Diese Arbeit wird durch NIH R01 GM47607, CA163296 und NSF 1.334.493 um CET unterstützt. Wir danken Mitglieder der Turner-Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Alle in diesem Bericht angegebenen Daten wurden durch die Erlaubnis von Wormer et al. 2014 11 wiedergegeben.

1. Herstellung von Durotaxis Chambers <ol><li> Einem 6-Loch-Gewebekulturplatte herzustellen, tarieren Sie die Waage mit einem 50-ml konischen Röhrchen. Man wiegt etwa 10 g des PDMS-Grundlösung in der 50-ml-Tube (die Lösung ist ziemlich viskos). </li><li> Für ein 90: 1 Substrat (Einhaltung von ~ 1 kPa), unterteilen das gemessene Gewicht des PDMS-Grundlösung in der Röhre um 90, um die richtige Menge an Vernetzer-Lösung benötigt bestimmen. Die berechnete Menge des PDMS-Vernetzer-Lösung auf die gleiche Röhre. Beispiel: 10 g / 90 = 0,11 g. In 0,11 g des PDMS-Vernetzer-Lösung auf den PDMS-Basislösung. HINWEIS: Die Basis und Vernetzungslösungen werden sowohl in der PDMS-Kit zur Verfügung gestellt. </li><li> Kräftig mischen die PDMS-base / Vernetzer-Mischung für 5 min bei RT mit einem kleinen Spachtel. In diesem Stadium wird die Mischung einer großen Anzahl von Luftblasen enthält. </li><li> Zentrifugieren Sie die PDMS-Substrat in einer Tischzentrifuge 5 min bei 50 × g bei RT, die bub entfernenbles. Wenn es noch Blasen nach 5 min, Zentrifuge erneut. </li><li> Pipette 1 ml 90: 1 PDMS Substrat in jede Vertiefung der Gewebekultur behandelten Platte mit 6 Vertiefungen. Eventuell verbleibende Luft in den PDMS vorhanden Blasen können in dieser Phase durch knallen sie mit einer 21 G-Nadel beseitigt werden. Ermöglichen, dass die PDMS für 30 min in der gut verteilen. </li><li> Boil 12 mm Glas # 1 Deckgläser in destilliertem Wasser für 5 min. Wiederholen Sie zweimal, und speichern Sie die Deckgläser in destilliertem Wasser. </li><li> Legen Sie ein, getrocknet Deckglas in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte durch leichtes Berühren einer Seite des Deckglases in die PDMS-Lösung fallen dann das Deckglas auf die PDMS. Als das Deckglas gelegt hat, wird die PDMS beginnen, um die Kanten des Deckglases über eingreifen, aber nicht vollständig abdecken. Dies wird eine Schnittstelle zwischen den PDMS und Glas nach dem Härten erzeugen (siehe 1A, B). </li><li> Die Platte bei 70 ° C in einem Ofen für 16 Stunden, um zu heilen (verhärten) die PDMS. Setzen Sie den plate in einer Zellkultur Kapuze und UV Sterilisation für 10 Minuten. HINWEIS: Am besten ist es, um die Platten innerhalb von ein paar Tagen der Anwendung zu machen. Jedoch können die Platten in Parafilm ohne Puffer eingewickelt und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen ohne nennenswerten Qualitätsminderung gelagert werden. </li></ol> 2. Zell Plating HINWEIS: Wenn die Untersuchung der Wirkung von siRNA-vermittelten Knockdown, führen Sie die Zuschlags mit den Anweisungen des Herstellers oder des optimierten Protokoll für den Zelltyp der Wahl. <ol><li> Mantel jeweils durotaxis Kammer mit 1 ml von 10 ug / ml Fibronektin in PBS ohne Calcium und Magnesium für 1 h bei 37 ° C. Alternativ kann das Fibronektin kann den Tag vor der Analyse durch Inkubation der PDMS mit 10 ug / ml Fibronektin in PBS für 16 Stunden bei 4 ° C angewendet werden. Sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche der Fibronektin in PBS-Lösung eingetaucht. </li><li> Bereiten hitzedenaturierte 1% BSA. Wiege 0,5 g BSA und löst ihn in 50 ml PBS.Filter sterilisiert die Lösung durch ein 0,22 um Filter und Hitze bei 80 ° C für 12 min. Hinweis: Diese Lösung ist der Tag vor dem Beschichten und bei 4 ° C Zelle. </li><li> Saugen Sie das Fibronektin-Lösung und wäscht 3 mal mit PBS. 1 ml der hitzedenaturierten BSA in PBS in jede Vertiefung und Inkubation für 30 min bei RT. </li><li> Trypsinize und zählen Zellen der Wahl, während die durotaxis Kammern sind mit der Hitze denaturiert BSA blockiert. </li><li> Platte 1 x 10 5 Zellen in einem Volumen von 2 ml in jede Vertiefung der durotaxis Kammer mit dem für den jeweiligen Zelltyp der Wahl erforderlichen Medien. Damit sich die Zellen anhaften und verteilt auf dem Substrat für 4 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5% CO 2. HINWEIS: U2OS-Zellen werden routinemäßig in DMEM mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 10 IU / ml Penicillin, 10 ug / ml Streptomycin ergänzt. HINWEIS: Die Zellzahl in diesem Beispiel verwendet wird, für eine optimierteU2OS-Zellen. Optimierung für andere Zelltypen erforderlich sein können. Diese Dichte verleiht den Zellen genügend Platz, um ohne signifikante Wechselwirkungen mit anderen Zellen wandern. </li></ol> 3. Bildgebung lebender Zellen <ol><li> Führen Sie Live Cell Imaging auf einem inversen Mikroskop mit Phasenkontrast mit einer 10X-Objektiv. Das Mikroskop ist mit einem geschlossenen ökologischen, feuchten Kammer eingebaut werden und ermöglicht die Steuerung der Temperatur bei 37 ° C und 5% CO 2 während einer Langzeitbildgebung. </li><li> Nachdem die Zellen für ca. 3,5 Stunden verteilt, montieren Sie die Platte in das Mikroskop Kammer. Die Probe (n) in die Kammer für 30 Minuten äquilibrieren. </li><li> Up automatisierte Multi-Point-Besuch auf dem Mikroskop falls vorhanden eingestellt. Konzentrieren Sie sich auf der Schnittstelle zwischen den 90: 1 PDMS und dem Deckglas, und wählen Sie Punkte für Bild in der ganzen Oberfläche mit durchschnittlich 40 Punkte pro durotaxis Kammer. Bild die Zellen alle 10 min bis zu 16 h. HINWEIS: Die WiederRegion von Interesse wird als zwei Zeilen angezeigt wird, mit der Außenleitung, die dem Rand des Deckglases und der Innenleitung entsprechend der tatsächlichen Grenzfläche zwischen den PDMS und dem Deckglas. Siehe Abbildung 1B. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Erzeugen Sie eine Tabelle wie in Tabelle 1. </li><li> Zählen die Anzahl der Durchgangsereignisse aus den PDMS auf der Glasoberfläche und umgekehrt von jedem Film erzeugt. Notieren Sie die Anzahl der Durchgangsereignisse in der entsprechenden Spalte in der Excel-Tabelle. HINWEIS: Ein Durchgangsereignis wird als der Zellkern, der über die Grenze zwischen dem PDMS und Glas in jede Richtung definiert. </li><li> Um mehrere Übergänge zu quantifizieren, zu zählen, wie oft die Zelle überquerte die Schnittstelle. Diese Nummer in dem Excel-Spalte entsprechend dem Substrat, auf dem die Zelle an dem Ende des Films angeordnet sind, aufgenommen werden. Wiederholen Sie die Analyse für jede Zelle, die die Schnittstelle in t durchquerter Film. Zellen, die während der Bilderzeugung aus dem Sichtfeld zu migrieren auszuschließen. Anmerkung: Es ist auch wichtig, um zu verifizieren, die durch Zellzählung zu Beginn des Experiments, dass die Zellen der Lage sind, auch für die fibronektinbeschichtete PDMS und Deckglas Oberflächen haften. </li><li> Wird der Prozentsatz an Zellen, die aus PDMS auf der Glasoberfläche (dh unterzog durotaxis) migriert. Hinzufügen der Anzahl der Durchgangsereignisse von weich bis hart und den mehreren Durchgangsereignisse, die auf harte und Dividieren durch die Gesamtzahl der Durchgangsereignisse beendet. </li><li> Berechnung des Prozentsatzes der mehrfachen Durchgänge durch Teilen der Anzahl von Mehrfachdurchgängen durch die Gesamtzahl von Übergängen. </li></ol>

<ol>
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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+focal+adhesion+assembly:+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates.">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hitchhiker&#8217;s+guide+to+mechanobiology.">A hitchhiker&#8217;s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li><li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+ion+channels:+molecules+of+mechanotransduction.">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li><li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec15,+a+component+of+the+exocyst,+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors.">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li></ol>

The authors have no conflicts to disclose.

Hier beschreiben wir eine einfache Test um durotaxis in migrierenden Zellen zu studieren. Eine große Stärke dieses Tests ist die Leichtigkeit der Herstellung der durotaxis Kammern mit PDMS. Die Steifigkeit der Substrate können leicht durch Ändern des Verhältnisses der PDMS-Basislösung zu Vernetzer, das Studium der verschiedenen Steifigkeiten im Assay ermöglicht manipuliert werden. Allerdings ist eine potenzielle Beschränkung des Systems, dass die Zellen nur auf eine einzige Änderung in der Steifigkeit Substrat ausgesetzt, im Gegensatz zu erleben eine Steifigkeit Gradienten, die durch ausgefeiltere Systeme 4 vorgesehen ist. Wichtig ist, dass im Gegensatz zu Polyacrylamid-Substrate sind die ECM-Komponenten müssen nicht chemisch vernetzt sein, um PDMS ist. Tatsächlich ist die Fibronectinbeschichtung ungefähr äquivalent sowohl auf dem PDMS und den Glasoberflächen, wie durch Anfärben mit einem für Fibronektin 11-Antikörper bestimmt. Da frühere Studien haben gezeigt, dass Zellen verhalten sich gleich auf beiden PDMS oder Polyacrylamid Substraten die Verwendung of PDMS Substraten bietet eine viel einfachere Modell, mit dem Mechanotransduktion in Zellen 10,12 studieren. Der wichtigste Schritt in der Herstellung der PDMS Substraten ist es, sicherzustellen, dass die Basis und die Vernetzungsmittel-Lösungen werden gründlich gemischt. Wenn sie nicht gut genug vermischt, dann werden die Substrate nicht vollständig härten bei Wärmebehandlung. Dies wird in das Deck Sinken zu weit in die PDMS oder das Deck Driften in den PDMS während der Bilderzeugung führen. Wenn die Zentrifugationskraft zu hoch ist, können die Basis und Vernetzers Lösungen in der Röhre zu trennen. Dies kann durch Verringern der Geschwindigkeit der Zentrifugation oder durch Entgasen der Mischung für 30 min unter Verwendung einer Vakuumkammer beseitigt werden. Schließlich ist die Zelldichte kritisch, da zu viele Zellen ihre Fähigkeit zur vollständigen ausbreiten und durch den Kontakt mit benachbarten Zellen durotax ungehindert beeinflussen. Die Dichte hier berichtet wurde U2OS-Zellen optimiert. Wenn jedoch andere Zelltypen verwendet werden, eine optimale cell Zahlen müssen empirisch bestimmt werden. Wir haben vor kurzem diesen Assay verwendet werden, um zu untersuchen, wie die focal adhesion Signalprotein cdGAP regelt mechanosensing und durotaxis 11. Offensichtlich gibt es zahlreiche zelluläre Komponenten zusätzlich zu fokalen Adhäsionen wie Zytoskelettelementen Proteintransport Komponenten und Ionenkanäle, die in mechanische Signalübertragung beteiligt sind, und somit kann auch die Regulierung der durotaxis 13 bei - 15. Jede dieser Komponenten kann ohne weiteres in unserem System unter Verwendung ähnlicher RNAi Ansätzen ausgewertet werden. Zusätzlich ist dieser Test sehr offen für die Einführung von verschiedenen pharmakologischen Aktivatoren oder Inhibitoren. Der Test kann auch so angepasst, um kompliziertere Formen der Analyse, wie beispielsweise den Einbau von fluoreszenzmarkierten Proteinen, in Kombination mit FRET oder FRAP Ansätze erlauben, um die Proteindynamik und räumlich-zeitlichen Aktivierung zu untersuchen.

Die extrazelluläre Matrix (ECM) besteht aus einer komplexen Reihe von strukturellen und Vernetzungsproteinen einschließlich Kollagen, Fibronectin und Laminin besteht. Es ist zwar bekannt, dass die ECM liefert wichtige strukturelle Unterstützung für Zellgewebe gibt es zunehmend Hinweise darauf, daß Zellen, aktiv auf physikalische Veränderungen zu reagieren in der ECM-Umgebung zu unterschiedlichen zellulären Prozessen, einschließlich der Zellüberlebens, der Differenzierung und der Zellmigration regulieren. Beispielsweise können Unterschiede in der Steifigkeit der ECM mesenchymalen Stammzellen gegenüber verschiedenen Linien fahren, mit weicher Substrate (~ 1 kPa) Förderung neurogene Linien während steife (~ 25 kPa) Substrate fördern osteogene Differenzierung 1. Ähnlich kann eine Erhöhung der Steifigkeit Stromamatrix wurde gezeigt, dass Brust Epithelzelle Tumorigenese und Invasion in das umliegende Gewebe 2,3 fördern. Ein besonders interessanter Aspekt dieser mechanosignaling Aktivität resultiert in einem Verfahren, wie durotaxis, bei dem Zellen wandern bevorzugt in Richtung eines starren Substrats 4,5 bekannt. Zellen ständig erfassen die physikalischen Eigenschaften ihrer extrazellulären Umgebung durch Integrin-Rezeptor-Bindung an den ECM. Dies wiederum fördert die Ansammlung von zahlreichen strukturellen und Signalproteinen, ihre zytoplasmatischen Domänen, die Bildung von Klebstoff fokalen Adhäsionen oder fokalen Kontakten 6,7 bekannten Strukturen zu fahren. Da Integrine haben keine inhärente enzymatische Aktivität werden Signale von der ECM durch diese Hilfsproteine ​​übertragen, um die Antwort der Zelle auf ihre sich verändernden Umwelt 8 koordinieren. Dementsprechend ist die Identifizierung und Charakterisierung der Schlüsselproteinen regulieren mechanosignaling und durotaxis involviert ein wichtiges Forschungsgebiet. Verschiedene Modellsysteme entwickelt worden, um zu studieren durotaxis in vitro, aber die meisten habenverwendet kollagenbeschichteten Polyacrylamid Substrate 4. Jedoch kann die Vorbereitung der Polyacrylamid Substrate technisch anspruchsvoll sein und das Kollagen in diesen Assays verwendet werden, müssen chemisch vernetzt mit dem Substrat 9 ist. Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrate wurde gezeigt, dass vergleichbare mechanische Eigenschaften wie die Polyacrylamid Substrate 10 aufweisen. Jedoch PDMS Substraten durch einfaches Mischen ein Verhältnis der Base zu Vernetzer hergestellt, und diese Substrate können mit ECM-Proteine ​​ohne die Notwendigkeit für eine chemische Vernetzung beschichtet werden, wodurch eine einfachere PDMS Werkzeug, um die Wirkungen der Steifheit auf das Zellverhalten zu untersuchen. Hier beschreiben wir, wie eine einfache durotaxis Kammer, in der ein weiches PDMS-Substrat mit einem starren Deckglas integriert vorzubereiten. Der Test, wie unten beschrieben, bietet eine schnelle und einfache Methode, um durotaxis studieren. Für diese Studie menschlichen U2OS Osteosarkom-Zellen in Kombination mit siRNA-vermittelten verwendeten wirKnockdown von cdGAP, um die Rolle dieser focal adhesion protein in durotaxis 11 zu studieren. Wichtiger ist, daß dieses Protokoll leicht den individuellen Bedürfnissen angepasst werden. Andere Zelltypen können für die U2OS-Zellen ersetzt werden und jedes Protein kann abgerissen oder überexprimiert wird, um die Auswirkungen auf das Zellverhalten während durotaxis bestimmen. Weiterhin kann das Protokoll angepasst ist, um fluoreszent markierte Proteine ​​enthalten, um ihre Dynamik und das Verhalten mit FRAP oder FRET Ansätze analysiert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Cover glass 12mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21600-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2OS cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified system for evaluating cell mechanosensing and durotaxis in vitro

Die Zusammensetzung und die mechanischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix sind sehr variabel zwischen Gewebetypen. Diese Bindegewebsstroma Vielfalt großen Einfluss auf das Zellverhalten normalen und pathologischen Prozessen, einschließlich der Zellproliferation, Differenzierung, Adhäsion Signalisierung und gerichtete Migration zu regulieren. In dieser Hinsicht ist die angeborene Fähigkeit von bestimmten Zelltypen, auf eine steifere oder weniger nachgiebig Matrixsubstrat wird als durotaxis bezeichnet migrieren. Dieses Phänomen spielt eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung, Wundheilung und Invasion von Krebszellen. Hier beschreiben wir einen einfachen Test zur durotaxis studieren, in vitro, mit Polydimethylsiloxan (PDMS) Substraten. Herstellung der beschriebenen durotaxis Kammern schafft eine Steifigkeit Schnittstelle zwischen dem relativ weichen PDMS-Gel und einem starren Deckglas. Im vorliegenden Beispiel haben wir diese durotaxis Kammern verwendet, um eine Rolle des cdc42 demonstrieren / Rac1 GTPase aktivierende Protein, cdGAP, in mechanosensing und durotaxis Regulierung im menschlichen U2OS Osteosarkom-Zellen. Dieser Test ist leicht an andere Zelltypen und / oder Zuschlags anderer Proteine ​​von Interesse, ihre jeweiligen Rollen in mechanosignaling und durotaxis erkunden.

Ein Schema des durotaxis Kammer ist in 1A gezeigt. Weichen PDMS-Substrat (eine 90: 1 Mischung von PDMS Basis Lösungen Vernetzer) in einer 6 Well-Platte verteilt und ein Deckglas wird oben auf den PDMS, die dann teilweise die obere Oberfläche des Deckglases abdeckt angeordnet, wodurch eine Schnittstelle schaffen zwischen den beiden Substraten unterschiedlicher Compliance. Die Steifigkeit des weichen PDMS Substrat ~ 1 kPa, vergleichbar mit der typischen Einhaltung des Hirngewebes ist, während die Steifigkeit von Glas ist etwa 1-2 GPa 1. Ein Phasenkontrastbild der Schnittstelle zwischen dem PDMS und Glas ist durch die weißen Pfeile in 1B gezeigt. Die Sternchen bezeichnen zwei Steuer RNAi Zellen migrieren in Richtung der härteren Substrat. Die Fransen, die zu sehen sind (schwarzer Pfeil) entspricht bis an den Rand des Deckglases. Um die Daten zu quantifizieren, sollte ein Microsoft Excel-Tabelle, wie in Tabelle 1 erzeugt werden &lt;/ strong&gt;. Sollte die Anzahl der Durchgangsereignisse gezählt und in der entsprechenden Spalte organisiert werden. Einige der erzeugten Filme können nicht zur Quantifizierung verwendet werden. Ein Film kann aus Quantifizierung weggelassen werden, wenn es eine Luftblase in den PDMS, das mit einem Zellen Fortschritt stört oder wenn die Zellen zu dicht gepackt, was zu Kollisionen, die Zell Direktionalität drastisch beeinflussen. Zellteilung sollte auch überwacht werden, da dies ebenfalls offen Zellbewegung zu beeinflussen. In der Regel werden die meisten adhärenten Zelltypen bevorzugt wandern in Richtung einer steiferen Substrat 2,4,12. Zu beginnen, um die molekularen Mechanismen, durch die Zellen auf mechanische Signale in ihrer Umgebung zu verstehen, können spezifische Proteine ​​unten mit siRNA stoßen werden. In unserem Beispiel etwa 70% der Kontroll-siRNA-behandelten Zellen zeigten durotaxis 2A. Im krassen Gegensatz dazu, wenn cdGAP wurde abgerissen mit RNAi hatten die Zellen keine Präferenzdarüber, ob sie auf die harte oder weiche Substrat 2A migriert. Darüber hinaus überquerte die cdGAP Zuschlagszellen die Grenze mehrmals, während Steuer siRNA behandelten Zellen in der Regel nur die Grenze einmal, 2B gekreuzt. Repräsentative Spuren der Kontroll-siRNA-Zellen zeigen, dass die Zellen wandern in der Regel über die Grenze einmal und bevorzugt blieb auf der steifere Oberfläche im Vergleich zu cdGAP siRNA behandelten Zellen, die nicht über eine Präferenz für entweder Steifigkeit nicht nachweisen, und die Grenze mehrmals 2C gekreuzt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52949/52949fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Durotaxis Kammer einzurichten. (A) Weiche PDMS wird in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte verteilt und ein Deckglas auf der Oberseite des PDMS platziert. PDMS wird über die Seiten der Oberseite des Deckglases eingreifen, befErz härtet, um eine Schnittstelle zwischen den zwei Substraten zu bilden. Durotaxis wird, indem man die Richtungsabhängigkeit der Zellen über den PDMS / Glas-Grenzfläche bestimmt. (B) Repräsentative Phasenkontrastbild, das die Schnittstelle zwischen den weichen PDMS und starre Glassubstrat. Die Sternchen zeigen Steuer RNAi behandelten U2OS-Zellen unterzogen durotaxis. Die weißen Pfeile bezeichnen die Schnittstelle zwischen den PDMS und Deckglas und der Pfeil zeigt die Kante des Deckglas unter den PDMS. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52949/52949fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/52949/52949table1.jpg" /> . Tabelle 1 Schematische Darstellung der Microsoft Excel-Tabelle einzurichten Spalten werden gegründet, um den Film Nummer, siRNA verwendet, die Anzahl der Zellen, die von den weichen PDMS migriertstarre Glassubstrat oder umgekehrt, sowie die Gesamtzahl der Zellen analysiert. Spalten werden auch für die Zellen, die die Schnittstelle mehrmals überqueren und am Ende entweder auf den weichen PDMS oder dem Glassubstrat gesetzt. Wenn eine Zelle über die Grenze mehrmals wandert, wird die Anzahl der Mehrfachdurchgangsereignisse dieser Zellen in der Spalte des Substrats, auf dem die Zelle an dem Ende des Films angeordnet sind, aufgenommen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52949/52949fig2.jpg" /> Abbildung 2. Knockdown von cdGAP in U2OS-Zellen führt zu einem Verlust der durotaxis. (A) Kontroll-siRNA behandelten Zellen wandern bevorzugt auf die starre Glassubstrat, während cdGAP siRNA behandelten Zellen fanden keine Vorlieben aufweisen. (B) Steuer siRNA behandelten Zellen überquerte die Grenze zwischen den PDMS und Glas einmal. Allerdings wanderten cdGAP RNAi behandelten Zellen hin und her über die boundary mehrmals. (C) Tracks von repräsentativen Zellen entweder mit Kontrolle behandelt oder cdGAP siRNA wurden unter Verwendung des Hand Tracking Plugin in ImageJ generiert. Die p-Werte wurden unter Verwendung eines Studenten t-Test bestimmt und Fehler Balken stellen die 95% Konfidenzintervall. Mit freundlicher Genehmigung von Wormer et al. 2014 11 wiedergegeben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52949/52949fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Ein vereinfachtes System zur Bewertung der Zell Mechanosensing und Durotaxis<em&gt; In-vitro-</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

8.1K Aufrufe.  SUNY Upstate Medical University. Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Serie: A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

Mosaic Zebrafisch Transgenese zur Beurteilung Enhancer-Sequenzen

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Forschung

Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

Ein vereinfachtes System zur Bewertung der Zell Mechanosensing und Durotaxis

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Mosaic Zebrafisch Transgenese zur Beurteilung Enhancer-Sequenzen

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans

Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit

Ein Protokoll für Labor Housing von Türkis Killifische (Nothobranchius Furzeri)