The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Qu&#233;bec-Sant&#233; (FRQS).

HINWEIS: Das Protokoll wird hier unter Verwendung von A549-Zellen mit Sendai-Virus (SeV) infiziert beschrieben. Jedoch wird das Protokoll für die SDS-PAGE und native PAGE funktioniert auch bei allen bisher untersuchten humanen und murinen Zelltypen, insbesondere Knochenmarkzellen mit verschiedenen Stimuli 9,15,19,24,25 IRF3 aktivierende stimuliert. 1. Die Infektion von A549-Zellen <ol><li> Aufrechtzuerhalten A549-Zellen in Kultur in einer 15 cm Platte bei 37 ° C / 5% CO 2 in 20 ml F12K / Ham-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (HALLO-FBS) und 1% L-Glutamin (gesamt F12K / Ham-Medium). Hinweis: Alle für die Zellkultur und Behandlungen verwendet Lösungen müssen steril sein. </li><li> Bei 24 Stunden vor der Infektion, saugt den mittleren und die Zellen werden mit 10 ml destilliertem phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) bei RT. </li><li> 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Platte, die Zellen abdecken und bei 37 ° C für 3 min. </li><li> Stoppen Sie die Inkubationszeit, sobald the-Zellen beginnen, von der Platte durch Ausklopfen sanft mit einer Hand zu lösen. Inaktivierung der Trypsin durch Zugabe von 10 ml vorgewärmt komplette F12K / Ham-Medium pro Platte und übertragen Sie die Zellen auf eine 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 350 × g für 3 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 8 ml komplette F12K / Ham-Medium, um eine homogene Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Pflanzensamen, die Zellen in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen pro 60 mm Platte in 4 ml vorgewärmt komplette F12K / Ham-Medium. Inkubation für 20-24 Stunden bei 37 ° C / 5% CO 2. Nach 20 bis 24 h, bilden die Zellen eine 90% konfluenten Monolayer (das entspricht 1,5 x 10 6 Zellen). </li><li> Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 2 ml Serum-freiem F12K / Ham-Medium (SFM). 2 ml frischem SFM pro 60 mm Platte. </li><li> Tauwetter ein Aliquot des Sendai-Virus (SeV) (bei -80 ° C gelagert aliquotiert) auf Eis und kurz vortexen. </li><li> Verdünnen Sie the-Virus im vorgeheizten SFM bis 60 HAU / 100 &amp; mgr; l zu erhalten. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren sanft und fügen Sie 100 ul der verdünnten Virus pro Platte, um die Infektion bei 40 HAU / 10 6 Zellen durchzuführen. Sie Virus in der nicht infizierten Kontrollplatte hinzufügen, nicht. </li><li> Die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2. Man schüttelt die Platten von Hand 3 oder 4 mal, oder mit Hilfe eines automatischen Orbital- oder Schüttler direkt in den Inkubator gestellt, während der ersten Stunde der Infektion. </li><li> Bei 2 h nach der Infektion, 2 ml F12K / Ham-Medium, das 20% HALLO-FBS, um eine Endkonzentration von 10% HALLO-FBS zu erhalten. </li><li> Die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2 für eine weitere 1, 4 und 7 h auf insgesamt Infektion Zeiten von 3, 6 und 9 Stunden zu erreichen sind. An jedem dieser Zeitpunkte, fahren Sie mit Schritt 2.1. </li></ol> 2. Herstellung von Ganzzellextrakte (WCE) <ol><li> Entfernen Sie das Infektionsmedium. Ernte der Zellen durch Abschaben in 1 mleiskaltem D-PBS und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine vorgekühlte 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 16,000 × g bei 4 ° C für 20 sec und sorgfältig dekan alle Spuren von D-PBS. HINWEIS: Bei diesem Schritt kann das Zellpellet direkt auf Proteinextraktion oder schockgefroren in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis / Ethanol-Bad bei -80 ° C bis zur Lyse gespeichert unterworfen werden. </li><li> Vorbereitung der Lysepuffer, enthaltend 50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% Glycerin und 1% Nonidet P-40 in destilliertem Wasser (ddH 2 O). Extemporarily hinzuzufügen Protease (1 ug / ml Leupeptin und 2 &amp; mgr; g / ml Aprotinin) und Phosphatase-Inhibitoren (5 mM Natriumfluorid, 1 mM aktiviert Natriumorthovanadat, 2 mM p-Nitrophenylphosphat und 10 mM β-Glycerophosphat, pH 7,5). HINWEIS: Der Lysepuffer ohne Inhibitoren können bei 4 ° C gelagert werden. Ein spezifisches Protokoll für die Aktivierung von Natriumorthovanadat in der Tabelle mit den spezifischen Reagenzien / Aufstellb beschriebennt. </li><li> Zellpellet in 70 &amp; mgr; l Lysepuffer. Typischerweise ist das Lysat Konzentration wird etwa 2 ug / ul sein. </li><li> Inkubieren auf Eis für 20 min. Flash-Einfrieren des Lysats durch Inkubation in einem Bad mit flüssigem Stickstoff für 15 Sek. Auftauen Lysat bei RT, bis es vollständig geschmolzen ist und Vortex für 10 Sekunden. Wiederholen Sie die Frost / Tau / Wirbelzyklus 3 mal. <ol><li> Alternativ führen Sie den Gefrierschritt in einem Ethanol / Trockeneis-Bad für 1 min. </li></ol></li><li> Zentrifuge bei 16.000 × g bei 4 ° C für 20 min. Den Überstand (der dem WCE) in eine neue vorgekühlte 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. Halten Sie das WCE auf Eis zu allen Zeiten. </li><li> Quantifizierung von Proteinen unter Verwendung jedes Protein Quantifizierungsverfahren mit Lysepuffer wie Bradford-Protein-Assay auf Basis 26 kompatibel. </li></ol> 3. Beschlussfassung der WCE Hohe Auflösung SDS-PAGE <ol><li> Bereiten Sie drei denaturierenden Elektrophorese Gele. <ol><li> Zum Nachweis vonIRF3 Formen gießen zwei Gele von mindestens 16 cm Länge mit einem Trenngel 7,5% Acrylamid / Bis-Acrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl, pH 8,8 (RT), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS ), 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 O TEMED und einem Sammelgel 4% Acrylamid, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 TEMED O. Vorsicht! Acrylamid, TEMED und SDS sind toxisch und / oder reizend. Schutzhandschuhe tragen und unter einer Abzugshaube zu manipulieren. </li><li> Zum Nachweis von SeV Proteine ​​gießen einem Gel aus einem Minimum von 8,5 cm Länge bei, ähnlich der in 3.1.1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Trenngel enthält 12% Acrylamid-Gel Eigenschaften. </li></ol></li><li> Denaturieren des in Schritt 2.6 erhaltenen WCE durch Zugabe von 1: 4 (v / v) 5x Ladepuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 10% SDS, 20% (p / v) Glycerin, 0,0005% Bromphenolblau und 25% β-Mercaptoethanol in ddH 2 O), gefolgt von Erwärmen bei 100 °C für 10 min. Schnellspin die Rohre nach unten die Kondensation, die in der Kappe bildet zu bringen. Vorsicht! β-Mercaptoethanol ist giftig beim Einatmen. Schutzhandschuhe tragen und unter einer Abzugshaube zu manipulieren. </li><li> Montieren Sie die Gele in der Migrationsgerät. Füllen des oberen und unteren Kammern mit Laufpuffer, der 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS und 192 mM Glycin in destilliertem Wasser (dH 2 O). </li><li> Last 14 ul der Molekulargewichtsstandard in einer Vertiefung jeder 16 cm Gel und 7 ul der Molekulargewichtsstandard in einem auch der 8,5 cm-Gel. Last 30 ug denaturierter WCE (hergestellt wie in Schritt 3.2 beschrieben) pro Vertiefung der beiden Gele in Schritt 3.1.1 IRF3 Formen Detektions hergestellt. Last 8-10 ug denaturierte WCE (hergestellt wie in Schritt 3.2 beschrieben) pro Vertiefung auf dem Gel in Schritt 3.1.2 SeV Analyse vorbereitet. </li><li> Führen Sie die Gele bei 30 mA Konstantstrom, bis der Migrationsfront den Boden des Gels erreicht. HINWEIS: Migration dauert in der Regel approximadig 3 Stunden für eine 16 cm-Gel und 45 min für eine 8,5 cm Gel. </li><li> Fahren Sie mit dem Transfer auf Nitrocellulosemembranen (Schritt 5). </li></ol> 4. Analyse der IRF3 Dimerisierung von Native-PAGE Hinweis: Diese Methode wurde ursprünglich von der Gruppe von Dr. T. Fujita 27 beschrieben. <ol><li> Bereiten Sie die obere (-) und unteren (+) Kammer Elektrophorese-Puffer. Die obere Kammer Puffer besteht aus 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT), 192 mM Glycin und 1% Natriumdeoxycholat (DOC) in ddH 2 O. Die untere Kammer Puffer enthält 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) und 192 mM Glycin in ddH 2 O. HINWEIS: Die obere und die untere Kammer der Elektrophorese-Puffer bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. Stellen Sie jedoch sicher, dass sie auf RT vorgewärmt, bevor Sie die Elektrophorese. </li><li> Gießen eines nicht denaturierenden Trenngel von mindestens 8,5 cm Länge, enthaltend 7,5% Acrylamid / Bisacrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl, pH 8,8 (RT), 1% ammonium Persulfat und 0,1% in ddH 2 O. TEMED </li><li> Vorlauf das Gel bei 40 mA Konstantstrom für 30 Minuten auf Eis. Drücken Sie die Laufgerät in das Eis in etwa der Höhe des unteren Kammer Elektrophorese-Puffer. Es ist wichtig, dass das Gel nicht in das Eis. </li><li> Während Vorlauf, mischen WCE auf Eis gehalten mit 2x nativen PAGE-Ladepuffer 1: 1 (v / v), die 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% Glycerin und 0,1% Bromphenolblau in ddH 2 O. </li><li> Last 8 - 10 &amp; mgr; g WCE (hergestellt wie in Schritt 4.4 beschrieben) unmittelbar am Ende des Vorlauf. </li><li> Führen Sie das Gel bei 25 mA Konstantstrom auf Eis, wie oben für den Vorlauf beschrieben, bis der Migrationsfront den Boden des Gels (ca. 40 min) erreicht. </li></ol> 5. Immunoblotanalyse IRF3 Species <ol><li> Vorbereitung der Transferpuffer, der 25 mM Tris-Base und 192 mM Glycin in ddH 2 O. Kühlen den Transferpuffer bei 4 ° C vor dem Gebrauch. </li><li> Nass drei Stück Nitrocellulose-Membran auf eine Größe geringfügig größer als die Gele in einem Kunststoff / Glas-Box mit den Übertragungspuffer geschnitten. Geben Sie die Orientierung der Membran durch Abschneiden einer Ecke. Der Übertragungspuffer kann 3-mal wiederverwendet werden. Lagern Sie den Puffer bei 4 ° C zwischen den Anwendungen. </li><li> Ungegossen die Gele (SDS-PAGE und native-PAGE) und schneiden Sie eine Ecke jedes Gel für die richtige Orientierung. <ol><li> Für native-PAGE, Inkubation des Gels bei RT unter leichtem Schütteln für mindestens 30 min in der SDS-PAGE-Laufpuffer, um das DOC vor der Übertragung auf dem Übertragungspuffer zu entfernen. </li></ol></li><li> Die Gele (SDS-PAGE und native-PAGE) in der Transferpuffer Inkubation für 5 - 10 min. </li><li> Montieren Sie einen Transfer-Sandwich pro Gel in einer Transferkassette mit der Membran in Richtung der positiven Elektrode (Schaumstoffpolster / Filterpapier / Membran / Gel / Filterpapier / Schaumstoffunterlage). Seien Sie vorsichtig, um alle Luftblasen zwischen den Schichten des Sandwich zu entfernen. </li><li> Führen Sie die Übertragung, wie empfohlen by der Hersteller für die Übertragungsvorrichtung verwendet wird. HINWEIS: Führen Sie alle Inkubationen und Waschungen in den nächsten Schritten auf einem Schaukel oder Orbitalschüttelvorrichtung Plattform. </li><li> Am Ende der Bewegungsphase, Inkubation der Membranen für 15 min in der Fixierungslösung, die 7% Essigsäure, 40% Ethanol und 3% Glycerin in ddH 2 O. Waschen der Membranen 3x 5 min in PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na 2 HPO 4 und 1,8 mM KH 2 PO 4 in dH 2 O). Vorsicht! Essigsäure ist giftig, reizend und brennbar. Schutzhandschuhe tragen und unter dem Abzug zu manipulieren. HINWEIS: Die Fixierungslösung kann mehrfach wiederverwendet werden. </li><li> Für die native-PAGE-Membran gehen Sie direkt zu Schritt 5.11. </li><li> Spülen der drei SDS-PAGE Membranen schnell in dH 2 O vor dem Inkubieren für 1 min in rot ponceau Lösung, enthaltend 6,57 mM rotem Ponceau und 1% Essigsäure in ddH 2 O. HINWEIS: Die rote ponceau Lösung r<html> eused mehrmals. </li><li> Spülen Sie die Membranen in dH 2 O, bis der Hintergrund ist weiß genug, um die Proteinbanden in rot gefärbt sehen. Beachten Sie die Markierungen mit einem Bleistift und den überflüssigen Membran um den Proteinen. Entfärben Membranen durch Inkubation für 5 min in PBS unter Rühren. </li><li> Die Membranen 1 h bei RT oder O / N Inkubieren bei 4 ° C in Blockierungslösung (PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 und 5% fettfreier Trockenmilch (PBS-T-Milch). Waschen der Membranen 3x 5 Minuten in PBS-T. HINWEIS: Die PBS-T Wäsche ist optional und nur dann erforderlich, wenn die Anwendung streng Antikörper in PBS-T, enthaltend 5% Rinderserumalbumin (PBS-T-BSA) (Abbildung 1 und Tabelle 1) in der nächsten Stufe verdünnt. </li><li> Inkubieren Sie die vier Membranen (von SDS-PAGE und native-PAGE) mit den primären Antikörper gemäß der Reihenfolge in Abbildung 1 und Tabelle 1 beschrieben. Führen Sie 5x 5 min Waschen in PBS-T. </li></ol>&quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53723/53723fig1.jpg" /> Abbildung 1. Reihenfolge der Immunoblot Analysen. Die schematische beschreibt die einzelnen SDS-PAGE und native-PAGE-Gelen erforderlich, um die verschiedenen IRF3 phosphoryliert und monomeren / dimeren Formen zu erkennen. Die spezifische Reihenfolge der Antikörper an die Membran von jedem Gel im Immunoblot Verfahren hervor angewandt ist. Beachten Sie, dass die Anti-Aktin-Antikörper werden zuerst verwendet, um eine gleiche Beladung der Proben vor Anwenden anderer spezifischer Antikörper zu gewährleisten. Die alternierende Sequenz, mit anti-Aktin-Antikörper, die nach den anti-phospho-IRF3 Antikörper aufgebracht, auch funktioniert. Stripping ist zwischen anti-Aktin und anti-SeV Antikörpern oder zwischen anti-Phospho-IRF3 und Anti-IRF3 Antikörper wegen der Größe der überlappenden Signalen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53723/53723fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Primäre Antikörper </td><td> Verdünnung </td><td> Verdünnungspuffer </td><td> Incubation </td><td> Sekundärantikörper </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> Anti-Actin </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 15 min bei RT </td><td> Anti-Maus- </td><td> Zu verwenden, nach SDS-PAGE Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser386 </td><td> 1/200 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N bei 4 ° C </td><td> Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach dem Mutter-PAGE. Es wird nicht empfohlen, um die verdünnte Antikörper Wiederverwendung </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser396 </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N bei 4 ° C </td><td&gt; Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Es wird nicht empfohlen, um die Wiederverwendung der verdünnten Antikörpers Anti-IRF3-P-396 ist auch von Cell Signaling. Optimale Verdünnung wurde als 1 / 1.000 für diesen Antikörper definiert, sondern kann zwischen den Chargen variieren. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser398 </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N bei 4 ° C </td><td> Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Es wird nicht empfohlen, um die verdünnte Antikörper Wiederverwendung </td></tr><tr><td> Anti-IRF3 voller Länge </td><td> 1 / 7.500 </td><td> PBS-T-Milch </td><td> 3 h bei RT </td><td> Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Anti-IRF3 Antikörpers voller Länge kann nach der nativen PAGE verwendet werden, aber es ist weniger empfindlich, um das Monomer zu erkennen. Verdünnt Antikörper können mehrmals wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-NES </td><td> 0,5 ug / ml </td><td> PBS-T-Milch </td><td> 3 h bei RT </td><td> Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach dem Mutter-PAGE. Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. </td></tr><tr><td> Anti-SeV </td><td> 1 / 14.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 3 h bei RT </td><td> Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. </td></tr><tr><td colspan="6"> HINWEIS: Verdünnung und Puffer für HRP-gekoppelten sekundären Antikörper verwendet werden, müssen optimiert werden, da sie variiert von einem Unternehmen zum anderen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Technische Daten der Antikörper im Immunoblotting-Verfahren verwendet. <ol start="13"><li> Inkubieren der Membranen mit der Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten sekundären Antikörper, wie in Abbildung 1 und Tabelle 1 aufgeführt. Waschen der Membranen 5x 5 min in PBS-T, gefolgt von 2 x 5 min in PBS, um Spuren von Tween vollständig entfernen. </li><li> Die Membranen 1 min Inkubieren in einem Volumen von verstärkter Chemilumineszenz-Reagenz ausreicht zur vollständigen Bedeckung der Membranen. Trocknen Sie die Membranen unter Verwendung von Filterpapier. </li><li> Legen Sie die Membranen in einem lumineszierenden Bildes Analysator, um die immunreaktiven Banden sichtbar zu machen. <ol><li> Alternativ führen Sie den Nachweis von immunreaktiven Banden mit empfindlichen Röntgenfilme. </li></ol></li><li> Die Membranen 3x 5 min in PBS waschen. HINWEIS: Bei diesem Schritt können die Membranen trocken gehalten werden. Ist jedoch eine weitere Abziehen erforderlich ist, ist es besser, das Strippen vor dem Trocknen der Membran durchzuführen. Membranen können auch zur kurzfristigen in PBS gelagert werden. </li><li> Für die Membranen, die nicht Strippen zwischen Inkubation mit Antikörpern erfordern (siehe Abbildung 1) gehen Sie direkt zu Schritt5.20. </li><li> Beim Abisolieren zwischen Antikörpern (siehe Abbildung 1), Inkubation der Membranen in vorgewärmtem Ausstreiflösung, die 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT) und 0,7% β-Mercaptoethanol in ddH 2 O bei 50 ° C erforderlich für 20 min unter regelmäßiger Bewegung. Die Membranen 3x 5 min in PBS waschen. HINWEIS: Agitation während des Stripping-Verfahren ist der Schlüssel. Strippen kann in einem Hybridisierungsofen durchgeführt werden. Alternativ Strippen kann unter Verwendung von Membranen, die in Kunststoffbeutel versiegelt und in ein Wasserbad eingetaucht werden. In diesem Fall ist es wichtig, um die Membranen 4 rühren - 5 mal während der Inkubation. </li><li> Die Membranen inkubiere 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C in PBS-T-Milch. </li><li> Die Schritte 5,12-5,16 gemäß 1. </li></ol>

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M., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-dependent+phosphorylation+of+the+IRF-3+transcription+factor+regulates+nuclear+translocation,+transactivation+potential,+and+proteasome-mediated+degradation.">Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation.</a> Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).</li><li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+triggering+of+the+type+I+interferon+system+by+virus+infection:+activation+of+a+transcription+factor+complex+containing+IRF-3+and+CBP/p300.">Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300.</a> EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).</li><li>Servant, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+minimal+phosphoacceptor+site+required+for+in+vivo+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+response+to+virus+and+double-stranded+RNA.">Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA.</a> J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).</li><li>Bergstroem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+in+vivo+virus-targeted+phosphorylation+site+in+interferon+regulatory+factor-3+(IRF3).">Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3).</a> J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).</li><li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ser386+phosphorylation+of+transcription+factor+IRF-3+induces+dimerization+and+association+with+CBP/p300+without+overall+conformational+change.">Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change.</a> Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).</li><li>Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modification+of+interferon+regulatory+factor+3+following+virus+particle+entry.">Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry.</a> J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).</li><li>McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+inhibit+IRF3+phosphorylation+in+response+to+Toll-like+receptor-3+and+-4+by+targeting+TBK1+activation.">Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).</li><li>Oliere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTLV-1+evades+type+I+interferon+antiviral+signaling+by+inducing+the+suppressor+of+cytokine+signaling+1+(SOCS1).">HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1).</a> PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).</li><li>Kato, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response.">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+IRF-3/-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection:+common+and+unique+pathways.">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).</li><li>tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+the+measles+virus+nucleocapsid+as+a+mechanism+of+IRF-3+activation.">Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation.</a> J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).</li><li>Bibeau-Poirier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+I{kappa}B+Kinase+(IKK)-Related+Kinases+Tank-Binding+Kinase+1/IKKi+and+Cullin-Based+Ubiquitin+Ligases+in+IFN+Regulatory+Factor-3+Degradation.">Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation.</a> J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).</li><li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Activation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3+during+Infection+by+Paramyxoviruses+Requires+MDA5.">Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5.</a> J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Das Protokoll beschreiben wir hier aus einer Kombination von hochauflösenden SDS-PAGE und native-PAGE auf die Verwendung von mehreren phosphospecific Antikörper zu den monomeren / dimeren und phosphoforms I-IV IRF3 unterscheiden gekoppelt. Entsprechende Erfassung dieser IRF3 Spezies ist wichtig, um vollständig zu charakterisieren IRF3 Aktivierung in einer bestimmten Umgebung. B. LPS-Stimulierung von aktivierten Makrophagen führt zur Bildung von dimeren, Ser396 / 398 phosphoryliert IRF3 die eine hypophosphorylierten (Form II) aufweist, aber nicht hyperphosphoryliert (Form III und IV), Muster in SDS-PAGE 15. Mit dem beschriebenen Protokoll, kann das Profil von virusinduzierten hyperphosphoryliertem Formen, die zusätzliche Ser339-Phosphorylierung neben Ser386 und Ser396-Phosphorylierung 10 erfordern unterschieden werden. Wichtig ist, ermöglicht dies auch Unterscheiden zwischen Ser396 phosphoryliert Arten, die nicht zeigen Dimerisierung, sind aber transkriptionell aktiv 10. Importantly, ist anzumerken, daß die Form I-IV Muster IRF3 phosphoforms menschliche IRF3 angewendet werden. Murine IRF3 kein ähnliches Muster und somit die Aktivierung von IRF3 gekennzeichnet weisen nur durch die Verwendung von Antikörpern in phosphospecific Immunoblot nach SDS-PAGE und durch native-PAGE. Das Erreichen einer hohen Auflösung Trennung der verschiedenen phosphorylierten Spezies IRF3 durch SDS-PAGE erfordert spezifische Parameter. Eine geeignete Lösung, ist es sehr wichtig, um Gele, die eine Mindestlänge von 16 cm besitzen. Selbst mit dieser Länge Trenngel, es ist Schlüssel der Migrationsfront den Boden des Gels zu erreichen, um eine angemessene Trennung der verschiedenen IRF3 Formen erhalten zu lassen. Auch muß die Sammelgel auf ein Minimum von 1 cm unterhalb des Kamms zu definierten Bands erhalten erstrecken. Dies ist wichtig, da die hyperphosphorylierten Formen IRF3 migrieren sehr nahe zueinander. Unscharfe Bands werden in fehlende Unterscheidung zwischen phosphoryla führented bildet ihren jeweiligen Quantifizierung zu beeinträchtigen. Zusätzlich kann die Konzentration von Ammoniumpersulfat und TEMED variieren von einem SDS-PAGE-Protokoll zu einem anderen. Variation in diesen Konzentrationen von denen, die hier angegeben wurde gefunden, dass die Auflösung in der Trennung der IRF3 Arten wesentlich beeinträchtigen. Der Nachweis von IRF3 Dimerbildung über die native-PAGE wurde ursprünglich von der Gruppe von Dr. T. Fujita beschrieben. Dieses Protokoll verwendet Puffer mit DOC, der die Dissoziation des IRF3 Dimers aus CBP / p300 27 ermöglicht. Es wird dringend empfohlen, um native-PAGE unmittelbar nach Zelllyse als Speicher des WCE bei -80 ° C ablaufen wurde festgestellt, zu einer signifikanten Veränderung der IRF3 Monomer / Dimer-Verhältnis führen. Zusätzlich ist es sehr wichtig, dass der pH-Wert der oberen und unteren Kammer Puffer auf pH 8,4 bei Raumtemperatur eingestellt wird, und nicht bei 4 ° C nach dem Mischen aller Komponenten, um eine ordnungsgemäße Trennung des Monomers vs Dimer zu erzielen. Eine TrennungGel mit einer Mindestlänge von 8,5 cm ermöglicht angemessene Trennung der IRF3 Monomer und Dimer. Der ideale Volumen der Probe plus Ladepuffers ist ungefähr 8 &amp; mgr; l für eine 5 mm und die Auflösung ist besser, wenn das Volumen auf ein Minimum reduziert. Somit ist es wichtig, den niedrigsten Volumen Lysepuffer verwenden WCE mit hoher Konzentration zu erhalten. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass eine effiziente Proteinextraktion erfordert Lyse in mindestens 5-fache Volumen des Zellpellets entnommen werden. Wenn das Volumen der Proben die oben angegebene Grenze überschreitet, würde dies zu einer schlechten Auflösung des Monomer / Dimer. Dies kann durch Zugabe eines Sammelgel, das 4% Acrylamid, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 O. TEMED gelöst werden Es ist sehr wichtig, die Proben ohne störende Streifenbildung zu laden. Langsam geladen mit einer Gel-Ladespitze nahe dem Boden des Brunnens gibt sehr gute Ergebnisse. Hier beschreiben wir die in vivo detection der Phosphorylierung an spezifischen Resten mit den derzeit verfügbaren phosphospecific Antikörper gegen Ser386 9, Ser396 und Ser398 15 19. Die Verwendung von IRF3 Mutanten und Massenspektrometrie-Analysen bestätigt haben, dass diese Rückstände phosphoryliert auf Virus-Infektion oder Überexpression IKKε / TBK1 Kinasen und sind entscheidend für IRF3 Aktivierung 6,9,10,19,21. Immunodetektion von Phospho-Ser396, Phospho-Ser398 und insgesamt IRF3 nach SDS-PAGE erfordert die Verwendung von zwei identischen Gelen (Abbildung 1). Tatsächlich wird eine signifikante Sensitivitätsverlust beobachtet, wenn phosphospecific Antikörper werden nach dem Ablösen der Membran verwendet wird. Es wird daher dringend empfohlen, zunächst phosphospecific Antikörper zu verwenden. Beachten Sie, dass alternative primäre und sekundäre Antikörper können auch funktionieren, aber die spezifischen Verdünnungen und die Reihenfolge der Nutzung sollte optimiert werden. Für IRF3 Analyse, 30 &amp; mgr; WCE ist angebracht, einen signifikanten Nachweis von IRF3 erhaltenPhosphorylierung durch Immunoblot unter Verwendung der angegebenen Antikörper bei der Verwendung von 4 mm Breite Brunnen. Obwohl in vielen Zelltypen mit verschiedenen Viren infiziert 30 ug wurde für geeignet befunden, wird diese Menge brauchen je nach Zelltyp und die Stimulation erhöht wird. Es ist bevorzugt, frischen Extrakte für SDS-PAGE verwenden, aber der Nachweis von IRF3 Phosphorylierung unter Verwendung der in diesem Dokument beschriebenen phosphospecific Antikörper ist stabil genug, um eine Runde der Lagerung des WCE bei -80 ° C vor der Analyse zu ermöglichen. Die Konzentrationen der hier beschriebenen Phosphatase-Inhibitoren wurden als ausreichend erwiesen, bei Verwendung von A549-Zellen. Höhere Konzentrationen wurden nicht gefunden, um bessere Ergebnisse zu erhalten. Jedoch diese Konzentrationen müssen möglicherweise bei der Untersuchung IRF3 Aktivierung in Zelltypen, die höher Phosphataseaktivität Ebenen aufweisen erhöht werden. Wichtig ist, dass die Phosphorylierung von IRF3 und die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch lange nicht verstanden. Daher ist eine vollständige Gruppe von Ser / Thr und Tyr-Phosphatase inInhibitoren verwendet wird, um möglichst noch nicht charakterisierten Aktivitäten, die den Nachweis von IRF3 Phosphorylierung, Dimerisation Abbau beeinflussen könnte blockieren. Zum Nachweis von IRF3 Monomer und Dimer, nachdem die meisten Virusinfektionen und in den meisten Zelltypen, 8 - wurden 10 ug WCE ausreichend erwiesen. Allerdings könnten höhere Menge an Proteinen zur Stimulation der Aktivierung IRF3 weniger effizient erforderlich. Die phosphospecific Antikörper gegen Ser386 in dieser Studie verwendet werden empfohlen, um in nativen PAGE als die Empfindlichkeit in denaturierenden SDS-PAGE verwendet werden, ist sehr schwach. Darüber hinaus wird die Phosphorylierung an Ser386 vorgeschlagen, mit der dimeren Form von IRF3 9 korrelieren, wodurch die Verwendung dieser Antikörper in nativen PAGE eine geeignete Strategie, dieses Konzept in einer bestimmten Einstellung zu bestätigen. Zu beachten ist, sind alternative Antikörper von verschiedenen Firmen und sind angeblich Phospho-Ser386 effizient erfassen nach SDS-PAGE. Phosphospecific Antikörper gegen Ser396 haben ebenfalls effizient u gewesensed IRF3 Phosphorylierung nach der nativen PAGE 20 zu erkennen. Wichtiger ist, Ser402 in der C-terminalen Cluster von phosphoacceptor Stellen wurde ebenfalls als wichtig für IRF3 Aktivierung und Phosphorylierung von Ser402 wurde durch Massenspektrometrieanalyse IKKε / TBK1 phosphoryliert IRF3 10,21,28 beobachtet werden. Trotz zwei verschiedene Versuche (NG, unveröffentlicht), sind keine phosphospecific Antikörper derzeit zur Verfügung stehen die Phosphorylierung von diesem spezifischen Rest in vivo zu folgen. Beachten Sie, dass phosphospecific Antikörper gegen Thr157 und Ser339 wurden auch beschrieben 11,13. Diese zusätzlichen phosphospecific Antikörper könnten in einem Verfahren der hochauflösenden SDS-PAGE ähnlich dem hier beschriebenen verwendet werden. In diesem Fall würden zusätzliche große SDS-PAGE-Gelen für jeden Antikörper benötigt und verarbeitet werden auf die gleiche Weise wie Gel # 2 (Abbildung 1). Nach unserer Kenntnis keine phosphospecific Antikörper gegen Ser173 oder Thr390 noch beschrieben worden ist,sie können jedoch einfach auf die hier beschriebene, sobald sie verfügbar werden 14,20 Protokoll hinzugefügt werden. IRF3 Aktivität wird durch Proteasom-vermittelten Abbau von hyperphosphoryliertem Formen 11,17 beendet. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht auch die Überwachung des IRF3 Verschlechterung, wenn die kinetische Stimulation verlängert und ist auf die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren (MG132, Lactacystin oder bortezomid) gekoppelt ist. Typischerweise wird in A549-Zellen mit SeV infiziert bei 40 HAU / 10 6 Zellen, beginnt IRF3 Phosphorylierung, sobald 2 h nach der Infektion und SeV IRF3 Abbau beginnt nach 12 Stunden. Proteasom-vermittelten Abbau wird aus der beobachteten Abnahme der Formen III und IV Ebenen am späten Zeitpunkten, die in den Bedingungen mit Proteasom-Inhibitoren umgekehrt wird geschlossen. Dies wird auch auf nativen PAGE übersetzen in einer Verminderung der IRF3 Dimer-Werte, die auf Proteasom-Inhibitor-Behandlung 29 zurückgewonnen werden. Wichtig ist, dass die hochauflösende technique hier präsentierten erlaubt die Unterscheidung zwischen den Abbauprozess und ein Mangel an Aktivierung. So haben sowohl Abbau und fehlende Aktivierung IRF3 Ergebnis in Abwesenheit der Detektion von Dimer / Phospho-Ser386 / 396. Jedoch ist der Mangel an Aktivierung mit der Erfassung IRF3 Monomer und der Formen I und II zugeordnet sind, während diese IRF3 Spezies werden nicht erkannt, wenn IRF3 wird 30 abgebaut. Immunpräzipitation Massenspektrometrie basierende Analyse ist eine Methode der Wahl, um die in vivo Phosphorylierung IRF3 an bestimmten Stellen zu erfassen. Diese Technik wurde verwendet, um die Phosphorylierung von Ser173 in IRF3, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 und Ser402 bestätigen Reste 10,20,21. Allerdings ist die Massenspektrometrie noch nicht eine erschwingliche / benchside Technik, die leicht für die tägliche Analyse der IRF3 Aktivierung nach mehreren Stimulationen zu verschiedenen Zeitpunkten verwendet werden kann. Daher hier beschriebene Verfahren unter Verwendung von SDS-PAGE, native-PAG verbundenE in Kombination mit Immunoblot unter Verwendung von Gesamt-und phosphospecific Antikörper stellt eine praktische, erschwingliche und sensiblen Umgang, um alle derzeit definierten Formen der actived IRF3 zu erkennen.

<html> Das ubiquitär und konstitutiv exprimierten Transkriptionsfaktors Interferon (IFN) Regulatory Factor 3 (IRF3) ist entscheidend für die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger vor allem durch die Induktion von IFN &amp; beta;, aber auch durch die Induktion des Chemokin (CC motif) Ligand 5 (CCL5 ) und mehrere antivirale Proteine, einschließlich IFN-induzierte Protein mit tetratricopeptide wiederholt IFIT1 / 2/3 1-3. Oder Lipopolysaccharid (LPS) 4: IRF3 Aktivierung wurde nach der Infektion mit einer Vielzahl von Viren, oder durch Einwirkung von Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly-I C) angegeben. Wichtig ist, dass die meisten untersuchten Viren Mechanismen entwickelt, um die IRF3 vermittelte Reaktion entziehen und damit die Flucht der Host angeborenen Immunabwehr 5. Somit überwachen IRF3 Aktivierung ist von großer Bedeutung, um die molekularen Mechanismen der unspezifischen antiviralen Abwehr verstehen, sondern auch, um die durch Viren verwendet, um diese Antwort entgegenzuwirken Strategie zu identifizieren. ent &quot;&gt; Viele veröffentlichten Berichten allerdings nur eine begrenzte Analyse IRF3 Aktivierung durch die Überwachung der IRF3-Zielgen Induktion (IFNB1 und IFIT1) durchgeführt und / oder Luciferase-Reportergen-Assay zu niedrige Auflösung Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gekoppelt ist (SDS- PAGE) -Analyse IRF3. Jedoch zahlreiche biochemische Studien zeigte die Analyse des Verhaltens verschiedener IRF3 Mutanten und Aufklärung der Kristallstruktur IRF3 6-11 haben dazu beigetragen, dass IRF3 herzustellen ist mit einer komplexen Reihe von aufeinanderfolgenden posttranslationalen Modifikationen durch Phosphorylierung an unterworfen mehreren Standorten. Die Menge der Phosphorylierung in IRF3 Aktivierung beteiligt scheint von dem Stimulus und höchstwahrscheinlich nach Zelltyp zu sein. Bei nicht infizierten Zellen, koexistiert IRF3 als nicht-phosphoryliert und hypophosphorylierten enthaltenden Arten phosphoresidues einschließlich Thr135 und Ser173, in der 1 -198 aa N-terminalen Bereich 6,12-14. Anhäufung dieser hypophosphorylierten form der IRF3 durch Stress induzieren, Wachstumsfaktoren und DNA-schädigende Mittel 6 induziert. Phosphorylierung von Ser / Thr-Reste am C-terminalen Region von IRF3 enthaltend die Transaktivierungsdomäne ausgelöst nach einer Aktivierung, die durch Viren, Poly I: C oder LPS in einer zelltypabhängig 15-17. C-terminale Phosphorylierung von IRF3 beinhaltet nicht weniger als 7 verschiedene phosphoacceptor Standorten in zwei Hauptcluster, Ser385 / Ser386 und Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 organisiert, dass jeder dazu beitragen, IRF3 Aktivierung durch Dimerisierung, Kernakkumulation, Verbindung mit dem CREB bindenden Protein (CBP) / p300 Co-Aktivatoren, DNA-Bindung an sensiblen Antwortelement (ISRE) Konsensus-Sequenzen und Transaktivierung von Zielgenen 9,10,17-19 IFN. Die Phosphorylierung von Thr390 ist auch gedacht, um virusinduzierten IRF3 Aktivierungs 20 beizutragen. Massenspektrometrie-Analysen von IRF3 haben gezeigt, dass Ser386, Thr390, Ser396 und Ser402 Reste direkt phosphorylatdurch den Inhibitor der &amp; kgr; B-Kinase ε (IKKε) ed / TANK-bindenden Kinase 1 (TBK1) Kinasen 9,10. Phosphorylierung an der C-terminalen Reste auch für die Beendigung des IRF3 Aktivierung über Polyubiquitinierung und Proteasom-vermittelten Abbau 10 erforderlich. Dieses Verfahren ist auch abhängig von der Phosphorylierung an Ser339, der für die Einstellung des propyl Isomerase Pin1 10,11 erforderlich ist. IRF3 Spezies, die mindestens Phospho-Ser339 / 386/396 Rückstände berücksichtigt werden hyperphosphorylierten Formen. Der genaue Ablauf und Funktion der Website bleibt eine Frage der Diskussion 10,21. Es ist nun klar, dass aktiviert IRF3 keinen homogenen Zustand dar, sondern dass verschiedene aktivierte Spezies ausgeprägte Phosphorylierung oder Dimerisierung Eigenschaften aufweisen vorhanden 10,22. Um ein vollständiges Verständnis der IRF3 Aktivierung in Reaktion auf bestimmte Krankheitserreger liefern, ist es daher notwendig, characterize welche der aktivierten Spezies induziert werden. Induktion IRF3 Zielgene IFNB1 und IFIT1 hat sich als zuverlässige Auslese für IRF3 Aktivierung. Jedoch Überwachen Expression dieser Gene nicht zwischen verschiedenen Aktivierungszuständen des IRF3 unterscheiden. Eine umfassende Analyse der IRF3 Aktivierungszustände in einer bestimmten Einstellung stützt sich auf die detaillierte Charakterisierung ihrer Phosphorylierung und Dimerisierung Status 10. Unphosphorylierten (Form I), hypophosphoryliert (Form II) und hyperphosphoryliertem (Formen III und IV) IRF3 Formen 6,18,23 erfolgreich durch eingeschränkte Mobilität in hoher Auflösung SDS-PAGE-Analyse aufgelöst werden. Monomeren und dimeren IRF3 Spezies effizient durch native-PAGE-Analyse identifiziert werden. Diese Ansätze werden stark verbessert, wenn es in Kombination mit phosphospecific Antikörper gegen verschiedene IRF3 phosphoacceptor Teilen geleitet verwendet. Standardprotokolle ermöglichen eine schlechte Auflösung vonProteine, die keine wirksame Trennung von unterschiedlichen IRF3 phosphorylierten Formen zulässt. Hier beschreiben wir im Detail ein Verfahren, um die höchste Auflösung zu erreichen, um die Induktion von verschiedenen Virus-aktivierte IRF3 Spezies unter Verwendung von SDS-PAGE, native-PAGE in Kombination mit Immunoblot gekoppelt mit Gesamt und phosphospecific Antikörper zu überwachen. In vivo Diskriminierung zwischen den Aktiv Formen IRF3 wird auf der Basis ihrer in der SDS-PAGE beobachteten Mobilitätsverschiebungen durchgeführt. Zusätzlich kann IRF3 Monomer und Dimer von nicht-denaturierenden Elektrophorese unterschieden werden. Die Kombination dieser zwei komplementären Techniken mit Immunoblot erweist sich als eine kostengünstige und sensiblen Umgang mit alle notwendigen Informationen für eine vollständige Analyse der Phosphorylierung-vermittelte Aktivierung von IRF3 erwerben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">F12/Ham</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11765-054</td>
			<td style="width:429px;">Warm in a 37&#176;C bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-PBS</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td>For cell culture.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trypsin/EDTA 0.25 %</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sendai virus Cantell Strain</td>
			<td style="width:191px;">Charles River Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">600503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Hepes</td>
			<td style="width:191px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">HEP001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">EDTA</td>
			<td style="width:191px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">EDT001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Glycerol</td>
			<td style="width:191px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">GLY001.1</td>
			<td style="width:429px;">Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7771</td>
			<td style="width:429px;">Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:191px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">LEU001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Aprotinin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>APR600.25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>159664</td>
			<td style="width:429px;">Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-Glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6376&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Bio-Rad Protein Assay Reagent&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006&#160;</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 %</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ACR005&#160;</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:191px;">Bioshop</td>
			<td>DEO701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>LabChem</td>
			<td>LC15320-4&#160;</td>
			<td>Work under fume hood. Toxic and irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SDS001.1&#160;</td>
			<td>Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Amonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TEMED</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15524-010</td>
			<td>Toxic and irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td style="width:429px;">Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLN001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SHY700&#160;</td>
			<td>Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nitrocellulose membrane (0.45mm)</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">162-0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acetic acid glacial</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ACE222.4</td>
			<td>Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Red ponceau</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3504&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911&#160;</td>
			<td>For PBS composition for immunoblot.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">Na2HPO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPD307.5</td>
			<td>For PBS composition for immunoblot.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662&#160;</td>
			<td>For PBS composition for immunoblot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td>For PBS-T-BSA composition for immunoblot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Non-fat dry milk</td>
			<td style="width:191px;">Carnation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Poly sorbate 20 (Tween)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>103168</td>
			<td style="width:429px;">Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Anti-IRF-3-P-Ser386</td>
			<td style="width:191px;">IBL-America</td>
			<td style="width:119px;">18783</td>
			<td>Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Anti-IRF-3-P-Ser396</td>
			<td style="width:191px;">Home made19</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td>
			<td style="width:191px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">4947s</td>
			<td>Store at -20oC.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Anti-IRF-3-P-Ser398</td>
			<td style="width:191px;">Home made15</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Anti-IRF-3-full length</td>
			<td style="width:191px;">Actif motif</td>
			<td style="width:119px;">39033</td>
			<td>Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Anti-IRF3-NES</td>
			<td style="width:191px;">IBL-America</td>
			<td style="width:119px;">18781</td>
			<td>Store aliquoted at -20oC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus</td>
			<td>Perkin-Elmer Life Sciences</td>
			<td>NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LAS4000mini CCD camera apparatus</td>
			<td style="width:191px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0317</td>
			<td>Store aliquoted at -20oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high resolution method to monitor phosphorylation-dependent activation of irf3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Abbildung 2 zeigt ein typisches Bild der Immunoblot IRF3 mit IRF3 Gesamt Antikörper und IRF3-phosphospecific Antikörper gegen Ser396 und Ser398 nach der Auflösung des WCE durch hochauflösende SDS-PAGE nachgewiesen. In unstimulierten Zellen A549 wird IRF3 als zwei Banden bei 50 und 53 kDa in der SDS-PAGE entsprechend dem nicht-phosphoryliert (Form I) und der hypophosphorylierten (Form II) Spezies IRF3 detektiert. Exposition der Zellen A549 SEV für 3-9 Stunden ergibt eine zeitabhängige Verschiebung zu langsam wandernden hyperphosphorylierten Formen III und IV, die von den Formen gut unterschieden werden I und II. Die hyperphosphoryliertem Bands migrieren bei 55-57 kDa. Die Formen III und IV sind ebenfalls spezifisch mit den Antikörpern gegen phosphospecific Ser396 und Ser398 immunologisch. Die Immundetektion von Actin dient als Kontrolle der gleiche Beladung zwischen den Fahrspuren. Eine Steuerung der SeV-Infektion wird durch die Anreicherung des Virus-Nucleocapsid-p gezeigtenrotein (N), die bei 60 kDa wandert. In Figur 3 ist das Profil der Detektion IRF3 von WCE durch native-PAGE gefolgt durch Immunoblot unter Verwendung von Anti-IRF3-NES-Antikörper und Antikörper gegen phosphospecific Ser386 gelöst erhaltenen gezeigt. In unstimulierten Zellen A549 wird IRF3 als eine einzelne Bande entsprechend der monomeren Form nachgewiesen. Bei Infektion mit SeV für 3-9 h, die Höhe der Abnahme IRF3 Monomer mit einer gleichzeitigen Ansammlung einer langsam wandernden Bande, die mit dem dimeren Form IRF3 entspricht. Die phosphospecific Antikörper gegen Ser386 nur IRF3 Dimer Arten. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53723/53723fig2.jpg" /> Abbildung 2. Nachweis von Distinct IRF3 Phosphorylierte Species (Formular I-IV) von SeV-Infektion in A549-Zellen induziert. A549-Zellen wurden für die nicht infizierten indica links oder mit SeV infiziertted Zeiten. WCE wurden durch hochauflösende SDS-PAGE, gefolgt durch Immunoblot (IB) unter Verwendung von Anti-IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) und Anti-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) phosphospecific Antikörper und anti analysiert -IRF3 Protein voller Länge Antikörpern. Die Infektion wurde unter Verwendung von anti-SeV-Antikörper überwacht (die Nukleokapsid-N-Protein ist gezeigt). Anti-Aktin-Antikörper wurden als Ladekontrolle verwendet werden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53723/53723fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53723/53723fig3.jpg" /> Figur 3. Überwachung von phosphorylierten / dimerisierte IRF3 Induktion durch SeV in A549-Zellen. A549-Zellen wurden nicht infizierte links oder mit SeV infiziert für die angegebenen Zeiten. WCE wurden durch native-PAGE aufgetrennt und unter Verwendung von Anti-IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) phosphospecific Antikörper und anti-IRF3-NES ANTIB durch Immunoblot zeigteodies. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53723/53723fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

a-high-resolution-method-to-monitor-phosphorylation-dependent

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K Aufrufe.  Université de Montréal. Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Serie: A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Forschung

Biologie

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Absolute Quantenausbeute Messung von Pulverproben

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Mit hochauflösenden Computertomographie, die dreidimensionale Struktur und Funktion pflanzlicher Gefäßsystem Visualisieren

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Ex-vivo-Verfahren für High Resolution Imaging von Cilia Motilität in Nagetier Atemwegsepithelien

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.