The authors have no acknowledgements.

Dieses Protokoll folgt die institutionellen ethischen Richtlinien für die Forschung an menschlichen Proben und informierte Zustimmung wurde von allen Spendern beteiligt erhalten. Zulassung für den hier beschriebenen Experimenten wurde von der Institutional Review Board der Universitätsklinik Antwerpen erhalten. Hinweis: Temperaturangaben sind immer Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. 1. Vorbereitung Flusskammer-Setup <ol><li> Vorbereiten Lanes, Schläuche und Pins <ol><li> Vortex die Kollagensuspension kräftig und verdünnt 1/20 in der isotonischen Glucoselösung vom Anbieter zu einer Endkonzentration von 50 &amp; mgr; g / ml geliefert. Hinweis: Wir verwenden Kollagen Pferde-Sehne, hauptsächlich bestehend aus Typ-I-Fibrillen. Die Pferde-Kollagen Typ I wird oft bezeichnet als &quot;Horm&quot; Kollagen und ist der goldene Standard für diese Art von Test 9 für sowohl historische als auch biologische Gründe. Menschliche Kollagen Typ III kann auch verwendet werden, aber the Fibrillen weniger gut beschichten und die Blutplättchenantwort ist nicht so stark. Andere Beschichtungsflächen , können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise von Willebrand - Faktor (vWF), Fibrinogen, Fibronectin, Laminin, Vitronektin, Thrombospondin-1 oder Kombinationen dieser 16. </li><li> Nehmen Sie eine neue Einweg-Biochips aus dem Behälter des Anbieters. Die Abmessungen der Biochips hier verwendeten 0.4W x 0,1H x 20L in mm 3. </li><li> Pipettieren 0,8 ul in die Spur (en) des mikrofluidischen Biochip an einem Ende des Chips und Marke als Auslass. Stellen Sie sicher, dass die Spur gefüllt ist 5 / 6. mit der kollagenhaltigen Beschichtungslösung in 1.1.1 bereit. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen. Anmerkung: Die Kanäle sind teilweise zu vermeiden Anhäufung von Kollagenfasern am Eingang des Kanals (siehe Diskussion) beschichtet. </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für 4 Stunden oder über Nacht in einer befeuchteten und geschlossenen Behälter. </li><li> Blockieren die beschichteten Kanäle durch Pipettieren Blockierungspuffer (1,0% (w / v) Rinderserumalbumin eind 0,1% (w / v) Glucose in 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) gepufferten Salzlösung (HBS; 0,9% (w / v) NaCl, pH 7,4) am anderen Ende und Mark als Einlass. Stellen Sie sicher, dass die Spur vollständig mit dem Blockierungspuffer unter Vermeidung von Luftblasen gefüllt ist. </li><li> Schneiden Sie Schlauch bei gleicher Länge (12 cm). Verwenden Sie eine pro Spur und verbinden jeden Schlauch mit einem Stift. Zum Beispiel kann ein Experiment zwei Bedingungen, führen in doppelter Vergleich wird vier Rohrstrecken und vier Stifte erfordern vorbereitet werden. </li><li> Spülen Sie den Schlauch mit destilliertem Wasser unter Verwendung einer Spritze und einer 26 G-Nadel oder die zugehörigen Anschlüsse. </li><li> Tränken Sie den Schlauch mit Blocking-Puffer. Speicher in einer geschlossenen und befeuchteten Behälter für mindestens 1 Stunde. </li></ol></li><li> Vorbereiten Pumpe und Verteiler <ol><li> Spülen Sie die Pumpe und Verteiler mit destilliertem Wasser, Luftblasen zu entfernen. </li><li> Saugen Sie das Blockierungspuffer aus der Biochip-Spur (n) am Ausgang des Fest 10 ul Spitze verwenden. Reinigen Sie die Oberfläche vonfrei wischen und denaturierten Alkohol Drucke und Staub entfernen der Biochip mit einer Genauigkeit Staub. </li><li> Befestigen Sie den Biochip auf einem automatisierten Mikroskoptisch. Wenn mehr als eine Spur gleichzeitig in einem Durchlauf verwendet wird, schließen Sie den Achtweg Verteiler Splitter zum Biochip Steckdose. Hinweis: Die achtspurige Verteiler Splitter ein Stück Hardware (Abbildung S1) ist mit der Pumpe und dem Biochip verbunden. Es ermöglicht den Betrieb aller verfügbaren (acht) Spuren auf einem Biochip oder eine Kombination von Spuren, die vom Bediener definiert in der zugehörigen Software sein kann. </li><li> Verwenden Sie die Stifte in den Schlauch sie in dem Biochip Einlass zu beheben. Legen Sie das andere Ende des Schlauchs (ohne Stift) in einem 1,5 ml konischen Röhrchen mit HBS gefüllt. Spülen Sie alle Schläuche und ihre angeschlossenen Bahnen mit 1 ml HBS mit der Pumpe, um Rest-Blockpuffer zu entfernen und schlecht Kollagen haften. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Blutproben <ol><li> Sammlung und Trennung vonfrisches Vollblut aus einem gesunden Freiwilligen. 17 <ol><li> Sammeln Sie die ersten Milliliter Blut in einem evakuierten Rohr (EDTA) als Antikoagulans enthält, und verwenden Sie ausschließlich diese Probe für die komplette Blutbild (CBC) mit einem automatisierten Hämatologie-Analysegerät. </li><li> Sammeln Sie ein Volumen von Blut in einem geeigneten Antikoagulans Vakuumröhren. Standard Antikoagulantien zur Strömungskammer Experimente sind Heparin oder Hirudin, wenn die Bildung Fibrin nicht Bestandteil des Studienprotokolls und Natriumcitrat, wenn es ist. Hinweis: Heparin wurde als Antikoagulans für alle Experimente verwendet in den Ergebnissen beschrieben. Anmerkung: Die Menge an Blut auf die Anzahl der Experimente abhängig durchgeführt werden. Etwa 1 Rohr (7 ml) für 3 Spuren. </li><li> Die Röhrchen auf einem Rotator anhängige Blut Rekonstitution. Hinweis: Der Test sollte innerhalb von 3 Stunden von Aderlass abgeschlossen sein. </li><li> Zentrifuge für 15 Minuten bei 250 g plättchenreiches Plasma herzustellen (PRP). Verwenden Sie die Zentrifuge nicht brechen Störung des lose gepackten Pellets zu verhindern. <ol><li> Wenn mehr als ein Röhrchen gesammelt wurde, bündeln das Blut in einem einzigen konischen Zentrifugationsröhrchen. Hinweis: Zentrifugierung langsamer oder weniger lange durchgeführt werden kann, abhängig von der PRP-Ausbeute und Differentialzelle &quot;Kontamination&quot; bevorzugt. </li></ol></li><li> Entfernen und entsorgen Sie die PRP und Leukozytenmanschette gepackten roten Blutkörperchen mit wenigen Thrombozyten führt. Hinweis: Die Thrombozytenzahl in der gepackten roten Blutkörperchen Fraktion 13 ± 5 x 10 3 pro ul (Mittelwert ± SD, n = 12) im Durchschnitt in unseren Händen. </li></ol></li><li> Blut Rekonstitution <ol><li> Thaw Blutgruppe AB (Rhesus-D-negativ) Plasma bei 37 ° C für 5 Minuten und 20 Sekunden pro 4 ml. </li><li> Bestimmen Sie den Hämatokritwert der gepackten roten Blutkörperchen hergestellt in 2.1.5 eine automatisierte Hämatologie-Analysegerät verwendet wird. </li><li> Bestimmen Sie die Blutplättchenkonzentration in der Blutbank vorbereitet Blutplättchenkonzentrat that wird verwendet, um den roten Zellfraktion oben zu rekonstituieren. </li><li> Berechnen Sie das Volumen der gepackten roten Blutkörperchen und Thrombozyten-Konzentrat, das 40% Hämatokrit und 250 x 10³ Blutplättchen / ul in einer 1-ml-Probe ergibt. Anmerkung: Weitere Ziel Titer von Zellen kann beliebig eingestellt werden, abhängig von der Studienprotokoll. </li><li> Transfer der roten Blutzellen und Plasma in ein frisches Röhrchen verpackt ein abgeschnittenes Pipettenspitze verwendet und Plättchenkonzentrat hinzufügen, bis ein Probenvolumen von 1 ml erreicht ist. Hinweis: In Abhängigkeit von den untersuchten Variablen sollte die Plasmafraktion in allen rekonstituierten Proben gleich sein, weil Plasma einen signifikanten Einfluß auf die Thrombusbildung Rate hat. Zum Beispiel, wiederholte Einfrieren und Auftauen oder Plasma von verschiedenen Spendern oder auf verschiedenen Antikoagulantien genommen kann das Ergebnis beeinflussen. </li><li> Mischen Sie das aufgelöste Blut sanft durch Umdrehen und führen Sie einen CBC. </li><li> Bereiten Sie eine &quot;leere&quot; Kontrollprobe, in der das Volumen der Thrombozytenfraktion ersetzt wirddurch das gleiche Volumen von 0,9% (m / v) Natriumchlorid in Wasser , um die Konzentration von endogenen Thrombozyten (dh nicht-Blutbank - Blutplättchen) in dem rekonstituierten Blut unter Verwendung eines CBC zu bestimmen. </li></ol></li><li> Beschriftung <ol><li> Pipette 1 ml rekonstituiert Blut in einem Teströhrchen, enthaltend 1 &amp; mgr; l 5 mM Calcein AM (5 &amp; mgr; M Endkonzentration). Hinweis: Andere Zellfarbstoffe 14 verwendet werden kann. </li><li> Vorsichtig mischen durch Umdrehen. </li><li> Inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C vor der Verwendung. </li></ol></li></ol> 3. Perfusions-Assay <ol><li> Konzentrieren Sie das Ziel auf den Kollagenfasern an der Unterseite der Bahnen verklebt. Idealerweise verwenden Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast (DIC) Einstellungen für diese Fokussierungsstrategie. Wählen Sie &#39;Set aktuellen Z für ausgewählte Fliese Regionen &quot;in der Experiment-Software digital die ausgewählten Z-Positionen fixieren. </li><li> Wählen Sie eine Region of Interest (ROI) in der Spur (xy) in der Experiment-Software des microscope, die während des Versuchs aufgezeichnet. Hinweis: Der ROI jeder Oberfläche beliebig innerhalb eines Perfusions-Spur gewählt werden kann. Es ist ratsam, nicht Thrombusbildung nahe dem Ein- und Ausgang einer Spur zu analysieren, um Nebenwirkungen des variablen Strömungsprofil in diesem Bereich zu vermeiden, auch wenn diese relativ klein ist. Die ROI-Oberfläche sollte eine beträchtliche Anzahl von Blutplättchen enthalten oder Nivellierung des Signals zu ermöglichen Thromben. In diesem Protokoll ist die ROI ein digital vernäht Aggregat von drei gleich große Seite-an-Seite - Bilder , was zu 0,62 mm 2 in der Mitte der 2 cm lange Spur. </li><li> Mischen Sie die Proben vorsichtig durch Umdrehen und positionieren diese neben dem Biochip auf der automatisierten Bühne. </li><li> Platzieren Sie den Schlauch, der mit dem Einlass des Biochips in den Teströhrchen mit den rekonstituierten Blutproben verbunden ist. </li><li> Starten Sie die Pumpe bei 50 dyn / cm 2 (oder eine andere Scherspannungen wie gewünscht) für diese Kanäle verbunden Röhren zu testenenthaltend die rekonstituierte Blutproben die Software der Pumpe. Hinweis: Andere Scherspannungen verwendet werden können. </li><li> Nehmen Sie Bilder alle 15 Sekunden für 5 Minuten in Echtzeit den Erwerb und Experiment-Software des Mikroskop. Hinweis: Andere Zeitreihen verwendet werden können, auf dem Versuchsaufbau abhängig. Anmerkung: Wir verwenden im allgemeinen eine 100-facher Vergrößerung (10X-Objektiv und 10X-Linsen), aber höher (oder niedriger) Vergrößerung einfach als Alternative verwendet werden kann. </li></ol> 4. Waschen Out <ol><li> Auswaschen alle Schläuche mit dem Auslass angebracht ist und mit dem Mehrkanal-Verteilerpumpe oder mit destilliertem Wasser, gefolgt von Natriumhypochlorit (Bleichmittel) 0,5% (v / v) und schließlich 0,1 M NaOH in Wasser. Entsorgen Sie den Schlauch an den Biochip Einlass als gefährlicher Abfall zu merken. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Bestimmen Sie Thrombus Wachstumskinetik mit der Bildanalyse-Software. Die folgenden Befehle sind spezifisch für ZEN2012. <ol&gt; <li> Öffnen Sie das Plugin Bildanalyse der Oberflächenabdeckung der Blutplättchen zu bestimmen. </li><li> Stellen Sie die Fluoreszenzschwelle in der Interactive Registerkarte Analysieren Sie die Pixelintensität zu definieren , die mit einem positiven Signal korreliert, dh einem anhaftenden Blutplättchen oder anhaftenden Blutplättchen. </li><li> Verwenden Sie Tabellen erstellen , um automatisch eine Tabelle erstellen , die die einzelnen Oberflächenbereiche (in &amp; mgr; m 2) dieser &quot;Objekte&quot; Pixel enthält , mit einem Signal zwischen den ausgewählten Schwellenwerten enthalten. Dies wird für jeden Zeitpunkt durchgeführt. Hinweis: Sobald Fluoreszenz Schwellen gewählt haben, automatisch die Analysesoftware &quot;Objekte&quot; im Sichtfeld, die die Kriterien erfüllen, erkennt. Diese Objekte sind Thromben, kleine Blutplättchenaggregaten oder einzelne Plättchen und umfassen eine Anzahl von Pixeln. Jedes Objekt wird in der Tabelle gesondert aufgeführt. </li><li> Speichern Sie diese Tabellen im XML-Format und öffnen Sie sie in einem Tabellenkalkulationsprogrammfür weitere Berechnungen. </li><li> Insgesamt die Oberflächenbereiche der ausgewählten Objekte durch Summierung und teilt das Ergebnis durch die Gesamtfläche des Meßfeldes (&amp; mgr; m 2). Dadurch wird die relative Flächendeckung (%) ergeben. Tun Sie dies für jeden Zeitpunkt. </li><li> Plotten diese Flächenbedeckungen in Funktion der Perfusionszeit und berechnen die Steigung durch lineare Regression, den Thrombus Wachstums kinetischer dieser bestimmten Bedingung erhalten wird. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Mikrofluidik - Strömungskammer Experimente sind ein hervorragendes Instrument Thrombozytenfunktion im fließenden Blut zu untersuchen und verwendet werden , die Hämostase in vitro in verschiedenen experimentellen Kontexten zu bewerten. Trotz schlechter Ring Standardisierung 9 zeigen wir , dass in unserem Labor die experimentelle Variation akzeptabel ist. Dies ermöglicht es, zuverlässig zu vergleichen (gepaart) Proben innerhalb einer gegebenen Studie. Dies wurde mit der gut dokumentierten Phänomen der Lagerung von Blutplättchen Läsion validiert, die eine schädliche Folge der Lagerung von Blutplättchen in Blutbank Bedingungen 11 ist. Darüber hinaus veröffentlichten wir vor kurzem die Auswirkungen der drei zur Verfügung stehenden Pathogeninaktivierung Technologien auf dem PC Thrombozytenfunktion in mikrofluidischen Strömungskammern nach der Rekonstitution von Blut 14,15. Die Blutplättchen reagieren unterschiedlich , wenn biophysikalischen und chemischen Parameter variiert 20 sind. Daher Schubspannung, Zellzahl und Zell composition, Temperatur, Beschichtung, Antikoagulans und viele weitere Faktoren können sich auf der Fragestellung innerhalb dieses Protokoll geändert werden, abhängig. Dieses Protokoll verwendet nur handelsübliche Hard- und Software-Tools, so dass andere Laboratorien einen ähnlichen Test durchzuführen. Für grundlegende Forschungszwecke kann dies ein Nachteil sein, vor allem, weil die zur Verfügung stehende Hardware ist weniger vielseitig als maßgeschneiderte Setups. Der Test selbst ist robust, aber die Reproduzierbarkeit leidet an biologischen und zeitlichen Variation. Daher müssen Assayproben so weit wie möglich zusammengepaßt werden und Größen studieren ausreichend groß sein sollte. Proben müssen auch zeitlich gepaart werden, weil rekonstituiert Blut nur für eine kurze Zeit gespeichert werden können. Obwohl mikrofluidischen Strömungskammern für die Thrombozytenfunktion Studien das Forschungsfeld vorangebracht haben, sollte mit Vorsicht vorgegangen werden, um die Thrombozyten Abhängigkeit von Blutrheologie zu überinterpretieren. Erstens ist die rechteckige Form der Strömungskammer nicht physiologischen, but die beste müssen wir optische erlauben auf das Wachstum von Thromben zu konzentrieren. Zweitens Blutgefäße nicht aus Kunststoff und dem Einfluss von Blutgefäßelastizität auf Plättchenfunktion gemacht kann daher nicht in diesem Protokoll untersucht werden. Drittens verursacht das Herz pulsatilen Fluss, während Spritzenpumpen mehr linear (obwohl auch leicht pulsierender) sind. Schließlich habe ich fibrillärem Kollagen Typ ist das Standardmaterial für die Blutplättchen-Studien unter Strömung verwendet, die tierischen Ursprungs ist. Bemerkenswert aber ich fibrillärem Kollagen Typ und klinische Ergebnisse für die Plättchenfunktion korrelieren gut in vielen Fällen als durch Jahrzehnte Erfahrung in der (Lichtdurchlässigkeit) 21,22 Aggregometrie gezeigt. Es gibt viele Assays , die Thrombozytenfunktion 23 zu untersuchen. Die meisten dieser Adresse ein oder ein paar Plättchen Merkmale während setzen Blutplättchen (Modelle) Hämostase zu arbeiten. Echtzeit-Bildgebung der Thrombusbildung wie hier gezeigt, ist die umfassendste, auf dem Laufenden. Das bedeutet, die meisten Aspekte der platelet Reaktion auf Gefäßverletzung enthalten sind. Einzigartige Vorteile sind die Einbeziehung von Durchblutung und die Anwesenheit aller Blutzellen. Der Test ist empfindlich gegenüber den derzeit verwendeten Arzneimitteln für gerinnungshemmende Therapie 24 sowie genetische Veränderungen durch in aberrant Thrombozytenfunktion 25. Dies zeigt, seinen Wert als relevanter Indikator für die Thrombozytenfunktion. Die umfassende Natur dieses Assays dennoch impliziert auch, dass es weniger als die analytische Assays Besonderheiten der plättchen Reaktion gemessen wird. Auswirkungen von Blutbanken Manipulationen auf die Thrombozytenkonzentrate können daher durch durch Strömungskammer Assays aufgenommen, aber zu interpretieren, was bewirkt, dass sie, ist eine zusätzliche Analyse erforderlich. Zum Beispiel zeigen unsere Daten, dass die Temperatur Thrombozytenadhäsion in mikrofluidischen Strömungskammern signifikant beeinflusst. Aber zusätzliche detaillierte Analyse hat gezeigt , dass Kühl Plättchen ihre Form verändern und Cluster GPIbα Rezeptoren 26. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Vielseitigkeit der Genehmigungen Klebefläche davon unterschiedliche reaktive Plättchensubstrate oder Kombinationen zu untersuchen. Neuere Arbeiten von De Witt et al. 16 demonstriert die Bedeutung von Substrat Definition der Systembiologie zur Thrombozyten. Außerdem ist die Kombination von variierenden Scherraten in Abhängigkeit von dem Substrat wichtig, weil auf immobilisierten vWf der Blutplättchen-Bindungs ​​werden hohen Scherraten erfordern, während dies weniger wichtig ist, an Kollagen zu binden. Daher ist je nach Fragestellung können Entscheidungen getroffen werden, auf welchen Substraten und ihre jeweiligen Strömungsgeschwindigkeiten berücksichtigt werden sollen. Abschließend präsentieren wir ein Protokoll für mikrofluidische Flusskammer Experimente Thrombozytenfunktion im Zusammenhang mit Blutbanken und Transfusionsmedizin zu studieren. Standardisierung Bemühungen sind im Gange 9,10,28-30 und die meisten dieser Empfehlungen sind in dem Protokoll vorgestellt enthalten. Die Rekonstitution von Blut ist ein Modell fürTransfusions aber zusätzliche Validierungsarbeiten sollte die Relevanz für die klinische Ergebnisse zeigen.

Hämostase erfordert die kombinierte Aktivität und regulierte von Zellen, Proteinen, Ionen und Gewebe in einem eingeschränkten Raum - Zeit - Rahmen 1. Unkontrollierte Aktivität kann in einem Spektrum von Erkrankungen zu Blutungen oder Thrombosen und Morbidität oder Mortalität führen zu Blutgerinnung im Zusammenhang. Ein mikrofluidischen Strömungskammer Experiment ist eine anspruchsvolle Technik , die Hämostase in vitro nachahmt. Dieser Ansatz ermöglicht Untersuchung des komplexen Zusammenspiel von Prozessen, die Teil der Hämostase mit einer führenden Rolle für Blutplättchen nehmen. Gefäßverletzung folgenden haften Blutplättchen an den exponierten subendothelialen Matrix (Glyko) Proteine ​​Blutverlust zu verhindern. Folgende Adhäsion, Blutplättchen zu aktivieren und zu aggregieren in Reaktion auf auto- und parakrine Signalisierung , die schließlich zur Bildung eines Plättchens Netzwerk führt, durch Fibrin stabilisiert , und was zu einer festen, gewickelten Thrombus 2 abdichtet. Im Gegensatz zu den meisten anderen Thrombozytenfunktionstests, Erfahgen mit Strömungskammern , um die physikalischen Parameter des Blutflusses und damit den Einfluss der Rheologie auf den beteiligten Zellen und Biomolekülen Berücksichtigung 3,4. Strömungskammer Experimente durch Variation Schlüsselparameter Grenzstein Einblicke in Hämostase und Thrombose erzeugt, die hämostatische (sub) beeinflussen Prozesse, einschließlich der Klebstoffmatrix, Rheologie und Strömungsprofile, zellulären Zusammensetzung, die Anwesenheit von Toxinen oder Medikamente, die Ionenstärke und viele mehr. In den vergangenen zwei Jahrzehnten geringen Durchsatz Flusskammer Experimente erfordern große Probenvolumina (10-100 ml) wurden zu mikrofluidischen Kammern oft entwickelt , bestehend aus kleinen Parallelplattenkammern und moderne Technologie auch für die Perfusion von Vollblut bei kontrollierter Wandscherbedingungen 5. Microscaling hat sich deutlich Assay Durchsatz meist erhöht, weil die Hardware-Setup vereinfacht und weniger (Blut) Volumen benötigt wird, wodurch das Experiment zugänglicher und Versatile. Zum Beispiel Blut von kleinen Labortieren kann nun ohne die Notwendigkeit verwendet werden, um Tiere zu opfern. Blutproben von gentechnisch veränderten Mäusen haben damit in der Identifizierung von Schlüsselmoleküle Förderung oder Hemmung Hämostase und in neue basische Erkenntnisse 6 unterstützt. Spezialisierte Forschungslaboratorien noch oft nach Maß Strömungskammern zum Beispiel aus Polydimethylsiloxan (PDMS) 7 verwenden , die auf lithogr Formen polymerisieren , die durch Software blueprinted werden kann. Die resultierende Kammer ist billig, Einweg und kann leicht für die Post-hoc-Analyse zerlegt werden. Darüber hinaus grundsätzlich jede Konstruktion von Schiffen, einschließlich Abzweigungen oder scharfe Kurven kann auf Befehl gebaut werden. Dieser Vorteil ist auch seine Nachteile, da die Standardisierung war bereits das primäre Problem mit Strömungskammer Experimente und PDMS Maß Kammern haben dies nicht unterstützt. Am Anfang dieser speziellen Frage, Beschichtung (Bedingungen), Fluoreszenzsonden, Antikoagulans, Temperatur und Zeit zwischen Probenahme und Analyse sind alle schlecht 8 standardisiert. Die Standardisierung dieser Variablen ist eine Herausforderung, aber dennoch den Vergleich der Ergebnisse zwischen den Laboratorien erforderlich zu ermöglichen. Dieses Thema ist das Hauptthema der Internationalen Gesellschaft für Thrombose und Hämostase in Wissenschaft und Standardisierung Unterausschuss für Biorheology 9,10. Thrombozytenkonzentrate (PC) sind bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen, die transfused Thrombozytopenie und / oder Blutungen verursachen. Aber Blutplättchen in PC sind bekannt zu desensibilisieren, insbesondere in Funktion der Lagerzeit 11 verbunden eine Verschlechterung Verfahren alterungs- und allgemein als Plättchenspeicher Läsion. Es wird manchmal behauptet , dass solche Thrombozyten bei Zirkulation wiederherzustellen einmal 12 transfused, aber Beweise dafür ist knapp. Ferner ist ein PC die Funktionalität von Plättchen bilden nicht routinemäßig getestet, weil die Beziehung zwischen solchen Assays undtherapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit ist unklar , 13. Mikrofluidik-Strömungskammern bieten ein Mittel der Thrombozytenfunktion in PC zu untersuchen, um die Kette von Manipulationen zwischen Sammlung und die Ausstellung zu optimieren. Es ist ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug für die direkte (gepaart) Vergleiche von PC , wie wir zuvor 14,15 veröffentlicht und wird hier beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1113">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD vacutainer tube with EDTA&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:268px;">368856</td>
			<td style="width:409px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD vacutainer tube with Heparin</td>
			<td style="width:220px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:268px;">368480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD vacutainer tube with Sodium Citrate</td>
			<td style="width:220px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:268px;">366575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hirudin Blood tube</td>
			<td style="width:220px;">Roche</td>
			<td style="width:268px;">6675751 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD vacutainer Eclipse</td>
			<td style="width:220px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:268px;">368650</td>
			<td>Blood collection needle with preattached holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips 100-1000</td>
			<td style="width:220px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:268px;">740290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips 2-200</td>
			<td style="width:220px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:268px;">739280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips 1-10</td>
			<td style="width:220px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">A08928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tube 5mL</td>
			<td style="width:220px;">Simport</td>
			<td style="width:268px;">11691380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical tube 15mL</td>
			<td style="width:220px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:268px;">1888271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical tube 50mL</td>
			<td style="width:220px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:268px;">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 mL Syringe</td>
			<td style="width:220px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Precision wipes</td>
			<td style="width:220px;">Kimtech</td>
			<td style="width:268px;">5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vena8 Fluoro+ Biochips</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">188V8CF-400-100-02P10</td>
			<td>Named in figure S1 A as &#39;Biochip&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vena8 Tubing</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td>
			<td>Named in figure S1 B as &#39;Disposable tubing&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vena8 Needles</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td>
			<td>Named in figure S1 B as &#39;Pin&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Connectors for single inlet cables of biochips</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">CONNECTORS-B1IC-PACK100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multiflow8 connect</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td>
			<td>Named in figure S1 B as &#39;Reusable tubing&#39; and &#39;Splitter&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Humidified box</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">HUMID-BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Software microfluidic pump</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">N/A</td>
			<td>Venaflux Assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horm Collagen</td>
			<td style="width:220px;">Takeda/Nycomed</td>
			<td style="width:268px;">1130630</td>
			<td style="width:409px;">Native equine tendon collagen (type I) 
			Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES buffered saline (HBS)</td>
			<td style="width:220px;">in house preparation</td>
			<td style="width:268px;">in house preparation</td>
			<td style="width:409px;">10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Blocking buffer</td>
			<td style="width:220px;">in house preparation</td>
			<td style="width:268px;">in house preparation</td>
			<td style="width:409px;">1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:220px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:268px;">C1430</td>
			<td style="width:409px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bleach 10%</td>
			<td style="width:220px;">in house preparation</td>
			<td style="width:268px;">in house preparation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.1M NaOH</td>
			<td style="width:220px;">in house preparation</td>
			<td style="width:268px;">in house preparation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Denaturated alcohol</td>
			<td style="width:220px;">Fiers</td>
			<td style="width:268px;">T0011.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mirus Evo Nanopump</td>
			<td>Cellix</td>
			<td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td>
			<td>with Multiflow8. Named in figure S1 A as &#39;Pump&#39; and &#39;Manifold&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Software microscope&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">N/A</td>
			<td>ZEN 2012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematology analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Table Top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>521-0095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Platelet incubater</td>
			<td style="width:220px;">Helmer</td>
			<td style="width:268px;">PF-48i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubation water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>A03429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube Roller</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>BTR5-12V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile docking device</td>
			<td style="width:220px;">Terumo BCT</td>
			<td style="width:268px;">TSCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing Sealer</td>
			<td style="width:220px;">Terumo BCT</td>
			<td style="width:268px;">AC-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex</td>
			<td style="width:220px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic flow chambers using reconstituted blood to model hemostasis and platelet transfusion in vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Um zu zeigen , Variation intra-assay, drei identische rekonstituierten Vollblutproben wurden gleichzeitig über Kollagen - beschichteten Oberflächen (Abbildung 1) perfundiert. Dies führte zu einem Variationskoeffizienten von 8,7%. Diese Statistik deutet darauf hin, akzeptabel Intra-Assay und labor Variation zuverlässigen Vergleich zwischen verwandten Proben ermöglicht. Der Einlass der kommerziellen Strömungskammer wir hier beschreiben, ist senkrecht zur Messkammer und diese leicht turbulent an diesem Punkt anstelle einer laminaren Strömung verursachen. Insbesondere in Versuchen ohne Gerinnungshemmung verursachen kann dies aufgrund der erhöhten Kontaktzeit zwischen dem Blut Verstopfungen und dem immobilisierten Agonist. Der verstopfte Einlass kann das Auslesen durcheinander bringen stromabwärts in der Kammer. Daher wurde die Einrichtung durch teilweises Beschichten der Strömungskammer (2) optimiert Verlassen derEinlässe frei von Thrombozyten-Agonisten, wodurch die Vermeidung vorzeitigen Aktivierung von primären und sekundären Hämostase. Partielle Beschichtung von Klebeflächen zudem erfolgreich von anderen Forschungsgruppen im Bereich 16 verwendet. Darüber hinaus ist diese einfache praktische Trick eine Bereicherung der &quot;Übergang&quot; Zone zu untersuchen, wo das Blut über die nicht-reaktiven (unbeschichteten) Oberfläche fließt der reaktiven weiter über (beschichtet) Teil. Transfusions wurde simuliert, indem Blut mit der mangelhaften Komponente Rekonstitution. Zu diesem Zweck wird antikoaguliertes Vollblut von einem gesunden Spender thrombozytopenische durch differentielle Zentrifugation und PC Blutplättchen gemacht wurde zugegeben Thrombozytenzahlen zu erhöhen. Eine wichtige Frage hier war, was Thrombozytenzahl für Ziel? In den meisten Fällen Bluttransfusionen real-life nicht zu einer Normalisierung der Thrombozytenzahl im thrombozytopenische Patienten. Vielmehr ein Wert über einer bestimmten Schwelle angestrebt,obwohl die genaue 19 Zielwert schlecht definiert. Um zu verstehen , den Einfluss unterschiedlicher Thrombozytenzahlen auf mikrofluidischen Strömungskammern Ergebnisse im Zusammenhang mit der Blut Rekonstitution wurden mehrere Rekonstruktionen durchgeführt mit abnehmender Thrombozytenkonzentrationen (Abbildung 3). Wie erwartet, niedriger führte Thrombozytenzahl in weniger Haftung in Abhängigkeit von Perfusionszeit. Daher innerhalb einer gegebenen Studie sollte die Thrombozytenzahl standardisiert werden 20 Vergleich zwischen Probenbedingungen zu ermöglichen. Die bloße Tatsache, dass es weniger Haftung, wenn die Thrombozytenzahl gering bedeutet jedoch nicht, dass der Test nicht die Blutplättchenablagerung in thrombozytopenische Proben verwendet werden können, zu messen, weil die Mikroskopie und die Kameraeinstellungen angepasst werden kann, die Empfindlichkeit zu erhöhen. Schließlich ist in den meisten Fällen verwendet die thrombozytopenische Probe zur Rekonstitution enthält Rest autologe Blutplättchen , die die Situation in den meisten Transfusionspatienten ähnelt anspruchs 19. Es ist currhängig unklar, ob und was im Zusammenhang mit der Transfusion mit allogenen Blutplättchen die Rolle von autologem Thrombozyten ist aber eine interessante Frage für die zukünftige Forschung. Nach dem Sammeln von Blut von gesunden freiwilligen Spendern wird Vollblut oft abgekühlt und gehalten bei einer konstanten Raumtemperatur vor der Komponente Vorbereitung. Blutplättchen sind jedoch empfindlich gegenüber Temperaturänderungen dar. 4 die Wirkung der verminderten Temperaturen nach der Blutentnahme zeigt und während der Perfusion. Thromben gefunden langsamer aufbauen , wenn das Blut auf Raumtemperatur (4A) abgekühlt wurde , verglichen mit einem identischen (gepaart) Probe gehalten bei 37 ° C während der gesamten Studie (4B). Im Kreislauf binden Blutplättchen an Gefäßverletzungsstellen unter den Bedingungen der erhöhten Wandschubspannung. Unterschiedliche Scherraten in mikrofluidischen Strömungskammern coated mit VWF / resultierte Fibrinogen in Differenzen für Gesamt Thrombozytenadhäsion am Endpunkt (5A) und für Thrombus Wachstumskinetik (5B). Schließlich zeigen, wie mikrofluidischen Strömungskammern verwendet werden kann, um PC für die Transfusion, wurde in Abhängigkeit von der PC Speicher Thrombus Wachstumskinetik verwendet untersuchen sucht. Alle Variablen in der Probenvorbereitung und Versuchsaufbau wurden während der gesamten Studiendauer standardisiert. Daher ist die einzige variable Parameter war PC Lagerzeit. 6 zeigt in Abhängigkeit von der Lagerungszeit Thrombuswachstum Verringern der Wirkung von Thrombozytenspeicher Läsion auf Hämostase in vitro demonstriert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig1.jpg" /> Abb . 1: Intra-Assay - Variation in mikrofluidischen Strömungskammer Experimente Mikrofluidik flo<html> w Kammer Experimente wurden bei 50 dyn / cm² an immobilisiertem Kollagen durchgeführt. Alle drei identische rekonstituierten Vollblutproben wurden in parallel und gleichzeitig perfundiert. Die Ergebnisse werden als Bereich (Whiskers) gezeigt für Oberflächenabdeckung in Abhängigkeit von Perfusionszeit. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig2.jpg" /> Fig . 2: teilweise beschichteten Kanal (A) Kollagenfasern durch Phasenkontrastmikroskopie sichtbar gemacht wurden nur in den beschichteten Bereich gefunden. (B) Eine Momentaufnahme nach 5 min der Perfusion mit Calcein AM Vollblutprobe bei 50 dyn gepumpt Rekonstitution beschriftet / cm 2 dargestellt. Beide Bilder wurden mit einer 100-facher Vergrößerung.<html> ig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig3.jpg" /> Abbildung 3: Thrombus Wachstumskinetik hängen von der Thrombozytenzahl in rekonstituierten Blut (A) Blut rekonstituiert wurde eine Blutbank Plättchen mit Konzentrat verschiedenen Thrombozytenkonzentrationen ergeben. 245 x 10³ / ul (●), 42 x 10³ / ul (■) und 12 x 10³ / ul (▲). Mikrofluidischen Strömungskammer Experimente mit Kollagen beschichteten Kanäle wurden bei einer Scherspannung von 50 dyn / cm² gleichzeitig für alle drei Proben durchgeführt. (B) Die Steigungen durch lineare Regression der Rohdaten in Feld A berechnet dargestellt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ontent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig4.jpg" /> Fig . 4: Die Temperatur und mikrofluidischen Strömungskammern Vollblut in Heparin Vacutainer gesammelt wurde 15 min in einem Wasserbad bei Raumtemperatur (A) oder bei 37 ° C (B) erhalten. Mikrofluidik - Perfusion an immobilisiertes Kollagen bei einer Schubspannung von 50 dynes / cm 2 durchgeführt wurde. Schnappschüsse am Endpunkt (5 min Perfusion) dargestellt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig5.jpg" /> Abbildung 5: Rolle der Scherbeanspruchung auf die Blutplättchen - Adhäsion an immobilisiertes VWF / Fibrinogen (A). Vier identische, Calcein AM gekennzeichnet, Vollblut rekonstituiertProben wurden mit variablen Schubspannung über eine VWF / Fibrinogen beschichtete Oberfläche perfundiert: 4,5 dyn / cm² (●), 50 dyn / cm² (■), 90 dyn / cm² (▲) und 225 dyn / cm² (♦). Nach 3 Minuten der Perfusion wurde eine Momentaufnahme aller vier Kanäle genommen. (B) Flächendeckungen in Abhängigkeit von der Zeit der Proben in (A) beschrieben sind , gezeigt Unterschiede in Thrombus Wachstumskinetik darstellt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig6.jpg" /> Abb . 6: Thrombus Bildung von Blutplättchenkonzentraten in Funktion der Lagerzeit Alle mikrofluidischen Strömungskammer Versuche wurden unter standardisierten Bedingungen auf Kollagen beschichteten Oberflächen mit einer Schergeschwindigkeit von 50 dynes / cm 2 durchgeführt. Blut war reconstituierte mit Thrombozyten Proben des gleichen Konzentrat getestet in zweifacher Ausfertigung an Tag drei (●), sieben (■) und zehn (▲) nach der Spende. Flächendeckungen in Abhängigkeit von Perfusionszeit dargestellt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="S 1" src="/files/ftp_upload/53823/53823sfig1.jpg" /> Abbildung S1:. Mikrofluidik - Strömungskammer Hardware - Setup (A) A Vena 8 Fluoro + Biochip auf der automatisierten Bühne des Mikroskops montiert und wird über flexible Schläuche an eine Spritzenpumpe mit Verteiler zu spalten die Pumpfunktion in acht separate Kanäle verbunden. (B) Rekonstituierte Blut fließt durch die Einwegschlauch auf der rechten Seite in die ausgewählten Kanäle des Biochips (Einlass). Die Wegwerfschlauch wird in den Einlass durch ein stainl festeness Stahl Einweg-Stift mit dem Setup geliefert. Der Blutfluss in (B) von rechts nach links und wird in langen , flexiblen Schläuchen gesammelt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823sfig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823sfig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

microfluidic-flow-chambers-using-reconstituted-blood-to-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

9.3K Aufrufe.  Belgium Red Cross-Flanders. Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro. 

Serie: Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Forschung

Biotechnik

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Systematische Analyse von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zellroll Mit einer Multi-Well-Platte mikrofluidischen System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen ausgesetzt um Stress mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern Scheren

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is required. However, cell culture using xenogenic or allogenic culture media has some disadvantages (i.e., risk of infectious agent transmission or slow cell expansion). Here, an autologous culture system is developed for the expansion of human skin fibroblast cells in vitro using a patient&#8217;s own platelet-rich plasma (PRP). Human dermal fibroblasts are isolated from the patient while undergoing abdominoplasty. Cultures are followed for up to 7 days using a medium supplemented with either fetal bovine serum (FBS) or PRP. Blood cell content in PRP preparations, proliferation, and fibroblast differentiation are assessed. This protocol describes the method for obtaining a standardized, non-activated preparation of PRP using a dedicated medical device. The preparation requires only a medical device (CuteCell-PRP) and centrifuge. This device is suitable under sufficient medical practice conditions and is a one-step, apyrogenic, and sterile closed system that requires a single, soft spin centrifugation of 1,500 x g for 5 min. After centrifugation, the blood components are separated, and the platelet-rich plasma is easily collected. This device allows a quick, consistent, and standardized preparation of PRP that can be used as a cell culture supplement for in vitro expansion of human cells. The PRP obtained here contains a 1.5-fold platelet concentration compared to whole blood together, with a preferential removal of red and white blood cells. It is shown that PRP presents a boosting effect in cell proliferation compared to FBS (7.7x) and that fibroblasts are activated upon PRP treatment.

This protocol presents a device that produces PRP to boost the in vitro expansion of cells in a 100% autologous fibroblast culture system.