Beschallen, 1: 15.625 </td><td> 72 </td><td> 62,5 </td><td> 0 </td><td> 1.4 </td><td> 14.7 </td></tr><tr><td> Digest, ordentlich </td><td> 7428 </td><td> 69,8 </td><td> 3.6 </td><td> 2.9 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> Digest, 1: 5 </td><td> 1460 </td><td> 71,4 </td><td> 4.4 </td><td> 3.4 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> Digest, 01.25 </td><td> 394 </td><td> 68,8 </td><td> 4.3 </td><td> 3.3 </td><td> 15.8 </td></tr><tr> &lt;td&gt; Digest, 1: 125 </td><td> 172 </td><td> 71 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 14 </td></tr><tr><td> Digest, 1: 625 </td><td> 134 </td><td> 73,9 </td><td> 3.7 </td><td> 3.7 </td><td> 14.1 </td></tr><tr><td> Digest, 1: 3.125 </td><td> 100 </td><td> 83.1 </td><td> 6.4 </td><td> 5.2 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> Digest, 1: 15.625 </td><td> 73 </td><td> 74 </td><td> 4.1 </td><td> 1.4 </td><td> 9.7 </td></tr><tr><td> MRC enz e </td><td> 50.000 </td><td> 44.7 </td><td> 4.2 </td><td> 4 </td><td> 8.7 </td></tr><tr><td> MRC zufällig f </td><td> 10.000 </td><td> 41.3 </td><td> 5.3 </td><td> 4.2 </td><td> 8.6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Genomic Verteilung der Integrationsstellen von repräsentativen Titrationsreihe Der Prozentsatz der gesamten Integrationsstellen th.im Herbst innerhalb RefSeq Gene, b innerhalb von 2,5 kb von CpG - Inseln, und c innerhalb von 2,5 kb von TSS d Die Gendichte innerhalb von 1 Mb die durchschnittliche Integrationsstelle rund um e MRC enz:.. zufallsgesteuert abgestimmt; eine Reihe von 50.000 einzigartige Integrationsstellen wurde durch zufälliges Auswählen Positionen in der Nähe MseI / BglII - Restriktionsstellen in hg19 erzeugt f MRC zufällig. angepassten Kontroll zufällig durch zufälliges Auswählen Positionen in hg19 ohne Normierung auf festen Positionen produziert 10.000 einzigartige Integrationsstellen enthält.

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Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

amplification-next-generation-sequencing-genomic-dna-mapping

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

17.5K Aufrufe.  Dana-Farber Cancer Institute. We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Serie: Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Forschung

Biologie

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomic MRI - eine öffentliche Ressource für ein Studium Sequence Patterns in genomischer DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...