This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt auf 100 ml Wasserprobe mit C18 Sorbens und Elution mit 50% v / v Methanol die SPE durchgeführt. Die angereicherte Probe wird verdünnt, um 10% V / V Methanol vor der Analyse mit einem Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) -Kit erreichen. 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie die Wasserproben <ol><li> Vor jeder weiteren Schritt, filtern jeder 100 ml Wasserprobe mit 0,2 um Porengröße Filter. </li><li> Spike-Bringen der Probe mit gewünschten Konzentration durch Verdünnen geeigneten Volumen Referenzlösung in einem Volumen von Wasser. B. Vorbereitung 100 ml Wasserprobe mit 100 ng / l E2 durch Verdünnen 3,3 ul E2 Referenzlösung in einer Konzentration von 300 ug / l. Verdünnen Sie diese Lösung zehnmal um eine Probe versetzt mit 10 ng / L E2. Verdünnen dieser letzteren zehn weitere Male, um eine Probe von 100 ml mit 1 ng / L E2 zu erhalten. </li><li> Legen Sie die filtrierte Probe (unmodifiziert oder Stachel) in einer Glasflasche mit GL45 Gewinde. Verwenden Sie die Probe am selben Tag. Nehmen Sie einen kleinen Bruchteil, um mit dem ELISA analysiert werden, um Anfangskonzentration zu schätzen. </li></ol></li><li> Vorzubereiten 300 ul Elutionsmittel durch Verdünnen Methanol in entionisiertem (Di-) Wasser auf 50% v / v in einer engen Röhre. </li></ol> 2. Herstellung des SPE Column <ol><li> Vorbereitung einer 20 mg / ml Suspension von Octadecyl-Silica Sorbenspartikel durch Zugabe von zunächst 1600 ul Methanol und 400 ul Di-Wasser auf 40 mg Umkehrphasenchromatographie Sorbens. Dicht schließen Sie den Deckel und rühren mit einem Wirbel. </li><li> Installieren der Bodenmembran in Spalte <ol><li> Wählen Sie eine Nylon-Membran mit einer Porengröße 11 &amp; mgr; m und auf einer doppelten Schicht von Anti-Staub-Gewebe. Mit einem Durchmesser von 3 mm Punsch, schneiden Sie zwei kleine Teile in der Membran. </li><li> Schnappen Sie sich eines der kleinen Membranen mit Flachbild-End-Filter Pinzette und legen Sie sie auf einer Seite der Säule. </li><li> Schrauben Sie die Flachbodenanschluss mit dem Rohr und festziehen. Die Membran ist now an Ort und Stelle und das Sorbens sicher hinzugefügt werden. Zeichnen einen Pfeil auf dem Körper der Säule in Richtung zum Ende, an dem die Membran platziert wurde. </li></ol></li><li> Vorbereiten des Sorbens gepackte Säule <ol><li> Befestigen Sie die Säule an der Halterung mit dem Pfeil nach unten. Die Spalte muss möglichst senkrecht eingestellt werden. </li><li> Befestigen Sie eine leere 10 ml Einwegspritze mit dem Ende des Rohres der Spalte, indem Sie die Luer-Lock-Anschlüsse. </li><li> Bereiten Sie eine Mikropipette mit einem 20-200 ul Spitze, die Lautstärke auf 100 ul. Diese Pipettenspitze Format ist auf die Größe des Sorbenskolonne hergestellt werden angepasst. Das Verfahren wäre schwieriger mit größeren Pipettenspitzen, wie beispielsweise die, die mit 1 ml Pipetten verwendet. </li><li> Man schüttelt die Sorptionsmittelsuspension mit einem Wirbel, und schnell Je 100 &amp; mgr; l in der Mitte auf der Säule. Während der Injektion, absaugen sanft alle pipettierten Lösung Trog die Membran mit Hilfe der Spritze mit der anderen Hand. Zu diesem stAlter, muss die Lösung Füllen der Spritze frei von Partikeln sein, und ein Partikelbett kann schließlich in der Säule festgestellt werden. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang 2 weitere Male durch Rühren der Stoffsuspension zwischen allen Pipettierschritte, um homogene Suspension der Partikel in der Lösung zu gewährleisten. Die sich ergebende Spalte enthält 6 mg Sorbens. </li><li> Wenn die 300 ul Suspension wurden geladen und durch Absaugen mit der Spritze getrocknet, halten Sie die Spritze in Position und legen Sie die zweite Nylon-Membran auf der Oberseite unter Verwendung der Zange mit der anderen Hand. </li><li> Schrauben Sie den zweiten Verbinder mit Schlauch und entsorgen Sie die Spritze. Die SPE-Säule betriebsbereit. </li></ol></li></ol> 3. Vorbereiten des Systems <ol><li> Ziehen Sie die SPE-Säule auf dem Gerät mit Hilfe der Luer-Lock-Anschlüsse. Muss der Pfeil in die gleiche Richtung wie der auf dem Endgerät angezeigt werden können. </li><li> Schließen Sie die Flasche die Probe auf die Vorrichtung, die durch Verschrauben dervorgesehen GL45 Sicherheitskappe auf sie. </li><li> Laden Sie 200 ul Laufmittel in der &quot;Eluent&quot; Reservoir. </li><li> Last 800 ul von Di-Wasser in der &quot;Verwässerung&quot; Reservoir. </li><li> Legen Sie eine Flasche auf dem Abfallausgang, um das verarbeitete Wasser während der Extraktionsschritt zu sammeln. Das Format ist nicht wichtig, aber das Volumen muß ausreichend groß in Bezug auf das Probenvolumen ist. </li><li> Legen Sie eine kleine Ampulle an der Sensorausgang mit dem minimalen Volumen Kapazität von 1,5 ml. Ein Volumen von maximal 1 ml zu klein sein wird als Blasen an dieser Steckdose zu bilden, wenn das Sammeln angereicherten Laufmittel und Verdünnungspuffer. </li><li> Überprüfen der Druckregler ist in geschlossener Position, indem Sie ihn manuell, Umkehr den Uhrzeigersinn, bis eine weitere Bewegung ist nicht möglich. </li></ol> 4. SPE mit dem Prototype <ol><li> Schalten Sie den Prototyp durch Drücken der Taste auf der Rückseite. </li><li> Herstellung der Benutzerschnittstelle und die Auswahl der Programm <ol><li> Öffnen Sie die Benutzeroberfläche. Auswählender Kommunikationsanschluss des Computers, an den das Gerät aus der Liste verbunden ist, und klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Weiter&quot;. </li><li> Geben Sie die Werte 580 für pset und 30 für dpset. Die Pumpe einzustellen, um den Druck in dem Drucksystem und Speicher bei 580 ± 30 mbar zu halten beim Laufen. </li><li> Wählen Sie den automatischen Modus. </li><li> Im automatischen Modus Ecke, laden Sie die Programmdatei in das Feld &#39;Konfigurationsdatei Pfad&#39;. </li></ol></li><li> Einstellen der Druckregler <ol><li> Starten Sie die Pumpe. </li><li> Drehen Sie manuell den Druckregler, bis der Wert für die preg zu lesen ist schlechter, aber nahe bei 320 mbar. </li><li> Halten Sie die Pumpe. </li></ol></li><li> Starten des SPE-Verfahren <ol><li> Drücken Sie &quot;Start&quot; in der automatisierten Modus Ecke. Die Pumpe einschalten und die Extraktion, Elution und Verdünnungsschritte automatisch aufeinanderfolgen. Das gesamte Verfahren für eine 100 ml-Probe wird in 50 min durchgeführt. </li><li>Überprüfen Sie den Wert der preg. 350 mbar während des Extraktionsschritt, um eine optimale Durchflussgeschwindigkeit zu gewährleisten - Es muss im Bereich 320 sein. </li><li> Schließen Sie die kleine Phiole und lagern bei 4-5 ° C im Dunkeln bis zur Analyse. Analysen durchzuführen in der folgenden 30 Stunden, um den Abbau des Analyten zu verhindern. </li><li> Entsorgen Sie das aufbereitete Wasser. </li></ol></li><li> Reinigung des Systems Hinweis: Nach jedem Extraktionsverfahren das System muss gereinigt werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. <ol><li> Bereiten Sie eine 10 ml Lösung von Methanol 70% v / v in einer GL 45 Glasflasche. </li><li> Ziehen Sie das SPE-Säule und stecken Sie den Schlauch mit Anschlüssen. </li><li> Im automatischen Modus, wählen Sie die Datei &quot;Reinigung&quot; und starten Sie es mit dem gleichen Druckeinstellungen. </li></ol></li></ol> 5. Nachweis der Estradiolkonzentration mit ELISA <ol><li> Vorbereitung der Eichproben mit Konzentrationen, wie im Protokoll mit dem ELISA-Kit, der verwendet wird angegeben. Bereiten Sie eine calibration mit der gleichen Matrix wie die Probe, und eine Kalibrierung mit Methanol 10% v / v eingestellt. </li><li> Abgeben der erforderlichen Menge der Probe in die Vertiefungen auf der Platte, nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Eichproben, unveränderten und Stachelwasserproben, die gefiltert wurden, aber mit SPE in Methanol 10% V nicht bearbeitet und angereichert Proben / v. Verwenden Sie 3 Vertiefungen pro Probe, um den Fehler mit dem Assay zu reduzieren. </li><li> Folgen den Hinweisen des Protokolls, das mit dem Kit für die Zugabe von Reaktanten, Inkubationszeit, Waschen und eine weitere Reaktion mit dem Enzym zur Verfügung gestellt. </li><li> Lesen Sie das optische Signal in jeder Vertiefung nach den Anweisungen des Herstellers Kit mit einem Plattenlesegerät Instrument und sammeln Sie die Daten. </li><li> Verwendung der Software des Plattenleser Instrument, um die Kalibrierungskurven, die angereicherten Proben mit Methanol 10% v passen und bestimmen die E2-Konzentration in der ursprünglichen Probe mit derselben Matrix, und / v. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Ein neues Verfahren zur Herstellung von Wasserproben, gefolgt von Analyse unter Verwendung von Immunoassay vorgeschlagen. Das Gerät ermöglicht es, Festphasenextraktion automatisiert und benutzerfreundliche Art und Weise durchzuführen. Die Filtration der Wasserprobe vor der Injektion in das System ist kritisch. Etwaige Partikel noch in der Lösung vorhanden wäre möglicherweise verursachen Verstopfung des fluidischen Netzwerk und behindern die SPE-Säule. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Vorbereitung des SPE-Säule. Die Menge der Partikel in der Säule ist für die beste Leistung zu erzielen. Besondere Sorgfalt ist bei der Herstellung der Suspension des Sorbens-Partikel, um die Agglomeration der Teilchen zu vermeiden. Dies wird durch Zugabe zuerst die Lösungsmittelfraktion zu dem trockenen Sorbens und dann Di-Wasserfraktion erreicht wird. Dann wird während des Verpackungsschritt ist es wichtig, um die Suspension gut gemischt, während das Absaugen des 100 &amp; mgr; l mit der Pipette. Am Ende des SPE Proverfahren, richtig Reinigung des Systems ist kritisch. Erstens verhindert sie eine Kreuzkontamination bei der Arbeit mit verschiedenen Proben und andererseits das Risiko der biologischen Verschmutzung des Gerätes verhindert, wenn es nicht verwendet wird. Wie in der Einleitung erwähnt, ist die Verwendung von Immunnachweisverfahren für die Analyse von kleinen Schadstoffmoleküle in der Umgebung erweitert. Diese Verfahren erreichen Grenzen Detektionen in den niedrigen ng / L Stufen 7, 11 und haben den Vorteil, dass sie sehr spezifisch. Solche Verfahren sind in Kombination mit chemischen Methoden, meist Massenspektrometrie verwandte Techniken 14, 15 der letzteren verwendet. Die Verwendung von organischen Lösemittel und profitieren von automatisierten SPE-Systeme, mit denen die Erreichung der geforderten hohen Pre-Konzentrationsfaktoren nicht einschränken. Im Vergleich dazu Immunoassays sind empfindlicher gegenüber dem Testpuffer Zusammensetzung und Mangel angepasst Probenvorbereitungstechniquen um den Prozess zu erleichtern. Unserem Modul zur Analyse von s gewidmetMall-Moleküle durch einen Immunoassay. Mit unserer automatisierten Verfahren wird eine 100-fache Anreicherung der Probe erreicht und ermöglicht es, den Analyten in der ELISA-Konzentrationsbereich zu erfassen. Wenn diese Vorkonzentration Performances scheinen niedrig im Vergleich zu herkömmlichen SPE, sie passen perfekt zu den Anforderungen für die Immun-Detektion. Darüber hinaus verfügt das Gerät über eine kleine Standfläche (25 cm x 15 cm x 10 cm) und kostengünstige Vergleich zu typischen manuellen oder automatisierten SPE Setups. 13. Falls erforderlich, kann der Durchsatz für die Mehrfachprobenanalyse daher durch Verwendung einiger Vorrichtungen erhöht werden parallel. Eine andere Möglichkeit wäre es, ein Verfahren für kleinere Volumina der Probe und Elutionsmittel, was die Zeit für das Verfahren erforderlichen reduzieren würde entwerfen. Einige andere Einschränkungen wurden durch die Beschreibung der Ergebnisse diskutiert. Gibt es noch zwei Schritte, bei denen der Benutzer beteiligt ist, sowohl mit dem Entwicklungsgrad des Prototyps verbunden und würden, indem sie einen weiteren Schritt hin ac gelöst werdenommercial Gerät. Die Packung der Sorptionsphase erfolgt manuell. Die Methode wurde jedoch gezeigt, einfach und reproduzierbar sein. Wir sind zuversichtlich, dass Einwegsäulen konnte produziert wenn das System auf einer höheren Maßstab hergestellt werden. Zusammenfassend haben wir ein neues Verfahren zur SPE auf einem kompakten, automatisierten Gerät ausführen beschrieben. Wir haben das Potential für die Analyse von Wasserproben durch Immunoassay durch die Beschreibung eines zur Erkennung von 17β-Estradiol von einem kommerziellen ELISA-Kit verwendete Extraktions und Vorkonzentrierung Verfahren demonstriert. Die Methode ist benutzerfreundlich und kostengünstig und könnte in der Zukunft in-line mit Biosensoren (work in progress) angewendet werden. Wir erwarten, dass unsere Plattform ermöglicht ähnliche Festphasenextraktionsverfahren auf komplexer Probenmatrix von hoher Relevanz für die Überwachung von EDC, wie Lebensmittel oder Urin durchzuführen. Wir sind überzeugt, unser System antut die Anwendung von etablierten und jungen Immunnachweisverfahren in unterstützender Bereich der Umweltanalytik.

Probenvorbereitung ist ein wichtiger Schritt in jedem Analyseprozess. Insbesondere die Entfernung von Matrixeffekten, Verminderung von Interferenzen, und die Anreicherung des Analyten erforderlich sind, um präzise Ergebnisse zu erhalten, und zu erreichen geringe Nachweisgrenzen. Endokrin wirksamen Substanzen (EDCs) sind von besonderer Bedeutung wegen ihrer Wirkung auf die lebenden Organismen, auch wenn in sehr geringen Konzentrationen in der Umwelt. Das natürliche Hormon 17β-Estradiol ist auf dem EU-Wasserverschmutzung Merkliste vorhanden und neigen zu der Liste der im Rahmen der Europäischen Wasserrahmenrichtlinie geregelt prioritären Stoffe aufgenommen werden. Festphasenextraktion (SPE) wird üblicherweise für die Analyse von kleinen Verunreinigungen in Wasser aufgebracht, wobei sowohl chemische 1-5 (Chromatographie, Massenspektrometrie) und immunologischen Nachweisverfahren 6-9. Letzteres gesammelt Interesse auf dem Gebiet der Umweltüberwachung, wie Immunoassays, sind in großen Vielzahl von Formaten, sind spezifisch für die target Analyten und erreicht niedrige Nachweisgrenze. 6 sind 7, 10, 11 verschiedenen Enzymimmuntests (ELISA) im Handel erhältlich und ermöglichen es, mehrere Proben gleichzeitig auf einem Multi-Well-Platte zu analysieren. Das Verfahren besteht in aufeinanderfolgenden Reaktionsschritte, die ein paar Stunden dauern kann. Das Endprodukt der Reaktion kann optisch detektiert werden, um die Konzentration des Zielmoleküls auf der Basis einer Kalibrierungskurve zu bestimmen. SPE klassischen Verfahren umfassen Sorbens Vorkonditionierung, Probenextraktion, Waschen, Elution und Eindampfen des Eluats. Die zur Verdünnung des Extraktes verwendeten Lösungsmittels wird so gewählt, je nach dem Nachweisverfahren. Für immunologische Verfahren, die Menge des organischen Lösungsmittels beeinflusst stark die Empfindlichkeit des Verfahrens. 12 Neben der Rückgewinnung und der Pre-Konzentration Performances, muss das Verfahren auch einfach zu sein und kosteneffizient. Automation des procedure hilft, menschliche bezogene Fehler zu verringern. In unserer bisherigen Arbeit 13 stellten wir unsere Prototypen für die automatisierte SPE, und unsere Methode wurde auf die Analyse von dem natürlichen Hormon 17β-Östradiol in Meerwasserproben angewendet. Mit der vorliegenden Video möchten wir die technischen Vorteile unserer Methode im Vergleich zu traditionellen Offline-und Online-SPE und seiner besonderen Kompatibilität mit Nachweis durch Immunreaktionen hervorheben. Wir beschreiben die Wasserproben zum Nachweis von 17β-Estradiol verwendete Protokoll. SPE mit Octadecyl-Silica (C18) Sorptionsphase und die Elution wird mit verdünntem Methanol durchgeführt wird.

<table><tbody><tr><td>Filter membrane 0.2 &amp;mu;m pore size</td><td>Merck Millipore</td><td>GNWP04700</td><td>For sample filtration</td></tr><tr><td>Nylon membrane 11 &amp;mu;m pore size</td><td>Merck Millipore</td><td>NY1104700</td><td>For SPE column</td></tr><tr><td>Disposable biopsy punch 5 mm</td><td>Medical Budget</td><td>39302439</td><td></td></tr><tr><td>Nucleodur C18 ec&amp;nbsp;</td><td>Macherey Nagel</td><td>713550.01</td><td>50 &amp;mu;m particle diameter</td></tr><tr><td>Synthetic sea water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SSWS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17beta-estradiol standard</td><td>Enzo Life Science</td><td></td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>17beta-estradiol ELISA kit</td><td>Enzo Life Science</td><td>ADI-900-008</td><td>96 wells, range 30 - 3,000 ng/L</td></tr></tbody></table>

a simple method for automated solid phase extraction of water samples for immunological analysis of small pollutants

Eine neue Methode zur Festphasenextraktion (SPE) des Umweltwasserproben vorgeschlagen. Der entwickelte Prototyp ist kostengünstig und benutzerfreundlich und ermöglicht eine schnelle, automatisierte und einfache SPE durchzuführen. Die vorkonzentrierte Lösung ist mit der Analyse durch Immunoassay kompatibel ist, mit einem niedrigen Gehalt an organischem Lösungsmittel. Es wird ein Verfahren zur Extraktion und Vorkonzentrierung natürliche Hormon 17β-Östradiol in 100 ml Wasserproben beschrieben. Umkehrphasen-SPE mit Octadecyl-Silica Sorbens durchgeführt, und die Elution wird mit 200 ul Methanol 50% v / v durchgeführt. Elutionsmittel wird durch Zugabe von VE-Wasser, die Menge an Methanol senken verdünnt. Nach der Vorbereitung der Säule manuell SPE wird das gesamte Verfahren automatisch innerhalb von 1 h durchgeführt. Am Ende des Prozesses wird Estradiol-Konzentration durch Verwendung eines handelsüblichen Enzym-gekoppelten Immunsorbens-Test (ELISA) gemessen. 100fach Vorkonzentration erreicht wird und der Methanolgehalt in 10% v / v. Vollständige Wiederherstellungen des Molekülswerden mit 1 ng erreicht / L versetzt entionisiertem und synthetischem Meerwasserproben.

Reproduzierbarkeit der Sorbenspackung wurde durch Trocknen ausgewertet und Gewichten des pipettierten Sorbens in Glasfläschchen und das Ergebnis ist in Fig. 1 Reproduzierbarkeit der zum Zeitpunkt der Injektion gezeigt wurde 100 ml-Proben getestet, wie in Abb. 2 in der anfänglichen Konzentration und Pre- gezeigten konzentrierte stockte Proben wurden unter Verwendung eines handelsüblichen ELISA-Kit für die 17β-Estradiol bestimmt und sind in Abbildung 3 dargestellt. Das vorgeschlagene Verfahren umfasst den Benutzer nach der Herstellung des Sorbens Phase (Abbildung 1). Sorbenspartikel zwischen zwei Membranen für mechanische Stabilität gehalten werden und dicht von dem Druck mit der Spritze ausgeübt wird, während der Pipettierung der Suspension in die Säule gepackt. Die sich ergebende Spalte enthält eine optimierte Menge von 6 mg des gewählten Sorbens mit nur 6% Fehler auf diesem Wert. Dieser Schritt dient auchals Sorptionsmittel Anlage, wenn die Suspension in eignet Lösungsmittel Bedingungen hergestellt. Nach der Herstellung und der Installation des SPE-Säule mit dem System, und das Laden der Lösungen in den jeweiligen Behältern wird die Vorkonzentration vollständig automatisiert und erfordert in der Summe weniger als 1 Stunde für ein 100-ml-Probe (Abbildung 2). Extraktion in 40 ± 8 min durchgeführt. Nur zwei Parameter werden vom Benutzer noch, die Herstellung des verpackten Sorbens und die Einstellung der Strömungsgeschwindigkeit beeinflusst. Die erste wäre durch die Anwendung im großen Maßstab Methoden zur Spalte Herstellung gelöst werden. Die zweite ist mit der manuellen Einstellung des Druckreglers, der den Druckwert verwendet, um die Lösung durch das System fahren bestimmt zusammen. Diese Fehlerquelle würde durch die Einführung eines elektronischen Druckregler verzichtet werden. In Bezug auf Leistungen, die PR-E-Konzentrationsfaktor erreicht ist 100. Zuerst wird 500fach Vorkonzentrierung durch Eluieren des Extraktes aus dem Sorptionsmittel mit 50% v / v Methanol erfolgen. Dann wird ein 5-facher Verdünnung durch Zugabe von Di-Wasser durchgeführt. Diese Verdünnung reduziert den Lösungsmittelgehalt und bewahrt die Immunoassay-Empfindlichkeit. Beim Blick auf die Kalibrierungskurven des ELISA (3A), ist es klar, dass die Methanol-Verhältnis in der angereicherten Probe keinen Einfluss auf die Empfindlichkeit des Immunoassays. Ein repräsentatives Ergebnis Vorkonzentration wird in 3 gezeigt. Das Verfahren wurde in VE-Wasser und künstlichem Meerwasserproben angewendet wurde mit 1 ng / L von 17β-Östradiol. Während die Probenkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze, die Pre-Konzentrationsverfahren erfolgreich bringt diese Proben im Bereich des Assays (30 - 30.000 ng / L). Die Wiederfindungsraten wurden durch Vergleich der Endkonzentration mit theoretischen spiked Konzentration erhalten. Rückforderungen von 128% ± 22% und 107% ±6% wurden für die Di-Wasser und künstlichem Meerwasser bzw. (3B) berechnet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53438/53438fig1.jpg" /> Abbildung 1. Abbildung und Reproduzierbarkeit des Verfahrens zur Sorbenspackung. Es gibt drei Schritte: Befestigen der ersten Nylon-Membran mit dem ersten Verbinder, Injizieren der Sorptionsmittelsuspension und Schließen der Spalte durch Einsetzen der zweiten Membran und Stecker. Die sich ergebende Spalte enthält 6 mg Sorbens mit 6% Standardabweichung (n = 6 vorbereitet und gewichtete Spalten). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53438/53438fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53438/53438fig2.jpg" /> Bild 2. Schritt-für-SchrittDarstellung der Vorgehensweise mit Reproduzierbarkeit der Zeit für die Probeninjektion. Die Lösung Eingänge werden in den Behältern oder Flaschen geladen. Die beiden Ausgänge sind die verarbeitete Probe (Abfälle) und die angereicherte Probe, die zur Analyse durch Immunoassay mit niedrigem Lösemittelgehalt verträglich ist. Das Gesamtverfahren ist automatisiert und nimmt etwas weniger als 1 h (n = 31 mit Standardabweichung). Der Einfluss der Nutzer auf der Durchsatz ist mit blauen Zeichen markiert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53438/53438fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53438/53438fig3.jpg" /> Figur 3. Ergebnisse der Vorkonzentrierung E2 und Analyse durch ELISA. (A) Die Kalibrationskurven des ELISA und Punkte für 1 ng / L gemessen versetzt di-Wasser (i) und künstlichem Meerwasser (ii) nach dem ENRichment. (B) Recoveries für 1 ng erhalten / L versetzt Di-Wasser (i) und künstlichem Meerwasser (ii) Proben nach Anreicherung (n = 4). Die Fehlerbalken sind die Standardabweichungen, die sich aus der Anzahl der Wiederholungen und die 3 Vertiefungen der ELISA-Platte, die verwendet wurden, um die Konzentration in jeder Probe zu bestimmen. Diese Zahl hat sich von (13) modifiziert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53438/53438fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Eine einfache Methode für die automatisierte Festphasenextraktion von Wasserproben für die immunologische Analyse von kleinen Schadstoffe

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

13.6K Aufrufe.  Centre Suisse d'Electronique et de Microtechnique. A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Serie: A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Forschung

Umwelt

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either "Contamination Detected" or "No Contamination Detected" within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

Charakterisierung und Anwendung von Passivsammler für die Überwachung von Pestiziden in Wasser

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VACUSIP eine verbesserte Inex Methode für<em&gt; In Situ</em&gt; Messung von partikulären und gelösten Verbindungen, die durch Active Suspension Feeders Verarbeitet

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better characterize the prevalence of these pathogens, EPA Method 1623 was developed and used to monitor levels of these organisms in US drinking water supplies 12. The method has three main parts; the first is the sample concentration in which at least 10 L of raw surface water is filtered. The organisms and trapped debris are then eluted from the filter and centrifuged to further concentrate the sample. The second part of the method uses an immunomagnetic separation procedure where the concentrated water sample is applied to immunomagnetic beads that specifically bind to the Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts allowing for specific removal of the parasites from the concentrated debris. These (oo)cysts are then detached from the magnetic beads by an acid dissociation procedure. The final part of the method is the immunofluorescence staining and enumeration where (oo)cysts are applied to a slide, stained, and enumerated by microscopy.
Method 1623 has four listed sample concentration systems to capture Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water: Envirochek filters (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filters (Pall Corporation), Filta-Max filters (IDEXX, Westbrook, MA), or Continuous Flow Centrifugation (Haemonetics, Braintree, MA). However, Cryptosporidium and Giardia (oo)cyst recoveries have varied greatly depending on the source water matrix and filters used1,14. A new tangential flow hollow-fiber ultrafiltration (HFUF) system has recently been shown to be more efficient and more robust at recovering Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from various water matrices; moreover, it is less expensive than other capsule filter options and can concentrate multiple pathogens simultaneously1-3,5-8,10,11. In addition, previous studies by Hill and colleagues demonstrated that the HFUF significantly improved Cryptosporidium oocysts recoveries when directly compared with the Envirochek HV filters4. Additional modifications to the current methods have also been reported to improve method performance. Replacing the acid dissociation procedure with heat dissociation was shown to be more effective at separating Cryptosporidium from the magnetic beads in some matrices9,13 .
This protocol describes a modified Method 1623 that uses the new HFUF filtration system with the heat dissociation step. The use of HFUF with this modified Method is a less expensive alternative to current EPA Method 1623 filtration options and provides more flexibility by allowing the concentration of multiple organisms.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

This protocol describes the use of a tangential flow hollow-fiber ultrafiltration sample concentration system and a heat dissociation as alternative steps for the detection of waterborne Cryptosporidium and Giardia species using EPA Method 1623.

Eine Änderung, die EPA-Methode 1623 Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration und Wärme Dissoziationsstufen nutzt, um auf Wasserbasis Detect<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Und<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Immunologie und Infektion

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identifizierung von pro- und Polyfluorinated chemische Spezies mit einem kombinierten gezielte und nicht gezielte Screening hochauflösende Massenspektrometrie-Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Die Herstellung einer Dipole-unterstützte Festphasenextraktion Microchip für die Spurenanalyse in Wasserproben

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Biotechnik

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Elektrowetting-basierte Digital Microfluidics Plattform für automatisierte enzymgebundene Immunsorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Solid-Liquid Extraction

Source: Laboratory of Dr. Jay Deiner &#8212; City University of New York
Extraction is a crucial step in most chemical analyses. It entails removing the analyte from its sample matrix and passing it into the phase required for spectroscopic or chromatographic identification and quantification. When the sample is a solid and the required phase for analysis is a liquid, the process is called solid-liquid extraction. A simple and broadly applicable form of solid-liquid extraction entails combining the solid with a solvent in which the analyte is soluble. Through agitation, the analyte partitions into the liquid phase, which may then be separated from the solid through filtration. The choice of solvent must be made based on the solubility of the target analyte, and on the balance of cost, safety, and environmental concerns.

Solid-Liquid Extraction: Principle, Procedure, Applications

Fest-Flüssig-Extraktion

Source: Laboratory of Dr. Jay Deiner &#8212; City University of New York
Extraction is a crucial step in most chemical analyses. It entails removing the ...

Lehre

JoVE Science Education

Chemie

Grundlagen der organischen Chemie

Extraction of Biomarkers from Sediments - Accelerated Solvent Extraction

Source: Laboratory of Jeff Salacup&#160;- University of Massachusetts Amherst
The distribution of a group of organic biomarkers called glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs), produced by a suite of archaea and bacteria, were found in modern sediments to change in a predictable manner in response to air or water temperature1,2. Therefore, the distribution of these biomarkers in a sequence of sediments of known age can be used to reconstruct the evolution of air and/or water temperature on decadal to millennial timescales (Figure 1). The production of long high-resolution records of past climates, called paleoclimatology, depends on the rapid analysis of hundreds, possibly thousands of samples. Older extraction techniques, such as sonication or Soxhlet, are too slow. However, the newer Accelerated Solvent Extraction technique was designed with efficiency in mind.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/10097/10097fig1.jpg" /> 
Figure 1. An example of a paleoclimate record showing changes in sea surface temperature (SST) in the eastern Mediterranean Sea during the past ~27,000 years3. This record comprises ~115 samples and is based on the isoprenoidal GDGT-based TEX86 SST proxy.

Accelerated Solvent Extraction of Total Lipid from Sediments

Extraktion von Biomarkern aus Sedimenten - beschleunigte Lösemittelextraktion

Source: Laboratory of Jeff Salacup&#160;- University of Massachusetts Amherst
The distribution of a group of organic biomarkers called glycerol-dialkyl ...

Eine einfache Methode für die automatisierte Festphasenextraktion von Wasserproben für die immunologische Analyse von kleinen Schadstoffe

Zusammenfassung

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