This research was supported by a National Leading Research Laboratory Program (Grant NRF-2013R1A2A1A05006378) through the National Research Foundation of Korea funded by the Ministry of Science, ICT and Future Planning. The authors also acknowledge a KAIST Systems Healthcare Program.

1. Herstellung der mikrostrukturierten Formen und Hydrogele <ol><li> Die gewünschten Mikrostufenmuster mit Su-8 auf der Oberfläche eines Silizium-Wafers über eine Standard zweistufige photolithographischen Technik 15,17 zum Gießen PDMS Schimmelpilze. Das gezeigte Beispiel verwendet eine Leberläppchens artigen Maschenmuster (1). </li><li> Abwiegen PDMS und einer Härterlösung mit einem Verhältnis von 1: 5 (das heißt, 12,5 g PDMS und 2,5 g Härter). </li><li> Mischen Sie die 15 g der Lösung gründlich, entgast die Blasen in einer Vakuumkammer, und dann verbreiten die gemischte Lösung auf einen mikrostrukturierten Oberfläche der Silizium-Wafer gleichmäßig innerhalb einer Foliengießen Gericht. </li><li> Setzen Sie den Silizium-Wafer auf eine 65 ° C erhitzt Platte für 90 min auf eine ebene Fläche, um die PDMS zu heilen. </li><li> Entfernen Sie die ausgehärtete PDMS aus der Gussschale und dem Silizium-Wafer. </li><li> Schneiden Sie die Kanten der PDMS und legen Sie sie auf eine Petrischale von 100 mm Durchmesser mitdie mikro Seite nach oben. </li><li> Auf der Petrischale unter Verwendung von 70% Ethanol und destilliertes Wasser für die primäre Sterilisations Waschen der Mikromuster gehärtet PDMS. Dann trocknet sie vollständig für 10 min in einem Ofen bei 65 ° C. </li><li> Auflösen und mischen O / N 3 g eines pulverförmigen nichtionischen Tensid in 100 ml destilliertem Wasser gelöst, wodurch eine 3% (w / v) Beschichtungslösung. </li><li> Platzieren der mikro PDMS Formen in einer Plasmareiniger und reinigen sie für 1 min (85 W, 0,73 mbar), um eine hydrophile Oberfläche zu schaffen, um die Zugabe von wässrigen Flüssigkeiten zu erleichtern. Dann Beschichten der Oberfläche der PDMS mit 100 ml Tensidlösung für mindestens 3 hr (ORO / N) unter Verwendung eines Labor Wippe. </li><li> Waschen Sie die Tensidlösung aus PDMS Formen und trocknet sie vollständig in einem Ofen bei 65 ° C für 10 min. Dann sterilisiert jede mikrostrukturierte Form durch Belichtung mit ultravioletter Strahlung (UV) über 30 min. </li></ol> 2. Bereiten Sie die Zellsuspension in einem Hydrogel-Vorläufer <ol><li> ZuHydrogel-Vorläufer herzustellen, werden in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Man löst 0,1 g Natrium-Alginat Pulver, wodurch eine 1% (w / v) Alginat Vorläufers. Um das Pulver vollständig aufzulösen, Inkubation und mischen sie O / N. </li><li> Die Lösung wird durch ein 0,22 um-Filter in eine 1 ml Spritze verbunden. </li><li> Kultur die HepG2-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin auf einer herkömmlichen Gewebekulturschale bis 70% ergänzt - 80% Konfluenz in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C . </li><li> Die Zellen einmal mit PBS zu waschen, und dann trypsinize sie durch Zugabe von 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA für 4 min in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Zentrifugation der Zellen von der Kulturschale für 3 min und resuspendieren mit 1 ml PBS nach der Entfernung des Überstands bei 250 × g geerntet. </li><li> Zählen die Anzahl von einzelnen verteilten Zellen in PBS unter Verwendung eines automatisierten ZellZähler. </li><li> Nach der Zentrifugation bei 250 × g für 3 min und PBS Entfernung, 1 ml der 1% (w / v) Natriumalginatlösung zu der verbleibende Zellpellet und mischen sie sanft mit Pipettieren. 10 7 Zellen / ml - die endgültige Saatdichte der Zellen sollte 5 x 10 6 ist. Inkubieren der Zell / Hydrogel-Suspension in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. </li></ol> 3. Laden und Vernetzung von Cell / Hydrogel Federung <ol><li> Aufzulösen 1,47 g Calciumchlorid zu dehydratisieren in 100 ml ddH 2 O zu einer vernetzenden Reagens (dh 100 mM CaCl 2 · 2H 2 O in ddH 2 O). </li><li> Spülen Sie das Innere eines Luftbefeuchter mit Ultraschall-Wandler mit 70% Ethanol, und füllen Sie es mit 200 ml Vernetzungsreagenz. Der Befeuchter ist 110 mm breit, 300 mm lang und 170 mm tief (dh 110 mm x 300 mm x 170 mm (B x H x T)). </li><li> Legen Sie die mikrostrukturierten PDMSFormen in einem Plasmafilter und reinigen sie für 1 min bei 85 W, um eine hydrophile Oberfläche zu schaffen. </li><li> 7,2 ul des gut vermischten Zell / Hydrogel-Suspension kontinuierlich geladen am Rand des Mikromusters auf der Form. Das gezeigte Beispiel verwendet eine Leberläppchens artigen Maschenmuster (1). Das Volumen der Suspension ist abhängig von der topographischen Muster. </li><li> Um die Gelierung der Zelle / Hydrogel-Suspension zu erreichen, schalten Sie den Luftbefeuchter und überprüfen, dass der Luftbefeuchter erzeugt einen Nebel des Vernetzungsreagens. Spray das Vernetzungsreagenz auf das Hydrogel-Vorläufer für 5 min, für den topographischen Oberfläche des PDMS Formen in einem Bereich von 5 cm. Hinweis: Entfernungen länger und kürzer als 5 cm konnte unvollständige und ungleichmäßige Gelierung zu bewirken sind. Sicherzustellen, dass der Befeuchter mit einer Sprührate von 250 ml / h, wodurch 20 ml Nebel des Vernetzungsreagens in 5 min. </li><li> Nach der Vernetzungsprozess, schalten Sie den Luftbefeuchter und füllen Sie die PDMS-molds mit PBS. </li></ol> 4. Handhabung des Einzel Modular Hydrogel Blätter <ol><li> Nehmen Sie jede gehärtete Hydrogelfolie von den mikrostrukturierten Formen über Pipettieren PBS sanft um das Hydrogel Blatt unter Verwendung eines 200 ul Pipettenspitze. </li><li> Pick up jede schwimm Hydrogelfolie mit einer End-zu schneiden 1.000 ul Pipettenspitze Ende. Jedes Leberläppchens förmige Netz Hydrogelfolie hat Abmessungen von 8 mm x 8,7 mm und ist 100 bis 200 &amp; mgr; m dick. </li><li> Übertragen Sie eine einzelne Schicht des Hydrogels Blatt in 1 ml DMEM in einer 12-Well-Platte, und die Kultur der Zellen in vitro in einer schwimmenden Weise mit der Hydrogel-Konstrukt als eine Einheit Komponente im 12-Well-Platte über eine Woche in einem 5 % CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Tauschen Sie jeden zweiten Tag des Kulturmediums. </li></ol> 5. Montage von mehrschichtigen Hydrogel Blätter <ol><li> Die Schritte 1.1 bis 1.5, ein PDMS-Rahmen mit Abmessungen von 18 mm x 18 mm x 4 mm zu erzeugen (W xH x T), und die 170 &amp; mgr; m hohen Säulenstrukturen an der unteren Fläche enthält. Verwenden von 42 g der Mischung von PDMS und Härter, mit dem gleichen Verhältnis, wie in Schritt 1.2. Legen Sie eine spezielle Polycarbonatform auf dem Siliziumwafer für die PDMS-Rahmen, um eine Innenrahmen mit Abmessungen von 8 mm x 9 mm x 2 mm zu erstellen (B x H x T). </li><li> Sterilisieren der PDMS Rahmen und 180 &amp; mgr; m Porennylonfilterpapiere in destilliertem Wasser und einer Pinzette in einem Autoklaven unter Wasser für 15 min bei 121 ° C. </li><li> Legen Sie die sterilisiert PDMS Rahmen auf ein Viertel der ein Stück Nylon-Filterpapier (mit einem Durchmesser von 5 cm) in einem 60-mm-Petrischale. </li><li> Übertragen einer modularen Hydrogelfolie in das Innere des PDMS-Rahmen unter Verwendung einer End-zu schneiden 1.000 &amp; mgr; l-Pipettenspitze. Die Hydrogelfolien zur Montage verwendet werden, sollten für mindestens einen Tag, nachdem sie hergestellt wurden, kultiviert werden. </li><li> Richten Sie die Kante jeder modularen Hydrogelfolie mit dem PDMS-Rahmen mit einem leeren 200 ul Pipettenspitze. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.4 und 5.5 unter Verwendung modularer Hydrogelfolien um einen Stapel von 4 bilden - 6 Schichten. </li><li> Entfernen des Kulturmediums durch Fließen ihn durch die Säulenstrukturen am Boden des PDMS-Rahmen. Es werden nun 2 ul Alginatlösung (2% w / v) an einer Ecke des Mehrschichtkonstrukts. </li><li> Sprühen eines Nebels des Vernetzungsreagenz für 30 s auf dem Mehrschichtkonstrukt, um die Kanten der einzelnen Schichten mit denen einer anderen zu befestigen. Ein 2-ml Nebel des Vernetzungsreagenz (mit einer Sprührate von 250 ml / h). </li><li> Spülen Sie die mehrschichtige Aufbau vorsichtig mit 400 ul DMEM und entfernen Sie die PDMS-Rahmen mit einer Pinzette. </li><li> Nehmen Sie das mehrschichtige Aufbau aus dem Filterpapier durch vorsichtiges Abwischen mit einem Zellheber nach der Zugabe von 4 ml DMEM. </li><li> Übertragen Sie die mehrschichtige Aufbau zu einer 6-Well-Platte, die 3 ml DMEM mit Filterpapier, und Kultur die Zellen in vitro in einer schwimmenden Weise mit dem Hydrogel-Konstrukt, wieeine Multiskalenzellgerüst in 6-Well-Platte über eine Woche in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Tauschen Sie jeden zweiten Tag des Kulturmediums. </li></ol>

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Mater. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+Biocompatible+Fabrication+of+Chemically+Sol&#8722;Gel+Transitional+Hydrogel+Free-Standing+Microarchitectures.">Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol&#8722;Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures.</a> 12 (1), 14-18 (2011).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+hydrogel+biopaper+for+patterned+3D+cell+culture+and+modular+tissue+reconstruction.">Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction.</a> Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).</li><li>Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. 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The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll liefert ein einfaches Verfahren zur Herstellung von modularen Hydrogelfolien und der Zusammensetzung und der 3D-Zellgerüste bilden. Um eindeutige gemustert Alginat Strukturen in kurzer Zeit zu bauen, sollten wir eine Vernetzung Prozess, der ausreichend steif Strukturen erstellen können, die komplexen Mikrostrukturen aus der Form zu halten, sowie Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen und den Stoffwechsel zu identifizieren. Wir haben ein Vernetzungsverfahren entwickelt, einschließlich eines Sol-Gel-Übergang, um ein Vernetzungsmittel mit einem Luftbefeuchter in der Form eines Nebels zu sprühen. Ohne diesen Vernetzungsverfahren können die Mikromaßstab Muster nicht in Form einer dünnen Hydrogel erzeugt Konstrukt mit der begrenzten Tiefe diffusive werden (100 - 200 um), die eine hohe Diffusionspermeabilität Metaboliten und Nährstoffen. Weiterhin, verglichen mit bestehenden diffusionsbasierten Verfahren, die erfordern 30 - 60 min, 18 - 20 das Vernetzungs timir war relativ kurz (3-5 min). Darüber hinaus war es auch schwierig, die dünnen Hydrogelfolien, die nur in einem flüssigen Medium mechanisch stabil waren manipulieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde die dünne Hydrogel-Struktur einfach und stabil gehandhabt und manipuliert mit einem Ende geschnitten herkömmlichen Tipp für transferal zwischen verschiedenen Kulturbedingungen. Verwendung Erzeugung und Manipulationstechniken, konnten wir nicht nur eine einschichtige Folie schwimmend für mögliche Anwendungen in der Wirkstoffassays, sondern auch mit gestapelter Mehrschichtstruktur zu schaffen, mit potentiellen Anwendungen als Gerüste für gewebeartige Konstrukte. Mehrschichtigen Zellarchitekturen können durch Stapeln der modularen Single-Layer-Hydrogel-Blatt (3A) erzeugt werden. Jede modulare Hydrogelfolie können unterschiedliche Zelltypen enthalten und kann an unterschiedliche Kulturbedingungen ausgesetzt werden. Diese Mehrschicht-Konstrukte können dann selektiv Assem werdenblutete. Jedoch kann einfach stapeln Hydrogel Blätter Zellnekrose innerhalb der zusammengesetzten Struktur führen, wenn die Gesamttiefe der beschränkten diffusiv Tiefe (3C) überschreitet. Um dieses Problem zu überwinden, wäre es notwendig, den Mikromaschen Muster, wie Leberläppchens artige Maschen auszurichten, wenn die Mehrschicht Hydrogelfolien zusammengesetzt werden. Wir benötigen daher einen PDMS-Frame mit demselben Muster wie die Innengrenze der Hydrogelfolie, die gestapelten Hydrogel Blätter auszurichten. Somit könnte ausgerichtet mit Lochanordnung im montierten Mikromaschen Hydrogelfolien verwendet werden, um erweiterte Pipeline-Strukturen zu bilden, die Erleichterung effizienter Nährstofftransport zur verbesserten Lebensfähigkeit der Zellen (3B). Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist das Fehlen von Zell-Matrix-Wechselwirkungen in der Alginat-Hydrogels. Alginat kann keine Zelladhäsion Liganden für die in vivo-ähnliche Zell-Matrix-Wechselwirkungen; 21 Allerdings ist es auser mechanischen und geometrischen Effekte als 3D-Zell-Verkapselung Gerüst mit Zell-Zell-Interaktionen. Für Primärzellen und Stammzellen könnten Alginat folgenden Modifikation mit RGD-enthaltende Peptide, 21 oder in Kombination mit Collagen oder Gelatine verwendet werden. 14,18 weitere Einschränkung ist, dass, sobald die Zell eingebetteten Hydrogel Blätter mit geringer Zelldichte unter gefertigt 5 x 10 6 Zellen / ml konnte Konstruktion mehrschichtige Struktur schwach Befestigungen zwischen den Hydrogelfolien verursachen, da nur die Kante der Struktur ist durch Verwendung von zusätzlichen Alginat fixiert. Jedoch können die Schichten kompakt als Einzelgerüst über Drainagestruktur unter dem PDMS Rahmen gestapelt werden. Darüber hinaus könnte eine höhere Dichte von Zellen in der Hydrogel-Blätter auf der Oberfläche als auch innerhalb der Schicht nach einem Tag Kultur, die Befestigungen zwischen Schichten beitragen würde, wie in 3A gezeigt, zu proliferieren. Die Hydrogelfolie fabricahier beschriebenen tion und Manipulationstechnik kann auf die in vitro-Kultursystemen und gewebeähnlichen Zellmodelle angepasst, um eine in vivo-artigen Mikroumgebung für Anwendungen, einschließlich Zellassays und Engineering künstlichen Organen bereitzustellen. Diese Technik könnte zur zellbasierten Medikamententests und biologische Studien, die geometrisch unterschiedliche 3D-Zell Mikro- und macroenvironments, dass verschiedene Zellen oder Hydrogel-Typen zu übernehmen erfordert angewendet werden.

Hydrogele sind besonders vielversprechender Biomaterialien und sollen in grundlegende Biologie, pharmakologischen Tests und der Medizin wichtig. 1 Biofabrication von Hydrogel-basierten zellularen Konstrukte wurde vorgeschlagen, um die Verwendung von Tierversuchen zu reduzieren, 2,3 ersetzen transplantierbaren Geweben, 4 und verbessern zellbasierte Assays. 5,6 Wasser enthaltende (hydro-) viskoelastische Materialien (Gele) ermöglichen eine große Anzahl von Zellen, die eingekapselt und in einer Gerüststruktur, die 3D-zelluläre Mikroumgebung steuern aufrechterhalten werden. In Verbindung mit der Führung des mikrofluidischen oder Mikrostrukturierungstechniken kann die Geometrie der Hydrogel-Konstrukte genau auf zellulärer Ebene gesteuert werden. Bis heute sind eine Vielzahl von Formen von Hydrogelen, einschließlich Teilchen, 7-9 Fasern, 10 - 12 und Blatt, von 13 bis 15 wurden als Bausteine ​​in von unten nach oben ange verwendetSchmerzen auf die Herstellung von Makromaßstab mehrzelligen Architekturen. Beide Hydrogel-basierte Partikel und Fasern sind für Anwendungen wie Mikromaßstab zellulären Umgebungen war leicht und schnell hergestellt, mit fluidischen Steuerungen mit mikrofluidischen Vorrichtungen. Da jedoch die Grundeinheiten von technischen Geweben, würde es schwierig sein, um sie neu anzuordnen und um es zu vergrößern ihr Volumen als Makromaßstab Konstrukte. 16 Es ist schwieriger makro skaliert Konstrukte zu erreichen, als mikrometergroße Grundmodule zu produzieren. Blattartigen Einheiten Hydrogelbasis Konstrukte können verwendet werden, um das Volumen der Gerüste durch einen einfachen Montageprozess zu erhöhen. Folgerichtig gestapelten Schichten Hydrogelfolien bieten nicht nur eine Volumenvergrößerung, sondern auch eine geometrische Ausdehnung in einem 3D-Raum. Wir haben bereits berichtet, ein Verfahren zur Herstellung mikro Hydrogelfolien, 13 - 15 zusammen mit ihrer Anordnung in mehreren LegeEred Zellarchitekturen. Die Technik ermöglicht komplexe Mikrostrukturierung und der modulare Aufbau von Zellkonstrukten über einen Stapelvorgang von mehrschichtigen Strukturen. Durch die Herstellung von gestapelten modularen Hydrogelfolien, die mikrostrukturiert sind, kann ein 3D-Zellkultursystem mit einer gesteuerten Makromaßstab zelluläre Mikroumgebung realisiert werden. Dieses Video-Protokoll beschreibt ein einfaches, aber leistungsfähiges Herstellungsverfahren, das verwendet werden kann, um modulare Hydrogelfolien konstruieren, auf der Grundlage der menschlichen Leberzelllinie (HepG2). Wir zeigen hier einfache Manipulation dieser gemusterten modularen Hydrogelfolien und deren Anordnung in eine Mehrschichtstruktur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:111px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td style="width:163px;">000000000001064291</td>
			<td style="width:397px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:288px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">P2443</td>
			<td>Powdered nonionic surfactant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Alginic acid sodium salt, low viscosity</td>
			<td style="width:111px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:163px;">B25266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ultrasonic humidifier</td>
			<td style="width:111px;">MediHeim</td>
			<td style="width:163px;">MH-2800</td>
			<td>Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 mL/h</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:288px;">Nylon net filter hydrofilic, 180 &#956;m</td>
			<td style="width:111px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:163px;">NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Polycarbonate mold</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of modular hydrogel sheets for micropatterned macro-scaled 3d cellular architecture

Hydrogele können auf der Mikrowaage unter Verwendung von Mikrofluid oder Mikrostrukturierungstechniken, um eine in vivo-ähnliche dreidimensionale (3D) Gewebegeometrie bereitzustellen strukturiert werden. Die erhaltenen 3D Hydrogelbasis zellulären Konstrukte wurden als Alternative zu Tierversuchen zur weitgehenden biologischen Studien, pharmakologischen Tests und Organtransplantationsanwendungen eingeführt. Obwohl auf Hydrogel-Basis und Fasern können leicht hergestellt werden, ist es schwierig, sie zum Wiederaufbau von Gewebe zu manipulieren. In diesem Video, beschreiben wir ein Herstellungsverfahren für mikro Alginat-Hydrogel Blättern, zusammen mit deren Montage ein Makro angelegte 3D-Zellkultursystem mit einem kontrollierten zellulären Mikroumgebung bilden. 200 um und mit präzisen Mikro - unter Verwendung einer Nebelform des Calcium-Geliermittel werden dünne Hydrogelfolien leicht mit einer Dicke im Bereich von 100 erzeugt. Zellen können dann mit der geometrischen Führung der Hydrogelfolien in gezüchtet werdenfreistehenden Bedingungen. Weiterhin kann die Hydrogelfolien leicht manipuliert werden mit einer Mikropipette mit einem End-Schnittspitze und kann durch Stapeln unter Verwendung einer gemusterten Polydimethylsiloxan (PDMS) Rahmen in mehrschichtigen Strukturen aufgebaut werden. Diese modularen Hydrogelfolien, die mit einem einfachen Verfahren hergestellt werden kann, gibt es Anwendungsmöglichkeiten der in vitro-Wirkstoffassays und biologische Untersuchungen, einschließlich funktionelle Studien von Mikro- und Makrostruktur und Geweberekonstruktion.

Wir haben die Herstellung und Manipulation von freistehenden Mobil Hydrogel Blättern beschrieben. Wie in Figur 1 gezeigt, hergestellt wir mikro PDMS Schimmelpilze und zellhaltige Hydrogel wurde auf die hydrophile Oberfläche dieser Formen und geladen vernetzt mit einem Luftbefeuchter, um eine aerosolierte Nebel von Geliermittel zu erzeugen. Nach der Freigabe aus den Formen wurden HepG2-Zellen in freistehender Hydrogelfolien mit verschiedenen Mustern (Abbildung 2) kultiviert. So sind die dünne Hydrogel Blättern ein 3D-Kulturumgebung. Ferner kann modular Hydrogelfolien durch Schichtung der Blätter mit einer Mikropipette mit einem End-Spitze schneiden, und mit einem PDMS-Rahmen, der 3D großmaßige Zellkultur (Figur 3) zusammengesetzt werden können. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig1.jpg" /> Abbildung 1. Fluss Chart, die das Herstellungs eines Hydrogelfolie und Multi-Layer-Hydrogel-Sheets. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig2.jpg" /> Abbildung 2. Selbsttragende 3D-Zellkultur in verschiedene Hydrogel-Sheets. Das Herstellungsverfahren des Sprühens Vernetzungsreagens aktiviert präzise Strukturierung von Alginat-Hydrogel auf der Mikroskala. Außerdem könnten die hergestellt Hydrogelfolien aus der Form entnommen und leicht in freistehender Bedingungen manipuliert werden. HepG2-Zellen wurden gemustert und in einer flachen Hydrogelfolie (A) kultiviert Hydrogelfolien mit hexagonaler Säulen (B), mesh (C), Leberläppchens förmige Netz (D), einer Anordnung von Löchern (E) und multiple microcomb artige Mikrofasern (F). Die Maßstabsbalken sind wie folgt:. 500 &amp; mgr; m (A, D, F), 100 &amp; mgr; m (B, C) ​​und 2 mm (E) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig3.jpg" /> Abbildung 3. Montage von mikrostrukturierten Hydrogel Blätter für Macro-scale Cellular Konstrukte. Verschiedene Arten von Hydrogelfolie könnte über Schicht-für-Schicht-Stapel mit Ausrichtung montiert werden, einschließlich der Montage von fünf Hydrogel Blätter mit HepG2-Zellen mit grüner Fluoreszenz und NIH3T3-Zellen, angefärbt mit roter Fluoreszenz (A) angefärbt. Eine Anordnung von mikrostrukturierten Hydrogel Blätter mit erweiterten Pipeline-Struktur (B) vorgesehenen höheren Zelllebensfähigkeit than, dass der Nicht-gemusterten Hydrogelfolien (C) nach 7 Tagen. Die Lebensfähigkeit wurde durch Färbung HepG2-Zellen mit Calcein-AM (lebende Zellen als grün dargestellt) und Ethidiumhomodimer-1 (rot dargestellt toten Zellen) beurteilt. Maßstabsbalken:. 500 &amp; mgr; m (A) und 200 &amp; mgr; m (B, C) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig3large.jpg" target="_blank">​​Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

construction-modular-hydrogel-sheets-for-micropatterned-macro-scaled

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Aufrufe.  Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment. 

Serie: Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Forschung

Biotechnik

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up cellular mimics that better represent the complexity of cellular life. To date there are a number of paths that could be taken to build compartmentalized cellular mimics, including the exploitation of water-in-oil emulsions, microfluidic devices, and vesicles. Each of the available options has specific advantages and disadvantages. For example, water-in-oil emulsions give high encapsulation efficiency but do not mimic well the permeability barrier of living cells. The primary advantage of the methods described herein is that they are all easy and cheap to implement. Transcription-translation machinery is encapsulated inside of phospholipid vesicles through a process that exploits common instrumentation, such as a centrifugal evaporator and an extruder. Reactions are monitored by fluorescence spectroscopy. The protocols can be adapted for recombinant protein expression, the construction of cellular mimics, the exploration of the minimum requirements for cellular life, or the assembly of genetic circuitry.

Herein we describe simple methods for the preparation of vesicles, the encapsulation of transcription and translation machinery, and the monitoring of protein production. The resulting cell-free systems can be used as a starting point from which to build increasingly complex cellular mimics.

Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

Gradient Stamm Chip für anregende zellulären Verhaltensweisen in Zelle beladenen Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

Bau eines vielschichtigen mesenchymale Stammzellen-Blatt mit einem 3D dynamische Kultursystem

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3D-Druck poröse Zellulose Nanocomposites Hydrogel Gerüste

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...