Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse EY019312 und EY021126 (VJK), EY002687 an die Augenklinik und Visual Sciences an der Washington University unterstützt und von der Forschung zur Verhütung Blindheit.

Alle Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Studies Committee an der Washington Universität zugelassen. 1. Einrichten der Perfusion und Probenständer <ol><li> Bereiten Lösung für Netzhautblutung frisch am Tag des Experiments. Verwenden Sie destilliertes und deionisiertes Wasser. Verwenden Sie eine der folgenden drei Lösungen. <ol><li> Bereiten bicarbonathaltige Ames-Lösung (1 l): 1 Flasche Ames &#39;Medien und 1,9 g NaHCO 3, </li><li> Vorbereitung Locke-Lösung (in mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na-Succinat, 0,5 Na Glutamat, 0,02 EDTA und 10,0 Glucose, 0,1% MEM-Vitamine und Aminosäuren Säuren </li><li> Vorbereitung HEPES-gepufferter Ringer-Lösung (in mM): 133,3 NaCl, 3,3 KCl, 2,0 MgCl 2, 1,0 CaCl 2, 10,0 Glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHeingestellt auf 7,5 ~ 5,8 ml 1 M NaOH, fügen 0,72 g / L Kulturmedium Leibovitz L-15. Verwenden Sie 20 bis 50 &amp; mgr; M DL-AP4 und 50 bis 100 &amp; mgr; M BaCl 2, um den Photorezeptor Antwort mit jeder Perfusion Medien zu isolieren. </li></ol></li><li> Vorbereitung Lösung für Elektroden 28 (in mM): 140,0 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 3 HEPES, 0,01 EDTA und pH-Wert auf 7,4 bis 7,5 mit NaOH. Elektrodenlösung kann bei Raumtemperatur mehrere Monate gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie und testen Sie den Probenhalter. <ol><li> Kleben Sie schwarz / grau Filterpapier auf der Oberseite der Kuppeln der untere Teil des Probenhalters (siehe Abbildung 1A). Verteilt zweikomponentigen 5 min Epoxidkleber vorsichtig um die Kanten der flachen Oberseiten der Dome. Wenn nötig, machen Sie es unter Dissektionsmikroskop. </li><li> Warten Sie, bis der Leim ist fast trocken (ca. 4 min) und drücken Sie die Filterpapier auf den Kuppeln unter Verwendung einer Flachs Artikel. Kleber Filterpapier mindestens einen Tag vor dem Experiment. DieFilterpapier kann mehrfach verwendet werden, sollten aber nach einem Monat der Aufnahmen ersetzt. Verwenden Sie 70% Ethanol zum Kuppeln sorgfältig von jedem Kleberrückstand reinigen vor der Installation der Ersatzpapier. </li><li> Füllen Sie die Elektrode Kanäle mit Elektrodenlösung versucht, alle Luftblasen zu vermeiden, und schrauben Pelletelektroden mit einem Gewindeadapter in die Elektrodenkanäle eingeschlossen (siehe 1A und B). Verbinden Sie die oberen und unteren Teile des Probenhalters mit vier Schrauben und füllen Sie die Perfusion Linien mit Elektrodenlösung. </li><li> Den Widerstand und die Spannung zwischen den Leitungen jedes Elektrodenpaar mit einem Multimeter (1B). Widerstand sollte unter 100 &amp; omega; k und die Spannung unter 10 mV, wenn die Kanäle sind blasenfrei und die Elektroden in einem guten Zustand sind sein. </li></ol></li><li> Gießen Sie 400-700 ml Perfusion Medien in der Glasflasche. Getrennte und weitere 300 ml in der Präparation der Netzhaut und s verwendet werdenriss es in einem Kühlschrank. Stellen Sie den Infusionsschlauch in den Wärmetauscher-Block und setzen Sie den vorgeheizten Block auf der Heizplatte (siehe Abbildung 1D). </li><li> Schließen Sie die Flasche mit einer Kappe, die hat Verbindungen zu 2 / O 2 Gas Co (wenn Ames &#39;oder Lockes verwendet wird) und für Infusionsschlauch (siehe Abbildung 1D). Heizen Sie die Flasche mit den Medien, um 37 o C und auf der Heizplatte oder auf der Oberseite des Lichtstimulationseinheit in einem Wasserbad auf 37 festgelegt - 39 o C 17. <ol><li> Prime die Perfusion Linien durch Perfusion mit Medium füllen sie das schwerkraftgetriebenen Strömung zu initiieren. <ol><li> Im LKC-System, stellen Sie die Flasche auf der Oberseite des Stimulators Einheit 17, um eine signifikante Gravitationsfluss, wird dann durch Durchflussregler, ohne durch die Senkung Ebene der Perfusionslösung in der Flasche während des Experiments beeinflusst angepasst werden. </li><li> In Ocuscience System, legen Sie die perfusion Flasche innerhalb des Faradayschen Käfigs, um das Rauschen zu minimieren und legen lange Perfusion Ausgangsleitungen von dem Probenhalter (siehe Schritt 2.8) und unterhalb des Niveaus des Probenhalters (und die Perfusion Flasche) zur Schwer Antrieb der Lösung zu erhöhen. Schirmen diese Ausgangsleitungen und die Abschirmung auf Masse des Verstärkers, um die Kopplung des elektromagnetischen Störungen auf das ERG-Signal zu vermeiden. </li></ol></li></ol></li><li> Stellen Sie die Durchblutung und zum 3 - 5 ml / min unter Verwendung von Durchflussreglern. Schließen Sie 5% CO 2/95% O 2 Gas aus einem Zylinder mit der richtigen Regler und stellen Sie die Durchflussrate zu stabilen Blasenbildung der Medien in der Flasche durch einen Luftstein zu gewährleisten. </li></ol> 2. Probenvorbereitung <ol><li> Montieren Sie sauber und scharf Dissektionsinstrumente einschließlich gerader Blattmikroschere, eine oder zwei 45 o Pinzette, Rasierklinge und ein rechteckiges Stück Filterpapier. </li><li> Pour etwa 200 ml kaltem Perfusion Lösung in eine große Petrischale, so dass der gesamte untere Teil des Probenhalters (einschließlich der Hauben) können in die Lösung eingetaucht werden. Dieser Schritt wird wichtig, wenn die Montage der Netzhaut auf den Kuppeln (siehe Schritt 2.6). Obwohl einige Lösungen wurden entwickelt, um mit Carbogen (5% CO 2/95% O 2) gesättigt werden, ist dies nicht wesentlich für die Zwecke Dissektion und war nicht in der hier beschriebenen Experimente durchgeführt. </li><li> Für ein typisches Experiment, halten Tiere in 12/12 Stunden hell / dunkel-Zyklus und dunkel passen sie für 6-12 Stunden vor den Aufnahmen. Euthanize das Tier durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte unter dim rotes Licht und alles tun, die folgenden Verfahren, in dim rot oder IR-Licht (Verwendung zB Rotfilter vor dem Mikroskoplichtquelle). <ol><li> Ziehen Sie die Augen, die von mit einer Pinzette und setzen Sie sie in den Medien. Platzieren Sie ein Auge in einer Zeit auf einem kleinen Stück Papier (zB einige regelmäßige Filterpapier) und machen soleuchtet etwa auf dem Niveau der Ora serrata, während das Auge mit einer Pinzette (dies ist außerhalb der Lösung hier getan) hält. </li></ol></li><li> Schneiden Sie entlang der Ora serrata (oder näher am Äquator des Auges) mit Mikroschere und entfernen Sie die Hornhaut und die Linse. Setzen Sie die Augenmuschel in der kalten Medien im großen Petrischale und wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Auge. </li><li> Schneiden Sie einen kleinen Schnitt von der Spitze der Augenmuschel zum Sehnerv hin, indem sie die Schere zwischen der Netzhaut und Lederhaut, um die Netzhaut so intakt wie möglich zu halten. Fassen Sie die Lederhaut von beiden Seiten des Einschnitts durch Verwendung von zwei Pinzetten und die Pinzette ziehen voneinander entfernt, um die Netzhaut zu lösen. <ol><li> Schneiden Sie den Sehnerv und versuchen, die Netzhaut mit einem Minimum an physischen Kontakt mit dem distalen Oberfläche zu isolieren. RPE wird meist automatisch lösen sich von der Netzhaut während der Präparation Prozess. Es ist wichtiger, um mechanische Störungen der Netzhaut, als die Vorform zu vermeidendissection schnell, in der Regel die Netzhaut kann mindestens 30 min in der Lösung inkubiert werden, ohne signifikante Auswirkungen auf die Antworteigenschaften. </li></ol></li><li> Montieren Sie die Netzhaut auf die Kuppeln des Probenhalters (Abbildung 1c). Tauchen Sie den unteren Teil des Probenhalters in der Petrischale mit den Netzhäute präpariert. Gleiten die Retina, Photorezeptorseite (die konvexe Oberfläche des isolierten Netzhaut) nach oben, oberhalb der Kuppel und heben Sie den Probenhalter, so dass der Netzhaut legt auf dem Filterpapier. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Netzhaut. </li><li> Trocknen Sie die Halteplatte vorsichtig, um elektrische Übersprechen zwischen der Netzhaut sowie Rausch- und Signal Rangieren zu verhindern. Probenhalter ist mit O-Ringen um den unteren Teil Kuppeln verschüttet wird zwischen der unteren und oberen Teile des Halters zu verhindern als auch die elektrische Isolierung der Photorezeptor und die Ganglienzellseiten der einzelnen Netzhaut zu helfen. Befestigen Sie den oberen Teil der Halterung mit den vier Schrauben (siehe Abbildung 1B) und füllen Sie die Perfusion Kanäle mit Perfusionslösung unter Verwendung einer Spritze und eine Nadel. </li><li> Übertragen der Probenhalter neben dem Wärmetauscherblock und Verbinden der Eingangs- und Ausgangs Perfusionsleitungen zur Probenhalterung (Figur 1D). Die Elektroden an der ERG-Verstärker (oberen Elektroden zu verbinden, um den Boden / Minus-Pin in den Verstärker) und befestigen Sie den Stimulator / Steuereinheit auf dem Probenhalter, indem Sie einen Adapter oder schieben Sie das Heizkissen in den Stimulatoreinheit je nachdem, welche in vivo ERG System verwendet wird. </li></ol> 3. Recordings <ol><li> Konfigurieren Sie die Verstärker und Reiz von Einstellungen mithilfe von Software der in vivo-System. Stellen Sie den Akquisitionsfrequenz auf einen Wert zwischen 1 und 10 kHz und eine Tiefpaßfilterung bis 300 Hz. Verwenden Sie keine Hochpassfilterung. Verwenden Sie 60 Hz (oder 50 Hz in Europa) Notch-Filter, falls erforderlich. </li><li> Nehmen Sie Grundlinie ohne Lichtstimulation und Witzh dim Stimulation (z. B. grünes Licht von -35 dB oder 0,3 mCd sm -2), die für eine gute elektrische Verbindung zwischen den Elektroden und der Netzhaut Probe zu testen. Warten Sie 10 bis 20 Minuten vor dem Beginn der Datenerfassung, so dass Netzhauttemperatur und Funktion zu erreichen einen stabilen Zustand. <ol><li> Wählen Reizparameter nach einem bestimmten Experiment und starten Sie die Datenerfassung. ZB verwenden grünes Licht von -40 bis 0 dB oder 0,1 bis zu 1.000 mCd sm -2 für eine scotopic Reaktion Familie. Verwenden Sie etwa 2 bis 3 log-Einheiten heller Blitze in photopischen Aufzeichnungen, wo Stangen müssen von Hintergrundlicht unterdrückt werden (3-30 Cdm -2) oder eine Sonde Flash (etwa 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, siehe Abbildung 3). </li><li> Beachten Sie jedoch, dass die exakte Lichtintensitätswerte könnten etwas abhängig von Ihrem System-Kalibrierung und experimentellen Bedingungen sein. Als Faustregel gilt, Stufenstärken aufgeschlüsselt nach 5-10-fache im Vergleich zu in vivo </em&gt; Aufnahmen bei der Verwendung von grünem Licht 17. Eine schwarze Abdeckung mit Öffnungen oberhalb der Netzhaut (im Gewerbeadaptersystem im Lieferumfang enthalten) kann verwendet werden, um die Lichtstreuung in den Probenhalter zu reduzieren und eine homogene und gleich Stimulation beider Netzhäute von der Ganzfeld Sphäre der kommerziellen in vivo Systeme werden. HINWEIS: Bei sich von dunkeladaptierten Retina, die Intensitäten der Testwallungen bei einem typischen Experiment Bleich nur ein vernachlässigbarer Anteil des Pigments verwendet wird, so dass das Fehlen von RPE getriebenen Regeneration kein Thema ist. Darüber hinaus hat es sich bereits gezeigt, dass Konus Pigment Regeneration noch Platz in der isolierten Netzhaut über den Müller Zelle visuellen Zyklus 20 zu nehmen. </li></ol></li><li> Wie Versuche dauern typischerweise 30 min bis zu mehreren Stunden, überwacht die Basisliniendrift, Geräuschpegel und Reaktionsstabilität während des Versuchs als Änderungen könnten diese technischen Probleme anzugeben. HINWEIS: Erhöhter Schall oder Abnahmed Antwortamplituden kann darauf hindeuten, Luftblasen in den Perfusion oder Elektrodenkanäle, zu niedrige oder hohe Temperatur, Lösung Leck / Spill oder Verschiebung der Netzhaut. </li></ol> 4. Reinigung <ol><li> Nehmen Sie den Probenhalter aus den Perfusion Linien, öffnen Sie sie und spülen Sie die Netzhaut von dem Filterpapier. Entfernen Sie die Elektroden und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser (nicht mit Ethanol). Reinigen Sie den Probenhalter (einschließlich der Perfusions-Kanäle) mit Ethanol und / oder destilliertes Wasser. Flush Infusionsschlauch vorsichtig mit&gt; 70% Ethanol. </li><li> Spülen Sie die Durchblutung Flasche mit destilliertem Wasser (keine Reinigungsmittel). Ethanol kann auch verwendet werden, um die Flasche zu reinigen. </li></ol>

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Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).</li><li>Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesopic+background+lights+enhance+dark-adapted+cone+ERG+flash+responses+in+the+intact+mouse+retina:+a+possible+role+for+gap+junctional+decoupling.">Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling.</a> J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).</li><li>Gouras, P., MacKay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+in+amplitude+of+the+human+cone+electroretinogram+with+light+adaptation.">Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).</li><li>Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+mouse+cone-mediated+electroretinogram+during+light+adaptation.">Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation.</a> Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).</li></ol>

Washington University in St. Louis hat einen Lizenzvertrag mit Xenotec, Inc. und können eine Lizenzgebühren aus dem Verkauf der ex vivo-Adapter zu erhalten.

<html> Wir zeigen hier die entscheidenden Schritte zur gleichzeitigen Gewinnung hochwertiger ex vivo ERG Aufnahmen aus zwei isolierten Maus Netzhaut durch die Verwendung in vivo ERG Systemkomponenten zusammen mit einem Ex-vivo-ERG-Adapter. In dieser Studie haben wir die beiden perfundiert Retinae von dem Tier mit der gleichen Lösung (entweder Ames, Locke oder Ringer), aber es ist auch möglich, jeden Netzhaut mit einer anderen Lösung, zB perfundieren, Drogentestzwecke. Die wichtigsten Schritte für den Erhalt von qualitativ hochwertigen Daten Abschirmung von elektromagnetischen Störungen, die sorgfältige Präparation der Netzhaut, stabile und relativ schnelle Strömung Perfusion mit einer fortgeschrittenen maßgeschneiderte Probenhalter und die Durchführung aller Probenvorbereitungsverfahren unter dim rot (oder IR) Licht. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die sofortige Nutzung der beiden Netzhäute und Dual Verwendung eines in vivo ERG-Setup, in vivo und ex vivo ERG Aufnahmen durchzuführen. _content &quot;&gt; Die angefertigten ex vivo ERG Probenhalter vor kurzem von uns 17 ausgebildet, und jetzt im Handel erhältlich, verbessert SNR durch effiziente elektrische Trennung der proximalen und distalen Teile der Netzhaut und optimiert die Durchblutung Strom über der Netzhaut (hohe Lösungswechselkurs .) Fehlen der langsamen Frequenzrauschkomponenten in ex vivo ERG Signal ermöglicht quantitative Analyse auch von sehr kleinen Reaktionen wurde jedoch gefunden, dass Ex-vivo-Aufnahme ist anfälliger für Störungen des AC-Netzleitungsrauschen (60 Hz in den USA,. 50 Hz in Europa) als in vivo-Experimenten. Dieses Rauschen zu dem Signal hauptsächlich durch die Perfusion Leitung gekoppelt ist, und es kann vor allem durch Abschirmung (und Erdung) aller Perfusion Komponenten (Flasche, Schläuche), die sich außerhalb des Faradayschen Käfigs oder Ganzfeld-Bereich entfernt werden, . Darüber hinaus manchmal 60 Hz Rauschen zu dem ex vivo ERG-Signal durch den Wärmetauscher gekoppelt ist, und dieses Rauschen kann auch durch Erdung entfernt werden. &lt;/ P&gt; Wir zeigen, wie bestimmte ERG Signalkomponenten durch Zugabe von pharmakologisch Blocker in das Perfusionssystem während des Versuchs erlaubt Dissektion der Funktion verschiedener Zelltypen in der gleichen Netzhaut / Experiment mit drei unterschiedlichen physiologischen Perfusionsmedium (Abbildung 2) zu entfernen. Eine neuere Studie hat gezeigt, dass die Wahl des Photorezeptors beeinflußt Perfusionsmedien Physiologie in Einzelzellaufzeichnungen 32. Hier Ames, Locke und &quot;HEPES-Ringer Medien verwendet wir dunkeladaptierten Flash-Antworten in Abwesenheit und Gegenwart von pharmakologischen Reagenzien bestimmt, den Photorezeptor-Komponente des ERG-Signal (Figur 2) zu isolieren, zu erfassen. Bicarbonat-gepufferten Lösungen gab größere a- und b-Wellenamplituden bis zu 1 mV. Photorezeptor dim Blitzreaktionen unter Lockes Medium mit Blocker enthalten komplizierte Wiedergewinnungswellenform (siehe Einschub in Abbildung 2D), die nicht mit AmesR gesehen wurde17; oder Ringer-Perfusion. Wenn die Verwendung von ex vivo ERG wird um mehr Labors angepasst wäre es hilfreich, die gleichen Perfusion Medien und Standardverfahren verwenden, um verschiedene Signalkomponenten zu isolieren. An dieser Stelle scheint es, dass die vielseitigste Option ist der Ames &#39;Medium, weil es stabil ist und große a- und b-Wellenamplituden. Darüber hinaus ist die Photorezeptorantwort, isoliert pharmakologisch in dieser Lösung scheint eine einfache Wellenform erinnert an die von einzelnen Photorezeptoren (2E) festgehalten wird. Dennoch bleiben einige offene Fragen über die Existenz von anderen unter in vivo Bedingungen beobachtet ERG Signalkomponenten. Zum Beispiel in unserer ex vivo Aufnahmebedingungen haben wir nicht gesehen prominente oszillierenden Potentiale 100-150 Hz schwingenden Wellen, die in der Regel in der steigenden Phase der b-Welle eines in vivo ERG Reaktion beobachtet. Es ist somit möglich, dass der innere Retinafunktion in unserem ex vivo </em&gt; Bedingungen wurde kompromittiert obwohl große Ex-vivo-b-Wellen lebensfähig bipolaren Zellfunktion in Verbindung gebracht. Künftige Studien sollten zu beheben, ob Änderungen in der hier gezeigten Versuchsprotokolle (Dissektion, Perfusion etc.) würde uns erlauben, oszillierenden Potentiale unter ex vivo Bedingungen aufzunehmen. Cone-Funktion ist entscheidend für unsere Vision. Allerdings ist Untersuchung von Kegeln durch ihre geringe Größe und der Knappheit vor allem in der Netzhaut der Maus 33 behindert. Isolierung von Kegel-Funktion ist in der Maus ERG Aufnahmen noch komplizierter, weil ihre M-Zapfen und Stäbchen haben fast identische spektralen Empfindlichkeiten 30. Standardprotokolle nutzen die mehrere log-Einheit Unterschied zwischen Stäbchen und Zapfen Empfindlichkeiten unter Verwendung stabunterdrückt Hintergrundlicht. Jedoch wird stetig Hintergrundlicht bekannt, Stangen 34,35 desensibilisieren und beeinflussen Kegel-Funktion möglicherweise durch Modulation der Gap Junction Kopplung zwischen Stäbchen und Zapfen &lt;sup&gt; 36,37. Somit ist es schwierig, eine Hintergrundlichtintensität, die hell genug, um Stangen gesättigt, ohne die Zapfen zu halten, ist zu finden. Hier zeigen wir eine alternative Doppelblitz-Methode, die die Vorteile von sowohl der niedrigeren Empfindlichkeit und schnellere Wiederherstellung Kinetik der Zapfen 19,29,30 erfolgt. Auf diese Weise ist es leichter, wirklich dunkeladaptierten kegel vermittelte Reaktionen zu isolieren. Uns ist aufgefallen, dass in Ames &#39;oder Lösungen Lockes ohne Blocker, die Details der Rückgewinnungswellenform wurden etwas im Laufe des Experiments durch die Verwendung von hellen Sonde und Testblitze betroffen. Dies erschwert die Subtraktion Analyse, um die Kegel Antworten zu isolieren. Jedoch Entfernen der glial-Komponente durch Barium geholfen, um den Schwanz der Antworten anzeigt, dass die Variabilität aufgrund der Müller Zellkomponente war stabilisieren. Auf diese Weise war es möglich, dunkeladaptierten kegel angetriebenen Reaktionen in WT-Mäusen (Figur 3) zu erhalten. Cone Antworten durch Doppelblitz isoliertVerfahren von WT-Mäusen schien kleiner im Vergleich zu denjenigen von WT-Mäusen unter Verwendung von Hintergrundlicht, um die Stange Aktivität 17,37 drücken aufgezeichnet. Dieser Unterschied kann durch einen gut charakterisierten Wirkung von Hintergrundlicht, das sich langsam (innerhalb von 10 min) erhöht Konus Reaktionsamplituden wahrscheinlich aufgrund der Entfernung des stab vermittelte Suppression der Zäpfchenreaktionen 37-39 erläutert. Zusammenfassend ist das Verfahren hier gezeigt ermöglicht ex vivo elektrophysiologischen Ableitungen der Funktion der Netzhaut zu untersuchen. In Zukunft hoffen wir, dass viele weitere Labore wird dieses leistungsfähige Methode, um die Physiologie und Pathologie des tierischen und menschlichen Netzhaut untersuchen anzupassen und zu unserem Verständnis der Netzhautfunktion voranzutreiben und zu entwickeln, bessere Therapien für Erblindung.

Elektroretinogramm (ERG) ist eine gut etablierte Technik, die verwendet werden können, um die elektrische Aktivität der Netzhaut durch Licht ausgelöst aufzuzeichnen. Die ERG-Signal wird hauptsächlich durch Spannungsänderungen durch radiale Ströme verursacht (entlang der Achse der Photorezeptoren und bipolare Zellen) in der Widerstands Extrazellularraum der Retina fließenden Strom erzeugt wird. Das erste Signal ERG wurde 1865 von Holmgren von der Oberfläche eines Fischauge 1 aufgezeichnet. Einthoven und Jolly 1908 2 unterteilt den ERG Reaktion auf das Auftreten von Licht in drei verschiedenen Wellen, a- genannt, B- und C-Wellen, die jetzt bekannt sind, um im Wesentlichen die Aktivität von Photorezeptoren widerspiegeln, ON bipolaren Zellen und Pigmentepithel Zellen, die jeweils 3-8. ERG aus den Augen der narkotisierten Tieren oder Menschen (in vivo) mit Mikroelektroden aufgezeichnet werden, aus isolierten Augen Vorbereitung 9, in isolierten intakten Netzhaut (ex vivo) 3,10-15 oder über bestimmte Netzhautschichten (lokaleERG) 4,16. Von diesen ist die in vivo ERG derzeit die am häufigsten verwendete Methode, um die Funktion der Retina zu bewerten. Es ist eine nicht-invasive Technik, die für diagnostische Zwecke verwendet werden kann oder um das Fortschreiten von Netzhauterkrankungen bei Tieren oder Patienten zu folgen. , In-vivo-ERG-Aufnahmen erzeugen jedoch eine komplizierte Signal mit mehreren überlappenden Komponenten, die oft von äußeren Augen physiologische Geräusche (zB Atmung und Herztätigkeit) kontaminiert. Lokale ERG kann verwendet werden, um das Signal über bestimmte Schichten der Netzhaut aufzuzeichnen, aber es ist die invasive und hat die niedrigste Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Vergleich zu den anderen ERG Aufzeichnungskonfigurationen. Lokale ERG ist auch technisch anspruchsvoll und erfordert teure Ausrüstung (zB Mikroskop und Mikromanipulatoren). Transretinal ERG von der intakten, isolierten Netzhaut (ex vivo ERG) bietet einen Kompromiss zwischen in vivo und lokale ERG Methoden, die stabil und high SNR Aufnahmen von intakter Netzhaut von Tieren oder Menschen 17. Vor kurzem wurde diese Methode erfolgreich eingesetzt, um Stäbchen und Zapfen Photorezeptorfunktion in Säugetieren, Primaten und menschliche Netzhaut 18-20 studieren. Darüber hinaus aufgrund der Abwesenheit von Pigment-Epithel in der ex vivo Retina, die positive C-Wellenkomponente des ERG-Signal entfernt wird und ein bekannter negativer langsamen PIII-Komponente ist in den ex vivo-Aufnahmen zeigte. Die langsame Komponente PIII wurde gezeigt, dass aus den von Müller Gliazellen in der Retina 21-23 stammen. Somit könnte ex vivo ERG Verfahren auch verwendet werden, um Müller-Zellen im intakten Netzhaut zu untersuchen. Mehrere Studien haben auch gezeigt, dass ex vivo ERG-Aufnahmen verwendet werden könnten, um die Konzentration von pharmakologischen Mitteln auf der Netzhaut 24 zu messen und testen Sie die Sicherheit und Wirksamkeit von Arzneimitteln 25-27 werden. Mehrere Handels in vivo-Systemen zur Verfügung stehen undin vielen Laboratorien, die nicht unbedingt über umfangreiche Elektrophysiologie Hintergrund verwendet. Im Gegensatz dazu wurden ex vivo-Geräte nicht bis vor kurzem 17 und als Folge nur wenige Labors werden derzeit nutzen diese leistungsfähige Technik zur Verfügung. Es wäre von Vorteil, um unser Wissen über Netzhaut Physiologie und Pathologie voranzubringen und neue Therapien für Krankheiten zu entwickeln blend ex vivo ERG-Aufnahmen zur Verfügung, um weitere Labors zu machen. Wir zeigen hier eine einfache und erschwingliche ex vivo ERG Vorrichtung 17 und zeigen, wie sie in Verbindung mit mehreren im Handel erhältlichen in vivo ERG-Systeme verwendet werden, um Stab- und Kegel-vermittelten Signal aufzuzeichnen (a- und b-Wellen) und die Funktion Müller-Zellen (langsam PIII) aus intakten Wildtyp-Maus Netzhaut.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>In vivo ERG system</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>HMsERG</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo ERG system</td>
			<td>LKC Technologies</td>
			<td>UTAS-E 3000</td>
			<td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex vivo adapter</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>Ex VIVO ERG adapter</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>North Central Instruments</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp;idCategory=27">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR emitter</td>
			<td>Opto Diode Corp.</td>
			<td>OD-50L</td>
			<td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prowler Night Vision Scopes</td>
			<td>B.E. Meyers Electro Optics</td>
			<td>D4300-I</td>
			<td>Military grade product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red filter</td>
			<td>Rosco Laboratories</td>
			<td>Roscolux #27 Medium Red</td>
			<td>May be used instead of IR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red head light</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>ERGX011</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>WPI, Inc.</td>
			<td>500086</td>
			<td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers #5</td>
			<td>WPI, Inc.</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Metler Toledo</td>
			<td>AB54-S/FACT</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter and electrode</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>pHI 350</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60129</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63020</td>
			<td>1.0 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>1.0 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0750</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP4</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>101</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>224731</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2834</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz culture medium L-15</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4386</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN3156</td>
			<td>5% CO2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Wir nahmen Flash Antworten von dunkeladaptierten Wildtyp (WT) C57BL / 6-Maus Netzhaut, indem Sie die oben beschriebenen und durch die Verwendung verschiedener Standard Perfusionslösungen (Abbildung 2) in Abbildung 1 veranschaulicht experimentelle Protokolle. Die Antwortwellenformen und Kinetik sowie Empfindlichkeit der Stäbchen-Photorezeptoren erschien ähnlich in Ames &#39;und Lockes Medien (2A und B). Auf der anderen Seite, unter HEPES gepufferte Ringer-Lösung (kein Bicarbonat oder 5% CO 2/95% O 2) die Antwortamplituden deutlich geringer. Wir haben auch festgestellt, dass in diesen Bedingungen b-Welle Stabilität gefährdet wurde. Zugabe von 40 &amp; mgr; M APB (DL-AP4) entfernt positive b-Welle effizient in allen drei Medien (den 2D-F). Die Entfernung der b-Welle ergab eine große langsame negative Welle (2D), die Müller-Zell-Aktivität 21 zugewiesen wurde. Zugabe von 100 &amp;# 956; M Barium abgeschafft diese Komponente und enthüllt die Photorezeptorantwort des ex vivo ERG Signal (den 2D-F). Wir konnten bis zu 1 mV gesättigten Photorezeptorantworten in Ames &#39;und Lockes aufzeichnen wohin maximale Reaktionen waren in der Regel etwa 200 &amp; mgr; V unter Ringer Perfusion. Cone Fotorezeptorantworten, zuvor durch sogenannte Doppelblitztechnik, bei der ein heller Blitz Sonde Sättigung der Stäbe wird durch einen Testblitz zu einem Zeitpunkt, wenn gefolgt Kegel haben ihre dunkeladaptierten Zustand wiederhergestellt, aber Stangen bleiben gesättigten 19,29 isoliert. Hier haben wir getrennt Kegel-vermittelte ERG-Antworten (die sowohl a- und b-Welle) in Ames &#39;Medien mit 100 &amp; mgr; M von Barium, aber nicht DL-AP4 ergänzt durch doppelte Flash-Technik (Abbildung 3). Barium wurde verwendet, um die langsame Glia-Komponente, die vor allem während der wiederholten Verwendung von brigh um den späten Teil der Antworten variabler machen schien entfernent blinkt. Wir haben eine konstante Sonden Flash, um Stäbchen und variable Test blinkt 300 ms nach dem Flash-Sonde zu sättigen, um Kegel Antworten hervorzurufen. Ein Kegel Antwort Familien durch Subtraktion Sonde Flash-Antwort von den &#39;Testsonde + flash&#39; Reaktionen erhalten wird, in 3B gezeigt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52855/52855fig1.jpg" /> Abbildung 1. Verwendung von ex vivo ERG Probenhalter. (A) Befüllung der Elektrodenkanäle und Montage der Elektroden. (B) Prüfung des montierten Probenhalter vor ihrer Zerlegung durch Messen des Widerstands und der Spannung zwischen den Elektrodenpaaren. (C) Montage der Netzhaut auf dem Filterpapier in den Probenhalter. (D) der Probenhalter zu den Perfusionsleitungen und ERG Verstärker im kommerziellen ERG sy verbundenStiel. Die Perfusion Strömungsweg durch blaue Pfeile gekennzeichnet. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52855/52855fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52855/52855fig2.jpg" /> Abbildung 2. Flash-Antwort Familien aus dunkeladaptierten WT Maus Netzhaut mit Lockes (A) durchströmt, Ames &#39;(B) und HEPES-gepufferten Ringer (C) Medium aufgezeichnet. Die Blitze abgegeben 3, 40, 130, 390 und 1.400 Photonen um -2 (von -36 bis -9 dB bzw. -3,6 auf -0,9 log (Cd sm -2) grünes Licht (530 nm)). Schwarze Spuren in (DF) zeigen Antworten von Netzhaut in (AC) aufgezeichnet nach Zugabe von 40 &amp; mgr; M und 100 &amp; mgr; M APB Barium. Red Spuren in (D) zeigen Antworten von der Netzhaut in aufgezeichnet (A)<html> mit durchbluteten Lockes mit 40 &amp; mgr; M APB aber nicht Barium ergänzt. Der Einschub zeigt die Antworten auf die drei dunkelsten blinkt in Lockes Medien, die APB und Barium. Die Blitze reichten von 7 bis 14.000 Photonen um -2 (von -32 bis 1 dB grünes Licht) in (D), von 3 bis 1.400 Photonen um -2 (von -36 bis -9 dB grünes Licht) in (E), und 7 bis 1.400 Photonen um -2 (von -32 bis -9 dB grünes Licht) in (F). Siehe Vinberg et al. 2014 17 und Lyubarsky et al., 1999 30 und 2004 31 für weitere Einzelheiten der Umwandlung von Lichtenergie in photopischen Cd sm gegeben -2 bis Photonen um -2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52855/52855fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Last / 52.855 / 52855fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Isolierung von Zäpfchenreaktionen mit Doppelblitzverfahren in WT-Maus. (A) Eine Antwort auf Flash (14.000 Photonen um -2 oder 1 dB grünes Licht, schwarz) und eine Antwort auf Flash, gefolgt von einem Test Flash-Sonde Sonde (81.000 Photonen um -2 oder 9 dB grünes Licht, rot). (B) Blitzreaktionen Cone blinkt reicht von 360 bis 81.000 Photonen um -2 (-14 bis 10 dB grünes Licht) durch Subtraktion der Sonde Flash-Antwort von dem getrennt zu testen &quot; Sonde + Test flash &quot;Antwort. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52855/52855fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

9.1K Aufrufe.  Washington University in St. Louis. Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Serie: Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In-vivo-Abfrage des Zentralen Nervensystems durch Translatome Polyribosom Fraktionierung

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

An Implantable System For Chronic In Vivo Electromyography

Electromyography (EMG) measures the muscle response to electrical stimulation or spontaneous activity of motor units and plays an important role in assessing neuromuscular function. Chronic recording of EMG activity reflecting a muscle&#8217;s reinnervation status after nerve injury has been limited, due to the invasive nature of traditional EMG recording techniques. In this regard, an implantable system is designed for long-term, in vivo EMG recording and nerve stimulation. It has been applied and tested in a study on reinnervation of laryngeal muscles. This system consists of 1) two bipolar electrode nerve cuffs and leads for stimulating each of two nerves: the recurrent laryngeal nerve (RLN) and internal branch of the superior laryngeal nerve (SLN); 2) two EMG recording electrodes and leads for each of the two laryngeal muscles: posterior cricoarytenoid (PCA) muscle and thyroarytenoid-lateral cricoarytenoid (TA-LCA) muscle complex; and 3) a skin receptacle interfacing all implanted lead terminals to an external recording preamplifier and stimulator using a connection cable. The wire leads are Teflon-coated, multi-filament, type 316 stainless steel. They are coiled and can stretch during body movement of the awake animal to prevent lead breakage and electrode migration. This system is implanted during an aseptic surgery. Afterwards, baseline EMG recordings are performed before the RLN is transected in the second surgery to study muscle reinnervation. Throughout the study, multiple physiological sessions are conducted in the anesthetized animal to obtain evoked and spontaneous EMG activity that reflects the reinnervation status of laryngeal muscles. The system is compact, free of infection over the course of the study, and highly durable. This implantable system can provide a reliable platform for research in which long-term recording or nerve stimulation is required in an anesthetized or freely moving animal.&#160;

Presented here is a protocol for the manufacturing of an implantable system for in vivo chronological recording of evoked and spontaneous electromyographic potentials. The system is applied to the investigation of reinnervation of laryngeal muscles following nerve injury. &#160;&#160;

Ein implantierbares System für die chronische In-Vivo-Elektromyographie

Electromyography (EMG) measures the muscle response to electrical stimulation or spontaneous activity of motor units and plays an important role in ...