This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).

Alle experimentellen Verfahren Mäuse beteiligt sind, wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Arizona genehmigt, und NIH-Richtlinien angepasst. 1. Gewebequelle für Hippocampus Kultur <ol><li> Pränatale Maus Welpen für Hippocampus Kultur zu erzeugen, verwenden zeit trächtige Mäuse (C57Bl6 / J), die im Haus 17 gezüchtet werden. Der Tag mit Vaginalpfropfens Erkennung wird als E0.5 bezeichnet. Die geplante Erntezeit für die Kultur ist E16.5-E17.5. Hinweis: Dieses Protokoll Kulturen von zwei Platten mit 24 Vertiefungen von zwei hochdichten Neuronen beschreibt Kokultivierung mit niedriger Dichte Neuronen (48 Deck insgesamt). Für weitere Platten, Materialien und Reagenzien können entsprechend skaliert werden. </li></ol> 2. 24-Well-Platten Vorbereitung für High-Density-Neuron Kulturen Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte (2-3) am Tag vor der geplanten Ernte von Embryonen. <ol><li> Bringen Sie zwei 24-LochPlatten in die Zellkultur Kapuze, öffnen Sie die Einzelverpackung. </li><li> Schließen Sie eine 18 G Spritzennadel in einen 1-ml-Plastikeinwegspritze. </li><li> Halten der Spritze, und das Ziel der Nadelspitze bei ~ 1 mm an der Mitte des Bodens der Vertiefung belassen. Mit mäßigem Kraft (~ 250 g), um den Boden des Bohrlochs (~ 1 mm lang) zu ätzen. Eine Nut wird gebildet werden und die Kunststoffmaterialien verdrängt wird über dem flachen Boden gut Oberfläche eine erhöhte Unterstützung bilden. Ätzen andere ~ 1 mm langen parallelen Nut bei ~ 1 mm nach rechts von der Mitte des Bodens in ähnlicher Weise. </li><li> Wiederhole diesen Schritt für alle Vertiefungen der beiden Platten mit 24 Vertiefungen. Die beiden 24-Well-Platten für High-Density-Kultur verwendet werden, sind nun bereit für die Beschichtung mit Poly-D-Lysin (siehe Schritt 3.8 unten). </li></ol> 3. Deckgläser Vorbereitung für Low Density Neuron Kulturen <ol><li> Verwenden Sie 12-mm-Durchmesser # 1 Runde Glas. </li><li> Legen Sie 50 Deckgläser in einem Durchmesser von 100 mm sterile Petrischale aus Kunststoff, und versenken Deckin 20 ml 70% ige Ethanollösung. Dieses Petrischale auf einer rotierenden Plattform mit mäßiger (70 rpm) Geschwindigkeitsdrehung für eine Stunde. Entfernen 70% Ethanol und dann mit einer frischen Charge von 70% Ethanol zu ersetzen. Drehen, und für eine weitere Stunde waschen. </li><li> Entsorgen Sie 70% Ethanol Reinigungslösung. In sterilem Wasser (gefiltert durch 0,2 &amp; mgr; m-Filtereinheit). Spülen Sie die Deckgläser rigoros durch die Petrischale mit der Hand drehen. Spülen Sie drei Mal, jedes Mal mit frischem sterilem Wasser zu ersetzen. </li><li> Legen Sie die Petrischale mit Deckgläsern in einer sterilen Zellkultur Kapuze mit Laminar-Flow. Saugen Sie das Spülwasser durch die Vakuumleitung und 10 ml sterilem Wasser filtriert, um die Deckgläser tauchen. Die Deckgläser sollten steril sein und sollte die Oberfläche für Poly-D-Lysin-Beschichtung sauber genug sein. </li><li> Öffnen Sie zwei 24-Well-Platten aus ihrer individuellen Verpackung, und legen Sie sie in der Haube. </li><li> Schalten Sie die Unterdruckleitung in der Motorhaube. Schließen Sie eine 200 ul Pipettenspitze mit der Vakuumleitung, und verwenden Sie einen scissor die Spitze schneiden, um eine größere Öffnung zu schaffen. </li><li> Verwenden Sie eine Fein Spitze # 5 tweezer Deckgläser aus der Petrischale zu holen, ein zu einer Zeit, und verwenden Sie die Unterdruckleitung, um das Deckglas vollständig trocknen. Dann legen Sie ein Deckglas in jede der Vertiefungen der 24-Well-Platte. Die 50 gereinigt Deckgläser sollte ausreichen jeder der Vertiefungen der beiden Platten mit 24 Vertiefungen zu füllen. </li><li> Verdünne die poly-D-Lysin-Stammlösung (1 mg / ml) in die Arbeitslösung (0,1 mg / ml) mit Boratpuffer (pH 8,5). Für die vier 24-Well-Platten (darunter zwei mit hoher Dichte Platten mit geätzten unten), Herstellung von 30 ml der Gesamtarbeitslösung. </li><li> In 300 ul 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin-Arbeitslösung in jede Vertiefung mit Glasplättchen. Stellen Sie sicher, die Deckgläser werden in Lösung vollständig eingetaucht. Wenn nicht, die Spitze # 5 Pinzette verwenden, um nach unten drücken Deckgläser gegen den Boden des Bohrlochs, und verwenden Sie die Spitze Poly-D-Lysin-Lösung zu führen alle die Oberfläche der Deck zu decken. Sichtprüfung alle Deck su zu machenre keine Luft zwischen der Platte und Deck gefangen. </li><li> In 300 ul 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin-Arbeitslösung in jede Vertiefung der hohen Dichte Kulturplatte mit geätzten Boden. Drehen Sie von Hand, um die Lösung zu verbreiten den gesamten Boden des Bohrlochs zu decken. </li><li> Rück alle vier Platten mit Poly-D-Lysin zu der Kultur -Inkubator inkubieren O / N. </li></ol> 4. Waschen und Pre-Anlage Platten für Kultur Anmerkung: In den folgenden Schritten (4-9) werden am Tag der Gewebeernte durchgeführt. <ol><li> Nach der Inkubation / Beschichtung von Deckgläsern und 24-Well-Platten O / N, bringen alle vier Platten (zwei mit Spenderdeck, zwei Akzeptor hoher Dichte Platten mit geätzten Kunststoffboden) in die Kultur Kapuze. Verwenden, um die Unterdruckleitung den Poly-D-lysin-Lösung zu entfernen. </li><li> Unmittelbar nach der Entfernung des Poly-D-Lysin-Lösung, fügen ~ 1 ml steriles Wasser zu jeder Vertiefung eine Plastiktransferpipette. Schließlich werden die Vertiefungen ausgefülltmit Wasser, lassen Sie für 10 Minuten stehen. Entfernen Sie das Wasser durch Vakuum, dann fügen Sie 300 ul Waschmedium in jede Vertiefung der Boden des Bohrlochs zu bedecken (mit oder ohne Glasplättchen). Nicht die Poly-D-Lysin-Beschichtung trocknen lassen. </li><li> Gibt alle vier Platten in die Zelle Inkubator. Die Platten sind bereit zu benutzen, wenn die dispergierten Neuronen im Hippocampus vorbereitet sind. </li></ol> 5. Herstellung von komplettem Kulturmedium und Trypsinlösung für enzymatische Verdauung <ol><li> Bereiten Sie 60 ml komplettem Kulturmedium durch Mischen der Bestandteile (siehe Materialien). Verwenden Sie eine 50-ml-Spritze mit einer 0,2 &amp; mgr; m Porengröße Spritzenfilter verbunden, filtern das komplette Kulturmedium in zwei 50 ml konischen Röhrchen. Jedes Röhrchen enthält 30 ml komplettem Kulturmedium. </li><li> In einem separaten 50 ml konischen Röhrchen, fügen ~ 30 ml Waschmedium (siehe Materialien) und erwärmen auf 37 ° C. Dies wird verwendet, um das Gewebe nach enzymatischer Verdauung zu waschen. </li><li> Bereiten Sie das Enzym Digestionsmedium. In einem 15 ml konische Röhrchen, fügen Sie 4,5 ml Waschmedium und 0,5 ml 2,5% Trypsin-Lösung und 50 &amp; mgr; l 100X DNase I. </li><li> Legen Sie das komplette Kulturmedium, Waschmedium und Enzymdigestionsmedium in einem 37 ° C Wasserbad. </li></ol> 6. Herstellung von Chirurgische Werkzeuge <ol><li> Sterilisieren alle chirurgischen Werkzeugen in einem Sterilisationstasche: zwei kleine Schere, eine Pinzette und zwei # 5 Pinzette. </li></ol> 7. Entfernen von Brains von E16.5-E17.5 Maus Embryonen und Dissection von Hippocampi <ol><li> Bereiten Sie zwei 10-cm-Petri gefüllten Schalen mit eiskaltem, sterilen Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS). </li><li> Euthanize die Maus dam mit einer intraperitonealen Injektion von Natriumpentobarbital Phenobarbital (100 mg / kg in einem Volumen von ~ 0,5 ml). Nach der Injektion, wenn der Damm Reaktion auf Zehe Prise verliert, opfern mit Genickbruch. </li><li> Sprühen Sie den Bauchbereich des Damms mit 70% Ethanol, und machen eine 2-cm langen Schnitt entlang der Mittellinie des Bauches zu belichtendie Gebärmutter. </li><li> Entfernen Sie die Embryonen und stellen einzelne in einem Durchmesser von 10 cm Petrischale mit kaltem Sezieren HBSS-Puffer. </li><li> Halten Sie den Embryo durch den Hals eine Zange verwenden, und verwenden Sie einen kleinen Schere den ersten Schnitt direkt in der Mittellinie unterhalb des Kleinhirns Ebene und Schnitt durch das Hirngewebe zu machen. Sie nicht den Embryo enthaupten. <ol><li> auf der Ebene der Schädelbasis Legen Sie die rechte Seite Spitze des kleinen Schere aus Schwanzregion, die aufgeschnitten wird, den ganzen Weg durch den rostralen Teil des embryonalen Gehirn (nicht überqueren Mittellinie) und einen Schnitt an der linken Seite zu machen. </li><li> Legen Sie die Seite Scheren links Spitze wieder um einen Schnitt auf der rechten Seite zu machen. Lassen Sie ein schmales Band von ungeschnittenen Schädelknochen und Hautgewebe am rostralen Ende, so dass das ganze Gehirn beiseite für die einfache Extraktion gekippt werden kann. </li><li> Verwenden Sie die Spitze der Schere die embryonale Gehirn in die HBSS-Lösung heraus zu schaufeln. Untersuchen Sie das Gehirn unter einem Binokular. Das Gehirn sollte ohne grobe Schnitt-o intakt seinff Regionen. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte alle Embryo Gehirne zu sammeln. </li></ol></li><li> Sammeln Sie alle intakten Gehirn in eine neue Petrischale mit 20 ml kaltem HBSS-Puffer. Legen Sie die Petrischale unter einem Präpariermikroskop. </li><li> Sehen Sie das Gehirn von Bauchseite. Halten Sie das Gehirn mit einer Pinzette am kaudalen Ende nach unten, legen Sie eine scharfe # 5 Pinzette diagonal einen Schnitt zwischen der Mitte rostral Punkt und dem Schwanz-Schläfenregion zu machen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die andere Hemisphäre. Nach dem, trennen zwei Hemisphären mit intakten Hippocampus vom Rest der Hirnstamm Gewebe zu schneiden. <ol><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede der Gehirne. </li></ol></li><li> Pool alle seziert Hemisphären, und entfernen Sie die Meningen mit zwei Paaren von # 5 Pinzette. </li><li> Identifizieren Sie die Entwicklung Hippocampus als eine gekrümmte Struktur, die im Inneren des Schläfenlappens gefaltet wird. Abwechselnd die beiden Paare von Pinzetten aus angrenzenden kortikalen Gewebe des Hippokampus zu trennen. Sammeln und bündeln alle hippocampi Gewebe (siehe Abbildung 1). </li></ol> 8. enzymatische Verdauung, Trennen in Einzel Neurons <ol><li> Verwendung eines Kunststoff-Transferpipette, übertragen alle seziert Hippocampi in die enzymatische Aufschlußlösung, enthaltend 5 ml Waschmedium mit 0,25% Trypsin + 1X DNase I in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Das Röhrchen wird in ein Wasserbad und Inkubation bei 37 ° C für 25 min, mit intermittierender sanften Invertierung des Rohres einmal in jedem 5 min. </li><li> Nach 25 min, entfernen Sie vorsichtig die Enzymlösung mit einer Hand gehalten Plastikpipette durch Absaugen verwendet wird. In warmen Waschmedium auf 10 ml und sanft in das Gewebe zu waschen, indem Sie langsam das Rohr 5-mal umgekehrt wird. Entfernen Sie das Waschmedium, und dann werden 10 ml Waschmedium erneut für eine zusätzliche Wäsche. </li><li> Entfernen Sie das Waschmedium, und 3 ml frisches, warmes Waschmedium wieder. Das Röhrchen mit der Hand rigoros auf das 15-fache der verdauten Neuronen aus dem Gewebe zu entfernen. Das Medium sollte, sobald die Zellen eine trübe gewordenwieder aus dem Gewebe in das Waschmedium abgetrennt. Sammeln der Zellsuspension in ein neues 15 ml konischen Röhrchen, während das verbleibende Gewebe in die Röhre zu verlassen. </li><li> Fügen Sie eine weitere 2 ml Waschmedium auf das Gewebe und sanft das verbleibende Gewebe getrennt durch Verreiben durch eine Plastikpipette für ~ 15-mal. Lassen Sie für 5 Minuten sitzen. Pool der Zellsuspension in die neue 15 ml konischen Röhrchen, die &quot;shake-off &#39;Zellen gesammelt enthält. </li><li> Zählen Sie die Dichte von Neuronen mit einem Hämozytometer. Typischerweise kann 3.000-5.000 Zellen pro Mikroliter erhalten werden seziert, abhängig von der Anzahl der Embryonen. Eine durchschnittliche Anzahl von 2,5 x 10 7 Neuronen werden geschätzt , wenn unter der Annahme , sechs Embryonen werden zerlegt. </li><li> Berechne das Volumen dieser Zellsuspension benötigt, um eine Dichte von 250.000 Neuronen / ml zu ergeben, wenn sie auf die 30 ml komplettem Kulturmedium zugegeben. Dieses Volumen einer der beiden konischen Rohren 30 ml komplettem Kulturmedium, das die hohe Dichte neuron Plattierungsmedium zu ergeben. </li> &lt;li&gt; Transfer 1,2 ml dieser hohen Dichte Neuron Lösung weitere 30 ml komplettem Kulturmedium mit einer Konzentration von ~ 10.000 Neuronen / ml zu ergeben. Verwenden Sie diese Verdünnung die niedriger Dichte Deck Saatgut. </li></ol> 9. Auflage des Neurons und langfristige Co-Kultur <ol><li> Bringen Sie die beiden 24-Well-Platten mit geätzten Böden für hohe Dichte Neuronen in der Zellkultur Kapuze. Entfernen Sie die 300 &amp; mgr; l Voraussetzung Medium durch Vakuum. Platte 0,6 ml hoher Dichte Zellsuspensionen bei 250.000 Neuronen / ml. </li><li> Bringen Sie die beiden anderen 24-Well-Platten mit Deckgläsern in die Kulturhaube, und entfernen Sie die 300 ul Voraussetzung Medium durch Vakuum. Platte 0,6 ml niedriger Dichte Zellsuspensionen bei 10.000 Neuronen / ml auf die Deckgläser in den zwei 24-Well-Platten. </li><li> Gibt alle vier 24-Well-Platten in den Inkubator. Lassen Sie für 2 Stunden sitzen. </li><li> Drehen Sie die niedriger Dichte Deck mit Neuronen der hohen Dichte Kultur haften. Stellen Sie sicher , dass die Neuronen einander zugewandt sind (dh not durch das Deckglas getrennt). Dann kehren die beiden Platten mit Co-Kultur in den Inkubator. </li></ol> 10. Co-Kultur Sustaining <ol><li> Feed - Co-Kulturen durch Zugabe von 300 &amp; mgr; l frisches Futter mittel (siehe Materialien) am Tag in vitro (DIV) 5. Es ist nicht notwendig 50% der ursprünglichen komplettem Kulturmedium zu entfernen, wie von vielen anderen Studien berichtet. Nährmediums enthält auch 15 uM Cytosinarabinosid (Ara-C, um eine Endkonzentration von 5 uM zu ergeben), um die Wahrscheinlichkeit von Kontamination Glia und Proliferation zu minimieren. </li><li> Nach dieser ersten Fütterung, fügen Sie 300 ul frisches Futter Medium ohne Ara-C in die gut jede Woche. Sollte die Kultur für mehr als einen Monat gehalten werden, die Hälfte des Mediums mit frischem Feed-Medium ersetzen jede Woche über einen Monat hinaus Zeitpunkt (mit dem ersten Medium Halb Ersatz bei DIV33). Morphologisch, sowohl eine hohe Dichte und niedriger Dichte Neuronen gesund aussehen bis zu drei Monaten (die längste Zeit von der exper beobachtetimenters). </li></ol> 11. Abbildung eines experimentellen Manipulation niedriger Dichte Neuron Transfection Hinweis: Bei der Transfektion in geringer Dichte Neuronen gewünscht ist, kann ein einfaches Calciumphosphat-Protokoll verabschiedet werden. Wir haben festgestellt, dass niedrige Dichte Kulturen bessere Transfektionseffizienz mit Calciumphosphat-Protokoll vor DIV12 haben, aber sie können bei DIV21 oder älter sind, prominente dendritischen Dornen sind während dieser Zeit mit viel geringerer Effizienz transfiziert werden. Die Durchführbarkeit der Transfektion der kultivierten niedriger Dichte Neuron durch Transfektion von Neuronen mit einem pEGFP-C3-Plasmid dargestellt ist (siehe unten). <ol><li> Bei DIV21 Entfernen 600 &amp; mgr; l konditioniertes Medium aus jeder Vertiefung der Co-Kultur, und übertragen sie auf eine neue 24-Well-Platte. Dann fügen Sie 600 ul frisches Futter Medium auf die Co-Kultur, um es wieder auf das ursprüngliche Volumen. <ol><li> Übertragen Sie die Deckgläser in die neue 24-Well-Platte mit 600 &amp; mgr; l konditioniertes Medium. Stellen Sie sicher, dass dieniedriger Dichte Neuronen nach oben zeigen. Legen Sie die hohe Dichte Platten und die neuen Platten mit Deck zurück in den Inkubator. </li></ol></li><li> Bereiten Sie zwei 1,5 ml sterilen Röhrchen. In einem Röhrchen, fügen Sie 600 ul 2X HEPES Salzlösung (HBS) Lösung gepuffert. Berechne das Volumen von 12 &amp; mgr; g pEGFP-C3 DNA basierend auf Plasmid-Konzentration. In der anderen Röhre, fügen Sie 74 ul CaCl 2 (2 M Lager) und das Volumen des Wassers das Plasmid nach der Zugabe von 600 &amp; mgr; l zu machen. Gut mischen durch Pipettieren und dann Plasmid-DNA hinzufügen. Langsam gut mischen. Lassen Sie beide Rohre für 5 min bei RT sitzen. </li><li> Während des 2X HBS Rohr von Hand halten und mäßig die Lösung auf einem Mischer gerührt, fügen Sie alle der 600 &amp; mgr; l der DNA-CaCl 2 -Lösung tropfen auf das Rohr 600 ul 2X HBS. Es ist entscheidend, dass der Niederschlag in Form von &quot;feinen Sand&quot; Granulat gebildet ist. zu stark und zu schnell mixen ist nicht wünschenswert, da es wahrscheinlicher, große &#39;Schnee flake&#39; artige Niederschläge produzieren wird, which hat dramatisch geringere Effizienz der Transfektion auf der Grundlage unserer Beobachtungen. </li><li> Lassen der Niederschlag weiter für 30 min im Dunkeln bei RT zu bilden. </li><li> 100 l Niederschlag zu jeder Vertiefung, die durch Tropfen auf den Deckgläsern enthält, fallen und gleichmäßig niedriger Dichte Neuron. Bringen Sie die Platte am Inkubator, und Inkubation für 2 Stunden. Unter der Annahme , der größte Teil des CaCl 2 in freier Form, führt dies zu einer Konzentration von ~ 17,6 mM Ca 2+, die Neuronen nach längerer Inkubation toxisch sein können. </li><li> Bereiten Sie eine 50 ml konischen Röhrchen mit ~ 50 ml Waschmedium, es warm bis 37 ° C. </li><li> Am Ende von 2 h, bringen die niedriger Dichte Neurons mit DNA-Calciumphosphat-Präzipitate in die Haube. Pick-up jeden einzelnen Deckglas mit einem scharfen # 5 Pinzette, und tauchen sie dreimal in 50 ml Waschmedium zu waschen kurz. Dann kehren sie auf die hohe Dichte Neuronen in seiner ursprünglichen Co-Kulturplatten mit niedriger Dichte Neuronen nach unten. </li><li> Weiter die Kultur bisDie geringe Dichte Kultur Neuronen auf Deckgläser werden für Studien geerntet. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die Langzeitkultur von ultra-niedriger Dichte des Hippocampus glutamatergen Neuronen unter serumfreien Bedingungen. Bei ~ 2000 Neuronen / cm 2 ist die Dichte mindestens zweifach niedriger ist als die meisten &quot;niedriger Dichte&quot; Kultur Zubereitungen mit oder ohne 2,3,11,13,14 durch die bestehende Literatur berichtet Glia - Unterstützung. Zusätzlich zu ultra-niedriger Dichte ist, ist dieses Protokoll neu und signifikant in zwei weitere Möglichkeiten. Zuerst wird keine Glia-Feeder-Schicht erforderlich, da die geringe Dichte Neuronen trophischen Faktor Unterstützung durch die hohe Dichte Neuronen erhalten, die in räumlicher Nähe sind, auch wenn es keine synaptischen Verbindungen oder den direkten Kontakt zwischen den Neuronen in verschiedenen Dichten kultiviert. Dieses Protokoll eliminiert die Notwendigkeit zur Herstellung von Glia einschichtigen vor den Kulturexperimenten geplant und ermöglicht sowohl eine hohe Dichte und geringe Dichte Kulturen gleichzeitig wachsen. Herstellung der Glia einschichtigen kann zeitraubend und l seinaborious und die meisten Literatur verwendet neugeborenen Ratten pup cortices 2. Daher ist für Labors, die nur mit Mäusen arbeiten, erfordert dies erhebliche zusätzliche Anstrengungen. Weitere Experimente in wichtiger ist , in denen neuronale spezifische Mechanismen untersucht werden, kann das Vorhandensein von Glia in der Co-Kultur , unerwünscht sein, weil es zuschreibt beobachteten Wirkungen speziell auf Neuronen, Gliazellen oder die Wechselwirkung zwischen den beiden Zelltypen 10 verhindert. Darüber hinaus ist für Gliazellen Kultur, Serum - Ergänzung ist obligatorisch 2,15, und dies kann die Glia-Neuron - Co-Kultur und die Einführung zusätzlicher Störfaktoren verunreinigen. Ein wichtiges Merkmal unserer Protokoll ist, dass die Co-Kultur unter definierten Medienbedingungen ist. Wir verwenden ausschließlich das komplette Kulturmedium ohne Serum zu ergänzen, und feststellen, dass, wenn das Kulturmedium Austauschplan strikt eingehalten wird, kann die Co-Kultur über drei Monate hinaus aufrechterhalten werden, was die Mehrheit der Experimente erfüllen sollte. Da es praktisch keinenGlia Präsenz, ist eine Beschränkung dieses Verfahrens, daß Vorsicht geboten, wenn sie mit den Ergebnissen der Literatur zu vergleichen, die Glia-Neuron-Kokulturen verwenden. Ein weiterer neuer Aspekt dieses Protokolls besteht darin, dass wir ein einfaches Verfahren verwenden eine effektive Mikroraum zwischen den mit hoher Dichte Neuronen auf dem Boden der 24-Well-Platte, und die niedrige Dichte Neuron zu den Glasdeckgläser rechts oben eingehalten gewachsen zu schaffen sitzen. Frühere Studien verwendet Punkte Paraffin auf die beschichteten Deckgläser aufgebracht , um die Deck bei ~ 500 &amp; mgr; m über der Schicht Glia Feeder erhöhen 2,8,9. Herstellung von Paraffin Punkte erfordert die richtige Größe und richtige Temperatur, die eine angemessene Menge an Anstrengungen und Praxis verlangt. Im Vergleich dazu liefert ein einfaches Ätzen auf den Vertiefungsboden Kunststoff mit einer 18 G Nadel unterstützt die Deckgläser sowie eine gute Trennung zwischen den beiden Schichten von Neuronen. Wir haben eine Patch-Clamp-Aufzeichnung Anlage mit digitalen Z-Meter verwendet, um die lin, um zu bestimmenOhrraum zwischen den beiden Schicht aus Neuronen, die durch auf der hohen Dichte konzentriert und dann auf die Schichten geringer Dichte unter Verwendung eines 60X Wasserimmersionsobjektiv, gefunden, und dass der Raum ist typischerweise 150-200 um (179,4 +/- 25,3 &amp; mgr; m, n = 5 ). Dieser engeren Raum (im Vergleich mit der von Wachs dots erzeugt) wahrscheinlich zu einem schnelleren Anstieg und eine höhere Konzentration von neurotrophen Faktoren zu übersetzen, damit eine ausreichende Unterstützung für die geringe Dichte neuron Bereitstellung wachsen. Obwohl dieser engeren Raum Fragen über die Geschwindigkeit des Kulturmediums Austausch erhöhen kann und ob der kleinere Raum behindert Neuronen aus Sauerstoff und Ernährungsunterstützung zu erhalten, zeigen unsere Ergebnisse, dass dies wahrscheinlich nicht ein Anliegen ist. Im Gegenteil, fanden wir, dass die hohe Dichte Neuronen unter den Deckgläsern auch besser (höhere Überlebensrate, aufwendigere Dendritenbaum und synaptic puncta durch NR1 Färbung, Daten nicht gezeigt) im Vergleich zu der hohen Dichte Neuronen aus dem gleichen Herstellungs wachsen, aber ohne die Überlagerung coverslips. Daher ist dieses einfache Protokoll nicht nur eine schnelle, einfache, aber auch sehr wirksam bei sowohl hoher Dichte und niedriger Dichte Neuronen aufrecht zu erhalten. Hippokampus - Neuronen in vitro Kultivierung erfordert Beschichtung von wachstumsfördernden Substrate, wie Poly-D-Lysin und / oder Laminin / Collagen 5,16. Obwohl sorgfältige Auswahl und Vorbereitung der Deckgläser für eine effektive neuronale Überleben kritisch sind, haben wir gefunden , dass wir mit dem Deckglas eine gründliche Reinigung mit 70% Ethanol ausgewählt ist , ausreichend ist, wodurch die Notwendigkeit von härteren Behandlung Negieren (zB in Säuren Sieden) der Deck. Nachdem die Deckgläser in Ethanol und trocknet im Vakuum gereinigt werden, scheint das Glas aufgrund der ursprünglichen Beschichtung hydrophob ist. Jedoch erfolgreiche Beschichtung von 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin in Boratpuffer sollten die Glasoberfläche hydrophil zu machen, so dass, wenn die Deckgläser aus dem Waschwasser, eine gleichförmige Schicht aus Wasser aufgenommen, die gleichmäßig istüber die gesamte Glasoberfläche ausbreitet beobachtet werden. Wir fanden, dass dies von entscheidender Bedeutung ist. Andernfalls werden die Neuronen sterben am ehesten nach einer unzureichenden Beschichtung durch Plattierung. Obwohl nur geringe Dichte Hippokampus - Neuronen in diesem Protokoll getestet werden, wird erwartet , dass andere neuronale Typen (zB kortikalen Neuronen, Kleinhirn - Körnerneuronen oder spezialisierte neuronale Populationen) können auch bei geringer Dichte in Gegenwart einer hohen Dichte neuron feeder aufrechterhalten werden Schicht. Schließlich, wenn dieses einfache Protokoll gefolgt ist, kann ein gesundes ultraniedriger Dichte Neuronen zu ernten erwarten. Broad - Anwendungen wie Immunzytochemie Kennzeichnung, die Live - Darstellung, morphologische Studien und Elektro Aufnahme können alle auf diesen Neuronen nach Standardverfahren 16,17 durchgeführt werden.

Hippokampus - Neuronen Anbau unter in vitro Bedingungen ermöglicht Beobachtungen und experimentelle Manipulation dieser Neuronen , die sonst nicht möglich sind , in vivo. Dieser experimentelle Ansatz ist weit verbreitet 1 zu offenbaren neuronalen Mechanismen des Wachstums, der Polarität, Neuriten - Spezifikation, des Handels und der subzellulären Lokalisation von Proteinen, die Synapsenbildung und funktionelle Reifung verwendet. Diese in vitro kultivierten Hippocampus - Neuronen, wenn sie von späten embryonalen Stadien geerntet, sind relativ rein (&gt; 90%) glutamatergen Zellen der Pyramiden Morphologie 2. Da Neuronen in einer 2-D - Oberfläche unter in vitro Bedingungen gezüchtet wurden, ermöglicht diese Methode eine einfache Beobachtung, wie die Live - Darstellung oder Immunzytochemie (ICC) über eine einzige Brennebene Färbung 3; oder Manipulationen, wie medikamentöse Behandlung und Transfektionen 3-6. Wenn bei hoher Dichte gezüchtet, neigen Neuronen hohe Überlebensraten haben wegen der höheren Concentrations von sezernierten Wachstumsfaktoren zusätzlich zu Verdauungs Unterstützung der Wachstumsmedien und auch wegen der Neuriten kontaktabhängige Mechanismen 7. Allerdings sind niedriger Dichte Neuronen im Hippocampus wünschenswert für morphologische Studien, in denen ein einzelnes Neuron kann in seiner Gesamtheit oder gebeizt für ICC-Analyse abgebildet werden. Geringer Dichte Neuronen sind schwer in Kultur zu halten aufgrund des Fehlens von parakrine Unterstützung und erfordern daher oft trophische Unterstützung von einer glialen (typischerweise kortikalen Astrozyten) feeder layer, die vor dem Neuron Kultur 2 vorbereitet werden muss. Wenn co-kultiviert mit einer Gliazellen Feeder-Schicht, sind niedriger Dichte Neuronen auf Deckgläsern gezüchtet, und blätterte dann auf der Oberseite der Schicht Glia, so dass die geringe Dichte Neuronen und Gliazellen sind einander zugewandt sind. Ein kleiner begrenzten Raum zwischen Glia und Neuronen ist , indem Paraffinwachs Punkte an den Ecken der Deck erstellt, also eine &quot;Sandwich&quot; Layout 2,8,9 erzeugen. Die geringe Dichte Neuronen wachsen wnnerhalb den engen Raum zwischen Gliazellen und dem Deckglas, das von Neuronen und Glia sezerniert eine permissive Mikro mit konzentrierter Faktoren erstellt. Dieser Ansatz führt zu geringer Dichte, voll entwickelten Neuronen, die einigermaßen voneinander entfernt sind, also ICC Kennzeichnung oder Live-Imaging-Studien erleichtern. Ein scheinbarer Nachteil Neuron-Glia-Co-Kultur, abgesehen davon, dass zeitraubend und arbeitsaufwendig ist, dass es Studium der neuronenspezifische, oder zellautonomen, Mechanismen verhindert. Obwohl dieses System ist weit weniger komplex als in vivo Nervengewebe, Glia Auswirkungen auf neuron Entwicklung durch sezerniert noch-nicht-vollständig definierte Faktoren können die Experimente 10 vermengen. Daher wird in Experimenten, die die Untersuchung von Neuron spezifische Mechanismen erfordern, definierten Kulturbedingungen, die Serum und Glia-Trägerschicht erforderlich sind, zu entfernen. In einer früheren Studie wurde in Züchten niedrigen Konzentrationen von Neuronen (~ 9.000 Zellen / cm 2) unter Verwendung eines th gelungenree dimensionale Hydrogelmatrix 11. Da eine relativ reine kann neuronalen Population mit hoher Dichte unter serumfreien Bedingungen ohne glial Unterstützung kultiviert werden, hypothesize wir, dass ultra-niedrige Dichte von hippocampalen Neuronen in serumfreien definierten Kulturmedium durch Co-Kultivieren mit hoher Dichte Neuronen gezüchtet werden, in eine Möglichkeit, die der konventionell angenommen Neuron-Glia-Kokultur analog ist. Tatsächlich wurden hohe Dichte hippocampalen Neuronenkulturen in einer &quot;Sandwich&quot; -Konfiguration vor kurzem eine kleine Anzahl von spezialisierten magnozellulären endokrinen Neuronen 12 zur Unterstützung verwendet wird . Daher Co-Kultur mit hoher Dichte Neuronen erlauben kann niedriger Dichte Neuronen trophischen Faktoren Unterstützung zu erhalten, die langfristige Überleben zu ermöglichen, ausreichend ist. Dieses Protokoll der Kultivierung mit ultraniedriger Dichte Neuronen wurde so formuliert und validiert. Das Protokoll kann in einem einzigen Experiment durchgeführt, mit hoher Dichte Herstellung von (~ 250.000 Zellen / ml) disvergesellschafteten Neuronen im Hippocampus zuerst, und macht dann eine Verdünnung mit einer Dichte ~ 10.000 Neuronen zu erhalten / mL (~ 3.000 Neuronen / Deckglas oder ~ 2.000 Neuronen / cm 2), die viel niedriger ist als in den meisten Kulturen mit geringer Dichte berichtet 2,3,9 , 11,13. Diese Kultur Zustand lose bezeichnet als &quot;ultra-niedriger Dichte&quot; Kultur und verwendet mit &quot;niedriger Dichte&quot; inter-changeably. Die hohe Dichte Neuronen werden auf der Poly-D-Lysin beschichtete Platten mit 24 Vertiefungen plattiert; während die geringe Dichte Neuronen auf Poly-D-Lysin-beschichtete 12-mm Glasplättchen ausgesät werden, die in einem anderen 24-Well-Platte angeordnet sind. Die Deckgläser mit geringer Dichte Neuronen haften auf der Oberseite der hohen Dichte Neuronen 2 Stunden später gekippt, nachdem die Neuronen abstammen und auf die Deckgläser angebracht. Zusätzlich anstelle Paraffin Punkte der Verwendung zu erhöhen, wurde die Deckgläser über der hohen Dichte Neuronenschicht, eine 18 G Injektionsnadel verwendet, um den Boden der 24-Well-Platten mit zwei parallelen Streifen zu ätzen. Die resultierende displaced, angrenzende Kunststoffe bieten eine erhöhte Unterstützung für die Glasplättchen. Dieser Raum wird konstant auf 150 bis 200 &amp; mgr; m gemessen, die ausreichend Sauerstoff und Kulturmedium Austausch ermöglicht, während eine Mikroumgebung mit konzentrierter Nahrungsfaktoren bereitstellt. Unter dieser Bedingung wachsen die niedriger Dichte Neuronen extensiv und über drei Monate in Kultur überleben können. Wenn diese Neuronen mit GFP-Plasmid nach drei Wochen in Kultur transfiziert sind, werden die Dendriten überschwänglich mit dendritischen Dornen besetzt. Als Beweis für das Prinzip werden die Daten zu zeigen, präsentiert, dass diese Co-Kultursystem mit ultraniedriger Dichte Kulturen von Neuronen im Hippocampus auf Poly-D-Lysine &quot;Mikro-Inseln&quot;, wo Neuronen bilden autaptic Verbindungen ausgesät unterstützt die Untersuchung von Zell erleichtern -autonomous, netzunabhängige Mechanismen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="713">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:144px;">21103-049</td>
			<td style="width:200px;">Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:144px;">17504-044</td>
			<td>aliquot, store in 0.6ml size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">GlutaMAX-I</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:144px;">35050-061</td>
			<td>dilute 100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">antibiotic-antimycotic (AA)</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:144px;">15240-096</td>
			<td>dilute 100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Complete Culture medium</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td>Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Wash medium</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td>same as &#39;Neurobasal medium&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Feed medium</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td>Neurobasal with 1X B27 supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">DNAse I</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:144px;">D5025</td>
			<td>prepare 100X stock at 0.6mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">poly-D-lysine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:144px;">P6407</td>
			<td>M.W. 70000-150000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">borate buffer</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:144px;">B6768 (boric acid); 71997(borax)</td>
			<td>1.24g boric acid &#38; 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">12-mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:135px;">Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH</td>
			<td style="width:144px;">1001/12</td>
			<td>No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">proFection transfection kit</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:144px;">E1200</td>
			<td>see&#160; protocol for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">2X HEPES buffered saline (HBS)</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:144px;">E1200</td>
			<td>see&#160; protocol for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:135px;">Pall Corporation</td>
			<td style="width:144px;">4192</td>
			<td>0.2um pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Endofree plasmid prep kit</td>
			<td style="width:135px;">Qiagen</td>
			<td style="width:144px;">12362</td>
			<td>for preparation of transfection grade plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">anti-MAP2 antibody</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td style="width:144px;">MAB3418</td>
			<td>mouse antibody, clone AP20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">anti-p-Tau antibody</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td style="width:144px;">AB10417</td>
			<td>rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">anti-NR1 antibody</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td style="width:144px;">MAB1586</td>
			<td>mouse antibody, clone R1JHL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">anti-GluR1 antibody</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td style="width:144px;">AB1504</td>
			<td>rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:144px;">14025092</td>
			<td>500ml size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for ultra-low density, long-term primary hippocampal neuron culture

Die Kultivierung primäre Neuronen im Hippocampus in vitro erleichtert mechanistischen Abfrage von vielen Aspekten der neuronalen Entwicklung. Dissoziierten embryonalen hippocampalen Neuronen können oft erfolgreich auf Glasdeckgläschen in hoher Dichte unter serumfreien Bedingungen wachsen, aber niedriger Dichte Kulturen erfordern typischerweise eine Zufuhr von trophischen Faktoren durch Co-Kultivieren mit einer Glia feeder layer, deren Herstellung zeitaufwendig sein kann und mühsam. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von Glia Interpretation der Ergebnisse und preclude Studien über neuronenspezifische Mechanismen vermengen. Hier wird ein vereinfachtes Verfahren für ultraniedriger Dichte (~ 2.000 Neuronen / cm 2), langfristige (&gt; 3 Monate) primären Hippocampus Kultur präsentiert , die unter serumfreien Bedingungen und ohne Gliazellen Unterstützung. Niedrige Dichte Neuronen sind auf Poly-D-Lysin beschichtete Deckgläser aufgewachsen, und blätterte auf hoher Dichte Neuronen in einer 24-Well-Platte gewachsen. Anstelle von Paraffin Punkte mit einem Raum zu schaffen between die beiden neuronalen Schichten können die Experimentatoren einfach ätzen die Kunststoff-Boden des Brunnens, an dem die mit hoher Dichte Neuronen befinden, einen Mikroraum förderlich für die geringe Dichte Neuron Wachstum zu schaffen. Die Co-Kultur kann leicht für&gt; 3 Monate ohne signifikanten Verlust der niedriger Dichte Neuronen aufrecht erhalten werden, wodurch die morphologischen und physiologischen Untersuchung dieser Neuronen zu erleichtern. Um diese erfolgreiche Kulturbedingungen zu erläutern, werden Daten zur Verfügung gestellt in Zellen mit niedriger Dichte nach längerer Kultur reichlich Synapsenbildung zu zeigen. Diese Co-Kultursystem erleichtert auch das Überleben von Neuronen in sparse einzelnen Inseln aus Poly-D-Lysin-Substrate und damit die Bildung von autaptic Verbindungen gezüchtet.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht erfolgreiche ultra-niedriger Dichte, langfristige Kultur der reinen glutamatergen Neuronen, ohne die Notwendigkeit von Glia-Zellen als Feeder-Schicht dient. Das Protokoll ist in Abbildung 1 graphisch dargestellt, die die Herstellung von hoher Dichte beinhaltet (auf Poly-D-Lysin 24 Vertiefungen beschichtet) und niedriger Dichte Neuronen (auf Poly-D-Lysin beschichteten Glasplättchen) getrennt, und anschließender Co-Kultur , die kann gehalten bis zu drei Monaten werden. 2A und 2B sind Darstellungen der mit hoher Dichte und niedriger Dichte Neuronen an 5 Tage nach dem Ausplattieren. Geringer Dichte Kultur ist ungefähr 30-fach geringer Dichte. Beide Neuronen unterziehen typische Entwicklungsstadien wie Kaech und Banker (2006) beschrieben. Am Tag 14, die beide mit hoher Dichte und niedriger Dichte Neuronen zeigen aufwändige dendritischen Strukturen, wie DIC Bilder (2C ergab,D, beachten Sie beide Platten aus dem gleichen Bereich sind mit unterschiedlichen Fokusebenen, wie sie in der Lage von Etch gezeigt). Wenn diese Neuronen sind mit MAP2 - Antikörper gefärbt , um die Dendriten zu offenbaren, keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der Dendriten (t 13 = 1,27, p&gt; 0,05, gemessen durch dendritische Spitze Nummer) und insgesamt dendritischen Länge (t 16 = 1,41, p&gt; 0,05 ) pro Neuron zwischen der hohen Dichte und niedriger Dichte Neuronen (Abbildung 2E, F) gefunden. Immunzytochemie Kennzeichnung wird verwendet, funktionelle glutamatergen Synapsen zu offenbaren. Wir verwenden Doppelfärbung der NMDA - Rezeptor - Untereinheit NR1 und die AMPA - Rezeptor - Untereinheit GluR1 (3A) und funktionelle Synapsen (co-lokalisierten puncta in gelb) zu etikettieren leicht identifiziert werden kann und quantifiziert ImageJ verwenden. Niedrige Dichte Neuronen werden auch mit einem Antikörper gegen dendritischen Protein-Marker MAP2 gekennzeichnet,in Kombination mit p-Tau axonalen Protein-Marker. Diese Doppel-Kennzeichnung ermöglicht eine klare Unterscheidung von Dendriten und Axone (3B). Geringer Dichte Kulturen können auch erfolgreich mit DNA - Plasmiden unter Verwendung von Calciumphosphat - Verfahren transfiziert werden, obwohl die Transfektionsrate bei späteren Stadien der Regel sehr gering ist (&lt;0,2% Neuronen , wenn sie bei DIV21 transfiziert). 3C veranschaulicht , dass EGFP Transfektion neuronale Morphologie zeigen kann, und machen feinen dendritischen Dorn Strukturen sichtbar. Schließlich als Proof of Concept, ultra-niedriger Dichte Neuronen unter Bedingungen werden gezüchtet , das autapse Bildung (3D) zu fördern. Diese ultra-niedriger Dichte autaptic Neuronen gewachsen auf Poly-D-Lysin-beschichtete &quot;Mikroinseln&quot; können mit diesem Co-Kultur-Protokoll über 2 Monaten durch die hohe Dichte Feeder-Neuron aufrechterhalten werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53797/53797fig1.jpg" /> &lt;strong&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der mit hoher Dichte und niedriger Dichte Co-Kultur - Protokoll. (A) E16.5-E17.5 embryonalen Maus - Gehirne werden gesammelt, Hippocampus seziert und mit Trypsin verdaut. (B) , verdaut Hippocampi werden gewaschen, in einzelne Neuronen getrennt und auf 24 - Well - Platten mit hoher Dichte (250.000 Zellen / ml) plattiert; in der Zwischenzeit mit niedriger Dichte (10.000 Zellen / ml) Neuronen werden auf Deckgläsern ausplattiert. Die Vertiefungen für hochdichte Kultur werden mit einer 18 G Injektionsnadel geätzt für die Deckgläser eine erhöhte Unterstützung. (C) Darstellung der Co-Kultur. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53797/53797fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53797/53797fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53797/53797fig2.jpg" /> Abbildung 2. Sowohl mit hoher Dichte und niedriger Dichte Neuronen comparable morphologische Entwicklung in Kokultur. (A, B) Mikroskopische Aufnahmen zeigen Plattierungsdichte sowohl hoher Dichte und niedriger Dichte Schicht. (C, D) DIC Bilder zeigen umfangreiche Neuritenwachstum in beide hoch (C) und niedriger Dichte (D) Neuronen. Die geringe Dichte Neuronen auf Deck ruhen direkt über den hohen Dichte Neuronen. Beachten Sie die Position des erhabenen Kunststoffträger. (E) Immunocytochemistry Kennzeichnung von dendritischen Protein MAP2. (F) Quantifizierung (Mittelwert ± SEM) der gesamten dendritischen Länge und dendritischen Spitze Anzahl pro Neuron. Kein signifikanter Unterschied (ns) zwischen hoher und niedriger Dichte gezüchtet Neuronen in Co-Kultur. Maßstabsbalken in (B, D), 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53797/53797fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53797/53797fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53797/53797fig3.jpg" /> Figure 3. Experimentelle Manipulationen von geringer Dichte Neuronen gewachsen in Co-Kultur. (A) Immunzytochemie Kennzeichnung in geringer Dichte Kultur ermöglicht die Identifizierung von funktionellen Synapsen , die durch Co-Kennzeichnung von GluR1 (grün) und NR1 (rot). (B) Co-Kennzeichnung von neuronalen dendritischen Protein MAP2 (magenta) und axonalen Protein p-Tau (grün). (C) Ein niedriger Dichte Hippocampus transfiziert mit pEGFP-C3 - Plasmid, zeigt reichlich dendritischen Dornen. (D) Eine geringe Dichte Neuron vorbereitet auf Poly-D-Lysin &quot;Mikro-Insel&quot;, und auf der Oberseite der hohen Dichte Neuronen gewachsen. Ein Aufzeichnungspatchelektrode füllt das Neuron mit Alexa-555 hydrazid die Morphologie des Neurons zu offenbaren. Maßstabsbalken in AD, 20 &amp; mgr; m.7fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Ein vereinfachtes Verfahren für Ultra-Low Density, Long-Term Primäre Hippocampus Kultur

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

a-simplified-method-for-ultra-low-density-long-term-primary

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.7K Aufrufe.  University of Arizona College of Medicine-Phoenix. Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms. 

Serie: A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Langfristige Verhaltens Verfolgung von Frei Schwimmen Schwach elektrische Fische

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of their normal in vivo interactions. Slices obtained from a variety of transgenic mouse lines or use of viral vectors for expression of fluorescently tagged proteins or reporters in wild type brain slices allow for high-resolution imaging by fluorescence microscopy. Although several methods have been developed for imaging brain slices, combining slice culture with the ability to perform repetitive high-resolution imaging of specific cells in live slices over long time periods has posed problems. This is especially true when viral vectors are used for expression of exogenous proteins since this is best done in a closed system to protect users and prevent cross contamination. Simple modifications made to the roller tube brain slice culture method that allow for repetitive high-resolution imaging of slices over many weeks in an enclosed system are reported. Culturing slices on photoetched coverslips permits the use of fiducial marks to rapidly and precisely reposition the stage to image the identical field over time before and after different treatments. Examples are shown for the use of this method combined with specific neuronal staining and expression to observe changes in hippocampal slice architecture, viral-mediated neuronal expression of fluorescent proteins, and the development of cofilin pathology, which was previously observed in the hippocampus of Alzheimer's disease (AD) in response to slice treatment with oligomers of amyloid-&#946; (A&#946;) peptide.

Presented here is a modified roller tube method for culturing and intermittent high-resolution imaging of rodent brain slices over many weeks with precise repositioning on photoetched coverslips. Neuronal viability and slice morphology are well maintained. Applications of this fully enclosed system using viruses for cell-type specific expression are provided.

Modifizierte Roller Schlauch Methode genau lokalisierte und sich wiederholende intermittierende Bildgebung während langfristige Kultur Gehirnscheiben im geschlossenen System

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

Langfristige sensorischen Konflikt in Mäusen frei Verhalten

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...