Diese Veröffentlichung wurde von der South Carolina Clinical &amp; Translational Research (SCTR) Institute unterstützt, mit einem akademischen Heimat an der Medizinischen Universität von South Carolina, NIH / NCATS Statt Anzahl UL1 TR000062. Weitere Unterstützung wurde von VA Merit Award BX002327-01 DRM zur Verfügung gestellt. DJH wurde von NIH / NCATS Statt Anzahl TL1 TR000061 von NIH Zuschusses Anzahl T32 GM008716 unterstützt. SEA wurde vom NIH Zuschusses Anzahl T32 HL07260 unterstützt.

Alle hier aufgeführten Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Medizinischen Universität von South Carolina genehmigt. Die hier beschriebenen Experimente sind akute, nicht-Überlebensexperimente. Als solche gibt es keine Verwendung von Augensalbe und eine sterile OP-Bereich nicht erforderlich ist. Sterbehilfe wird durch Ausbluten bei der Ernte des Herzens erreicht. 1. Versuchsvorbereitung <ol><li> Bis entweder einen konstanten Druck oder konstanten Fluss Langendorff Perfusion 4 Stellen. </li><li> Herstellung von 4 L modifizierte Krebs-Henseleit-Puffer (in mM: 112 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgSO 4, 1 K 2 HPO 4, 1,25 CaCl 2, 25 NaHCO 3, 11 D-Glucose, 0,2 Octansäure, pH = 7,4). <ol><li> Machen 10x stock Puffer. <ol><li> Aufzulösen NaCl, KCl, MgSO 4 und K 2 HPO 4 in 3 L Reinstwasser. </li><li> Löse CaCl 2 in 500 ml Reinstwasser with 40 ml 1 N HCl. </li><li> Langsam CaCl2-Lösung in den Puffer in 1.2.1.1 vorgenommen. Fügen Sie genug hochreinem Wasser auf insgesamt 4 L. Lassen Sie für 1 Stunde vor dem Filtrieren durch ein 0,8 um Filter zu rühren. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Löse NaHCO 3 in 4 L Reinstwasser. Man lässt 1 h, bevor es durch einen Filter an 0,8 um-Filter rühren. Lagerung bei 4 ° C </li></ol></li><li> Kombinieren Sie 400 ml 10x Krebs Henseleit-Puffer mit 400 ml 10x NaHCO3-Puffer. Fügen Sie genug hochreinem Wasser auf insgesamt 4 L. auflösen Glukose und Oktansäure unter Rühren. Man filtriert durch 0,8-um-Filter. </li></ol></li><li> Bereiten System für Herz. <ol><li> In 2 l gefiltert Puffer zu einem 4-l-Flasche 38 in platziert über dem Hahn an die Aortenkanüle angebracht. Dadurch wird ein Perfusionsdruck von 70-80 mmHg in das Herz, die die empfohlene Perfusionsdruck 4 zu liefern. </li><li> Legen Gasdispersions bubbler in den Puffer in der Flasche. </li><li> Führen Sie den Puffer durch das System, dass auf jeden Fall alle Blasen aus dem Inneren der Rohrleitung zu beseitigen. </li><li> Einzuschalten Gas (95% O 2/5% CO 2) mindestens 30 min vor Herz ist auf dem System platziert werden. Verwenden Sie ein Gasstrom-Sonde und Blutgasanalysegerät, um die Sauerstoffsättigung zu überprüfen. </li></ol></li><li> Bereiten chirurgisches Material und Ballon. <ol><li> Für die Ernte von Herz, bereiten ein Paar von 6,75 &quot;chirurgische Schere, ein Paar von 4.5&quot; Schere, zwei Paare von Hämostatika, zwei Sätze von Karamellenmalz Zange zwei Spritzen mit 27 G Nadeln, 2 Stück von 0-Gauge-Seidenfaden (ca. 15 cm in der Länge), einer 1/16 inch Stacheldraht Kanüle und eine Trachealkanüle. </li><li> Um Trachealkanüle montieren, kleben Sie ein kurzes Stück von 1/16 Zoll Durchmesser Kunststoffschlauch mit einem Y-Verbinder. </li><li> Um Ballongerät montieren: fügen Sie eine Sondennadel an ein Stück 1/16 Zoll Schlauch, dann bringen Sie Schlauch an Druckwandlergehäuse. Eine kleine Spritze zu der anderen Seite des Druck tr befestigtansducer Gehäuse wird Aufblasen und Entleeren des Ballons zu ermöglichen. <ol><li> Schneiden Sie ein Quadrat der Plastikverpackung und Platz Spitze einer Magensonde Nadel in der Mitte. Wickeln Sie die Plastikfolie um die Sondennadel. </li><li> Füllen Ballon mit Kochsalzlösung und binden mit zwei Nähten. Blasen Sie Ballon, um sicherzustellen, keine Lecks vorhanden sind. Das Volumen der Salzlösung innerhalb des aufgeblasenen Ballons sollte ungefähr 200 &amp; mgr; l, kann aber abhängig von der Größe der Ratte variieren. </li><li> Alternativ können Sie einen Latex Fingerling anstelle der Plastikfolie. Platzieren Sie eine Magensonde Nadel innerhalb Fingerling, füllen mit Kochsalzlösung und Krawatte ab. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ernte das Herz <ol><li> Restrain eine Sprague Dawley-Ratte mit einem decapicone oder andere manuelle Rückhaltevorrichtung. Wiegen Ratte. </li><li> Verabreichen Ketamin / Xylazin-Mischung (0,85 mg / kg Ketamin und 0,15 mg / kg Xylazin) durch intraperitoneale Injektion an Ratten anästhesiert. Diese Dosis des Anästhetikums ausreichend für Anästhesie liefern20-40 min, aber das Verfahren sollte möglichst schnell nach der Narkose wird bestätigt, durchgeführt werden. </li><li> Bestätigen richtigen Grad der Anästhesie durch Tests toe Prise Reflex. </li><li> Tracheotomie <ol><li> Entfernen pelt von Mitte Vorderpfote auf Basis des Kiefers, mit Gefäßklemmen, um Fell und Schere zu erheben, um Einschnitt zu machen. Halten Sie das Fell angehoben, um es von der darunter liegenden Muskeln zu trennen, so dass man auf dem Fell schneiden und entfernen. </li><li> Verwendung hemostats, heben Drüsengewebe und machen einen horizontalen Schnitt in Faszie schlechter als das Drüsengewebe. Verwenden hemostats zu Einschnitt spreizt, kümmert sich nicht um nick die Halsvenen. </li><li> Verwendung Hämostaten pinch Muskeldarüberliegenden Luftröhre, und mit einer Schere einen Quereinschnitt im Muskel genau unter der Spitze der Hämostatika. Verwendung hemostats, verbreiten Gewebe auseinander, um die Luftröhre zu offenbaren. </li><li> Gefäßklemmen vorsichtig unter Luftröhre, Clearing Faszie, während voran durch leichtes Vor- und Zurück hemostats. </li><li>Sobald hemostats erfolgreich hinter der Luftröhre gelegt, kneifen 0-0 Seidennaht mit Gefäßklemmen und hemisect die Luftröhre mit einem kleinen, scharfen Schere. </li><li> Legen Trachealkanüle in die Trachea hemiseziert, ziehen Naht hinter der Luftröhre, und binden Sie den Faden um die Kanüle eingeführt Luftröhre, die Verankerung des Nahtmaterials zu der Y-Leiste der Kanüle mit einem Chirurgen Knoten. </li><li> Unter Verwendung einer 27 G Nadel injizieren 1.000 U / kg Heparin in die Halsschlagader und lassen Sie sie für 30 Sekunden zu zirkulieren. </li></ol></li><li> Thorakotomie <ol><li> Entfernen pelt von Mitte Bauch bis Mitte Vorderpfote Region durch Kneifen mit Gefäßklemmen und Schneiden mit einer Schere. </li><li> Machen Sie eine ¾-Zoll-Quereinschnitt in die Bauchmuskelwand, direkt unterhalb des Zwerchfells. </li><li> Machen Sie eine vertikale Inzision bis die Bauchdecke und Brustwand, Schneiden entlang dem Brustbein. </li><li> Schneiden Sie die Blende wieder auf bilateraler Ebene, dann verbreiten Brustkorb zu Herzen, Klemmbrustkorb mit Gefäßklemmen, um sicherzustellen, bleibt es verbreitet zu offenbaren. </li&gt; <li> Verwendung hemostats, entfernen Sie vorsichtig Thymus, Aussetzen der aufsteigenden Aorta. </li><li> Necken hemostats durch Aorten-Schleife, Vorschieben und Zurückziehen hemostats und sanft Verbreitung Faszie zu Spitze Gefäßklemmen ermöglichen durch. </li><li> Verwenden hemostats zu 0-0 Seidennaht hinten aufsteigenden Aorta zu ziehen, binden Naht zu einem lockeren Halb quadratischen Knoten. </li><li> Schalten Hahn, um den Fluss von Perfusionspuffer, hemisect Aorta beginnen und sofort legen Kanüle in Aortenlumen. Schnell cinch eine Halbkreuzknoten und füllen Sie die Knoten, Anziehen gründlich. </li><li> Mit einer Schere Herzen weg von den großen Gefäßen zu sezieren, Herz aus der Brust zu entfernen und um die Perfusion Spalte. </li><li> Abschneiden von überschüssigem Lungengewebe und lassen Herz auf der Säule für etwa 15 min vor dem Einsetzen des Ballons äquilibrieren. Verwenden Sie einen normalen Durchflussrate von Puffer durch das Herz von 10-20 ml / min. </li></ol></li></ol> 3. Langendorff-Perfusion und Ischämie-Reperfusionsverletzung <ol><li> Platzierung der LV vorssure Ballon <ol><li> Lassen Sie die Luft Ballon beim Rollen in eine Kegelform und schalten Hahn, um sicherzustellen, Ballon bleibt entleerten. </li><li> Excise linken Vorhof mit einer kleinen Schere, um den Zugang zu Mitralklappe aussetzen. </li><li> Legen Ballon durch linken Vorhof und Mitralklappe in den linken Ventrikel. </li><li> Startdruck-Monitoring-Software (LabChart Pro). </li><li> Blasen Sie Ballon durch Öffnen Absperrhahn und sanft zunehmende Menge an Kochsalzlösung in Ballon, bis der diastolische Druck Lesung aus Mikromanometer Null übersteigt. </li><li> Auf Länge-Spannung Antwort überprüfen, aufblasen Ballon langsam zu einer diastolischen Druck von 75 mmHg, entleeren langsam, einmal zu wiederholen. </li><li> Eingestellt diastolische Druck 10 mmHg durch Modulieren der Menge von Salzlösung in den Ballon. Schalten Hahn zu Ballon auf diesem Niveau der Inflation zu versiegeln und zu pflegen geschlossenen Drucksystem zwischen LV Ballon und Druckwandler. </li><li> Unteren Herzkammer in die erhitzt und Abdeckung mit Kunststoffkammer. </li></ol></li><li> AnzeigeDienst der Ischämie-Reperfusionsverletzung <ol><li> Stecker die Unterseite der erwärmten Kammer und erlauben Kammer mit ergossenen Puffer zu füllen. </li><li> Als Puffer Herzen unter Wasser, drehen Hahn, den Fluss von Puffer in das Herz zu stoppen, zu induzieren globale Ischämie. Ischämie Zeit kann je nach den Zielen des Experiments variieren. </li><li> Nach 30 Minuten der Ischämie, schalten Hahn, um die Strömung des Puffers in das Herz wiederherzustellen, Initiierung der Reperfusion. </li><li> Lassen Sie Reperfusion des Herzens für 1 h vor Beendigung des Experiments. Verwenden variable Reperfusion Zeiten, abhängig von den Zielen des Experiments. </li></ol></li><li> Kündigung Experiment und Ernten von Tissue <ol><li> Verwendung Seitenöffnung des Absperrhahns verabreichen 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung bei 4 ° C in das Herz mit einer Rate von 10 ml / min, um das Herz anzuhalten. </li><li> Herz entfernen Perfusion Spalte wegschneiden restlichen Vorhofgewebe. </li><li> Zeigen Herz in einen Edelstahlgewebe Schneidematrix, Deckel mit Parafilm und Stelle bei -80 ° C für 8 Minuten, oder bis das Herz hat einen Marshmallow artige Konsistenz. </li><li> Entfernen Block vom Gefrierschrank und legen Sie in Rasierklingen schneiden Matrix zu Herzen in 2 mm dicke Scheiben schneiden. Gewebeblöcke können auch mit anderen als 2 mm Scheibe Größen erworben werden. </li><li> Scheiben entfernen ein zu einer Zeit und fallen in flüssigem Stickstoff auf Blitzeis für biochemische Untersuchungen. Bewahren Sie den dritten Ventrikel Scheibe von der Spitze zur Infarkt Färbung. </li><li> Entfernen Gewebe aus flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur Verwendung in biochemischen Experimenten. </li></ol></li><li> Infarkt-Färbung <ol><li> Inkubieren des dritten ventrikulären Scheibe in 10 ml 1% w / v Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) bei 37 ° C für 15 min. Anmerkung: Die Inkubation in TTC kann für 15 oder 30 Minuten bei unveränderter Wirksamkeit 15 durchgeführt werden. </li><li> Übertragen Gewebeschnitt von TTC zu 10% Formalin und lassen Sie sie bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Für optimale Ergebnisse zu hörents sollte von Formalin aufgenommen und innerhalb von 24 Stunden 4 abgebildet werden. </li><li> Fotografie Buntscheibe und Verwendung Software wie ImageJ zu Infarktgröße schätzen, nach dem Protokoll des Herstellers. Fotografieren so bald wie möglich nach der Fixierung, da der Farbstoff im Laufe der Zeit verblassen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Isoliert perfundierten Rattenherzen erfolgreich eingesetzt werden kann, um die Wirkung von pharmakologischen Intervention Herz Präkonditionierung Reperfusionsverletzung 9 untersuchen. Es gibt jedoch einige wesentliche Schritte der Prozedur, die um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten standardisiert werden müssen. Aufrechterhalten einer Temperatur von 37,4 ° C innerhalb des Systems ist entscheidend, denn auch milder Hypothermie und Hyperthermie kann Herz Präkonditionierung 10,11 führen. Die Gesamtzeit, die von der Injektion des Anästhetikums zur Exzision des Herzens verstreicht muß auf einem Minimum gehalten werden, da eine verlängerte Exposition gegen Ketamin kann mit Herz Vorkonditionierung 12 stören. Rechtzeitige Kanülierung der Aorta in situ wesentlich ist, um Herz Exzision der Verhinderung der Entwicklung von Hypoxie in das Herz oder das Ausbluten des Tieres vor. Insgesamt sollte die Zeit vom ersten Schnitt, um das Entfernen des Herzens nicht mehr als 6-8 min. Die linksventrikuläre balloon müssen auf Dichtheit vor jedem Experiment überprüft und gegebenenfalls ausgetauscht werden. Das System muß genau beibehalten werden, einschließlich Spülen der gesamten Vorrichtung mit destilliertem Wasser nach jedem Durchlauf und Ersetzen von abgenutzten Schlauch wie erforderlich, um ein Auslaufen oder Kontamination des Inneren der Rohrleitung zu verhindern. Dem isolierten Herzen können für eine beliebige Anzahl von neuartigen Verwendungen, einschließlich Fluoreszenz-Bildgebungs 13 NMR Spectroscopy 7 und das optische Abbildungs ​​14 unter vielen anderen geändert werden. Das System kann auch modifiziert werden, um die Herzen von verschiedenen Tieren, einschließlich Mäusen durchströmen. Diese Abwandlung ist besonders nützlich, da es für Experimente unter Verwendung von transgenen Mäusen. So ändern Sie das System für die Mäuseherzen, kleinere Kanülen und eine kleinere Perfusion Spalte verwendet werden, zusätzlich zu anderen Modifikationen. Detaillierte Beschreibungen, wie man die Langendorff-Verfahren zur Mäuseherzen nutzen anderswo 16,17 veröffentlicht. Andere ModifikationenDieses Protokoll die Verabreichung verschiedener Arzneimittel zu verschiedenen Zeitpunkten. Bei der Untersuchung der Fähigkeit eines Arzneimittels zur pharmakologischen Präkonditionierung oder Nachkonditionierung verursachen, ist es notwendig, den Wirkstoff zu unterschiedlichen Zeitpunkten in Bezug auf die Reperfusionsverletzung zu verabreichen. Das Medikament kann dem Tier verabreicht werden, bevor das Herz herausgeschnitten, oder in den Puffer entweder vor das Herz an der Säule oder während der ischämischen Phase so angeordnet, dass das Medikament bei Reperfusion vorliegt gemischt. Alternativ kann eine Seitenöffnungs verwendet werden, um einen Bolus des Arzneimittels zu jedem Zeitpunkt während der Protokoll verabreichen. Zusätzlich kann das Protokoll modifiziert, um die Dauer der Ischämie, Reperfusion oder beides zu ändern. Dies erlaubt die Analyse der funktionellen und biochemischen Daten zu mehreren Zeitpunkten, und kann verwendet werden, um den zeitlichen Verlauf der akuten Wirkung eines Arzneistoffs zu verfolgen. Wenn der Reperfusionsperiode verändert wird, ist es wichtig zu beachten, dass mindestens 60 Minuten der Reperfusion sind necessar für TTC-Färbung, um effektiv zu beschreiben Infarktbereich 15. Die Haupteinschränkung des isolierten Herzmodell in Bezug auf Ischämie-Reperfusionsverletzung ist, dass es nicht für viele systemische Faktoren, die bei der Einstellung der Ischämie-Reperfusion in vivo vorhanden sind, Rechnung zu tragen. Diese Eliminierung systemisch wirken muss bei der Analyse der Daten, die unter Verwendung der Langendorff-Modell erklärt werden, jedoch nicht die Fähigkeit des Modells, um neue Fragen zu der Reaktion der Myozyten, Fibroblasten und Endothelzellen, Ischämie und anschließende Reperfusion beantworten auszuschließen. Das isolierte Herzmodell ermöglicht eine vollständige Manipulation vieler Variablen, die Ischämie-Reperfusionsverletzung zusätzlich zu Echtzeit-Analyse der funktionellen Auswirkungen auf das Herz über kurze Zeitintervalle. Die mit Hilfe der isolierten Herzen System generierten Daten ist von unschätzbarem Wert für das Verständnis der pharmakologischen Präkonditionierung oder senden Anlage von derHerz in Reaktion auf verschiedene pharmazeutische Interventionen.

Aufklärung der Ereignisse des Herz Reaktion auf sowohl Ischämie und Reperfusion zugrunde liegen weiter zu verbessern die Behandlung von Herzinfarkt und Herz 1 operative Eingriffe, die Aorten-Querspann 2 erfordern. Während in vivo Modellen von Ischämie-Reperfusionsverletzung ermöglichen sehr nützlich Endpunktanalyse, sind sie nicht so wirksam für die Untersuchung der funktionellen Auswirkungen von Ischämie-Reperfusionsverletzung akut in Echtzeit. Zusätzlich kann in vivo Ischämie-Reperfusion-Modelle erzeugen im Allgemeinen zu signifikanten Schwankungen in der Infarktgröße und die direkte Abgabe von Arzneimittel an das Herz zum Zeitpunkt der Reperfusion ist eine Herausforderung. Die Verwendung einer Langendorff-Herzen isoliert System für die Untersuchung ischämischen Reperfusionsschäden ermöglicht Echtzeit-funktionelle Bewertung der pharmakologischen Behandlungen, gleichmäßige Flächen infarzierten Gewebe und momentane Abgabe von Arzneimittel direkt in den Herzmuskel. Zuerst beschrieben by Oscar Langendorff 1895 3 ist der Langendorff-Herz isoliert ein robustes Modell für die Untersuchung ischämischen Reperfusionsschäden, nachdem er in Ischämie-Reperfusion Forschung für den letzten 40 Jahren 4,5 verwendet. Hier werden einige Modifikationen vorgenommen, um das isolierte Herz zur Funktionsanalyse zu optimieren. In situ Kanülierung der Aorta, während das Herz schlägt, wird sichergestellt, dass das Herz nicht ischämischen Präkonditionierung, die die Ergebnisse der Ischämie-Reperfusion den Versuchen 6 verändern würden auftreten. Um dies zu erleichtern, wird ein Luftröhrenschnitt durchgeführt, so dass Belüftung und gewährleisten physiologische Stabilität der Ratte während der Operation. Das Herz wird dann auf eine Glaswassermantel spiral Säule, durch die Krebs-Henseleit-Puffer wird durch retrograde Perfusion direkt in die Aorta geliefert befestigt. Eine Kochsalzlösung gefüllten Ballon wird in den linken Ventrikel eingeführt und mit einem Druckwandler, der für die Echtzeit-Messung von Drücken von innerhalb der Herzkammer ein ermöglicht befestigtd Berechnung mehrerer funktioneller Parameter. Am Ende des Experiments wird das Herz mit kalter Kochsalzlösung gespült, um die Kontraktion und in flüssigem Stickstoff eingefroren, um Downstream-Analyse von DNA, RNA und Protein-Ebene ermöglichen verhaften. So modifizierte, dient der Langendorff-perfundierten Herzen als ein wirksames System für die direkte Überwachung der physiologischen Wirkung von pharmakologische Interventionen zu jeder Zeit während des akut ischämischen Reperfusionsschäden.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Octanoic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2875</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Medical Pressure Transducer</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Peristaltic Pump</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07521-40</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Easy Load Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Heated circulating water bath</td><td>Lauda</td><td>M3</td><td></td></tr><tr><td>Tubing Flow Module</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Modular Research Console</td><td>Transonic</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Inline flow sensor</td><td>Transonic</td><td>ME2PXN</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab Data Acquisition Device</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>LabChart data acquisition software</td><td>AD Instruments</td><td>MLU60/8</td><td></td></tr></tbody></table>

induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff-perfused rat hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

Die linke Kammerballon Vorrichtung ermöglicht eine Echtzeitüberwachung des Drucks durch den Auftraggeber linken Ventrikel (Abbildung 1) entwickelt. Wie zuvor 7 beschrieben, kann diese Druckspur verwendet, um viele der Parameter der Herzfunktion zu berechnen. Diese Berechnungen können in der Basisphase als auch der Reperfusionsphase gemacht werden, gemittelt über mehrere Spuren in jeder Gruppe, und verglichen, um zu bestimmen, ob die pharmakologische Intervention ergab Herz Vorbehandlung, wie wir zuvor 9 gemacht. Ein solcher Parameter ist der entwickelte Druck, die als Differenz zwischen dem systolischen Druck und dem diastolischen Druck. Der entwickelte Druck in normalen perfundierten Rattenherzen kann von 70 bis 130 mmHg (1A) reichen. Nach einem ischämischen Insult, ist der entwickelte Druck reduziert und die enddiastolischen Druck erhebt (1B). Wenn die Rattenverabreicht eine bekannte Vorbehandlung Mittel wie der Klasse I und IIb HDAC-Inhibitor SAHA (vorinostat) 18 vor dem Herausschneiden des Herzens, die Reduktion in den entwickelten Druck und die Höhe des enddiastolischen Druck, mit Ischämie-Reperfusionsverletzung assoziiert abgeschwächten (Abbildung 1C). Andere Maßnahmen der linksventrikulären Funktion, wie beispielsweise die Rate der Druckerzeugung (dP / dt max) kann die Geschwindigkeit des Druckentspannungs (-dP / dt max), und die Rate Druck Produkt (RPP) direkt erhalten oder von der berechnet werden Software Ausgang (Abbildung 2). Der ischämische Phase kann auch in Echtzeit überwacht werden, wobei die Einstellung der scheinbaren Druckerzeugung innerhalb von Minuten nach dem Beginn der Ischämie. Ischämische Kontraktion kann auch durch Messen der Zeit, der Kontraktion und die Zeit bis zum Auftreten Kontraktion Spitze überwacht werden. Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) wird häufig verwendet, um zwischen einem metabolisch differenctive und inaktive Gewebe, und ist für die Infarkt Färbung verwendet. Einmal in das Gewebe TTC wird von Stoffwechselenzymen verringert aufgenommen und verwandelt das aktive Gewebe rot. Inaktive Gewebe nicht TTC zu verringern, und als solche wird weiß 8 färben. Langendorff-perfundierten Rattenherzen, die nicht an ischämischer Verletzung unterzogen wurden keine weißen Bereiche (nicht dargestellt) zu zeigen, während die Herzen, um Ischämie-Reperfusionsverletzung zeigen wesentliche Bereiche weiß gefärbt, was auf Infarktgewebe (Abbildung 3) unterzogen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig1.jpg" /> Abbildung 1: Repräsentative Druck Spuren von linksventrikulären Ballondruck durch die LV Ballon auf ventrikuläre Kontraktion aufgezeichnet.. Herz nicht zu Ischämie (A) ausgesetzt erleben eine geringe Verlust der Kontraktionsfähigkeit über die Zeit. Herz-Ischämie unterzogen (B) zeigen immediate Verlust der Druckerzeugung, gefolgt von tonische Kontraktion. Nach Reperfusion, diese Herzen erleben erhöhten EDV und verringerte Druck entwickelt. Herzen mit SAHA vorkonditioniert und Ischämie (C) unterzogen zeigen Dämpfung von ischämischen Reperfusionsschäden. N = 1 pro Gruppe. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig2.jpg" /> Abbildung 2: Berechnete Parameter der Herzfunktion Rate von Druckerzeugung (A), Geschwindigkeit des Druckentspannungs (B), entwickelte Druck (C), und bewerten Druckprodukt (D) sind einige Parameter der Herzfunktion, die von der berechnet werden kann. Druck-Monitoring-Software. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig3.jpg" /> Abbildung 3: TTC-Färbung zur Infarktgebiet. </strong&gt; Beispiel Herzkammerquerschnitt nach der Ischämie Reperfusionsschaden. Gepunktete Linie skizziert linken Ventrikels (LV) von rechten Ventrikel (RV). Focal Infarkt durch weiße Fläche angezeigt, während lebensfähiges Gewebe wird durch rot-Färbung angezeigt.

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Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Induktion und Beurteilung der Ischämie-Reperfusion Injury in Langendorff-perfundierten Rattenherzen

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

induction-assessment-ischemia-reperfusion-injury-langendorff-perfused

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

23.0K Aufrufe.  Medical University of South Carolina. The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Serie: Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Akuter Myokardinfarkt bei Ratten

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Forschung

Medizin

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biologie

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via recanalization of the coronary artery is the most effective strategy for reducing the size of ischemic myocardium. The coronary microvasculature cannot be visualized and imaged&#160;in vivo, but there are several invasive and noninvasive techniques that can be used to assess parameters which depend directly on coronary microvascular function. The endothelial function after ischemia reperfusion can be assessed also at the level of the coronary circulation via the coronary flow reserve (CFR).&#160;In this study, peak velocity of left anterior descending (LAD) coronary arteries was measured in rats in vivo via Transthoracic Doppler Echocardiography during resting and stress challenge (induced by Dobutamine). A normal heart can increase its coronary blood flow up to four times above the resting values during stress induction. Following ischemia reperfusion, we found a significantly diminished CFR, which can be used as a marker of coronary microvascular dysfunction. CFR has opened a window on the importance of microvascular dysfunction and has been shown to predict cardiovascular risk independent of whether the severe obstructive disease is present.

Coronary flow reserve (CFR), is defined as the ratio of maximal coronary blood flow to the resting coronary blood flow. We present a protocol for evaluating CFR in rats via ultrasound, which offers the opportunity to predict cardiovascular risk factors in the absence of obstructive coronary disease.

Bewertung des koronaren Flussreservats nach Myokard-Ischämie-Reperfusion bei Ratten

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

Verbesserung der CVD-Forschung mit modifizierter Langendorff-Perfusion

Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts

Despite important advancements in the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases (CVDs), the field is in urgent need of increased research and scientific advancement. As a result, innovation, improvement and/or repurposing of the available research toolset can provide improved testbeds for research advancement. Langendorff perfusion is an extremely valuable research technique for the field of CVD research that can be modified to accommodate a wide array of experimental needs. This tailoring can be achieved by personalizing a large number of perfusion parameters, including perfusion pressure, flow, perfusate, temperature, etc. This protocol demonstrates the versatility of Langendorff perfusion and the feasibility of achieving longer perfusion times (4 h) without graft function loss by utilizing lower perfusion pressures (30-35 mmHg). Achieving extended perfusion times without graft damage and/or function loss caused by the technique itself has the potential to eliminate confounding elements from experimental results. In effect, in scientific circumstances where longer perfusion times are relevant to the experimental needs (i.e., drug treatments, immunological response analysis, gene editing, graft preservation, etc.), lower perfusion pressures can be key for scientific success.

Autor im Rampenlicht: Advancing Cardiovascular Research - Maßgeschneiderte Langendorff-Perfusionstechniken für verbesserte experimentelle Ergebnisse

This article demonstrates the feasibility of achieving longer perfusion times (4 h) of murine cardiac grafts without function loss by employing lower (30-35 mmHg) than physiological (60-80 mmHg) perfusion pressures during Langendorff.

Modifizierte Langendorff-Perfusion zur Verlängerung der Perfusionszeiten von Nagetier-Herztransplantaten

Despite important advancements in the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases (CVDs), the field is in urgent need of increased research and ...

Biotechnik

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

OrganIschemia-Reperfusion Verletzung durch Simulation hämodynamischer Veränderungen im Lebertransplantationsmodell der Ratte

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

<meta charset="utf8"></head><body>Ein Fluoreszenzassay zur Beurteilung der Permeabilität einer kardialen mikrovaskulären Endothelbarriere in einem Rattenmodell für Ischämie/Reperfusion

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Ein Fluoreszenzassay zur Beurteilung der Permeabilität einer kardialen mikrovaskulären Endothelbarriere in einem Rattenmodell für Ischämie/Reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of heart reflow and induce secondary myocardial injury. A simple and reproducible model of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury is a good tool for researchers. Here, a customizable method to create a myocardial infarction (MI) model and MIRI by precision ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) through micromanipulation is described. Accurate and reproducible ligature positioning of the LAD helps obtain consistent results for heart injury. ST-segment changes can help to identify model accuracy. The serum level of cardiac troponin T (cTnT) is used to assess the myocardial injury, cardiac ultrasound is employed to evaluate the myocardial systolic function, and Evans-Blue/triphenyl tetrazolium chloride staining is used to measure infarct size. In general, this protocol reduces procedure duration, ensures controllable infarct size, and improves mouse survival.

Here we describe a simple and reproducible method that can induce myocardial infarction or myocardial ischemia-reperfusion injury in mice by precision ligation of the left anterior descending coronary artery through micromanipulation.

Induktion von Myokardinfarkt und myokardialer Ischämie-Reperfusionsschädigung bei Mäusen

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Induktion und Beurteilung der Ischämie-Reperfusion Injury in Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Zusammenfassung

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Akuter Myokardinfarkt bei Ratten

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Bewertung des koronaren Flussreservats nach Myokard-Ischämie-Reperfusion bei Ratten

Modifizierte Langendorff-Perfusion zur Verlängerung der Perfusionszeiten von Nagetier-Herztransplantaten

Modifizierte Langendorff-Perfusion zur Verlängerung der Perfusionszeiten von Nagetier-Herztransplantaten

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OrganIschemia-Reperfusion Verletzung durch Simulation hämodynamischer Veränderungen im Lebertransplantationsmodell der Ratte

Ein Fluoreszenzassay zur Beurteilung der Permeabilität einer kardialen mikrovaskulären Endothelbarriere in einem Rattenmodell für Ischämie/Reperfusion

Ein Fluoreszenzassay zur Beurteilung der Permeabilität einer kardialen mikrovaskulären Endothelbarriere in einem Rattenmodell für Ischämie/Reperfusion

Induktion von Myokardinfarkt und myokardialer Ischämie-Reperfusionsschädigung bei Mäusen