ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.

Das folgende Protokoll wird gemäß den Leitlinien, die von der Abteilung für Labortiermedizin an der University of North Carolina in Chapel Hill niedergelassen. 1. Bereiten Sie das folgende Material und Reagenzien vor dem Start <ol><li> Vorbereitung EC Medien durch Hinzu 400 ml niedrigen Glucose (1 g / l D-Glucose oder LG) Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 50 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum, 50 ml Nu-Serum IV, 5 ml Antibiotika-Antimykotika, und hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1 und Heparin-Komponenten aus dem im Handel erhältlichen Kits. </li><li> Vorbereitung 500 ml FACS-Puffer (0,5% BSA und 2 mM EDTA in PBS); filtriert durch ein steriles 0,22 um Filtertasse. </li><li> Zu sterilisieren oder zu desinfizieren Sezieren Bord. </li><li> Dissektion Stifte, chirurgische Scheren und Dissektoren sterilisieren. </li></ol> 2. EG-Isolation (Tag 1, ~ 5 Stunden) <ol><li> Euthanize Maus mit Kohlendioxid oder einem anderen Verfahren konform with der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Politiken. Hinweis: Mehrere Brusttumoren unterschiedlicher Größe (von 5 bis 15 mm Durchmesser) in einem einzigen genetisch veränderten Maus zu entwickeln, wie beispielsweise C3-Tag, sollten Sie alle von ihnen für TEC Isolation zu ernten. Bei Verwendung von Tumoren, die orthotop bei Mäusen eingepflanzt werden, Pool zwei vor drei 1 cm 3 Tumoren für eine einzige EG-Isolation. Hier verwenden wir Brusttumoren als Demonstration, aber das Protokoll kann für andere Tumorarten modifiziert werden. </li><li> Desinfizieren Maus durch Sprühen oder mit reichlichen Menge von 75% v / v Ethanol Abwischen des Mausbauchseite. </li><li> Resezieren Tumoren mit einer Schere und Dissektoren unter aseptischen Bedingungen in eine sterile Haube oder an einer Sterilbank. <ol><li> Ausstrecken und die Glieder der Mäuse Stift auf einem Seziertisch Bord. Machen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt mit der Schere ohne Öffnen des Bauchfells. Lateral zerlegen zwischen der Haut und dem Bauchfell zu den Brustdrüsen, wo Tumore befinden.Das Bauchfell nicht öffnen. </li><li> Verbrauch nur Tumorgewebe von den Brustdrüsen, Weglassen normalen Brust Margen. Sorgfältig schneiden Sie Nicht-Tumor-Gewebe wie Haut und Muskeln, und legen Sie sezierten Tumoren in einem konischen Röhrchen mit 30 ml DMEM-LG auf Eis. </li></ol></li><li> Bringen Tumorproben zur Gewebekultur Kapuze; waschen Gewebe mit sterilem LG-DMEM 1-2 mal. </li><li> Transfer Tumoren von der konischen Röhrchen in einen sterilen Gewebekulturpetrischale, 2 ml DMEM-LG in der Schale, und Hackfleisch mit einem Paar von sterilen Schere in Stücke &lt;5 mm. </li><li> 5 ml Collagenase (stock = 2 mg / ml in Hanks Balanced Salt Solution, im Folgenden HBSS), 1 ml Dispase (stock = 2,5 U / ml in HBSS) und 75 &amp; mgr; l Desoxyribonuclease (lieferbar = 1 mg / ml in PBS ) in die Petrischale. Gesamtvolumen ist jetzt ~ 10 ml. </li><li> Übertragen Sie die Kollagenase / Gewebemischung aus der Petrischale mit einem gewebe Dissociator Rohr und auf einem Gewebe Dissociator für 60 Sekunden laufen zweimal (voreingestellt Dissoziation prOgram auf der Dissociator: 1270 Gesamt Schuss pro Lauf). Inkubieren mit leichten Schütteln auf einem Schüttler für 75 min bei 37 ° C. </li><li> Filter verdaute Gewebe durch ein 100 &amp; mgr; m Zellsieb über einem 50 ml konischen Röhrchen. Rinse-Filter mit 5 ml FACS-Puffer, um jegliche verbleibenden Zellen zu waschen. Spin bei 280 xg für 5 Minuten und der Überstand vorsichtig abzusaugen, ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Verdünnen Sie 1 ml der Stamm RBC Lysispuffer (10x) in 9 ml sterilem Wasser. Lyse der roten Blutzellen mit 10 ml Lyse-Puffer (1x) und unmittelbar Spin 5 min bei 280 x g. Hinweis: Dieser Schritt kann übersprungen, wenn wenig Blut sichtbar ist. </li><li> Resuspendiere in 10 ml FACS-Puffer. Mischen Sie 10 ul der Zellsuspension mit 10 ul Trypanblau, und zählen lebende Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Die Zellen bei ~ 10 7 Zellen / 100 ul. Zugabe von 10 &amp; mgr; l FcR-Block pro 100 ul Zellsuspension, und Inkubieren auf Eis für 10 min. </li><li> In Ratten-Anti-Maus-PE-konjugierten CD31 Antikörpers nach. Tabelle 1 auf Eis inkubieren 10-15 min und das Röhrchen klopfen, gelegentlich. </li><li> 10 ml FACS-Puffer auf das Rohr und Schleudern bei 280 × g für 5 min. Den Überstand vorsichtig abnehmen und waschen Sie das Zellpellet erneut mit 5 ml FACS-Puffer. Zentrifuge Zellen zu pelletieren. Überstand wird abgesaugt, ohne störende Zellpellet. </li><li> Hinzufügen FACS-Puffer und Anti-PE-Mikrokügelchen gemäß Tabelle 2 auf Eis inkubieren. 10 - 15 min. Flick Rohr gelegentlich. </li><li> 10 ml FACS-Puffer und Spin-Proben bei 280 × g für 5 min; sofort abwaschen mit 5 ml FACS-Puffer und Zentrifuge wieder. Überstand wird abgesaugt, ohne störende Pellet. </li><li> Das Volumen auf 300 ul in FACS-Puffer. Spin durch 35 &amp; mgr; m-Sieb Zell Röhrchen mit 5 min bei 280 x g. Benutzen Sie 2 Rohre und ein größeres Volumen, wenn nötig. </li><li> Einrichten Magnet mehrgerüstigen und magnetischen Spalten in Haube, fügen Sie eine Spalte mit dem Separator und ins Gleichgewicht der Säule mit 2 ml FACS-Puffer. </li><li> Aspirate des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 0,5 - 1 ml FACS-Puffer. </li><li> Übergeben Sie die Zellsuspension durch die äquilibriert magnetischen Spalte. </li><li> Dreimal mit 2 ml FACS-Puffer Die Säule, und sammeln Flow-Through (FT) in einem 15-ml-Tube (FT-Fraktion). </li><li> Nehmen Sie die Spalte aus dem Separator und Elution mit 2 ml FACS-Puffer in einen anderen 15 ml-Röhrchen (Eluatfraktion). Verwenden Sie Kolben, um sicherzustellen, alle Zellen aus der Säule. Wiederholung der Elution noch zwei Mal mit 2 ml FACS-Puffer jedesmal. </li><li> Spin des Eluats bei 280 × g für 5 min. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 10 ml EC Medien. </li><li> Ebenso teilen die Eluatfraktion (~ 6 ml) in 10 cm Gelatine beschichteten Schalen. Seit drei 1 cm 3 Tumoren, Platte eluiert Zellen in mindestens vier Platten. Alternativ Platte eluiert Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen in mehrere Platten (z. B. Saatgut, 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml und 3 ml des Eluates in vier Platten), um sicherzustellen, daß einet mindestens eine Platte ist dünn mit eluierten Zellen ausgesät. Prüfen, ob die Konfluenz der anhaftenden Zellen ist bei ~ 1% am nächsten Tag (dh ungefähr 1,0 bis 2,0 x 10 5 anhaftenden Zellen). Anmerkung: Die Zellen brauchen spärlich zu plattierenden sodass EC Kolonien können, ohne von anderen Zelltypen kontaminierten bilden. </li><li> Platte FT-Fraktion in einem 10 cm-Schale zu lassen Zellen zu gewinnen O / N. Überprüfen Sie, ob die Platte 80-100% konfluent am nächsten Tag. Frieren Sie die Zellen nach unten (-80 ° C) in 250 ul zellgefrierenden Medien in einem Kryoröhrchen und speichern sie in flüssigem Stickstoff am nächsten Tag. Anmerkung: FT-Fraktion kann zur Tumorzellisolierung zu einem späteren Zeitpunkt und / oder als Negativkontrolle für EC Genexpressionsanalyse der isolierten EC-Klone verwendet werden. </li><li> Ändern Medien alle 2 - 3 Tage. Kolonien beginnen, nach 7 bilden - 10 Tage. Kleine EG Kolonien können so früh wie Tag 3. Markieren Sie die Kolonien mit einer feinen Spitze-Markierung auf dem Boden der Schale identifiziert werden. </li><li> Abkratzen unspezifische cEllen rund um die identifizierten Kolonien mit einer sterilen 200 ul Pippet Spitze. </li></ol> 3. Colony Auswahl mit Cloning Ringe <ol><li> Ändern Medien alle 2 - 3 Tage. 7 Tage - EC Reinheit kann durch LDL (Dil-Ac-LDL) zusätzlich bei etwa 5 überprüft werden. In 50 ul LDL pro 10 ml EC-Medium und Inkubation für 3-4 h vor der Überprüfung der Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Hinweis: Mehrere LDL + EC-Klone konnten bei ~ Tag 7 beobachtet werden. </li><li> Beginnen Ernten EC Kolonien, wenn sie Durchmessern von 3 erreichen - 5 mm in der Größe. (Wählen Sie große Kolonien, die mit kleinen LDL + Zellen, die für beste Ergebnisse gepackt werden.) </li><li> Vor der Ernte EG mit Clonierungsringen, Vorstrich ein paar 6-Well-Platten mit 0,5% Gelatine. Saugen Sie Gelatine, 2 ml EC Medien in jede Vertiefung, und halten Sie die Platten in einen Inkubator, bis sie benötigt. </li><li> Abkratzen Nicht-EG an den Rändern der Kolonien, um sicherzustellen, dass keine anderen Zelltypen werden mit dem Klonen Ring eingefangen werden. </li><li> Mit einemPhasenkontrastmikroskop (4X oder 10X-Objektiv), Exposé mit einer feinen Spitze-Markierung auf dem Boden der Kulturschale die Bereiche mit EC Kolonien. </li><li> Waschen Sie die Platte mit 10 ml PBS und lassen Sie eine sehr dünne Schicht aus PBS in der Platte beim Ansaugen. (Wichtig: eine kleine Menge (~ 0,5 ml) PBS werden die Zellen während des Klonen-Ring-Verfahren am Leben zu erhalten; auch muss Gewebekleber Wasser zu binden.) </li><li> Wählen Sie eine Klonierung Ring entsprechender Größe. Verwenden Sie ein Paar Pinzette zu holen ein Ring, und mit einer 10 ul Pipettenspitze eine kleine Menge von Gewebekleber gleichmäßig auftragen auf das Klonen Ring. Hinweis: Verwenden Sie nur eine minimale Menge (~ 0,2 &amp; mgr; l für einen kleinen Ring) der Gewebekleber zum Klonen Ringe, und stellen Sie sicher, Gewebekleber wird gleichmäßig über die Bodenfläche verteilt, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. Übermäßige Gewebekleber erzeugt Wärme und bildet Filme, die Zellen zu töten kann. </li><li> Legen Sie das Klonen Ring über die EG-Kolonie. Drücken Sie vorsichtig das Klonen Ring um die ri klebenng auf die Platte. Stellen Sie sicher, dass die Kolonien werden nicht vor dem Kleben der Ring getrocknet. </li><li> Unmittelbar Pipettieren von 25 ul der enzymatischen Zellablösung Lösung in den Klonierungsvektor Ring und inkubiere ~ 1 min oder bis die Zellen sind lose befestigt. </li><li> Pipet-Zellen bei der Klonierung Ring tropfenweise in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit vorgewärmten EG Medien. (Wichtig: die Platte, um Zellen zu dispergieren, nicht schütteln; EG lieber in dichten Trauben wachsen.) Waschen Sie das Klonen Ring mit 50-100 ul EG Medien, um so viele Zellen wie möglich zu sammeln und übertragen alle Waschanlagen in den gleichen 6-Well- . </li><li> Wenn einige Kolonien in der 10 cm-Schale zu klein, um zu ernten, 10 ml frischem Medium, lassen die Kolonien wachsen für ein paar Tage, und wiederholen Sie den Klonen Ring Prozedur erneut. </li><li> Wachsen geernteten Kolonien in Platten mit 6 Vertiefungen bis 80 - 100% konfluent waren, und die Übertragungszellen zu 3 Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen, zuvor in einer 10 cm-Gewebekulturschale expandierenden ihnen. Abkratzen Verunreinigung Zellen. Wiederholeneine weitere Runde des Klonens Ringverfahren (Schritte von 3,5 bis 3,10), wenn nötig. Halten Zellen relativ konfluent (~ 60-70%) bei der Erweiterung. EG kann aufhören zu wachsen, wenn überzogen zu spärlich. </li><li> Charakterisieren EG durch FACS, Färbung, PCR usw. Beachten Sie, dass Dil-Ac-LDL ist fluoreszierend und können mit PE oder andere fluoreszierende Antikörper für FACS stören. </li></ol>

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-angiogenesis:+new+concept+for+therapy+of+solid+tumors.">Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors.</a> Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).</li><li>Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instructive+role+of+the+vascular+niche+in+promoting+tumour+growth+and+tissue+repair+by+angiocrine+factors.">Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).</li><li>Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+endothelial+cells+directly+influence+cancer+progression.">Stromal endothelial cells directly influence cancer progression.</a> Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).</li><li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells.">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li><li>Beck, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vascular+niche+and+a+VEGF-Nrp1+loop+regulate+the+initiation+and+stemness+of+skin+tumours.">A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours.</a> Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (1), a006429 (2012).</li><li>Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells.">Tumor endothelial cells.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (3), a006536-a006536 (2012).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+heterogeneity+of+tumor+endothelium.">Molecular heterogeneity of tumor endothelium.</a> Cell Tissue Res. 335 (1), 271-281 (2009).</li><li>Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+endothelial+cells+based+on+their+increased+uptake+of+acetylated-low+density+lipoprotein.">Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein.</a> J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).</li><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells.">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li><li>Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).</li><li>Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stable+molecular+signature+in+mammary+tumor+endothelial+cells+that+persists+in+vitro.">Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro.</a> Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).</li><li>Beijnum, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+tumor+angiogenesis+dissected:+specific+targeting+of+colon+cancer+angiogenic+vasculature.">Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature.</a> Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).</li><li>McDonald, D. M., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+angiogenesis:+from+microscope+to+clinic.">Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic.</a> Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).</li><li>Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+abnormalities+of+blood+vessels+as+targets+in+cancer.">Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer.</a> Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).</li><li>Ghosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+endothelial+cells+exhibit+aberrant+Rho-mediated+mechanosensing+and+abnormal+angiogenesis+in+vitro.">Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).</li><li>Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells+express+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+but+not+ErbB3+and+are+responsive+to+EGF+and+to+EGFR+kinase+inhibitors.">Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors.</a> Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).</li><li>Hida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+endothelial+cells+with+cytogenetic+abnormalities.">Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities.</a> Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).</li><li>Dudley, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcification+of+multipotent+prostate+tumor+endothelium.">Calcification of multipotent prostate tumor endothelium.</a> Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).</li><li>Dunleavey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+channels+formed+by+subpopulations+of+PECAM1(+)+melanoma+cells.">Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells.</a> Nat. Comm. 5, 5200 (2014).</li><li>St Croix, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+human+tumor+endothelium.">Genes expressed in human tumor endothelium.</a> Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).</li><li>Bhati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+human+breast+tumor+vascular+cells.">Molecular characterization of human breast tumor vascular cells.</a> Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).</li><li>Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+CYP24+in+the+tumor+microenvironment.">Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+endothelial+cells+in+culture.+Growth+and+DNA+synthesis.">Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis.</a> J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).</li><li>Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+vascular+bed+origin+influence+differences+in+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries.">Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).</li><li>Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+differences+between+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries+revealed+by+microarray+analysis.">In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).</li><li>Paruchuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pulmonary+valve+progenitor+cells+exhibit+endothelial/mesenchymal+plasticity+in+response+to+vascular+endothelial+growth+factor-A+and+transforming+growth+factor-beta2.">Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2.</a> Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li><li>Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -. H., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+endothelial+cells+with+osteogenic+differentiation+potential.">Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).</li><li>Ginsberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+direct+reprogramming+of+mature+amniotic+cells+into+endothelial+cells+by+ETS+factors+and+TGF&#946;+suppression.">Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGF&#946; suppression.</a> Cell. 151 (3), 559-575 (2012).</li><li>Sapino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD31+by+cells+of+extensive+ductal+in+situ+and+invasive+carcinomas+of+the+breast.">Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast.</a> J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).</li><li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations.">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li><li>Cooley, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling+mediates+endothelial-to-mesenchymal+transition+(EndMT)+during+vein+graft+remodeling.">TGF-&#946; signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling.</a> Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).</li><li>Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie1+deficiency+induces+endothelial-mesenchymal+transition.">Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition.</a> EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells+with+distinct+patterns+of+TGF&#946;-driven+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGF&#946;-driven endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li><li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone.">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+clonally+expanding+haematopoietic+compartment+in+bone+marrow.">Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow.</a> EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).</li><li>Sawamiphak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+regulates+VEGFR2+function+in+developmental+and+tumour+angiogenesis.">Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).</li><li>Chi, J. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+diversity+revealed+by+global+expression+profiling.">Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).</li><li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration.">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells.">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aufgrund der Schwierigkeiten bei der reinen Primär TEC Kulturen, viele in vitro-Studien Ersatz TEC mit handelsüblichen EC Linien oder primäre EC wie humane Nabelvenen-EC (HUVEC) 13. Jedoch können diese EG-Populationen aus normalen Geweben dienen nur als Proxy für TEC, die sich deutlich von ihren normalen Gegenstücken unterscheiden. Zum Beispiel sind TEC phänotypisch und funktionell abnormalen in vivo und einige dieser Anomalien können tragbare in vitro 14-18 sein. TEC haben anomale Wachstum, wandernd, und Differenzierung Fähigkeiten und kann mit CD31 + Tumorzellen verschmelzen, um gefäßähnlichen Strukturen 16,19,20 bilden. Studien unter Verwendung von entweder kultiviert TEC oder Laser Capture Mikro seziert Tumorgefäße haben ergeben, dass TEC weichen von normalen EC in der Genexpression, zytogenetische und epigenetische Profile 12,18,21-23 demonstriert. Trotz vertiefen unser Verständnis der Tumor-Angiogenese in den letztenJahrzehnten sehr wenige funktionale und mechanistische Studien mit kultivierten primären TEC zur Verfügung. EG wurden aus menschlichen Nabelvenen in den frühen 1970er Jahren 24 isoliert. Anschließende Isolierung und Kultivierung von mikrovaskulären EC von anderen Menschen und der Maus Gewebe hat ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von endothelialen Funktionen sowohl in Gesundheit und Krankheit 25 bis 28 vorgesehen. Die meisten EG-Isolierung-Protokolle beinhalten drei wichtige Schritte: Erhalten einer Einzelzellsuspension nach mechanischer Dissoziation oder enzymatische Verdauung, Etikettierung EG mit einem Endothel-spezifischer Antikörper, die entweder an ein Fluorophor oder magnetischen Mikrokügelchen konjugiert ist, und Bereicherung der EG-Bevölkerung mit Zellsortierung oder Magnetspalten. Jedoch Isolierung von Maus-EC, insbesondere von Tumoren, hat sich als schwierig aufgrund der geringen Ausbeute an lebensfähigen EC und häufige Verunreinigung anderer Zelltypen, einschließlich Tumorzellen und Fibroblasten nachgewiesen. Darüber hinaus in vitro phänotypische Drift der EG in michsenchymal ähnlichen Zellen (Endothelzellen-to-mesenchymale Transition, EndMT) eine weitere Herausforderung für die Langzeitkultivierung von EG von normalen Geweben, Tumoren und umprogrammiert Vorstufen. Die größte Herausforderung bei der TEC Isolation Kontamination durch Tumorzellen, die sich leicht verdrängen können die langsamer wachsenden EG Kolonien, die in der Regel angezeigt, nachdem ~ 7-10 Tagen in Kultur. Darüber hinaus ist eine häufig verwendete Selektionsmarker zum Isolieren EG CD31 die reichlich im Endothel exprimiert wird, sondern markiert hämatopoetischen Zellen und in einigen Fällen Tumorzellpopulationen 20,30. Darüber hinaus, während bereichernd für EC, CD31-vermittelten immunomagnetische Spaltenauswahl kann nicht jede einzelne verunreinigende Zellen, die schließlich über EC-Kulturen nach ein paar Durchgänge erfolgen zu entfernen. Durch das Hinzufügen einer Klonen-Ring Schritt ist man in der Lage zu wählen und zu erweitern reinen klonal abgeleitete EG-Populationen, die frei von diesen verunreinigenden Zelltypen sind. Eine zweite Herausforderung ist die langfristige HauptWartung von reinem EG ohne Förderung EndMT. EndMT tritt während der Entwicklung, während vaskuläre Dysfunktion rekapituliert werden, und ist üblich in kultivierten EC (insbesondere in Gegenwart von TGFß) 31-33. Zur Minimierung EndMT, entfernen kontaminierenden Zellen, die als Quelle TGFß tätig werden kann, halten Kulturen bei hohen Dichten und pflegen hohe Konzentrationen von bFGF in den Medien zu allen Zeiten. Wie wir kürzlich gezeigt, ist bFGF wichtig, EC-Spezifikation zu erhalten, wie es TGFß gesteuerte Ausdruck Glattmuskelaktin (ein EndMT Marker) 34 entgegenwirkt. Unter Verwendung dieser Methodik Isolierung von EG von einem &quot;Schicksals-mapped&quot; Reporter Mäusen wurde ebenfalls gezeigt. Diese Mäuse sind besonders nützlich bei Studien, in denen intravital Bildgebung benötigt wird 35. Obwohl einige Etikettierung von blutbildenden Zellen können in der CDH5 cre auftreten: ZsGreen l / s / l Mäusen hier verwendet wird, bietet dieses Modell eine relativ schnelle und einfache Methode zur Erzeugung von Grippeorescent EG in vivo. Ein alternatives EC-Linie-Kennzeichnung Modell ist eine Tamoxifen-induzierbare Maus (CDH5 cre / ERT2) gekreuzt mit einer floxed Reporter Mausstamm (ZsGreen l / s / l), die EG treu haben werden und irreversibel markiert 36,37 . Fluorescent EG von den induzierbaren Cre Mäuse können auch unter Verwendung von FACS oder die Verwendung der Methodik die wir hier beschreiben, gereinigt werden. EG sind heterogen in verschiedenen Gefäßbetten und &quot;intra-Schiffes&quot; Heterogenität kann auch unter den EG im gleichen Gefäß 38,39 existieren. Darüber hinaus hat eine Hierarchie von EC mit unterschiedlichen Proliferationspotential im EC-Populationen aus Venen isoliert beobachtet worden, und ein geringer Anteil der klonalen EC können passagiert werden über 40 Populationsverdopplungen 40. Daher Einschränkungen des hier beschriebenen Verfahrens sind: 1) eine mögliche Auswahl dieser hochproliferative EG die sich in der Behälterwand; und 2) die Anreicherung von nur einem specific Gefäß Subtyp von Arterien, Venen oder Kapillaren abgeleitet, die Klone, die nicht den gesamten EG-Bevölkerung in vivo vollständig darstellen zu produzieren kann. Dennoch, wie mehrere klonale Subpopulationen von einem Isolierungsverfahren erhalten werden, kann dieses Verfahren nützlich für die funktionelle und genetischen Analysen EC Heterogenität, die in Tumoren und anderen Geweben 12 existiert. Zusammengenommen hier beschrieben wird, ist eine EG-Isolationsverfahren, das reine EG Kolonien frei von verunreinigenden Nicht-EG-produziert. Die isolierten Zellen sollten nützlich für die in vitro funktionelle Studien, genomweite Expressionsprofilen und molekulare Charakterisierung von neuen Wegen, die Tumor-Angiogenese kontrollieren.

Endothelzellen (EC) sind bei der Entwicklung von soliden Tumoren essentiell. Von Einleitung der Angiogenese-Schalter in ruhenden Tumoren zu Verbreitung und Aussaat von Metastasen an entfernten Stellen, EG bilden die Leitungen, die Blut, Sauerstoff bereitzustellen und Nährstoffe, um das Tumorwachstum 1 aufrecht zu erhalten. Wie vor kurzem vorgeschlagen, EC auch Perfusions-unabhängige Funktionen und bilden eine Nische, die das Wachstum von Krebs-Stammzellen und anderen Tumor Stromazellen 2-5 unterstützt. So hochgereinigte Tumor-spezifischen EG (TEC) für die in-vitro-Kultur ermöglicht Routine funktionelle Studien, die Licht auf neuartigen molekularen Mechanismen der Vermittlung der Tumorangiogenese und Übersprechen mit Tumorzellen zu vergießen wird. EC sind hochspezialisierte Abhängigkeit von dem Ursprungsgewebe 6. Aufgrund der Heterogenität der verschiedenen Tumorarten und der Tumor-Mikroumgebung kann TEC auch einzigartige Funktionen, die eine tumorspezifische Spezialisierung o widerspiegeln anzeigenf das Gefäßsystem. Zum Beispiel gibt es auffallende Variabilität der Genexpressions in TEC aus unterschiedlichen Typen oder Qualitäten von Tumoren 7,8 isoliert. Allerdings können häufige Co-Reinigung von Nicht-EG, insbesondere Tumor-assoziierten Fibroblasten und Tumorzellen, mit TEC verwechseln genomweite Expressionsanalysen. Diese unerwünschten Zelltypen sind besonders problematisch, in Studien, die auf langfristigen in vitro Expansion des TEC Kulturen verlassen. Hier beschrieben wird ein High-Fidelity-Verfahren, die durchweg reine EG Kulturen von Tumoren und anderen Geweben produziert. Nach immunomagnetische Spalte Bereicherung der EG-Fraktionen und Entfernen von co-gereinigten Nicht-EG, um eine zusätzliche Klonen-Ring Schritt reine EG Kolonien verwendet 9 zu erfassen. Jede Kolonie in Kultur für mehrere Passagen, ohne die Entstehung von gefährdend Nicht-EG erweitert werden. Dieses Verfahren ergibt ebenfalls mehrere EC-Klone aus einer einzelnen Isolierungsverfahren, die ideal für die Untersuchung von Endothelial Heterogenität. Darüber hinaus wird gezeigt, dass CDH5 cre: ZsGreen l / s / l-Reporter-Mäuse sind ein wertvolles Werkzeug zur Erzeugung von &quot;Schicksal-mapped&quot; lesbar und dauerhaft markierte EC, die ZsGreen Fluoreszenz in Kultur 10 aufrecht zu erhalten. Mit geringfügigen Anpassungen des Protokoll sollte dieses Verfahren an verschiedene Tumortypen oder normalen Geweben sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 Bullet Kit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td>Not all components used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (Hyclone)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated at 56&#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu-Serum IV</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-51004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 &#956;m filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% v/v ethanol for disinfection</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing media (Bambanker)</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>302-14681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002004</td>
			<td>Make stock concentration 1 mg/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil-Ac-LDL</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>46-034-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymatic cell detachment solution (Accutase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393-100ML</td>
			<td>Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FcR Blocking Reagent&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral protease (Dispase)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS02104</td>
			<td>Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-rat anti-mouse CD31 antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4 %&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes (sterile)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes (sterile)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes)&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separator&#160; (MidiMACS)</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 100 &#956;m&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning rings (assorted sizes)</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>378470000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting board</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps and scissors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterilize before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting pins 2&#34;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterilize before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes with 35 &#956;m filter cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cup (Stericup, 0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip marker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive (Vetbond)</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociator (gentleMACS)</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Preset program &#34;m_impTumor_01&#34; used for tissue dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen freezer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate or rotary shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast light microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells

Frisch isolierte Tumor-spezifische Endothelzellen (TEC) kann zur molekularen Mechanismen der Tumorangiogenese zu erforschen und dienen als ein in vitro-Modell für die Entwicklung neuer Inhibitoren der Angiogenese bei Krebs ist. Jedoch ist die langfristige in-vitro-Expansion von murinen Endothelzellen (EC) herausfordernde aufgrund phänotypischer Drift in Kultur (endothelial-to-mesenchymale Transition) und Verunreinigungen mit Nicht-EC. Dies gilt insbesondere für die TEC die leicht durch co-gereinigte Fibroblasten oder Tumorzellen in Kultur outcompeted werden. Hier wird ein High-Fidelity-Isolierungsverfahren, die die Vorteile der Anreicherung immun gepaart mit Kolonie-Auswahl und in vitro Expansion dauert beschrieben. Dieser Ansatz erzeugt reine EG Fraktionen, die völlig frei von verunreinigenden Stromazellen oder Tumorzellen sind. Es wird auch gezeigt, dass die linien zurückzuführen CDH5 cre: ZsGreen l / s / l Reportermäusen, mit dem Protokoll, beschrieben, sind ein wertvolles Werkzeug, um Zell verifizierenReinheit der isolierten EG Kolonien aus diesen Mäusen zeigen, langlebige und brillante ZsGreen Fluoreszenz in Kultur.

EC stellen nur geringfügige einen Bruchteil der gesamten Zellpopulation in den meisten Geweben von Erwachsenen 11. Es ist daher wichtig, vollständig zu verdauen, die geerntete Gewebe in eine Einzelzellsuspension, die die maximale Freisetzung von EC von extrazellulärer Matrix (ECM) und Bindegewebe gewährleistet. Nach unserer Erfahrung bietet CD31-vermittelte immunomagnetische Auswahl nur angereicherten aber nicht reine EG Fraktionen; Daher ist ein weiterer entscheidender Schritt, die physische Entfernung von co-gereinigten Nicht-EG und Auswahl / Ausbau der EG-Kolonien unter Verwendung Clonierungsringen (Abbildung 1). So wurden beispielsweise bei der CD31-angereicherten EG ohne weitere Kolonieselektion, Nicht-EG rasch vermehrt und vermischt mit EC, Herstellung unreine EG Kulturen wie von Dil-Ac-LDL + und DiI-AC-LDL zeigte vernickelt - Populationen (2A) . Wenn jedoch Säuleneluate wurden bei niedriger Dichte plattiert, wuchsen die EG-Kolonien mit relativ wenigen umgebenden Nicht-EG, die von sc entfernt wurden,Vergewaltigung mit einer Pipettenspitze (2B). Das Wachstum und die Reinheit der expandierte Kolonien können weiter durch Zugabe von Dil-Ac-LDL überwacht werden. Kleine EG Kolonien können bei ~ Tag sieben nach der CD31-vermittelten Anreicherung in der Säule (2B, oberen Platten) zu beachten. Nach der Auswahl und den Ausbau der EG-Kolonien, Dil-Ac-LDL - Zellen werden eliminiert und die Zellpopulation ist hochrein für Dil-Ac-LDL + EG, geändert durch Dil-Ac-LDL-Aufnahme (2B, Bodenplatten) angezeigt. Um zu testen, ob der Isolationsmethode können konsistente Ergebnisse, mehrere Klone von beiden Brusttumoren aus C3-Tag reseziert abgeleitet sind (FVB / N C3 1 -Tag) Mäusen oder normalen Brustdrüsen von altersangepassten Wildtyp-FVB-Mäusen wurden isoliert und expandiert 12. Die Reinheit jeder TEC und normale EG (NEC) Bevölkerung wurde dann vorsichtig gekennzeichnet, um die Reinheit zu gewährleisten. Durchflusszytometrie Analysen von drei unabhängigen Proben zeigte einen einzigen, uniformed CD31 + Population, die sich von IgG Isotypkontrollen (3A) war. Die mRNA-Expression von EC Markern, einschließlich CD31, CDH5 (VE-Cadherin), CD133 und VEGFR2 in allen vier EC getesteten Klone betrug ca. 200 bis 7000 mal höher als die von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF), die als negative Kontrolle verwendet wurde, (3B). Wie erwartet, ausgedrückt alle EG-Klone im Vergleich zu MEFs fast nicht nachweisbare Mengen der mesenchymalen Marker-Gene COL1A1 und Tagln. Immunfluoreszenzfärbung zeigte, daß alle Zellen in einer repräsentativen TEC Klon wurden gleichmßig CD31 + (3C). Außerdem waren diese EC-Klone in der Lage, spontane gefäßartige Strukturen in vitro zu bilden, was sie Endothelfunktionen nach Kultivierung (3D) zu halten. Die Isolierungsverfahren wurde weiter validiert mit CDH5 cre: ZsGreen <sup&gt; l / s / l Mäusen, wo alle EG sind unauslöschlich mit dem grün fluoreszierenden Protein markiert, ZsGreen (4A, a). Lungengewebe, die reichlich EC enthält als Proof-of-Prinzip für die Isolationsprozedur (4A, B) verwendet wird. ZsGreen + Zellen besteht ~ 30% der Gesamtzellpopulation im Lungenhomogenat, und wurden teilweise nach CD31-vermittelte immunSpaltenAuswahl (4B) angereichert. Als CDH5 cre: ZsGreen l / s / l-Mäuse tragen eine konstitutive Cre-Gen, sind ein Teil der hämatopoetischen Zellen auch mit ZsGreen 10 gekennzeichnet. Somit kann der tatsächliche Prozentsatz EC in den Lungen niedriger als die beobachtete ~ 30% betragen. Insbesondere etwa 20% der Zellen co-isoliert mit ZsGreen + / CD31 + EC waren ZsGreen - (4B). Da Verschmutzung durch diese Nicht-EG kann in Kultur weiterhin bestehen, ist nicht geeignet für Studien der angereicherten EG Bevölkerung in dieser Phase, dasserfordern weitere in-vitro-Zellkultur. Doch nach dem Auftragen Clonierungsringen zu reinem EG-Kolonien zu erfassen, ein 100% reines ZsGreen + Bevölkerung wurde erhalten, der in der Kultur (4C und 4D) weiter ausgebaut werden konnte. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53072/53072fig1.jpg" /> Abbildung 1. Flussdiagramm und Übersicht der EG-Isolierungsverfahren. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53072/53072fig2.jpg" /> Abbildung 2. Dil-Ac-LDL Unterscheidet EG verunreinigen Nicht-EG in lebenden Kulturen. (A) Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder, die EG und Co-isoliert Nicht-EG ohne Klonen-Ring Auswahl der EG Kolonien. (B) Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder von EC-Kolonien in den verschiedenen Phasen der Isolation. Gestrichelten Linien markieren die boundaries von Dil-Ac-LDL + EG und die umliegenden kontaminierenden Zellen. Weiß Pfeilspitzen zeigen Nicht-EG außerhalb eines EG-Kolonie, die mit einer Pipettenspitze entfernt werden sollte. Maßstabsbalken entsprechen 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53072/53072fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53072/53072fig3.jpg" /> Abbildung 3. Klonierung Ringe und physikalische Entfernung von Nicht-EG produzieren pure und funktionelle Langzeit EG Kulturen. (A) Repräsentative FACS Dot-Plots von CD31-Färbung von verschiedenen EG-Klone. Drei repräsentative Proben gezeigt. Die offene schwarze Rechteck in jeder Parzelle skizziert die CD31 + Population. Ein IgG-Isotyp als negative Kontrolle verwendet. (B) Messung der endothelialen Genexpression in ausgewählten NEC und TEC-Klone. Die mRNA-Niveaus von Endothelial Gene CD31, CD133, CDH5 und VEGFR2 sind relativ zu denen der embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) exprimiert und die mRNA-Spiegel von mesenchymalen Gene COL1A1 und Tagln sind relativ zu denen der NEC-1 ausgedrückt. (C) Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung eines erweiterten TEC-Klon. CD31 wird grün dargestellt und Kerne mit 4&#39;6&#39;-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Blau gefärbt. (D) Repräsentative Bilder der Röhrenbildung durch verschiedene EG-Klone auf Matrigel beschichtet. Maßstabsbalken entsprechen 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53072/53072fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53072/53072fig4.jpg" /> Abbildung 4. EG Isoliert von CDH5 cre: ZsGreen <strong&gt; l / s / l Mäusen Pflegen Brilliant ZsGreen Fluoreszenz in Kultur (A) die Endothelzellen-Linie Tracing Maus CDH5 cre:. ZsGreen l / s / l trägt eine floxed ZsGreen Transgen, das durch CDH5 induzierte CRE vom EG zum Ausdruck gebracht. (a) Lungengewebe von der CDH5 cre: ZsGreen l / s / l-Mäuse wurden geerntet und zur EC Isolierung verdaut. (b) Repräsentative Bilder der CDH5 cre: ZsGreen l / s / l Maus Lungengewebe. ZsGreen (grün) markiert das Endothel und Zellkerne sind mit DAPI (blau) gefärbt. (B) FACS-Dot-Blots zeigt den prozentualen Anteil der ZsGreen + Zellen vor (Mitte) und nach (rechts) der CD31-vermittelten Anreicherung in der Säule aus der homogenisierten Lungengewebe eines CDH5 cre: ZsGreen l / s / l Maus. Ungefärbt Wildtyp (WT) Lungenhomogenat (links) wurde als Negativkontrolle für Gating verwendet. Die große offene Rechtecke zeigen ZsGreen - Zells und die kleine offene Rechtecke zeigen Zellen doppelt positiv für ZsGreen (FL1-H-Kanal) und CD31 (FL2-H-Kanal). (C) FACS-Histogramm zeigt, dass ZsGreen + EG (grüne Spitze) bleiben 100% reinem nach in vitro-Kultivierung. Ein ZsGreen - EC Bevölkerung wurde als Negativkontrolle (graue Spitze) verwendet. (D) Repräsentative Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder einer Frühphase ZsGreen + EC Kolonie und eine erweiterte ZsGreen + EC Kolonie. Maßstabsbalken entspricht 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53072/53072fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td class="xl63"> Handynummer </td><td class="xl64"> FACS-Puffer (ul) </td><td class="xl64"> CD31-PE-Antikörper (ul) </td></tr><tr><td class="xl65"> 1 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 100 </td><td class = &quot;xl66&quot;&gt; 5 </td></tr><tr><td class="xl65"> 2 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 200 </td><td class="xl66"> 6 </td></tr><tr><td class="xl65"> 3 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 300 </td><td class="xl66"> 7 </td></tr><tr><td class="xl65"> 4 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 400 </td><td class="xl66"> 8 </td></tr><tr><td class="xl65"> 5 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 500 </td><td class="xl66"> 9 </td></tr><tr><td class="xl65"> 6 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 600 </td><td class="xl66"> 10 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 PE-konjugiertem Anti-CD31-Antikörper-Volumes für verschiedene Zellzahlen benötigt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td class="xl63"> Handynummer </td><td class="xl64"> FACS-Puffer (ul) </td><td class="xl64"> Anti-PE magnetischen Mikrokügelchen (ul) </td></tr> &lt;tr&gt; <td class="xl65"> 1 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 80 </td><td class="xl66"> 20 </td></tr><tr><td class="xl65"> 2 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 160 </td><td class="xl66"> 40 </td></tr><tr><td class="xl65"> 3 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 240 </td><td class="xl66"> 60 </td></tr><tr><td class="xl65"> 4 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 320 </td><td class="xl66"> 80 </td></tr><tr><td class="xl65"> 5 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 400 </td><td class="xl66"> 100 </td></tr><tr><td class="xl65"> 6 x 10 &amp; sup7; </td><td class="xl66"> 480 </td><td class="xl66"> 120 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Anti-PE Microbead Volumes für verschiedene Zellzahlen benötigt.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

isolation-and-culture-expansion-of-tumor-specific-endothelial-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K Aufrufe.  University of North Carolina at Chapel Hill. We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models. 

Serie: Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Forschung

Medizin

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Isolierung und Kultur von primären Endothelzellen von Canine Arterien und der

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. The origin, classification and characterization of EPCs are complex; notwithstanding, two prominent sub-types of EPCs have been established: so-called &#34;early&#34; EPCs (subsequently referred to as early-EPCs) and late-outgrowth EPCs (late-EPCs). They can be classified by biological properties as well as by their appearance during in vitro culture. While &#34;early&#34; EPCs appear in less than a week after culture of peripheral blood-derived mononuclear cells in EC-specific media, late-outgrowth EPCs can be found after 2-3 weeks. Late-outgrowth EPCs have been recognized to be directly involved in neovascularization, mainly through their ability to differentiate into mature endothelial cells, whereas &#34;early&#34; EPCs express various angiogenic factors as endogenous cargo to promote angiogenesis in a paracrine manner. During myocardial ischemia/reperfusion (I/R), various factors control the homing of EPCs to regions of blood vessel formation.
Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a chemokine-like pro-inflammatory and ubiquitously expressed cytokine and was recently described to function as key regulator of EPCs migration at physiological concentrations1. Interestingly, MIF is stored in intracellular pools and can rapidly be released into the blood stream after several stimuli (e.g. myocardial infarction). 
This protocol describes a method for the reliable isolation and culture of early-EPCs from adult human peripheral blood based on CD34-positive selection with subsequent culture in medium containing endothelial growth factors on fibronectin-coated plates for use in in vitro migration assays against serum samples of cardiac surgical patients. Furthermore, the migratory influence of MIF on chemotaxis of EPCs compared to other well-known angiogenesis-stimulating cytokines is demonstrated.

Endothelial progenitor cells (EPCs) are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. This method describes the isolation of human EPCs from peripheral blood, as well as the identification of their migratory potential against serum samples of cardiac surgical patients.

Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen von gesunden Freiwilligen und ihre Migratory Potential Beeinflusst von Serumproben nach einer Herzoperation

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite of these eccentric hamstring actions are concentric quadriceps actions, where the larger and likely stronger quadriceps straighten the knee. Therefore, to stabilize the lower limbs during movement, the hamstrings must eccentrically combat against the strong knee-straightening torque of the quadriceps. As such, eccentric hamstring strength expressed relative to concentric quadricep strength is commonly referred to as the &#34;functional ratio&#34; as most movements in sports require simultaneous concentric knee extension and eccentric knee flexion. To increase the strength, resiliency, and functional performance of the hamstrings, it is necessary to test and train the hamstrings at different eccentric speeds. The main purpose of this work is to provide instructions for measuring and interpreting eccentric hamstring strength. Techniques for measuring the functional ratio using isokinetic dynamometry are provided and sample data will be compared. Additionally, we briefly describe how to address hamstring strength deficiencies or unilateral strength differences using exercises that specifically focus on increasing eccentric hamstring strength.

The hamstrings are a group of muscles that are sometimes problematic for athletes, resulting in soft tissue injury in the lower limbs. To prevent such injuries, functional training of the hamstrings requires intensive eccentric contractions. Additionally, hamstring function should be tested in relation to quadricep function at different contraction speeds.

Muskel-Ungleichgewichte: Testen und trainieren funktionale exzentrische Muskelfaserriss Stärke in Athletic Populationen

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...