Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).

1. Synthese von Iridium (III) Complex <ol><li> Man wiegt 53,6 mg (50 umol) [Ir (ppy) 2 Cl] 2 und in 5 ml Methylenchlorid zu lösen. Fügen Sie diese Lösung auf eine 50 ml-Erlenmeyerkolben mit einem Rührstab ausgestattet. </li><li> Man wiegt 26,2 mg (100 umol) AgOTf und in 5 ml Methanol aufzulösen. </li><li> Fügen Sie den gelösten AgOTf in die [Ir (ppy) 2 Cl] 2 Lösung und rühren Sie 1 Stunde. Hinweis: Eine cremefarbene Aufschlämmung sollte zur Folge haben. </li><li> Nach 1 Stunde filtriert man das Aufschlämmung durch Silicagel in ein 25 x 95 mm-Dram Phiole und abzudampfen restliche Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer (5-10 min). </li><li> Nachdem das meiste Lösungsmittel entfernt wird, prüfen Sie, ob eine ölige gelbe Rückstand in der Ampulle verbleibt. Zu diesem Rückstand, fügen Sie 1 ml Methanol wieder aufzulösen, um ein Produkt zu lyophilisieren und 1-2 Tage, um den gelben festen Produkts zu ergeben. </li><li> Charakterisieren die Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + Produkt (Ir1) von H &lt;sup&gt; 1 NMR (in CDCl 3), ESI und UV-Vis wie zuvor beschrieben. 23 </li></ol> 2. Wechselwirkungen von Ir1 mit verschiedene Aminosäuren <ol><li> Vorbereitung einer 2 mM Lösung von Ir1 in Methanol (MG 537,10 g / mol). Wirbel um eine vollständige Auflösung des Feststoffes zu gewährleisten. </li><li> Vorzubereiten 100 uM Lösungen der folgenden Aminosäuren und Biomolekülen in HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCl, pH 7,4), Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Versuchen, Val. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l jeder Aminosäure in einer schwarzen 96-Well-Platte. 100 l HBS auf die Platte als eine leere dienen. </li><li> In 2,5 ul der 2 mM Ir1 Lösung zu jeder Probe und schütteln Sie die Platte auf einem Plattenschüttler für 10 min. </li><li> Nach 10 Minuten erhalten die Emissionsspektren der Proben unter Verwendung eines 96-Well-Platten-Lesegerät (365 ex / em 400-700). <ol><li> Die Platte wird in der Instrumentenplatte und öffnen Sie die Reader-Software, um die Einrichtung eines neuen Experiments. </li><li> Stellen Sie die neue experiment einen Fluoreszenz-Scan mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und einer Spaltbreite von 9 nm mit der Optik in der obersten Position zu lesen. </li><li> Lesen der Emission von 300 bis 700 nm mit einer Schrittweite von 5 nm. </li><li> Exportieren Sie die Daten für die Datenanalyse. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Proben auf eine klare Platte mit 96 Vertiefungen und Bild die Emission mit einem UV-Transilluminator. </li></ol> 3. Titration von Ir1 mit BNT-II <ol><li> Bereiten Sie eine 1 mM Stammlösung von BNT-II (MW 8233,6 g / mol) in HBS sowie eine 2 mM Lösung von Ir1 in Methanol. </li><li> Von der Stammlösung, bereiten 1 ml von 100 uM BNT-II in HBS. Mischen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, die Probe wird gemischt. </li><li> Seriell verdünnt das 100 uM BNT-II um die Hälfte in HBS auf eine Endkonzentration von 1,56 &amp; mgr; M BNT-II. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l jeder Verdünnung in dreifacher Ausfertigung mit HBS, die als eine leere, in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Zu jeder Probe, fügen 2,5 ul 2 mM Ir1. </li><li> Shake die Platte für 10 Minuten auf einem Plattenschüttler. </li><li> Nach dem Schütteln, lesen Sie die Emissionsintensität bei 510 nm (Anregung bei 365 nm) unter Verwendung einer 96-Well-Platten-Lesegerät. <ol><li> Die Platte wird in der Instrumentenplatte und öffnen Sie die Reader-Software, um die Einrichtung eines neuen Experiments. </li><li> Den neuen Versuch, einen Fluoreszenz Endpunkt mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge von 510 nm gelesen. Stellen Sie die Schlitzbreite für beide Wellenlängen zu 9 nm, mit der Optik an der Spitzenposition. </li><li> Lesen Sie die Platte und exportieren Sie die Daten für die Analyse. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Proben auf eine klare Platte mit 96 Vertiefungen und Bild die Titration mit einem UV-Transilluminator. </li></ol> 4. Echtzeit-kinetische Analyse der Ir1 / BNT-II System mit Bioschicht Interferometry <ol><li> Fügen Sie 200 ul der kinetischen Puffer (KB; 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,02% Tween-20) bis 8 Vertiefungen in der ersten Spalte einer schwarzen 96-Well-Platte und legen Sie die Platte in das KunststoffsensorHalter. Sorgfältig übertragen 8 Ni (II) NTA Biosensoren auf die erste Spalte in der Kunststoffhalter, so dass die Spitzen in die Vertiefungen der Puffer suspendiert. Setzen Sie die Kunststoffhalterung in der linken Seite der Interferometrie Instrument. </li><li> Bereiten Sie eine 2 ml einer 0,5 &amp; mgr; M Lösung von BNT-II in KB. </li><li> Bereiten Sie 500 ul einer 10 &amp; mgr; M Lösung von Ir1 in KB, und seriell um die Hälfte zu verdünnen bis 0,156 &amp; mgr; M in KB. </li><li> Auf eine neue schwarze Platte mit 96 Vertiefungen, Pipette 200 ul KB für alle 8 Wells in Spalte A und C. </li><li> In der gleichen Platte, Pipette 200 ul des 0,5 uM BNT-II-Lösung in die Vertiefungen in Spalte B </li><li> Je 200 ul jeder Verdünnung Ir1 in Spalte D, die mit KB als Rohling in gut D1. Fügen Sie die Verdünnungen so dass die Vertiefungen zu erhöhen in Ir1 Konzentration durch die Säule. </li><li> Dieses Platte des Instruments in der rechten Seite der Platte mit den Vornetzen Sensoren. </li><li> Im Bioschicht Interferometrie-Software, die Einrichtung eines Grund Kinetic Experiment durch die Definition der Platte, Test und Sensorspitzen. <ol><li> Um die Platte zu definieren, wählen Sie eine Spalte auf dem Bildschirm der rechten Maustaste, und wählen Sie die entsprechende Definition für die Brunnen. Wählen Sie &quot;Buffer&quot; für die Spalten A und C, &quot;Load&quot; für Spalte B und &quot;Probe&quot; für Spalte D. </li><li> Definieren Sie den Test in der nächsten Registerkarte, indem Sie die folgenden Schritte (Klicken Sie auf &quot;Hinzufügen&quot;): Die Gleichgewichtseinstellung (Custom), 60 sec; Loading, 120 s; Baseline, 60 sec; Association, 120 s; und Dissoziation, 300 sec. Wählen Sie das Äquilibrierungsschritt und klicken Sie doppelt auf Spalte A. Wiederholen Sie zum Laden (Spalte B), Baseline (Spalte C), Association (Spalte D) und Dissoziation (Spalte C). Wählen Sie die Ni (II) NTA-Sensoren. </li><li> Gehen Sie zum nächsten Reiter und bestätigen, dass die Sensoren in Spalte A auf der Plastiksensorhalter. </li><li> Bestätigen Sie das Experiment richtig beschrieben ist, legen Sie einen Dateinamen an, sicherzustellen, dass &quot;Verzögerung Experiment&quot; markiert ist, und drücken Sie auf &quot;Go&quot;. NAnmerkung: Durch die automatisierte Handhabung des Gerätes, sobald die kinetische Experiment wird ausgeführt, die Schritte vorkommen, wie programmiert. </li></ol></li><li> Sobald die kinetische Durchlauf abgeschlossen ist, verarbeitet die Daten in der vorgesehenen Verarbeitungssoftware. <ol><li> Doppelklicken Sie auf den Ordner mit dem Dateinamen des Interesses an dem unteren Abschnitt der Platte auf der linken Seite. Dann doppelklicken Sie auf den entsprechenden Ordner unter &quot;Kinetics&quot; im oberen Bereich der Frontscheibe. Gehen Sie zu der Registerkarte Verarbeitung. </li><li> Überprüfen Sie die Subtraktion-Box auf der linken Seite, um den Sensor Auswahlbildschirm zu öffnen. Klicken Sie rechts auf gut A4 und ändern Sie den Typ und Referenz-Well. </li><li> Markieren Sie das Kästchen neben der Y-Achse ausrichten und sicherstellen, dass die gewählte Stufe ist Baseline. Geben Sie den Zeitbereich, um die letzten fünf Sekunden der Basislinie (ca. 55-60 sec) sein. </li><li> Markieren Sie das Kästchen für die Inter-Schritt-Korrektur und wählen Align zur Dissoziation. Stellen Sie sicher, dass die Savitzky-Golay-Filter Feld markiert ist, und drücken Sie &quot;Process Data! ̶1; </li><li> Gehen Sie zu der Registerkarte Analyse. Stellen Sie sicher, dass &quot;Assoziation und Dissoziation&quot; ist die Auswahl für die Schritte zu analysieren und, dass das Modell 1: 1. Wählen Sie einen lokalen, Ganz fit und drücken Sie &quot;Fit Curves!&quot; </li><li> Markieren Sie alle Kurven in der Tabelle und der rechten Maustaste, um alle Kurven auf eine Farbe gesetzt. Als nächstes wählen Sie eine globale (Full) fit, nach Farbe und Rmax Unlinked von Sensor gruppiert. Drücken Sie auf &quot;Fit Curves&quot; globalen Kinetik Daten zu erhalten. </li></ol></li></ol> 5. On-Bead Nachweis von BNT-II und rcHRP-II mit Ir1 <ol><li> Vorbereitung jeweils 1 ml einer 1 &amp; mgr; M Lösung von BNT-II und rcHRP-II in HBS mit Tween (HBST; HBS mit 0,025% Tween 20). </li><li> Seriell jedes Protein verdünnt um die Hälfte in HBST bis zu einer Endkonzentration von 15,6 nM. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l jeder Verdünnung in dreifacher Ausfertigung in einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen, die Verdünnungen in der Reihenfolge von der niedrigsten zur höchsten Konzentration nach unten eine Spalte. </li><li> Je 10 &amp; mgr; l von 50 um Ni (II) NTA Agarose magnetischen Teilchen in jeder Verdünnung gut. <ol><li> Mischen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen die magnetischen Teilchen nach jedem Pipettieren enthält, um sicherzustellen, die Teilchen bleiben suspendiert. </li></ol></li><li> Legen Sie die Platte auf einem Plattenschüttler für 15 Minuten, um die Proben mit den Partikeln inkubiert. </li><li> Nach dieser Inkubationszeit wird die Platte auf einer Platte mit 96 Vertiefungen Magneten und warten Sie 30 sec für die Partikel aus der Lösung ziehen. </li><li> Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette, ziehen Sie die Originalprobe und entsorgen Sie als Abfall. Die Platte aus dem Magneten. </li><li> Fügen Sie 200 ul HBST in jede Vertiefung mit Hilfe der Mehrkanalpipette. Pumpen Sie den Puffer nach oben und unten mehrere Male, um die magnetischen Partikel zu waschen. </li><li> Legen Sie die Platte zurück auf den Magneten, und warten Sie 30 Sekunden für die Partikel aus der Lösung ziehen. </li><li> Unter Verwendung der Mehrkanalpipette, ziehen Sie die 200 ul Puffer und als Abfall entsorgen. Die Platte aus dem Magneten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,8 through 5.10 zweimal zu drei Waschungen der Teilchen zu vervollständigen. </li><li> 100 ul HBST in jede Vertiefung, die magnetische Teilchen, gefolgt von 2,5 ul 2 mM Ir1. </li><li> Die Teilchen mit Ir1 Inkubieren auf einem Plattenschüttler für 1 Stunde. </li><li> Nach 1 Stunde, lesen Sie die Emissionsintensität bei 510 nm (Anregung bei 365 nm) unter Verwendung einer 96-Well-Platten-Lesegerät. <ol><li> Die Platte wird in der Instrumentenplatte und öffnen Sie die Reader-Software, um die Einrichtung eines neuen Experiments. </li><li> Den neuen Versuch, einen Fluoreszenz Endpunkt mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge von 510 nm gelesen. Stellen Sie die Schlitzbreite für beide Wellenlängen bis 9 nm, mit der Optik an der Spitzenposition. </li><li> Lesen Sie die Platte und exportieren Sie die Daten für die Analyse. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Proben auf eine klare Platte mit 96 Vertiefungen und Bild die Titration mit einem UV-Transilluminator. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Als Mikropartikel-basierten Diagnosewerkzeuge kommen, um die Spitze der modernen Diagnose-Technologie, ist Nachweis von Ziel-Biomolekülen direkt auf der Oberfläche des Partikels ein großer Vorteil. Sind die traditionellen molekularen Nachweisverfahren, wie ELISA und PCR, vorteilhaft, da sie sehr niedrige Nachweisgrenze 25 erreichen. Diese Tests erfordern jedoch umfangreiche Reagenzien und langwierige Protokolle. Dieser Test wurde entwickelt, um Sandwich-ELISA-Typ-Wechselwirkungen, ohne Zeit und Reagenz Anforderungen (Abbildung 5) zu imitieren. Zusätzlich wurde die Kosten des Ir1 Sonde pro Probe auf etwa einen Cent, wohingegen die Kosten für die Antikörper für einen typischen ELISA ist $ 0,20-0,30 pro Probe. Da die oben beschriebenen Verfahren beruhen auf einer cyclometallier- Iridium Sonde zur Detektion des Malaria Biomarker würde diese Sonde nicht anfällig für Fehlerarten gemeinsam mit anderen Nachweismethoden (d. Fluorophor quenchi seinng und Antikörper / Enzymabbau). Histidin ist in seiner Metallbindungseigenschaften einzigartig. Die skizzierten Arbeits nutzt dieses Phänomen durch Ersetzen der Antikörper in einem typischen Sandwich-ELISA mit Metall enthaltende Komplexe. Ni (II) NTA erfasst rcHRP-II auf der Oberfläche des Partikels und Ir1 signalisiert die Anwesenheit des Proteins. Der wichtigste Schritt im Assay ist damit die magnetischen Partikel mit der Probe und der Sonde mischen. In einer 96-Well-Platte ELISA die Biomoleküle und Reagenzien erreichen Gleichgewicht mit der zweidimensionalen Oberfläche des Boden des Bohrlochs. Magnetpartikel haben die Tendenz, aus der Lösung absetzen aufgrund ihrer dichten Eisenoxid-Kern, der die verfügbaren Bindungsstellen reduzieren würde. Daher müssen die Teilchen während des Assays Zeit gemischt werden, um eine maximale Bindung zu gewährleisten. Bei der Gestaltung eines Reagenz zur Krankheitsdiagnose, muss man im Hinterkopf behalten die Form der Patientenprobe sowie die physiologische Konzentration der Biomarker. FürMalaria kann die Konzentration von PF-HRP-II in dem Blut eines Patienten zu günstigen picomolar hohe nanomolar variieren. Während dieser Assay für höhere Infektion klinisch relevant, die Nachweisgrenze muss, um auf asymptomatische Patienten mit niedrigen picomolar zirkulierenden pf HRP-II erkennen verbessert werden. In den oben beschriebenen Verfahren, der &quot;Einschaltbereit&quot; in der Gegenwart von Histidin durch Ir1 erzeugte Signal auftritt. Während die Malaria Biomarker ist reich an Histidin, andere Serumproteine, wie Humanserumalbumin und Histidin Glykoprotein, würde eine Signalantwort mit der Sonde hervorzurufen. Dies würde wiederum zu falsch positiven Diagnosen führen. Dies macht die Erfassung des Proteins auf der Oberfläche des Partikels eine vorteil Schritt, dass das Protein von Interesse kann schnell von einer Patientenprobe extrahiert werden. Zusätzlich Gestaltung eines bifunktionellen Sonde, dass Paare eine Histidin-reiche Peptid zu einem robusten molekulares Erkennungselement (dh. Aptamer), Könnte eine weitere Ebene der Spezifität des Tests hinzufügen. Das Peptid würde mit Iridium geladen werden, bevor die Kopplung an das Aptamer. Bei einer solchen Konstruktion kann die stabile Ir1 Sonde immer noch verwendet werden, während eine Zielspezifität mit dem Aptamer. Dies würde für die Anwendung der Sonde an nativen HRP-II in einer komplexen Matrix (d. Plasma oder Vollblut) zu ermitteln und verringern unspezifische Bindung Effekte erlauben. Um das Signal des schnellen Diagnosetests weiter zu verbessern, könnte der Test in eine elektrochemilumineszente (ECL) System, bei dem PF-HRP-II auf der RDTs als elektroAuslese 26 erfaßt werden eingearbeitet werden. Diese nächste Generation Iridium Sonde würde erheblich verbessern unsere On-Bead-ELISA-Test zum Nachweis von Biomarkern Krankheit.

Kolorimetrischen und Fluoreszenzmarkierung ist eine wichtige Methode zur Detektion und Verfolgung von biochemischen Molekülen und verarbeitet 1,2. Die häufigsten Fluoreszenzmarker sind solche niedermolekularen organischen Farbstoffe 3,4, aber diese Moleküle nicht immer ideal optische Eigenschaften. Fluoreszenzfarbstoffe sind anfällig gegen Ausbleichung, haben oft geringe Stokes-Verschiebungen und können überlappende Anregungs- und Emissionsspektren haben. Kolorimetrischen Markierung wird oft durch den Einsatz von enzymatischen Markierungen, die ein verstärktes Signal nützlich Immunoassay Quantifizierung 5,6 erreicht. Diese Enzyme haben auch ihre Nachteile, einschließlich der Lichtempfindlichkeit, den Reaktionsbedingungen und kurzen Substrat Haltbarkeit. Diese Eigenschaften sind in der Regel Immunoassays und Proteinmarkierungsmethoden benötigen, um unter kontrollierten Bedingungen mit teuren Reagenzien durchgeführt werden. Emittierenden Übergangsmetallkomplexe wurden als Alternative Kennzeichnung Ansatz fo erforschtr biochemischen Nachweis. Insbesondere cyclometallierten Ir (III) wurde im Rahmen von organischen Leuchtdioden (OLEDs) 7-9 Sauerstofferfassungs 10 untersucht, Katalyse 11 und Protein / Zellfärbung 12-14. Hohe Photostabilität und Quantenausbeute machen diese Klasse von Sonden ein guter Kandidat für Biomolekül-Erkennungs 15,16. Es wurde vorher festgestellt, dass Ir cyclometallierten (III) -Komplexe, der Form [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, irreversibel binden, Histidin und rufen eine blau-grüne Signalantwort 12,17. Diese Komplexe sind nicht emittierenden in Solvenskomplex Zustand, aber wenn Histidin verdrängt die Lösungsmittelmoleküle und bindet an das Metallzentrum, ein intensives Phosphoreszenzsignal nach langwellige UV-Strahlung freisetzen sie. Dieses Signal erst nach Ligandensubstitution, und ist das Ergebnis von einem Triplett-Zustand Elektronen Entspannung in den Grundzustand durch die Aktivierung von Metall-Ligand-Charge-Transfer (3 MLCT) und Liganden zentriert Transfer (3 LC) Pfade 8,15. Diese Komplexe können potentiell als Nachweissonden für Histidin-reiche Proteine ​​verwendet werden. Histidin-reiche Proteine ​​und deren Regulation Ebenen sind wichtig für viele Krankheiten, darunter Leberzirrhose, Krebs und thrombische Störungen. 18 Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) ist insbesondere ein gut validierten Biomarker für die Malaria-Parasiten-Infektion. Dieses Protein ist 67 kDa und enthält 34% Histidin, meist innerhalb charakteristischen AHHAHHAAD wiederholende Motive 19. Diese Wiederholungen können Histidin freien Metallionen zu binden 19 und Häm-Komplexe 20 in Wirts Blut. pfHRP-II wird gewöhnlich in geringen Ressourceneinstellungen mit immunchromatographischen Schnelldiagnosetests (RDTs) erkannt, aber diese Tests sind oft ungenau aufgrund der Probenbedingungen, niedrige Biomarker-Konzentration, schlechte Fertigungsstandards und Antikörperabbau 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Metall basierende phosphoreszierende Sonden wie cyclometallier- Ir (III) oben beschriebenen Komplexe sind attraktive Möglichkeiten für den Nachweis von pfHRP-II aufgrund ihrer selektiven Bindung von Histidin und deren stabile und effiziente Emissionseigenschaften. In diesem Dokument ist die Verwendung von [Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2] + (Ir1) zu BNT-II, einen verzweigten Peptid-Mimetikum pfHRP-II erforscht 22 detektieren. Kinetik dieser Interaktion in Echtzeit mit Bioschicht Interferometrie-Techniken überwacht. Der Test wurde auch mit einem on-bead ELISA-Typ-Format, bei nanomolaren Nachweisgrenzen erreicht wurden angepasst. Dieser Test hat das Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISAs, da es in weniger als 2 Stunden mit dem Antikörper-freie Reagenzien durchgeführt werden, anstelle der 4-5 h und biologischen Reagenzien mit typischen ELISAs erforderlich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>658383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver trifluoromethanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNT-II peptide</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant HRPII</td>
			<td>Immunology Consultants Laboratory inc.</td>
			<td>AGPF-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar white polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grenier black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA magnetic agarose particles</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>36111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H4 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Biotech Transilluminator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FBDLT-88</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

iridium(iii) luminescent probe for detection of the malarial protein biomarker histidine rich protein-ii

Diese Arbeit beschreibt die Synthese einer nicht-emittierende cyclometallierte Ir (III) -Komplexes, Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), die eine schnelle und langlebiges phosphoreszierende Signal auslöst, wenn sie einem Histidin koordiniert enthaltenden Proteins auf der Oberfläche eines magnetischen Partikels immobilisiert. Synthese von Ir1, in hohen Ausbeuten, ist eine vollständige O / N und beinhaltet das Teilen des Muttercyclometallierten Ir (III) Chlor-verbrückten Dimer in zwei Äquivalente des solvatisierten Komplexes. Um die Spezifität zu bestätigen, wurden mehrere Aminosäuren, die für die Koordination Aktivität untersucht, wenn auf das synthetisierte Sonde aufgenommen und nur Histidin löste eine Signalantwort. Verwendung BNT-II, einen verzweigten Peptid-Mimetikum Malaria Biomarker histidinreichem Protein II (pfHRP-II), wurde das Iridium-Sonde als ein Werkzeug für HRP-II Detektions validiert. Abschrecken Effekte wurden im BNT-II / Ir1 Titration festgestellt, wenn im Vergleich zu L-Histidin / Ir1, diese wurden auf sterische Hinderung und Tri zurückzuführenPlet Zustand Abschrecken. Bioschicht Interferometrie wurde verwendet, um in Echtzeit die Kinetik der Wechselwirkung des Ir1 mit BNT-II zu bestimmen. Sobald das System optimiert wurde die Nachweisgrenze von rcHRP-II unter Verwendung der Sonde festgestellt, daß 12,8 nM in Lösung sein. Wenn dieses Protein auf der Oberfläche einer 50 um magnetische Agarose Teilchen immobilisiert, die Nachweisgrenze lag bei 14,5 nM. Die robuste Signalantwort dieses anorganischen Sonde sowie ihre Flexibilität im Einsatz in Lösung oder auf einer Oberfläche immobilisiert ist, kann sich in Richtung auf eine Vielzahl von Anwendungen verleihen, aus diagnostischen Anwendung zur Bilderzeugung.

Wie in Abbildung 1, Synthese der Ir1 Solvenskomplexes-Komplex beteiligte Aufspaltung des Chlorid Brücke in der Mutter Dimer durch Ausfällung des Chlorids in Form von unlöslichen AgCl und Vereinigung von Wassermolekülen an das Metallzentrum dargestellt. Die Bildung von Ir1 wurde von H 1 NMR und ESI bestätigt. Zusätzlich wurden UV-Vis-Banden charakteristisch für Metall-Ligand-Charge-Transfer-und π-π * Übergänge zu dem Spektrum zugeordnet, ferner die Validierung der Bildung von Ir1. Das solvatisierte Komplex weist keine emittierende Charakter, wenn sie bei 365 nm angeregt wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> Fig. 1: Synthese und Charakterisierung von Ir1 Chloride Brückenspaltungsreaktion von Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) phenyl) diiridium (III), um die Aquokomplex Ir erstellen (ppy) 2 (H 2 O) 2 </sub&gt; + (Ir1). Bei Zugabe von L-His zur Aquokomplex in wässrigem Puffer, Leuchtsignal eingeschaltet ist. Sobald der Komplex synthetisiert und charakterisiert wurde die Aminosäureselektivität analysiert, wie zuvor unter Verwendung eines ähnlichen Iridium Analog 17 beschrieben. 2A zeigt, daß nur Histidin löste eine Signalantwort bei 510 nm, wenn sie bei 365 nm angeregt wird. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> Figur 2: Aminosäure-Selektivität und Titration von Ir1 mit histidinreichem Peptide (A) Zusammenspiel von 200 uM verschiedener Aminosäuren (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) mit 50 &amp; mgr; M. Ir1 in HBS. Spektrale Scans wurden von 400 bis 700 nm bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm in einer schwarzen 96-Well-Platte entnommen. Signal in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) von allen Aminosäuren besides Histidin (gestrichelte schwarze Linie) war vernachlässigbar. (B) nanomolaren Konzentrationen von BNT-II (▪) und rcHRP-II (♦) wurden mit Ir1 in HBS titriert. Die Histidin-reiche Peptide wurden mit der Sonde für 15 min in der Lösung vor dem Ablesen der Emission bei 510 nm nach Anregung mit 365-nm-Licht inkubiert. Nachweisgrenze wurde als Wert von x, wenn y = 3σ blank berechnet. Dieses &quot;on-Schalter&quot; der Phosphoreszenz des Iridium-Sonde tritt auf, weil die angeregten Singulettzustand (1 MLCT / 1 LC) des Ir (III) Biokonjugat erfährt Intersystem Crossing zum Triplett angeregten Zustand (3 MLCT), wenn Histidin koordiniert mit dem Metallzentrum. Diese Sonde wurde ein Peptid Mimik des Malaria-Biomarker Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pf HRP-II) zu BNT-II angewendet. In einer Titration von BNT-II mit Ir1, eine konzentrationsabhängige Signalantwort beobachtet ( <strong&gt; 2B). Rekombinante HRP-II (rcHRP-II) zeigte auch eine ähnliche Reaktion in Lösung. Die Nachweisgrenze der BNT-II und rcHRP-II in Lösung waren 54,8 nM und 12,8 nM. Verwendung Bioschicht Interferometrie-Techniken, die K D von Ir1 Bindung an BNT-II immobilisiert auf einem Ni (II) NTA-Oberfläche wurde gefunden, dass 2,05 &amp; mgr; M (Figur 3) sein. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> Abbildung 3: Echtzeit-kinetische Analyse Ir1 mit BNT-II Bioschicht Interferometrie für kinetische Analyse von verschiedenen Konzentrationen von Ir1 Bindung an BNT-II auf der Oberfläche eines Ni (II) NTA Glassensor.. Nach Äquilibrieren der Sensoren in KB (Region A) sind die Sensoren mit 0,5 uM BNT-II (Region B) geladen. Sobald das Peptid an den Sensoren geladen wird, wird ein Ausgangswert festgelegt (Region C) vor der Messung der Assoziation von Ir1 zum BNT-II (Region D). Nacheine Zeit der Vereinigung werden die Sensoren wieder in KB gesetzt, um die Dissoziation (Region E) zu messen. Die gesamte kinetische Analyse Vorgang dauert weniger als 30 Minuten. Wenn von einer Lösung basierenden Assay an ein magnetisches Teilchen Plattform, die zusätzliche Komplexität des Teilchens in dem System musste berücksichtigt werden. Es wurde aus früheren Arbeiten bekannt ist, dass diese Partikel effizient die Malaria Biomarker pf HRP-II zu binden. 24 Black Fluoreszenzplatten funktionierte gut für die Lösung Assay oben beschreiben, aber weiße Platten für die on-Partikeldetektionsplattform besser geeignet waren, wie in gesehen 4A. In einer weißen Platte wird das Licht zurück in die Probe reflektiert wird, wodurch eine bessere Absorption der Ir1 auf die Oberfläche des Partikels gebunden ist. Im On-Partikel-Assay wird die Nachweisgrenze der rcHRP-II wurde bestimmt, dass 14,5 nM (4B) ist. Die Nachweisgrenze für rcHRP-II-Lösung und von partikel waren STATISTMtisch die gleiche Basis eines ungepaarten t-Test (p = 0,731). <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> Abb. 4: On-bead Nachweis von BNT-II und HRP-II (A) Differenzen zwischen dem von Ir1 BNT-II auf der Oberfläche von 50 um Ni gebunden erfassten Signals (II) NTA magnetische Agarose-Teilchen in einem schwarzen 96- Well-Platte (durchgezogene Linie) im Vergleich zu einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen (gestrichelte Linie). Die Partikel wurden mit 365 nm Licht angeregt und die Emission wurde bei 510 nm gemessen. (B) Die Titration rcHRP-II auf den magnetischen Teilchen immobilisiert und unter Verwendung Ir1. Nachweisgrenze wurde als das va berechnetlue von x, wenn y = 3σ leer. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> Abbildung 5: Schematische Darstellung des On-Bead-Erkennung von rcHRP-II mit Ir1 Allgemeine Systematik der HRP-II-Bindung an der Oberfläche des Ni (II) NTA-Teilchen und mit Ir1 gekennzeichnet.. Die Partikel werden mit einem histidinreichem Peptid für 15 min inkubiert. Nach diesem Inkubationszeitraum werden die Partikel mit Hilfe eines Magneten HBST, um die Teilchen aus der Lösung zu ziehen gewaschen. Schließlich können die Peptid gebundene Partikel mit Ir1 für 1 h vor dem Ablesen der Emission bei 510 nm nach Anregung mit Licht von 365 nm inkubiert.

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IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Iridium (III) Lumineszierende Sonde zum Nachweis von Malaria-Protein Biomarker Histidin Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

iridium-iii-luminescent-probe-for-detection-malarial-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

9.1K Aufrufe.  Vanderbilt University. Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Serie: IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Ice binding proteins (IBPs), also known as antifreeze proteins, inhibit ice growth and are a promising additive for use in the cryopreservation of tissues. The main tool used to investigate IBPs is the nanoliter osmometer. We developed a home-designed cooling stage mounted on an optical microscope and controlled using a custom-built LabVIEW routine. The nanoliter osmometer described here manipulated the sample temperature in an ultra-sensitive manner.

LabVIEW-betriebenen Novel Nanoliter Osmometer für Ice Binding Protein Untersuchungen

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Forschung

Chemie

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Quantitative und qualitative Untersuchung der Partikel-Partikel Wechselwirkungen mit Kolloidales Probe Nanoskopie

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Sedimentationsgleichgewicht eines Klein Oligomer bildenden Membrane Protein: Wirkung von Histidin Protonierung auf pentamere Stabilität

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are rapidly oxidized, for example by atmospheric oxygen, to indigo type dyes. This reaction enables fast and easy screening in vivo without isolation or purification of enzymes, as well as rapid tests on agar plates or in solution (e.g., blue-white screening, micro-wells) and is used in biochemistry, histochemistry, bacteriology and molecular biology. Unfortunately the synthesis of such substrates proved to be difficult, due to various side reactions and the low reactivity of the indoxyl hydroxyl function. Especially for glucose type structures low yields were observed. Our novel approach employs indoxylic acid ester as key intermediates. Indoxylic acid esters with varied substitution patterns were prepared on scalable pathways. Phase transfer glycosylations with those acceptors and peracetylated glycosyl halides can be performed under common conditions in high yields. Ester cleavage and subsequent mild silver mediated glycosylation yields the peracetylated indoxyl glycosides in high yields. Finally deprotection is performed according to Zempl&#233;n.

Indoxyl glycosides are well-established and widely used tools for enzyme screening and enzyme activity monitoring. Especially for glucose type structures previous syntheses proved to be challenging and low yielding. Our novel approach employs indoxylic acid esters as precious intermediates to yield a considerable number of indoxyl glycosides in good yields.

Synthese von Indoxyl-Glykoside zum Nachweis von Glycosidase Aktivitäten

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

HPLC-Messung der DNA-Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-Desoxyguanosin, in kultivierten Zellen und tierischen Geweben

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding the role of complexes in biological systems. While the direct characterization of biomolecular assemblies has become increasingly important in recent years, native fractionation techniques that are compatible with downstream analysis techniques, including mass spectrometry, are necessary to further expand these studies. Nevertheless, the field lacks a high-throughput, wide-range, high-recovery separation method for native protein assemblies. Here, we present clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), which is a novel separation modality for non-covalent protein assemblies. CN-GELFrEE separation performance was demonstrated by fractionating complexes extracted from mouse heart. Fractions were collected over 2 hr and displayed discrete bands ranging from ~30 to 500 kDa. A consistent pattern of increasing molecular weight bandwidths was observed, each ranging ~100 kDa. Further, subsequent reanalysis of native fractions via SDS-PAGE showed molecular-weight shifts consistent with the denaturation of protein complexes. Therefore, CN-GELFrEE was proved to offer the ability to perform high-resolution and high-recovery native separations on protein complexes from a large molecular weight range, providing fractions that are compatible with downstream protein analyses.

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

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Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Color Spot Test As a Presumptive Tool for the Rapid Detection of Synthetic Cathinones

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and other border protection agencies globally. Color testing is a presumptive identification technique indicating the presence or absence of a particular drug class using rapid and uncomplicated chemical methods. Owing to their relatively recent emergence, a color test for the specific identification of synthetic cathinones is not currently available. In this study, we introduce a protocol for the presumptive identification of synthetic cathinones, employing three aqueous reagent solutions: copper(II) nitrate, 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline (neocuproine) and sodium acetate. Small pin-head sized amounts (approximately 0.1-0.2 mg) of the suspected drugs are added to the wells of a porcelain spot plate, and each reagent is then added dropwise sequentially before heating on a hotplate. A color change from very light blue to yellow-orange after 10 min indicates the likely presence of synthetic cathinones. The highly stable and specific test reagent has the potential for use in the presumptive screening of unknown samples for synthetic cathinones in a forensic laboratory. However, the nuisance of an added heating step for the color change result limits the test to laboratory application and decreases the likelihood of an easy translation to field testing.

Here we present a simple, inexpensive, and selective chemical spot test protocol for the detection of synthetic cathinones, a class of new psychoactive substances. The protocol is suitable for use in various areas of law enforcement that encounter illicit material.

Vor Ort Farbtest als mutmaßlichen Werkzeug für die schnelle Erkennung von synthetischen Cathinone

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, tuberculosis, lung cancer, and liver disease. This protocol describes a reproducible method for sampling breath in children and then stabilizing breath samples for further analysis with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The goal of this method is to establish a standardized protocol for the acquisition of breath samples for further chemical analysis, from children aged 4-15 years. First, breath is sampled using a cardboard mouthpiece attached to a 2-way valve, which is connected to a 3 L bag. Breath analytes are then transferred to a thermal desorption tube and stored at 4-5 &#176;C until analysis. This technique has been previously used to capture breath of children with malaria for successful breath biomarker identification. Subsequently, we have successfully applied this technique to additional pediatric cohorts. The advantage of this method is that it requires minimal cooperation on part of the patient (of particular value in pediatric populations), has a short collection period, does not require trained staff, and can be performed with portable equipment in resource-limited field settings.

This protocol describes a simple method for the acquisition of breath samples from children. Briefly, samples of mixed air are pre-concentrated in sorbent tubes prior to gas chromatography-mass spectrometry analysis. Breath biomarkers of infectious and non-infectious diseases can be identified using this breath collection method.

Atem-Sammlung von Kindern für Krankheit Entdeckung von Biomarkern

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, when used together, can indicate the presence of gunshot residue (GSR) by producing a fluorescence signal in the presence of three key analytes (antimony, lead, and organic components of GSR). The protocol describes the synthesis of the biosensors using Escherichia coli (E. coli), and the analytical chemistry methods used to evaluate the selectivity and sensitivity of the sensors. The functioning of the system is demonstrated by using GSR collected from the inside of a spent cartridge casing. Once prepared, the biosensors can be stored until needed and can be used as a test for these key analytes. A positive response from all three analytes provides a presumptive positive test for GSR, while each individual device has applications for detecting the analytes in other samples (e.g., a detector for lead contamination in drinking water). The main limitation of the system is the time required for a positive signal; future work may involve studying different organisms to optimize the response time.

A protocol is presented using synthetic biology techniques to synthesize a set of bacterial biosensors for the analysis of gunshot residue, and to test the functioning of the devices for their intended use using fluorescence spectroscopy.

Vorbereitung und Anwendung eines neuen bakteriellen Biosensors für die präventive Erkennung von Gunshot Residue

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Iridium (III) Lumineszierende Sonde zum Nachweis von Malaria-Protein Biomarker Histidin Rich Protein-II

Zusammenfassung

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