We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit britischen Innenministeriums Ordnung unter Projektlizenznummer 60/4435 durchgeführt wie in den Animals (Scientific Procedures) festgelegten Gesetz (1986). Embryonen in bestimmten Entwicklungsstufen zu sammeln, wurden zeitlich Paarung bis O / N eingestellt. Uhr am Tag der Suche nach einer vaginalen Pfropfen wurde Embryonaltag (E) 0,5 bezeichnet. 1. Grundlagen zur Zeit E7.5 oder E8.5 Implantation Embryonen für die ex vivo Kultur <ol><li> Opfern die schwangere weibliche Mäuse durch Genickbruch. </li><li> Isolieren Sie die Gebärmutter mit einer Schere, hielt sie mit einer Pinzette und legen Sie in einem 30 mm-Schale mit M2 Medium gefüllt ist. </li><li> Vorsichtig zerreißen das Myometrium mit zwei Paaren von feinen Pinzette. </li><li> Abziehen der Decidua, darauf achten, daß die extra Hohlräumen durchstechen. </li><li> Entfernen Sie die Reichert-Membran durch Quetschen sie mit einer Pinzette und langsam trennt sie vom Embryo. </li><li> Überprüfen Sie die Embryonen unter einem PräpariermikroskopStereomikroskop, um sicherzustellen, dass der Dottersack, Amnion und ectoplacental Konus intakt sind. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen auf eine saubere Schüssel M2 mit einer Pipette und auf ein 30 mm Kunststoff-Petrischale Deckel auf Eis (das &quot;Eis-Plattform &#39;) teilweise Chill Embryonen. </li><li> Falls erforderlich, speichern Embryonen in M2 auf einem Eis-Plattform für bis zu 1,5 Stunden, z. B. während der Medienherstellung oder die Manipulation von Kleinserien von ~ 3-4 Embryonen bei RT. Hinweis: Wiederherstellung und Dissektion der Nagetier-Embryonen im Detail zuvor 7,8,16 beschrieben. </li></ol> 2. Bereiten Sie die Embryokulturmedium <ol><li> Frisch tauen entweder im Handel erhältlichen Rattenserum (siehe Glanville-Jones et al. 13 für Daten) oder Rattenserum in-house nach Copp und Cockroft 16, die Wärme wurde für 30 min inaktiviert bei 56 C in 1 ml eingefroren vorbereitet Aliquots bei -80 ˚C Hinweis: Im Handel erhältliches Rattenserum akzeptabel<html> Kulturzeiten von 24-36 h, obwohl Serum in-house hergestellt ist, in unserer Erfahrung, eine überlegene Kultur für Zeiträume von bis zu 48 Stunden. </li><li> Frisch Vorbereitung eines Überschusses (z. B. 10 ml) von definierten Nahrungsergänzungsmittel, die aus Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat. </li><li> Berechnen Sie das Volumen des Kulturmediums, die je nach der Anzahl der Embryonen von jeder Stufe, die gehen zu kultiviert werden, erforderlich ist (siehe Abschnitt 3). Mischen Sie die Rattenserum mit den definierten Ergänzungen machen 50% Kulturmedium (1: 1 (v / v) Rattenserum: definiert Ergänzungsmittel) und / oder 75% Kulturmedium (3: 1 (V / V) Rattenserum: definiert Ergänzungen). </li><li> Übergeben Sie die Embryokulturmedium durch ein 0,45 um-Filter und fügen Sie 10.000 IE / ml Penicillin und 10 ug / ml Streptomycin. Anmerkung: frisch aufgetauten L-Glutamin und Natriumpyruvat Lösung ist entscheidend für die Entwicklung des Embryos während der ex vivo-Kultur. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Ex-vivo-Kulturbedingungen für die verschiedenen Embryonalstadien <ol><li> Für E7.5 Embryonen: statische Kultur unter Verwendung von 4-Well-Platten in einem Inkubator mit 5% CO 2 in Luft bei 37 ° C für 24 h zugeführt. Kultur bis zu zwei Embryonen pro Vertiefung in 1 ml 50% Kulturmedium. </li><li> Für E8.5 Embryonen: Verwenden Sie ein Rollergeräte 8 Drehen bei 35 U / min Einbeziehung kontinuierlichen Begasung mit 5% CO 2 in Luft bei 37 ° C während 24 Stunden (1 ml 50% Kulturmedium pro Embryo). </li><li> Für E9.5 Embryonen: Verwenden Sie ein Rollergeräte bei 35 Umdrehungen Dreh mit 5% CO 2, 40% O 2 55% N 2 bei 37 ° C zugeführt / min Einbeziehung Gasen für 24 Stunden (1 ml von 75% Kulturmedium pro Embryo). Hinweis: Kultur Embryonen innerhalb von 3 Stunden nach der euthanizing die Mäuse als längere Zeiträume in M2 Entwicklung nachteilig beeinflussen. Siehe Copp und Cockroft 16 für das Verfahren der ex vivo Embryokultur. </li></ol> 4. Grafting kultivierten Zellen in E7.5 oder E8.5 Maus Embryonen <ol><li> Körperlich kratzen EpiSCs, die ubiquitär GFP exprimieren, aus einer 6-Well-Kulturplatte mit einem 20-200 ul Pipettenspitze und legen Sie sie in einem 30 mm-Schale mit den Embryonen Hinweis: Um Zellklumpen in den Embryonen einzusetzen, sollten die Zellen physikalisch statt verschrottet Trypsin behandelt werden. </li><li> Befestigen Sie eine handgezogen Pfropfen Kapillare zu dem Ansaugrohr, eine Mund-Pipette zu machen. </li><li> Saugen Sie vorsichtig den Mund Pipette auf eine oder mehrere Zellklumpen von der Größe&gt; 20 Zellen in den Pfropfen Kapillare zu ziehen. </li><li> Vorsichtig ausblasen die Zellen, um große Klumpen teilweise zu dispergieren. </li><li> Wählen Sie einen Zellklumpen enthält ~ 10-20 Zellen und saugen in die Pfropfen Kapillare wieder, indem sie es in der Nähe der Öffnung der Kapillare. Achten Sie darauf, um die Zellklumpen in die und aus der Kapillare wiederholt zu bewegen, Break-up in kleinere Stücke zu vermeiden. </li><li> Halten Sie den Embryo lose an Ort und Stelle mit einer Pinzette und legen Sie die PfropfenKapillare in dem interessierenden Bereich eine Öffnung zu schaffen. </li><li> Die Klumpen vorsichtig zu vertreiben aus dem Pfropfen Kapillare, so dass die kurze Kette von 10-20 Zellen im Embryo eingereicht. </li><li> Wiederholen Transplantation Verfahren für die gewünschte Anzahl von Embryonen. Verwenden Chargengrößen von 3-4 Embryonen für die Bequemlichkeit. </li><li> Verlassen Embryonen in der gleichen Gericht aus M2-Medium, Bild die veredelten Embryonen mit Hilfe eines Fluoreszenzverbindung Binokular mit Kamera, halten Abbildungszeit auf ein Minimum, um die Exposition der Embryonen zu hohe Licht und Hitze zu vermeiden. Anmerkung: Bestimmen Aufnahmezeiten empirisch, da diese von den technischen Daten der Kamera und Mikroskop sowie der Art und der Fluoreszenzintensität des Fluorophors ab. </li><li> Übertragen des Embryos in einem pastette mit einem minimalen Volumen von M2-Medium auf voräquilibriert Kulturmedium (siehe Abschnitt 3) unmittelbar nach der Bilderzeugung. Hinweis: die Morphologie der Embryonen Sorgfältig prüfen nach der Transplantation. Nur Kultur der INTACt Embryonen. </li></ol> 5. Handmade Elektroporation Materialien und Geräte-Setup (Bereiten Sie die folgenden im Vorfeld der Elektroporation Experimente): <ol><li> Für die DNA-Spritzen Pipetten: Ziehen DNA-Spritzen Pipetten unter Verwendung einer horizontalen Mikropipette Abzieher. Spritzen Pipetten sollten eine feine Spitze haben mit einer Öffnung von weniger als 10 &amp; mgr; m zu Gewebeschäden bei der Injektion von DNA in den embryonalen Hohlräumen zu vermeiden. </li><li> Für Glaskapillare Elektroporation: Verwenden Sie ein Mikroschmiede, um die Öffnung der DNA-Spritzen Pipetten zu einem Innendurchmesser von entweder 20 oder 30 &amp; mgr; m geschnitten. Zellschäden zu vermeiden, wenn die Kapillare in Kontakt mit der Embryo zur Elektroporation, muss die Spitze der Glaskapillare sauber geschnitten und enthält scharfe Bruchkanten werden. </li><li> Für handgemachte Kapillare Elektrode (Anode) (Abbildung 1): Legen Sie eine 0,2 mm Durchmesser Platindraht in eine Elektroporation Glaskapillare mit einer festen Öffnung 20 oder 30 &amp; mgr; m Durchmesser, um die Auserwählten zu konzentrierenric Strom und liefern die Plasmid-DNA in einem kleinen Bereich von Interesse in dem Embryo. </li><li> Für handgemachte L-förmigen Elektrode (Kathode) (Abbildung 1): biegen, eine 0,2 mm Durchmesser Platindraht Schaffung einer &quot;L&quot; -Form, mit dem horizontalen Teil des &quot;L&quot; in der Umgebung von 1 mm in der Länge. </li><li> Befestigen Sie jede Platinelektrode mit einer dünnen isolierten Draht und fügen diesen in einer Mikroinjektionsnadelhalter durch Isolierband abgedeckt. </li><li> Montieren Sie die Nadelhalter auf Standard-Mikromanipulation Instrumentenhalter. </li><li> Der Stromkreis wird, wie in Abbildung 1 dargestellt: eine Verbindung der Kapillare Elektrode an die Anode der Stromversorgung; Verbinden der L-förmigen Elektrode an die Anode des Multimeters; verbinden die Kathode der mulimeter mit der Kathode der Stromversorgung. </li></ol> 6. Die Elektroporation E7.5 oder E8.5 Maus Embryonen <ol><li> Füllen Sie die Elektroporation Glaskapillare mit PBS in ca. 1-2 mm von oben und legen Sie die straiGHT Platinelektrode (Anode) in die Glaskapillare bis er den Boden der Kapillare erreicht. </li><li> Anker die L-förmige Elektrode (Kathode), die auf der Oberfläche einer 30 mm Petrischale mit PBS gefüllt. </li><li> Übertragen Sie den Embryo aus M2-Medium in das PBS-gefüllten Elektroporation Gericht. </li><li> Legen Sie die Injektionsnadel aus seitlichen Epiblast in die Amnionhöhle des Embryos. Mit Hilfe eines pneumatischen pico Pumpe, injizieren DNA-Lösung (pCAG-Cre: GFP oder pCAG-GFP 1-1,5 ug / ml mit 0,01% grüne Lebensmittelfarbe Farbstoff) in den Hohlraum, bis er vollständig gefüllt ist. Für E7.5-E8.5-Embryonen, ist kleiner als 5 &amp; mgr; l DNA-Lösung für einen Embryo erforderlich. Unter Verwendung der grünen Farbstoff als Indikator, achten Sie darauf, um den Embryo platzen. </li><li> Vorsichtig Position des Embryos zwischen den Elektroden und bewegen Sie die Kapillare Elektrode an den genauen Ort, wo die DNA zu liefern ist. Hinweis: Die Ausrichtung des Embryos ist abhängig von der Region, in der die DNA elektroporiert werden. </li><li> ElectropoBewerten des Embryos unter Verwendung von 200 Volt (V) in 6 Pulse, jeder von 50 ms Dauer mit einem 1 sec Intervall zwischen jedem Impuls. </li><li> Übertragen Sie die Embryo voräquilibriert Kulturmedium unmittelbar nach der Elektroporation. Falls gewünscht, wiederholen Sie den Vorgang für die nächste Embryo. Hinweis: Fügen Sie das Kulturmedium in einen sterilen Behälter und legen Sie sie in der Kulturbrutschrank vor, ins Gleichgewicht des Mediums. </li><li> Um nach der Kultur erkennen elektroporierten Zellen 2 h, übertragen Sie die Embryonen auf eine saubere 30 mm Petrischale von M2 Medium unter Verwendung eines pastette. Bild die Embryonen wie in Schritt 5.9 mit Hilfe eines Fluoreszenzverbindung Binokular. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen wieder in Kultur unter Verwendung eines pastette unmittelbar nach der Bildgebung. </li><li> Um tote Zellen durch Elektroporation verursacht werden, färben die Embryonen mit einem weitErythrozytenMembran undurchlässig Kernfarbstoff (1: 200 in Embryokulturmedium) bei 37 ° C für 10 min 2 h nach der Elektroporation (Optional) </li><li> Um die elektroporierten Zellen zu zählen, fixieren Sie die embryos in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 2-4 h bei 4 ° C, zu Verschmutzung des Ringes mit einem ultravioletten oder fernen Rot fluoreszierende Kerngegenfärbung und Bild die Embryos unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops (Optional). Hinweis: Embryonale Wachstum wird beeinträchtigt, wenn zu lange in PBS. Daher sicherstellen, daß die Zeit, die jeder Embryo elektroporieren minimiert wird (&lt;5 min pro Embryo). </li></ol>

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The authors have no conflicts of financial or other interest to declare.

Pfropfung Der entscheidende Schritt für die Zelltransplantation Experimenten ist das Einfügen eines zusammenhängenden Reihe von Zellen im Idealfall in einer einzigen Aktion, um Zerfall der Klumpen zu vermeiden. Diese Technik erfordert etwas Übung, bei der Kontrolle der Mundpipette. Wenn Spenderzellen übernehmen und in der Host, wird deren Derivate im Embryo zu zerstreuen. Um weiter zu bestimmen, ob die dispergierten Donor abgeleiteten Zellen differenzieren in geeigneter Weise in den Wirt können die Immunfärbung auf den Embryo Abschnitten durchgeführt werden. Wenn Spenderzellen nicht mit dem Host-Umgebung kompatibel ist, sie entweder nicht erkannt werden kann (wie sie aus dem Embryo ausgestoßen) oder bilden nicht eingebauten Klumpen in den Embryonen nach Kultur. Wenn beide dispergierten Zellen und Zellklumpen wurden beobachtet, kann dies darauf hinweisen, dass zu viele Zellen wurden gepfropft und übermäßige Spenderzellen, die nicht mit umgebenden Wirtszellen in Wechselwirkung treten können in Folge Klumpenbildung. In diesem Fall müssen zusätzliche Transplantate enthalteneine geringere Anzahl von Zellen durchgeführt werden. Die Haupteinschränkung der Zellen Pfropftechnik ist, dass es nicht möglich ist, die vollständige in vivo Potential von Zellen, da Maus ex vivo Kultur über einen längeren Zeitraum als 48 Stunden nicht erreicht worden zu bestimmen. Wenn jedoch mit ultraschallgesteuerten Zellinjektion kombiniert wird, kann es möglich sein, kultivierten Zellen der Embryos in utero zu übertragen. Um zusammenzufassen, Zelltransplantation Experimente sind weit verbreitet in unserer Gruppe verwendet und haben uns wertvolle Hinweise auf die In-vivo-Potenzial der verschiedenen Zelltypen 4,21,22 gegeben. Es ist eine Technik allgemein anwendbar, um die in vivo Potential von in vitro gezüchteten Zellen in der frühen Postimplantationsembryonen beurteilen. Elektroporation Obwohl in dieser Studie haben wir nur gezeigt haben, dass es effizienter, die Kapillare Elektroporation Technik zu verwenden, um das Epiblast Ziel, it ist ebenfalls möglich, absichtlich Ziel anderen Keimschichten wie Entodermzellen. Der entscheidende Schritt für die Kapillare Elektroporation Technik ist es, die Zeit für jedes Embryos (&lt;5 min pro Embryo) elektroporieren minimieren, da PBS ist sehr nachteilig für die frühe Mausembryonen. Obige hat unsere Daten zeigen, dass in den meisten Bereichen in der Embryonen, Elektroporation keinen Einfluss auf die Embryowachstum. Jedoch Elektroporation im Knoten verursachte abnormale Entwicklung und führte zum vorzeitigen Tod des Embryos. Dies ist aufgrund einer Beschädigung oder zum Tod der Zellen, die wichtige Signalstellen 23 bilden wahrscheinlich. Daher würden diese Region müssen bei dieser Technik vermieden werden. Ein weiterer Nachteil ist, dass, wie in der Ergebnisse Abschnitt erwähnt, während Epiblast oder Primitivstreifen Zellen wurden gezielt einige Entodermzellen wurden elektroporiert. Dies kann sein, weil DNA erreicht Endoderm durch Spalten unter dem Ektoderm Epithel. Endoderm aus Epithelzellen besteht und in unserer Erfahrung these Zellen haben eine höhere Neigung zur Aufnahme DNA. Deshalb wird, wenn die Anwendung dieser Technik zum Schicksal Mapping, ist es wichtig zu ermitteln, welche Zellen zunächst aufnehmen DNA. Es sei auch bemerkt, dass, obwohl pCAG-GFP und pCAG-Cre werden: GFP Plasmide können effizient unter Verwendung der in dieser Studie gezeigt Elektroporationsparameter geliefert werden kann, kann die Effizienz anderer DNA-Konstrukte variieren kann und keine individuelle Optimierung. Veränderungen in der DNA-Konzentration, die Elektroporation Spannung oder der Anzahl von Impulsen kann gemacht werden, wenn Plasmide werden als schwierig zu transfizieren sind. Zusammenfassend kann unsere verbesserte kapillare Elektroporation System effizient und reproduzierbar liefern GFP oder Cre: GFP Plasmide in sehr wenigen Zellen im Embryo mit begrenzter Zelltod. Da diese Methode nicht teuer oder hoch spezialisierte Ausrüstung erfordern, kann es von großem Nutzen für die Zell Tracking-Studien oder bei der Prüfung der Auswirkungen der ektopische Expression oder bedingte Löschen o seinf Gene in frühen Embryonen, wird, wenn die Elektroporation in Embryonen mit floxed bedingte mutierten Allelen durchgeführt. Daher bietet diese Elektroporationstechnik eine nützliche funktionelle Werkzeug für das Verständnis auf einer Zelle-für-Zelle-Basis die Rollen von zell intrinsischen Faktoren im Zusammenhang mit der Wildtyp-embryonalen lokalisierten Umgebungen.

Zellkultur wurde in großem Umfang in der Entwicklungsbiologie Studien verwendet. Embryonalen Stammzellen der Maus (WSR) und Epiblast-Stammzellen (EpiSCs) kann in alle drei Keimblätter in vitro zu differenzieren und sind ein nützliches Modell für die Zelldifferenzierung in der frühen Säugetierembryogenese. Die Ableitung dieser Zelllinien wurde eine Chance für in-vitro-Manipulation und detaillierte Untersuchung der lokalisierten Signalwege und Transkriptions Netzwerke, die während der frühen embryonalen Musterbildung eröffnet. Jedoch bleibt es wichtig, die in vivo Relevanz der Manipulationen in der Kultur durchgeführt bestimmen. Die In-vivo-Potenzial der Präimplantationsdiagnostik Embryonen gewonnenen Maus WSR hat durch die Einführung sie zurück in Präimplantationsembryonen (Morulae oder Blastozysten) 1 bewertet. Allerdings EpiSCs, die die Epiblastzellen in Postimplantationsembryonen darstellen kann nicht effizient in Präimplantationsembryonen 2,3 integrieren. Unsere previouns Erkenntnisse haben gezeigt, dass EpiSCs effizient zu erzeugen, Chimären und dazu beitragen, den Keimblättern, wenn sie in der Implantation Embryonen 4 gepfropft. Daher ist der beste Weg, um die in vitro gezüchtete Zellen zu bewerten, um sie in ihre entsprechenden Umgebung in vivo einzuführen. Elektroporation ist ein weit verbreitetes Verfahren, um exogene Moleküle in Zielzellen sowohl in vivo und in vitro-Experimenten zu liefern. Elektrische Energie kann eine große Anzahl von Poren in der Zellmembran, die exogene Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA), um die Zellen eintreten kann generieren. Eine der größten Herausforderungen für diese Technik ist es, eine optimale Lebensfähigkeit der Zellen mit hoher Effizienz Elektrotransfektion 5,6 kombinieren. Für die Elektroporation von Nukleinsäuren in embryonalem Gewebe, vergoldete Elektroden am häufigsten verwendet worden, so dass Targeting von Zellen in einem breiten Raumbereich 7-9. Um eine loca erreichenlized Gentransfer, eine nadelförmige Elektrode wurde verwendet, um eine Brenn elektrischen Feldes 10,11 zu erzielen. Unter Verwendung dieses Verfahrens zeigten die Autoren, dass nach der Elektroporation 30-60 Zellen hatte die DNA aufgenommen konstruieren 11. Dennoch scheint es, daß genau Anpassung der Anzahl der elektroporierten Zellen nach wie vor schwierig mit fester Breite Elektrode. Die Kapillare Elektroporation Technik wurde verwendet, um Plasmide zu einzelnen Zellen 12-14 zu liefern. Jedoch hat diese Technik nicht für die Elektroporation von Plasmiden, Embryonen ex vivo angewendet. In jüngerer Zeit hat eine Mikrovorrichtung lokal elektroporieren wenige distalen visceralen Entodermzellen (weniger als 4 Zellen) in der frühen Postimplantationsmausembryonen 15 gemeldet. Es ist jedoch noch nicht bekannt, ob dieses Gerät effizient Ziel Ektoderm und Mesoderm ex vivo. In dieser Studie beschreiben wir zwei neue Verfahren zur zellulären und Gen-Funktion in der frühen Post bewerten-Implantation Embryonen. Wir zuerst zeigen, wie man in vitro kultivierten Zellen in definierten Stellen in der frühen Mausembryonen zu pfropfen, um ihre in-vivo-Potenzial zu bewerten. Die Integration der transplantierten Zellen und deren Nachkommen, die alle durch eine genetische Markierung (beispielsweise ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) markiert sind, können durch Immunfärbung von Gewebe spezifische Proteine ​​untersucht werden. 4 Zweitens beschreiben wir ein verbessertes Verfahren, um genau zu liefern DNA lokalisierte Stellen in den Embryo mittels Elektroporation. Anstatt eine nadelförmige Elektrode, legten wir einen dünnen Draht in einem spitzen Glaskapillare, und zeigen, dass diese Modifikation kann die DNA auf eine kleine Zahl von Zellen mit hoher Effizienz und begrenzte liefern Zelltod. Darüber hinaus zeigen wir, dass durch die Verwendung von Glaskapillaren mit unterschiedlichen Öffnungsgrößen, können wir die Anzahl der elektroporierten Zellen zu steuern. Deshalb glauben wir, diese Methode kann von großem Nutzen sein, um frühen embryonalen Musterbildung Studie mit kleinen Zahlen of Zellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Forceps</td>
			<td style="width:275px;">Dumostar</td>
			<td style="width:275px;">T5390</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Dissecting stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:275px;">&#160;Zeiss</td>
			<td style="width:275px;">Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Stereomicroscope system with fluorescence&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Nikon</td>
			<td style="width:275px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Inverted microscope with a digital camera</td>
			<td style="width:275px;">Olympus</td>
			<td style="width:275px;">Olympus BX61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Inverted confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:275px;">Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Low melting point agarose&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">11397863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">30mm Petri dishes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">121V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">4-well plates</td>
			<td style="width:275px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:275px;">179820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">10010015&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Paraformaldehyde (PFA)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">NICHIRYO</td>
			<td style="width:275px;">Nichipet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">tips&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:275px;">685280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:275px;">SANYO</td>
			<td style="width:275px;">MCO-17AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Roller culture apparatus&#160;</td>
			<td style="width:275px;">BTC Engineering</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Syringe filters 0.45&#181;m, sterile&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">10462100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">SH30549.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">SH30239.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:275px;">DE17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Gas Cartridge for Portable Meker Burner</td>
			<td style="width:275px;">COLEMAN&#160;</td>
			<td style="width:275px;">COLEMAN 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:347px;">Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:275px;">640798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">A5177-5EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Flaming/Brown micropipette puller&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:275px;">P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Microforge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">De Fonbrune</td>
			<td style="width:275px;">BS030301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pneumatic pico pump&#160;</td>
			<td style="width:275px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:275px;">PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Microloader tips&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:275px;">5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">ECM 830 square wave pulse generator&#160;</td>
			<td style="width:275px;">BTX</td>
			<td style="width:275px;">45-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Green food coloring dye</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">C.I. 42053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye</td>
			<td style="width:275px;">Biotium</td>
			<td style="width:275px;">40060-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">pCAG-Cre:GFP&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Addgene</td>
			<td style="width:275px;">#13776&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">pCAG-GFP&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Addgene</td>
			<td style="width:275px;">#16664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Multimeter</td>
			<td style="width:275px;">Excel</td>
			<td style="width:275px;">XL830L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Micromanipulators&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Leitz&#160;</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">0.2mm diameter platinum wire&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:275px;">E404-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:275px;">Abcam</td>
			<td style="width:275px;">ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Goat anti-Chicken IgY, HRP</td>
			<td style="width:275px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:275px;">sc-2428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Liquid DAB+ Substrate Chromogen System&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Dako</td>
			<td style="width:275px;">K3467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">A far-red fluorescence nuclear counterstain</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for precisely localized transfer of cells or dna into early postimplantation mouse embryos

Manipulation und Kultur der frühen Maus-Embryonen ist eine leistungsstarke und dennoch weitgehend ausgelastet Technologie Steigerung des Werts von diesem Modellsystem. Umgekehrt Zellkultur wurde in großem Umfang in der Entwicklungsbiologie Studien verwendet. Es ist jedoch wichtig, festzustellen, ob in vitro kultivierten Zellen wirklich in vivo Zelltypen zu repräsentieren. Pfropfen Zellen in Embryonen, gefolgt von einer Bewertung ihrer Beteiligung bei der Entwicklung ist eine nützliche Methode, um das Potential von in vitro kultivierten Zellen zu bestimmen. In dieser Studie beschreiben wir ein Verfahren zum Pfropfen von Zellen in einem definierten Ort der frühen Postimplantationsmausembryonen, gefolgt von der ex vivo-Kultur. Außerdem stellen wir einen optimierten Elektroporationsmethode, die Glaskapillaren verwendet bekanntem Durchmesser, die eine genaue Lokalisierung und Anpassung der Anzahl von Zellen Empfangen exogene DNA sowohl mit hohen Transfektionseffizienz und niedrige Zelltod. Diese Techniken, die keine sp erfordernecialized Geräte, übertragen experimentelle Manipulationen der Gastrulation und frühen Organogenese stufigen Mausembryo möglich, kann Analysen Einsatz in kultivierten Zellpopulationen und die Wirkung der genetischen Manipulationen in situ auf die Zelldifferenzierung.

Pfropfung EpiSCs die ubiquitär exprimieren EGFP (r04-GFP aus E6.5 Ektoderm abgeleitet und C2, die in vitro aus mESCs abgeleitet) 4 manuell von der Kulturschale abgeschabt und in verschiedene Stellen von E7.5-Embryonen (2A) gepfropft. Die Embryonen wurden ex vivo kultiviert und nach 24 Stunden analysiert. Die Verteilung von Spenderzellen wurde durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt. Wenn Spenderzellen aufgenommen, vermehren sie und ihre Derivate innerhalb der Host-Embryonen (2B) dispergiert. Es wurde beobachtet, daß Transplantate enthalten 10-16 Zellen effizient in den Wirts Embryonen (2A und 2B) eingearbeitet, jedoch Pfropfung mehrere Zellen nicht in besseren chimaerism führen. Stattdessen erzeugt transplantierten Zellen unincorporated Klumpen (2C und 2D). Elektroporation Einssess die Effizienz unserer Elektroporationssystem lieferten wir GFP-exprimierenden Plasmiden (pCAG-GFP und pCAG-Cre: GFP) auf bestimmte Websites im Embryo. In Übereinstimmung mit einer früheren Studie 11 wurden GFP + Zellen in Embryonen nachgewiesen 1-2 Stunden nach der Elektroporation (2E und 2G). Wenn distalen Epiblastzellen am späten Primitivstreifen Stadium Embryos wurden durch Elektroporation, trugen markierten Zellen zu neuronalen Ektoderm nach 24 Stunden in Kultur (Abbildung 2E und 2F). Dieses Ergebnis entspricht auch den bekannten Schicksal Karten Epiblastzellen in Gastrulation Embryonen 17. Ähnlich wird, wenn das GFP-Expressionsplasmid wurde in Primitivstreifens an E8.5 (2-5 Somiten) elektroporiert, GFP + -Zellen zu paraxialen Mesoderms (2G und 2H), im Einklang mit bekannten Schicksal Karten der späten Primitivstreifens 18 beigetragen . Außerdem beobachteten wir, Beitrag zu allen drei Keimschichten aus elektroporierten Zellen (2I-K),was darauf hindeutet, dass die Elektroporation Verfahren nicht das Zellverhalten in vivo beeinträchtigen. Allerdings haben wir auch festgestellt, dass, während Epiblast (E7.5) oder Primitivstreifen Zellen (E8.5) wurden gezielte, einige Entodermzellen wurden elektroporiert (3C und Tabelle 1). Einer der Hauptvorteile der Verwendung eines Kapillar-Elektrode ist, daß die Anzahl der elektroporierten Zellen gesteuert werden kann, einfach durch Ändern des Durchmessers der Öffnung aus. Um die Anzahl der elektroporierten Zellen zu bestimmen, wurden die Embryos 2 Stunden nach der Elektroporation fixiert und in Wholemount auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet wird. Die Anzahl der GFP + -Zellen wurde manuell in den konfokalen z-Stapel gezählt. Tabelle 1 zeigt, dass für eine bestimmte Stufe, wodurch die Öffnungsgröße der Glaskapillare 20 bis 30 &amp; mgr; m führt zu DNA-Aufnahme durch mehrere Zellen. Wenn eine einzelne Öffnungsgröße zwischen Stufen (E7.5 gegen E8.5) verglichen wird, wurden mehr Zellen gefunden, um in einer späteren Stufe der Elektroporation werden. Dieser Effekt kann durch eine höhere Konzentration an DNA, die in der Amnionhöhle zu E8.5 sein. Weil die DNA-Lösung wurde mit dem grünen Lebensmittelfarbstoff gemischt werden, kann man die grüne Farbe zu verwenden, um die DNA-Konzentration in der Amnionhöhle zu beurteilen. Im Mikroskop, ist es klar, dass, wenn sie mit E8.5-Embryonen verglichen wird, ist die grüne Farbe nach der DNA-Injektion in den Hohlraum des E7.5-Embryonen viel leichter. Obwohl die gleiche Konzentration an DNA-Lösung wurde in E7.5 und E8.5-Embryonen injiziert, war mehr DNA-Lösung in der Amnionhöhle von Embryos E8.5, um es vollständig zu füllen, weil sie in der Größe größer sind. Nach dem Zurückziehen der Injektionsnadel, gibt es immer eine gewisse Leckage der DNA-Lösung aus der Amnionhöhle und da das Einstichloch ist im Vergleich zu der Größe der Amnionhöhle früher Embryonen größer ist, ist es wahrscheinlich, dass es proportional mehr Leck von E7.5 als E8.5 Embryonen, die zu einem niedrigeren DNA-Konzentration. Die unterschiedliche Anzahl transfizierterZellen können auch durch die unterschiedlichen Durchmesser oder induzierten Transmembranspannung (ITV) Schwellen der Zellen in den verschiedenen Phasen ist. Ein Nachteil der Elektroporation ist die zugehörige Zelltod. Ähnlich wie die traditionellen vergoldet oder nadelförmigen Elektroden, die Elektroporation unter Verwendung eines Kapillar-Elektrode veranlasst den Zelltod. Nach der Elektroporation erschien der Zielregion in der Farbe dunkler im Vergleich zu benachbarten Regionen (3A und 3B), was anzeigt, dass ein gewisser Grad des Zelltods ist in diesem Bereich aufgetreten ist. Die Anzahl der toten Zellen durch das Elektroporationsverfahren verursacht wird, weiter zu bestimmen, wurden die Embryos mit einem fluoreszierenden Zellmembran undurchlässige Kernfarbstoff gefärbt. Die Kerne der toten Zellen mit einer membran undurchlässigen fernen Rot-Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Die Färbung bestätigt, dass diese Kapillare Elektroporationstechnik bewirkt nur eine kleine Anzahl von toten Zellen in der Nähe der Elektroporation Website (3D und Table 1). Uns ist aufgefallen, dass, obwohl abgestorbenen Zellen an der Elektroporation Website erscheinen, sind auch GFP + -Zellen und toten Zellen exklusivsten voneinander (Abbildung 3E und 3F). Wenn darüber hinaus der Schwanzseiten Epiblasts bei E8.5 wurde mit pCAG-GFP und einer Glaskapillare Öffnung von 20 um, eine große Zahl von GFP + -Zellen elektroporiert wurde nach 48 Stunden in Kultur (Figur 3G und 3H) detektiert. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe am GFP + -Zellen nachgewiesen 2 h nach der Elektroporation sind noch lebensfähig bei der weiteren Kultur. Wir hat die Anzahl der GFP + -Zellen nach 24 Stunden ex vivo Kultur. Sechs Embryos wurden mit pCAG-GFP bei E7.5 elektroporiert, mit einer Kapillaröffnung von 20 um Durchmesser. 107 ± 31 (Mittelwert ± Standardabweichung) GFP + Zellen / Embryos festgestellt wurden. Da zu Beginn der Kultur (2 h) wurden 9-Zellen im Durchschnitt pro Embryo elektroporiert ( <s<html> trong&gt; Tabelle 1), bedeutet dies, dass elektroporierten Zellen unter 3-4 Spaltungen innerhalb 2 Stunden. Der durchschnittliche Zellverdopplungszeit von E7.5 bis E8.5-Embryonen ist etwa 6-7 h in allen Zellen mit Ausnahme derjenigen, in der ventralen Knoten 19,20. Dies legt nahe, dass die Elektroporation Verfahren nicht das normale Zellwachstum zu behindern. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schaltungsdiagramm der Elektroporation Setup. Der Embryo enthaltenden DNA-Lösung in ihrer Amnionhöhle wurde zwischen den beiden Elektroden angeordnet ist. Strom bei den gewählten Parametern wurde durch eine Rechteckimpulsgenerator (Netzteil) zur Verfügung gestellt. Ein Multimeter in Serie, um den elektrischen Strom, der den Embryo zu detektieren. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53295/53295fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Verteilung der gepfropften oder elektroporierten Zellen in Wirts Embryonen. (AH) GFP-Fluoreszenz Overlays (grün) auf Hellfeld Bilder Wholemount Embryonen (Graustufen) (A) 10-16 GFP + EpiSCs wurden in den distalen Bereich einer späten gepfropften -streak Stadium Embryo. (C) Eine größere Klumpen von GFP + EpiSCs wurde in den distalen Bereich einer Halbserie Stadium Embryos gepfropft. (B und D) Die Verteilung der EpiSCs abgeleiteten Zellen (grün) in den Host-Embryonen (in gezeigt A und C) nach 24 Stunden in Kultur. (B) GFP + -Zellen in den Wirtsembryo dispergiert, was auf korrekte Integration der Spenderzellen. (D) Pfropfen größeren Zellklumpen in Folge nicht eingebauten Klumpenbildung in den Wirtsembryo. (EK) pCAG-Cre: GFP-Plasmid ele<html> in bestimmten Bereichen des Wildtyp-Embryonen ctroporated. Elektroporation den distalen Bereich eines frühen Knospenstadium Embryo (E) oder des Primitivstreifens eines 2-5 Somiten Stadium Embryos (G) führte zu GFP + -Zellen in diesen Regionen zu 2 Stunden nach dem Eingriff. (F und H) die Verteilung von GFP + -Zellen in den Wirtsembryos nach 24 Stunden in Kultur und zeigt, daß elektroporierten Zellen tragen zur Neuroektoderm (schwarzer Pfeil) (F) und paraxialen Mesoderms (weißer Pfeil) (H). (IK) DAB Immunfärbung für die GFP + -Zellen zeigt, daß die elektroporierten Zellen Vorrücken in Neuroektoderm (I) geben kann, Mesoderm (J) und Endoderm (J und K) nach 24 Stunden in Kultur. Maßstabsbalken (AH) = 250 &amp; mgr; m; Maßstabsbalken (IK) = 100 um. Hinweis: 1A und 1B aus unserer früheren Veröffentlichung 4 abgedruckt.href = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig3.jpg" /> Abbildung 3. Verteilung der GFP + -Zellen und toten Zellen in den Embryonen nach der Elektroporation (AC) pCAG-Cre:. GFP-Plasmid in die Schwanzseiten Epiblastzellen eines E8.5 elektroporiert (2-5 Somiten-Stadium) Embryo (Kapillaröffnung Größe :. 20 um) (A) 2 h nach der Behandlung zeigte die Zielregion eine dunkle Farbe (weißer Pfeil) im Vergleich zu anderen Teilen des Embryos. Einschub zeigt eine Vergrößerung der Elektroporation Region. (B) Bildhellfeld (Graustufen) überlagert mit dem grün fluoreszierenden Kanal, der die elektroporierten Zellen (grün). (C) Ein konfokales z-Scheibe zeigt, dasszwei Entodermzellen (grün) nahm auch das Plasmid, wenn die Schwanzseiten Epiblastzellen wurden gezielt. . Die Zellkerne werden in Rot (DF) pCAG-Cre gezeigt: GFP-Plasmid wurde in der kaudalen Seite des Knotens eines E8.5 Embryo elektroporiert (Kapillaröffnung Größe: 30 um). Der Embryo wurde 2 Stunden lang kultiviert. Elektroporierten Zellen sind grün und tote Zellen rot dargestellt. (D) Die Elektroporation Bereich sowohl GFP + Zellen sowie tote Zellen enthält. Der Bereich, in dem weiße Box wurde in einem konfokalen Mikroskop analysiert. Manuelles Zählen der z-Stapel zeigte, dass es 33 GFP + -Zellen und 23 toten Zellen in diesem Bereich. Nur zwei Zellen waren sowohl für beide Fluorophore positiv. (E und F) XYZ Ansicht eines konfokalen z-Scheibe von der weißen Box Region D, welche GFP + -Zellen getrennt von den toten Zellen sind. Die Zellkerne sind blau dargestellt (G und H) pCAG-Cre:. GFP-Plasmid wurde in einigen cel elektroporiertls im kaudalen Seiten Epiblast eines E8.5 Embryonen (Kapillaröffnung: 20 &amp; mgr; m) und abgebildet nach zwei (G) und 48 (H) Stunden ex vivo Kultur Hinweis: (H) Der Embryo wurde in zwei nach der Kultur getrennt. Kopf und Herz Regionen wurden entfernt. Maßstabsbalken (A, B, D, G und H) = 250 um; Maßstabsleiste (C, E und F) = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53295/53295fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Durchmesser der Öffnung des Kapillarrohrs </td><td> Embryonalstadium </td><td> Elektroporation Effizienz: nein. Embryonen GFP + Zellen nach 2h / gesamte Anzahl enthält. der Elektroporation Embryonen (Nr. GFP + Embryonen, die in der Regel nach 24 oder 48 Stunden-Kultur entwickelt) </td><td> Durchschnittliche Anzahl der GFP + -Zellen pro Embryo ± Standardabweichung (n = Nr. Der untersuchten Embryonen) </td><td> Anzahl derGFP + endodermalen Zellen pro jedem Embryo ± Standardabweichung (n = Nr. Der untersuchten Embryonen) </td></tr><tr><td> 20 um </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 7/9 (7) </td><td> 9 ± 3 (n = 4) </td><td> 4 ± 2 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30 um </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 13/15 (12) </td><td> 17 ± 2 (n = 4) </td><td> 6 ± 1 (n = 4) </td></tr><tr><td> 20 um </td><td> E8.5 (2-5 Somiten) </td><td> 12/13 (10) </td><td> 21 ± 4 (n = 4) </td><td> 11 ± 4 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30 um </td><td> E8.5 (2-5 Somiten) </td><td> 2/2 (2) </td><td> 33 und 26 (n = 2) </td><td> 14 und 16 (n = 2) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Electroporation Effizienz pCAG-Cre: GFP-Plasmid in Maus-Embryonen. Abkürzung: LS, spät Primitivstreifen Stufe; LB: späten Knospenstadium. Die Embryonen werden nach inszeniertDowns und Davies 12

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Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Methoden für die genau zu lokalisieren Übertragung von Zellen oder DNA in frühen Postimplantations Maus Embryonen

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

methods-for-precisely-localized-transfer-cells-or-dna-into-early

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Aufrufe.  School of Biological Sciences, University of Edinburgh. We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Serie: Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transkriptom Profilieren<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Eine neue Verwendung des dreidimensionalen Hochfrequenz-Sonographie zur frühen Schwangerschaft Charakterisierung in der Maus

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...