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1. Herstellung von Rückengründe <ol><li> Produktion von Flachfolie von PLLA durch Lösungsmittelgießen. <ol><li> Arbeiten in einem Abzug, um eine Lösung von 2% (w / v) PLLA in Chloroform (2 g PLLA in 100 ml Chloroform), gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur (RT) bis zur vollständigen Lösung (ca. 3 h) herzustellen. </li><li> Legen Sie die Scheiben auf einer Glaspetrischale. Anmerkung: Die Verwendung Edelstahlscheiben mit einem Innendurchmesser von 10,5 mm (etwas kleiner als der ventral Probendurchmesser), so dass die Scheibe auf der Oberseite der ventralen Substrat platziert. Andere Materialien wie etwa Polytetrafluorethylen (PTFE) oder Glasscheiben ebenso verwendet werden. </li><li> Zugeben von 200 ul der PLLA-Lösung in die Waschmaschine und verdampfen lassen langsam für 30 min bei RT. Um eine langsame Verdampfung des Lösungsmittels zu ermöglichen, schließen Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie mit ein paar Löcher. </li><li> Erhitzen Sie die Proben bei 120 ° C für 5 Minuten, um Lösungsmittelspuren zu verdampfen. </li><li> Lassen Proben kühl zu tunwn bei RT. </li><li> Sobald Proben abgekühlt sind (30 min ungefähr), Deckel mit 18,2 M &amp; Omega; · cm Wasser in der Petrischale und Inkubation für 8 min bei RT. Hinweis: Wenn Proben nicht vollständig abgekühlt ist, können sie aufnehmen 18,2 M &amp; Omega; · cm Wasser und einem gummiartigen Zustand übernehmen. Zusätzlich Inkubation in 18,2 M &amp; Omega; · cm Wasser für weniger als 8 min kann in unangebrachter Ablösung, und für mehr als 8 min in Loslösung von der Scheibe führen. </li><li> Mit einer Rasierklinge, hebeln Sie die Scheiben, um sie ziehen Sie die Petrischale. </li><li> Entfernen Sie alle Unvollkommenheiten von der Kante der Scheibe mit einer Pinzette und lassen Sie die Proben an der Luft trocknen. </li><li> Speichern der Proben in einem Vakuum-Exsikkator (80 mbar) bis zum Tag des Experiments aufgrund PLLA abbaubar durch Hydrolyse. </li></ol></li><li> Produktion von PLLA-Fasern durch Elektrospinnen. <ol><li> Arbeiten Sie in einem Abzug, um eine Lösung von 8% (w / v) PLLA in Hexafluorisopropanol (8 g PLLA in 100 ml Hexafluorisopropanol) durch umrühren vorbereitening bei RT bis zur vollständigen Auflösung (3 Stunden ungefähr). </li><li> Legen Sie das Polytetrafluorethylen (PTFE) Scheiben auf ein Aluminiumblech oder auf einer Trommel für die Elektrospinnen, um zufällige oder ausgerichteten Fasern bzw. zu erhalten. Anmerkung: Die Verwendung Polytetrafluorethylen (PTFE) Scheiben mit einem Innendurchmesser von 10,5 mm (etwas kleiner als der ventral Probendurchmesser), so dass die Scheibe an der Spitze der ventralen Substrat platziert. Andere Materialien, wie rostfreier Stahl oder Glas Scheiben könnten ebenso verwendet werden. Sollte die Trommel mit einer Winkelgeschwindigkeit von 160,7 s -1 (Radius = 7 cm), um die ausgerichteten Fasern zu erhalten, zu drehen. Eine langsamere Geschwindigkeit könnte Faserausrichtung nicht auslösen und eine schnellere Geschwindigkeit wird in gebrochenen Fasern führen. </li><li> Legen Sie die Spritze mit der Polymerlösung und auf der Spritzenpumpe. </li><li> Elektrospinnen PLLA Lösung unter Verwendung eines 0,9 ml / h Fließgeschwindigkeit mit einer Spannung von 30 kV und einer Kollektorabstand von 12 cm. </li><li> Stoppen Sie das Elektrospinnverfahren achterner 20-30 Minuten, einmal eine gute Faserdichte erreicht wird (da Zellen mit mehreren Fasern gleichzeitig interagieren). </li><li> Erhitzen Sie die Proben bei 120 ° C für 5 Minuten, um Lösungsmittelspuren zu verdampfen. </li><li> Speichern der Proben in einem Vakuum-Exsikkator (80 mbar) bis zum Tag des Experiments aufgrund PLLA abbaubar durch Hydrolyse. </li></ol></li></ol> 2. Sandwich Kultur <ol><li> Montieren Sie den sandwichartigen Kultur einmal Zellen dem ventralen 2D Substrat haftet. <ol><li> Arbeit in einer Kultur Haube sterilen Bedingungen, um sicherzustellen und zu sterilisieren alle Materialien (Deckgläser, Rücken Substrate, Pinzette, etc.) durch UV-Exposition für 30 min. </li><li> Coat die ventralen und dorsalen Substrat mit Fibronektin, um spezifische Zellproteinhaftung leiten. Dazu läßt man die Proben in 20 &amp; mgr; g / ml von Fibronektin in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS), die Ca 2+ und Mg 2+ (200 &amp; mgr; l / s gelöstausreichend) für 1 Stunde. Hinweis: Aufgrund des Herstellungsprozesses, haben Rücken Substrate A bezeichnet Ober- und Unterseite, da die Lösungsmittel gegossene Film und elektrogesponnenen Fasern auf einer der Seiten der Scheibe angebracht. Diese Seite ist daher ein Blick auf die Zellen (Figur 3). <ol><li> Nach der Proteinbeschichtung, waschen Sie die Proben zweimal mit DPBS, um Protein im Überschuß zu entfernen. Dann inkubieren Proben in DPBS, bis ihre Verwendung, um die Proben vor zu trockener, da dies bewirkt, dass Protein Denaturierung zu verhindern. Verwendung DPBS, das Ca 2+ und Mg 2+, da zweiwertige Kationen regulieren Proteinfaltung. </li></ol></li><li> Samenzellen auf dem Glasplättchen 13. Hinweis: Da die sandwichartige Kultur wird auf 2D Substraten basieren, werden Zellaussaat, ähnlich wie auf einer 2D-Probe durchgeführt werden. Beispielsweise werden C2C12 Myoblasten bei 17,500 Zellen cm -1 für Differenzierungsexperimente und NIH3T3-Fibroblasten sind bei 7000 c ausgesät ausgesätEllen cm -1 für isolierte Kulturen Zellmorphologie und die Haftung zu studieren. </li><li> Die Proben werden im Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 und, sodass die Zellen an der ventralen Substrat für 3 Stunden zu halten. </li><li> Setzen Sie den ventralen ausgesät Substrat in einer neuen Vertiefung einer 12 Multiwellplatte (wo Waschmaschinen passen). Hinweis: Montage des sandwichartigen Kultur in einer neuen und ist ein Weg, der Zellen, die an der Unterseite der Brunnen nach der Aussaat eingehalten haben, zu befreien, da diese Nährstoffe verbrauchen und sezernieren Wachstumsfaktoren und Abfälle, die Zellen innerhalb der kultivierten beeinflussen lassen sandwichartigen Systems. Dies ist auch ein Muss für zellulare Extraktionen, um nur die Zellen in der sandwichartigen Umgebung kultiviert lysieren. </li><li> Sorgfältig und mit Hilfe einer Pinzette, überlagern die dorsale Substrat, auf die Zellen. Nachfüllung mit Medium (1 ml) und bei 37 ° C mit 5% CO 2. Hinweis: Das Gewicht der Scheibe wird in die dorsale Unter verhindernStrate aus schwimmenden. </li><li> Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche, wie in Standard-2D-Kulturen. Den dorsalen Substrat nicht bewegen, da dies könnte in Zellschäden führen. </li></ol></li><li> Montieren Sie den sandwichartigen Kultur kurz nach Zellaussaat. <ol><li> Arbeit in einer Kultur Haube sterilen Bedingungen, um sicherzustellen und zu sterilisieren alle Materialien (Deckgläser, Rücken Substrate, Pinzette, etc.) durch UV-Exposition für 30 min. </li><li> Coat die ventralen und dorsalen Substrat mit Fibronektin, um spezifische Zellproteinhaftung leiten. Dazu läßt man die Proben in 20 &amp; mgr; g / ml von Fibronektin in DPBS, die Ca 2+ und Mg 2+ (200 ul / Probe) 1 h gelöst. <ol><li> Nach der Proteinbeschichtung, waschen Sie die Proben zweimal mit DPBS, um Protein im Überschuß zu entfernen. Dann inkubieren Proben in DPBS, bis ihre Verwendung, um die Proben vor zu trockener, da dies bewirkt, dass Protein Denaturierung zu verhindern. Verwendung DPBS, das Ca 2+ und Mg <sup&gt; 2+ da zweiwertige Kationen regulieren Proteinfaltung. </li></ol></li><li> Seed-Zellen auf Deckgläsern in eine Vertiefung einer 12 Multiwellplatte (wo Scheiben passen). Um dies zu tun, verwenden Sie ein hochkonzentrierte Zellsuspension zu Zellverlust nach der Verlegung die dorsale Substrat zu vermeiden. </li><li> Sorgfältig und mit Hilfe einer Pinzette, überlagern die dorsale Substrat, auf die Zellen. Nachfüllung mit Medium (1 ml) und bei 37 ° C mit 5% CO 2. Hinweis: Das Gewicht der Scheibe wird in die dorsale Substrat Aufschwimmen verhindern. </li><li> Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche, wie in Standard-2D-Kulturen. Hinweis: Die Rücken Substrat nicht bewegen, da dies zu Zellschäden führen. </li></ol></li></ol> 3. Analyse Anmerkung: sandwichartigen Kulturen werden auf 2D Substraten, und so ist üblicherweise durch die bereits für Standard-2D-Kulturen entwickelten Verfahren analysiert werden. Da beispielsweise PLLA ist transparent und cells gezwungen sind, innerhalb der xy-Ebene zu bewegen, wird die Mikroskopie als auf 2D-Substraten durchgeführt. Die Zellmigration kann daher als für 2D Kulturen analysiert werden, ohne die Notwendigkeit von Tracking-Zellen in der z-Achse wie für 3D-Kulturen, die das Experiment und Bildanalyse vereinfacht. Um die Wundheilung Assay durch einen Kratzer Test studieren folgen Sie diesem Protokoll: <ol><li> Untersuchung der Zellwanderung (Wundheilungs Assay) innerhalb des sandwichartigen Kultur. <ol><li> Arbeit in einer Kultur Haube sterilen Bedingungen, um sicherzustellen und zu sterilisieren alle Materialien (Deckgläser, Rücken Substrate, Pinzette, etc.) durch UV-Exposition für 30 min. </li><li> Coat die ventralen und dorsalen Substrat mit Fibronektin, um spezifische Zellproteinhaftung leiten. Dazu läßt man die Proben in 20 &amp; mgr; g / ml von Fibronektin in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS), die Ca 2+ und Mg 2+ 1 h gelöst. <ol><li> Nach der Proteinbeschichtung, waschen Sie die Proben zweimal mit DPBSum Protein im Überschuß zu entfernen. Dann inkubieren Proben in DPBS, bis ihre Verwendung, um die Proben vor zu trockener da dies Protein Denaturierung verursachen zu vermeiden. Verwendung DPBS, das Ca 2+ und Mg 2+, da zweiwertige Kationen regulieren Proteinfaltung. </li></ol></li><li> Samenzellen auf den Deckgläschen mit hoher Dichte 13. </li><li> Die Proben werden im Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 und sodass die Zellen Konfluenz erreichen. </li><li> Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die Zellschicht, um Kratzer zu 2 Zellpopulationen durch einen Spalt getrennt zu erhalten. </li><li> Setzen Sie den ventralen ausgesät Substrat in einem neuen gut geeignet für die Zeitraffer-Akquisition und dem dorsalen Substrate passen (dh 12 Multi-Well-Platte). </li><li> Sorgfältig und mit Hilfe einer Pinzette, überlagern die dorsale Substrat, auf die Zellen und dann nachgefüllt Medium (1 ml für eine 12 Multi-Well-Platte). Hinweis: Das Gewicht der Scheibe wird verhindert ter dorsal Substrat aus schwimmenden. </li><li> Legen Sie die Probe in der Zeitraffer-Mikroskop (bis 37 ° C und 5% CO 2) und nehmen Sie Bilder von der Lückenschluss alle 20 Minuten. </li><li> Analysieren Sie den Lückenschluss mit speziellen Software wie das Plugin MiToBo von ImageJ. 14 </li></ol></li></ol> Hinweis: Protein und Nukleinsäure-Extraktion wird in ähnlicher Weise wie auf der 2D-Substraten durchgeführt. Es gibt nur einen zusätzlichen Schritt, der in der Demontage des sandwichartigen Kultur Lysepuffer direkt auf die Zellen, um die Effizienz der Extraktion hinzuzufügen besteht. Beispielsweise für mRNA-Extraktion: <ol start="2"><li> Extrahieren von mRNA aus sandwichartigen Kulturen <ol><li> Vorbereitung alle Puffer vom kommerziellen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Nehmen Sie die sandwichartige Kultur aus dem Inkubator. </li><li> Entfernen Sie die Kulturmedien aus den Proben. </li><li> Die Proben einmal Waschen mit DPBS, die Ca2+ und Mg 2+ (1 ml), und entfernen Sie die gesamte Lösung. </li><li> Mit Hilfe einer Pinzette, entfernen Sie den Rücken Substrat und fügen Sie die Lyse-Puffer (350 ul) zur ventralen Substrat. Overlay wieder die dorsale Substrat auf der ventralen Substrat zur Lyse der Zellen auch an der dorsalen Substrat haftet. </li><li> Entfernen Sie die Rücken Substrat, um die Lyse-Lösung zu isolieren. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um die mRNA zu erhalten. </li></ol></li></ol> Anmerkung: Immunodetektion von Proteinen kann auch als 2D Substraten durchgeführt werden. Seit sandwichartigen Kulturen könnte die korrekte Diffusion der Antikörper und Puffer zu behindern, sollte Inkubationszeiten erhöht werden. Auch kann das Sandwich vor dem Starten des Färbeprotokoll demontiert werden, aber im letzteren Fall einige Zellen im dorsalen Substrat und einige zur ventralen Substrat verbunden bleiben. <ol start="3"><li> Immunodetect Proteine ​​innerhalb einer sandwichartigen Kultur <ol&gt; <li> Die Probe einmal Waschen mit DPBS setzen und mit 4% Formaldehyd in PBS für 20 Minuten bei 4 ° C. Anmerkung: Dorsal Substrat kann während des Fixierungsprozesses, so daß Diffusionsprobleme vermieden entfernt werden. </li><li> Gründlich mit DPBS (1 ml) und dann mit permeabilisieren 0,5% Triton X-100 in DPBS (1 ml) für 5 min bei RT. </li><li> Blockieren unspezifischer Bindungsstellen mit 1% Albumin in DPBS (1 ml) für 30 min bei RT. </li><li> Inkubieren mit dem primären Antikörper (2 ug / ml; 1 ml) in Blockierungslösung 3 h bei RT. </li><li> Für 10 min mit DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml) 3x waschen. </li><li> Inkubieren 2 Std mit sekundärem Antikörper (2 ug / ml) und 1 &amp; mgr; g / ml DAPI in Blocking-Lösung (1 ml) bei RT. </li><li> Für 10 min in DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml) 3x waschen. </li><li> In DPBS waschen. Hinweis: Die Proben können auf einem Objektträger mit Vectashield montiert und mit Nagellack versiegelt, wenn Rücken Substrate vor der Immundetektion entfernt werden. </li><li> Beachten Sie unter dem FluoreszenzmikroUmfang wie für Standard-2D-Substraten. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Heutzutage ist 3D-Kultur ein wichtiges Thema für die pharmazeutische und biotechnologische Industrie und Forschung in der Zellbiologie, einschließlich Krebs und Stammzellen. Als Folge mehrere 3D-Kultursysteme entwickelt worden. Leider Unterschiede zwischen den 3D-Systemen in der Regel in verschiedenen Zellverhalten führen, behindert das Verständnis der Zellschicksal. Außerdem sind die experimentellen Verfahren in der Regel nicht so einfach, wie für die 2D-Kultursysteme. Daher die Entwicklung neuer Kultursystemen versuchen, zu überwinden einige dieser Nachteile ist sehr wichtig. Sandwichartige Kultur wurde gezeigt, dass essentielle Prozesse wie Zelldifferenzierung, Zellmorphologie, Zellsignalisierung und Zellmigration stark beeinflussen. Darüber Zellen Ähnlichkeiten mit Zellen in 3D-Systemen kultiviert, die Unterstützung der Aussage, dass sandwichartigen Kultur verbindet 2D mit 3D-Kultursystemen. Physiologische Gewebe weisen Poren im Bereich von 3 bis 14 μm, die Zellen Zwang und beeinflussen daher zellulären Prozessen wie Migration. Dies ist irgendwie rekapituliert Verwendung des sandwichartigen System dorsalen und ventralen Reize Betreiber per se einer eingeschränkten Umgebung, die Zellmorphologie begrenzt und wird notwendigerweise unabhängig von der Proteinzüge beeinflussen Zellmigration. Durch die gleichzeitige Stimulation der dorsalen und ventralen Rezeptoren ist sandwichartig Kultur eine robuste Technik, die Rolle der Dimensionalität das Zellverhalten zu untersuchen. Außerdem ist, wie es auf 2D Substraten ist diese Kultursystem vielseitig unterschiedlichen Materialeigenschaften und ECM-Eingängen, die die Untersuchung des Zellverhaltens bei unterschiedlichen Mikroumgebungen zu studieren. Außerdem kann der Einfluß der Zeit, zu der dorsalen Rezeptoren auf Zellschicksal stimuliert durch Verschneidung der dorsalen Substrat zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht werden. Daher, im Gegensatz zu anderen 3D-Systemen stellt die sandwichartige System ein breites Spektrumder gut kontrollierten zellulären Mikroumgebungen. Folglich ist die sandwichartigen System ist eine interessante Zellkultur-Plattform, um verschiedene physiologische Umgebungen, um Zellbiologie und Testzelle Schicksal unter verschiedenen Kulturbedingungen zu studieren imitieren. Wie bereits erwähnt, ist ein Vorteil dieses Systems, daß unterschiedliche ventralen und dorsalen Substrate können unter Verwendung verschiedener Proteinbeschichtungen untersucht werden. Daher können wichtige Parameter für das Schicksal der Zelle, wie die Ligandendichte durch Steuern der Ligandendichte von jedem der 2D-Substrate (zB ventralen und dorsalen Substrate) abgestimmt werden. Beachten Sie jedoch, dass verschiedene Substrate können Änderungen im Protokoll benötigen. Zum Beispiel kann mit größeren dorsalen Substrate in der Notwendigkeit einer ordnungsgemäßen Inkubationszeit, die Proben aus der Petrischale abziehen gesetzt führen. Ebenso könnte größer ventralen Substrate in hypoxischen Bereichen in der Mitte der Probe aufgrund des begrenzten Sauerstoffdurchlässigkeit der ventralen führenSubstrat (aufgrund des Deckglas). Darüber hinaus werden Analyseverfahren auf den Substrateigenschaften abhängen. Zum Beispiel wird mit einer undurchsichtigen Substraten dorsalen Standardmikroskopie Protokolle behindern obwohl es immer noch erlauben, Protein / Nukleinsäure-Extraktion. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Durchlässigkeit des dorsalen Substrat, da Zellen erlaubt sein sollte, Nährstoffe aus dem Medium zu erhalten und entsorgen Abfälle. Zusammenfassend ist eine sandwichartige Kultur ein einfaches System, das die Möglichkeit bietet, verschiedene 3D-ähnlichen Mikroumgebungen zu imitieren, um das Schicksal der Zelle zu untersuchen.

Traditionell Zellkultur wurde auf zweidimensionalen (2D) als Substrate verwendet, obwohl die meisten in vivo zelluläre Mikro eine dreidimensionale (3D) Natur. Diese unnatürliche 2D-Umgebung löst Veränderungen im Verhalten der Zelle als eine Möglichkeit der Selbstanpassung zu einer flachen Welt, die einen direkten Einfluss auf das Schicksal der Zelle 1,2. Daher Ergebnisse auf 2D-Zellkulturen erhalten werden, sind nicht immer reproduzierbar in vivo. Dies hat die Entwicklung von neuen relevanten Kultursystemen versuchen, mehrere physiologische ähnlichen Bedingungen um weitere Einblicke in jeder Dimension abhängige biologische Mechanismus 3,4 zu liefern gefördert. Einer der Hauptunterschiede zwischen dem 2D- und dem 3D-Kultur in vivo-Umgebung ist die Verteilung der Zellen-Rezeptoren der extrazellulären Matrix (ECM) verankert ist: während auf 2D Substrate Zellen ventral haften, sind die Mehrzahl der Zellen in vivo vollständig durch das ECM umgeben so cell Adhäsion tritt durch eine 3D-Verteilung von Rezeptoren. Dies löst verschiedene Zelladhäsion Signaltransduktionswege modulieren, wodurch wichtige Prozesse wie Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Genexpression. In den letzten Jahrzehnten wurden viele verschiedene 3D-Kultursysteme etabliert 5-8, obwohl ihre Variabilität und Komplexität behindert deren Standardisierung gemeinsam Zellkulturverfahren. Außerdem 3D-Systeme sind in der Regel nicht leicht zu handhaben und zu aktuellen experimentellen Verfahren 2D Substrate nicht ohne weiteres für die 3D-Kulturen hergestellt werden. Außerdem Literatur selten vergleicht 3D-Kulturen mit dem Äquivalent 2D Bedingung oder anderen 3D-Systemen, behindern die richtige Verständnis des Zellverhaltens in diesen Modellen. Sobald mit den Zellen auf einem 2D Substrat die Anregung der dorsalen Rezeptoren haften - durch Überlagerung einer Schicht aus einem neuen Material (Sandwich-ähnlichen Kultur) - Zell-Antworten können gleichermaßen 3D-Umgebungen auszulösen. Die reaSohn dafür ist die gleichzeitige Aktivierung sowohl dorsalen und ventralen Rezeptoren zu haften und in der Sandwich-Umgebung verteilt (Abbildung 1) 9,10. Als Konsequenz Zellen eine wichtige Änderungen bezüglich 2D Kulturen 11,12. Auf diese Weise wird das Schicksal der Zelle bei der Montage aufgrund der Sandwichkultur bestimmt, da die Rücken Stimulation löst Veränderungen im zellulären Wege-Taste. Daher wird das Zellschicksal stark von der Zeit, wenn die sandwichartige Kultur zusammengebaut 11 bestimmt. Aufgrund der Natur des Systems, ist eine sandwichartige Kultur ein einfaches und vielseitiges Werkzeug, das Studium der verschiedenen Parameter in Zell / Material-Wechselwirkungen wie Chemie, Topographie, Steifigkeit und Proteinbeschichtungen sowohl auf der ventralen und dorsalen Seiten ermöglicht. Dies bietet einen höheren Grad an Flexibilität im Vergleich zu anderen 3D-Systemen (Figur 2) aufgrund der unabhängigen dorsalen und ventralen Kombination verschieden variety der Oberflächenbeschaffenheit. Zudem können andere Zelllinien und verschiedene Zeiten, die sandwichartig zusammenzusetzen Kultur untersucht werden, was die breite Spektren von Möglichkeiten. Ein Standardprotokoll des sandwichartigen Kultur wird unter Verwendung von detaillierten entweder Poly-L-Milchsäure (PLLA) elektrogesponnenen Fasern oder Folien als Rücken Substraten Deckglas als ventral Substrat und Fibronectin als Proteinbeschichtung. Sandwichartigen Kulturen wurden direkt nach Zellaussaat oder nach 3 h von 2D-Kultur zusammengebaut. Beachten Sie jedoch, dass andere Materialsysteme und Proteine ​​eingesetzt werden könnten; ebenfalls sandwichartigen Kultur kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten zusammengesetzt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ploy(lactic acid)</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses (12 mm&#216;)</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>631-0666</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>CL0200</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105228</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010-200V0</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE1000</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage DC Power Supply</td>
			<td>Glassman High Voltage</td>
			<td>Series FC</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hucoa-Herl&#246;s</td>
			<td>3111</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow&#160; hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>AV30/70</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">74004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7409</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions

Zellkultur wurde traditionell auf zweidimensionalen (2D) Substrate, wo Zellen mit Rezeptoren, die zur ventralen Biomaterialoberfläche haften geführt. Jedoch in vivo, die meisten Zellen sind vollständig von der extrazellulären Matrix (ECM) umgeben ist, was in einem dreidimensionalen (3D) Verteilung der Rezeptoren. Hiermit können die Unterschiede in der Outside-in-Signalwege und damit das Verhalten der Zelle auslösen. Dieser Artikel zeigt, dass die Stimulation der dorsalen Rezeptoren von Zellen durch Überlagerung eines Films aus einem neuen Material (a sandwichartigen Kultur) bereits zu einer 2D-Substrat haftet löst wichtige Änderungen in Bezug auf Standard-2D-Kulturen. Außerdem verschiebt sich die gleichzeitige Anregung ventralen und dorsalen Rezeptoren Zellverhalten stärker an die in 3D-Umgebungen gefunden. Zusätzlich aufgrund der Art des Systems ist eine sandwichartige Kultur ein vielseitiges Werkzeug, das die Untersuchung der verschiedenen Parameter in Zell / Material inte ermöglichtractions zB Topographie, Steifigkeit und unterschiedlichen Proteinbeschichtungen sowohl auf der ventralen und dorsalen Seiten. Da schließlich sandwichartigen Kulturen werden auf 2D Substraten, mehrere Analyseverfahren bereits für Standard-2D-Kulturen entwickelt normalerweise verwendet werden kann, die Überwindung komplexere Verfahren für die 3D-Systemen benötigt.

Die Stimulation der Rezeptoren dorsal im sandwichartigen Kultur löst Veränderungen in der Zellmorphologie, Zelladhäsion und intrazelluläre Signalwege (zB focal adhesion kinase, FAK) 10-12. Als Beispiel Fibroblasten innerhalb des sandwichartigen System kultiviert überexprimiert die α 5-Integrin-Untereinheit im Vergleich zu dem 2D, wie für andere 3D-Kulturen 15,16 beobachtet. Zellschicksal ist stark abhängig von der Zeit, wenn die Rücken Rezeptoren stimuliert und durch die Eigenschaften des dorsalen Interaktion, ähnlich wie dies in anderen 3D-Systemen wie Hydrogele. Zum Beispiel Hydrogele in denen Proteine ​​sind eng in der Regel gebunden zeigen kleineren und abgerundeten Zellen mit unbebauten Aktin-Zytoskelett und diffuse fokalen Adhäsionen. Dies kann in einer sandwichartigen Kultur unter Verwendung von Substraten, die Proteine ​​zu adsorbieren dicht nachgeahmt werden, so dass die Zellen nicht in der Lage, diese Schicht von Proteinen und Zell sprea mechanisch reorganisierending behindert wird. In ähnlicher Weise können Hydrogele, wo Zellen können die ECM Umgestaltung mit der Sandwich-System unter Verwendung von Substraten, die Proteine ​​lockerer 10 adsorbieren nachgeahmt werden. Die Stimulation der Rücken Rezeptoren wurde gezeigt, C2C12 Zellschicksal zu modulieren. Dorsal elektro PLLA-Fasern direkte Ausrichtung der Zellen, wenn sie mit Fibronektin beschichtet, aber nicht, wenn es mit Rinderserumalbumin (ein nicht klebe Protein) beschichtet. Dieses Ergebnis weist darauf hin, Zellen tun biologisch Sinn und reagieren auf den dorsalen Eingänge (4) 9. Zusätzlich sandwichartigen Kulturen mit ebenen Rücken PLLA löste eine Erhöhung des Niveaus der Myogenese. Dies hängt auch von der dorsalen biologische Reize da die Wechselwirkung mit verschiedenen Rücken Proteine ​​ergibt deutliche Differenzierung Raten (Figur 5) 9. Zellmigration in der sandwichartigen Kultur ist auch im Vergleich zu dem 2D-Kultur verändert. Es hat seinen gezeigt, dass in einer Wundheilungsassay Zellen innerhalb des Sandwichkultur nehmen eine sehr langgestreckte Morphologie und Migration kürzere Distanzen als auf 2D-Substrate (Filme 1 und 2). Zellmigrationsraten sind ferner mit der Natur der ventralen und dorsalen Stimulations 12 zusammen. Ähnlich wie in den 3D Fibronektin und Kollagengele 17,18 erhöht sandwichartigen Kulturzellvermittelte ECM Reorganisation (dh der ventralen Fibronectin) in Bezug auf das 2D-Zustand (Figur 6) 12. Dieses Verfahren beruht auf der dorsalen mechanische Reize und Zytoskelett Stabilität, da die Verwendung von Kontraktionshemmer (blebbistatin, Y27632) behindert den Vorgang. Interessanterweise wurde die ventrale Fibronektin auch bei Verwendung unterschiedlicher Rückenproteinbeschichtungen (dh Vitronectin und Rinderserumalbumin) reorganisiert und selbst wenn unbeschichtet 12. Abb. 1:. Skizze der Standard (2D) und sandwichartigen Kulturen Stimulation der dorsalen Rezeptoren innerhalb des sandwichartigen Kultur löst zusätzliche Zelladhäsion Signalisierung, die wichtige zelluläre Prozesse moduliert <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53090/53090fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53090/53090fig2highres.jpg" width="700" /> Abbildung 2: Sandwich-ähnlichen Kultur ist ein vielseitiges System, das die Untersuchung der verschiedenen gut kontrollierten Parameter (topographischen Eingänge, Steifigkeit Gradienten ...) an den beiden ventralen und dorsalen Substrate ermöglicht. Abb. 3: Dorsal Substrate für oben und Querschnittsansicht, um zu zeigen, dass eine bestimmte Ober- und Unterseite haben skizziert (A) Wohnung PLLA Film und (B) elektrogesponnenen Fasern. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53090/53090fig4highres.jpg" width="700" /> Abb. 4: Morphologie C2C12 unter verschiedenen Kulturbedingungen einschließlich Ebene (P) und ausgerichteten Fasern (a) von PLLA, die als ventral (Index) verwendet oder dorsalen (gestellt) Substrate Gepunktete Linien stellen Fasern Orientierung, wo notwendig. Zellen, die auf der Ebene Substrat kultiviert und mit ausgerichteten Fasern aus PLLA (SW p a) spüren die Rücken Reize überlagert. Insbesondere Zellen spüren den dorsalen Fasern, wenn sie mit Fibronektin beschichtet, aber nicht, wenn beschichtet with Rinderserumalbumin (ein nicht klebe Protein). Folglich Zellen haften an den mit Fibronectin beschichteten Fasern und richten in die gleiche Richtung. Bild von Referenz 9 angepasst. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53090/53090fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53090/53090fig5highres.jpg" width="600" /> Abbildung 5: Zelldifferenzierung in sandwichartigen Kulturen nach 4 Tagen in Differenzierungsmedium. Verschiedene Kulturbedingungen wurden analysiert, einschließlich Ebene (P) und ausgerichteten Fasern (a) von PLLA, die als ventral (Index) oder dorsalen (gestellt) verwendet wurden Substraten. Die Proben wurden mit Fibronektin in allen Fällen beschichtet. (A) Fluoreszenzfärbung zeigt sarcomeric Myosin-positiven Zellen (grün) und Zellkerne (rot). (B) DifferenzierteZellen Orientierung wie durch eine schnelle Fourier-Transformation berechnet. (C) die Myogenese wie durch den Prozentsatz der sarcomeric Myosin-positiven Zellen bestimmt. Daten sind normiert auf den Goldstandard Kontrolle. Statistisch signifikante Unterschiede sind mit *** P &lt;0,001 angegeben. Bild von Referenz 9 angepasst. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53090/53090fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53090/53090fig6highres.jpg" width="700" /> Abbildung 6: Reorganisation der ventralen Fibronektin. Sandwichkultur löst ventralen FN Reorganisation durch Bilden neuer Fibronektin Fibrillen (bürstenartigen Kennzeichnung; ausgeführt mit weißen Pfeile). Ventral Fibronektin innerhalb sandwichartigen Kulturen mit verschiedenen Rückenproteinbeschichtung (Fibronectin, Vitronectin und Rinderserumalbumin) reorganisiertoder sogar, wenn die Rücken Substrat unbeschichtet gelassen. Aktin-Zytoskelett (grün), Kerne (blau) und FN (rot) angezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53090/53090fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Film 1: Zellmigration auf 2D. L929 Fibroblasten-Migration auf einem Fibronectin beschichteten Deckglas in einem Wundheilungsassay. Die Bilder wurden für 16 Stunden (mit einem Rahmen genommen alle 20 min) erworben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53090/2D.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> Film. 2: Zellmigration innerhalb des sandwichartigen Kultur L929 Fibroblasten-Migration in einer Wundheilungs Assay innerhalb eines sandwichartigen Kultur waren die ventrale Substrat war ein mit Fibronectin beschichteten Deckglas und der dorsalen Substrat ein mit Fibronectin beschichteten PLLA Film. Die Bilder wurden für 16 Stunden (mit einem Rahmen genommen alle 20 min) erworben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53090/movie_2_SW.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a>

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Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Aufrufe.  Universitat Politècnica de València. The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Serie: Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Mikrostrukturierten Oberflächen zum Studium Hyaluronsäure Wechselwirkungen mit Krebszellen

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabrication von Nanoporöse Gold-Patterns für Zell-Material-Interaktion Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Herstellung eines Multiplex künstliche zellulären Mikroumgebung Arrays

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...