Diese Arbeit wurde teilweise wurde durch NIH Zuschüsse, R44 und R01 HL109505 GM087784 unterstützt. Autoren danken der technischen und OEM-Team von Gilson, INC für erweiterte technische Unterstützung.

Die Autoren MKC, MJG, EEB, NJD und RO sind oder waren zum Zeitpunkt der Entwicklung Mitarbeiter InvivoSciences, INC, die die hier beschriebenen Roboter-Protokolle konzipiert und entwickelt. TW ist der CSO für InvivoSciences INC. SH ist Mitarbeiter von Gilson INC.

In der vorliegenden Studie ein Verfahren zur Roboterkultur für iPSC Produktion, die miniaturisiert und automatisiert die Fütterung und Durchgang in eine 96-Well-Plattenformat und gleichzeitig eine effiziente Scale-up haben wir. Ein Flüssigkeitshandhabungsroboter wurde verwendet, um routinemäßig zu füttern iPSC Kolonien und Gang sie in regelmäßigen Abständen durch enzymatische Spaltung. Der Roboter wurde so programmiert, dass der extrazellulären Matrix-Gel-beschichteten Platten produzieren und führen Sie eine Aussaat Dichtegradienten. Wenn Fibroblasten und Fettgewebe abgeleiteten iPSCs wurden in diesem System für mehr als 20 Passagen, etwa 3 Monate lang kultiviert wurde Pluripotenz aufrechterhalten, wie auch stabilen Karyotyp. Beide Zelllinien wurden in der Lage Differenzierung zu Kardiomyozyten. Zusammen, die Sammlung von Protokollen hier beschriebenen können Anwender mit sehr wenig Stammzellkultur Erfahrung oder nur begrenzten Zugang zu spezialisierten Kulturanlagen, die Kultur Stammzellen und eine hohe Zellproduktion oder mehreren Leitungen Umgang mit minimaler Arbeit und Kosten. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Roboter-Protokolle hier detailliert ein Verfahren zum wirtschaftlichen Maßstab aus iPSC Herstellung und Handhabung. Ein Vorteil ist, skalierbaren Stammzellkultur in einem etablierten Platten basiertes Format hier gezeigt und zuvor 44,47 - 49, um Pluripotenz aufrechterhalten. Während andere Formate von skalierbaren Stammzellkultur Ausbeute pluripotenten Zellen 20,23,29 diese Platte basierte Methode erfordert im wesentlichen keine Veränderung der Kultur-Format, wie die Anpassung an Suspension, die Verwendung von Antischaum Chemikalien oder längerer Verwendung von Rho-Kinase-Inhibitor 20. Diese Platte basierend Verfahren kann daher schnell und vorherzusehen war, unterzubringen neuen Linien, weil die Kulturbedingungen sind ähnlich. Da der Einsatz von iPS für Krankheit Modellierung erhöht 4,6,19,50 werden neue iPSC Linien kontinuierlich erzeugt. Die hier beschriebenen Techniken sind am besten geeignet zur Kultur neue Zeilen in mittleren bis hohen Volumen und den Durchsatz, da die Schranke auf dem Format Übergang low. Dies gilt auch für die Arbeit und Ausrüstung notwendig, um die Kolonien zu erhalten. Schließlich, da das Format und Handhabung ähnlich der zur Ableitung und Validierung iPSC Leitungen Kultur Leistung, wie eine gerichtete Differenzierung Umwelt sind, ist wahrscheinlich mehr vorhersagbar. Figur 8 veranschaulicht eine Strategie zur Maßstabsvergrößerung der Herstellung von Stammzellen in 96-Well-Platten. Eine Platte (Zyklus 0) wird verwendet, um Roboter Saatgut 12 neue Platten, eine 12-fache Erhöhung (Zyklus 0-1). Nach einigen Tagen der Fütterung, eine der zwölf Platten agiert, um einen weiteren Satz von zwölf Platten (Zyklus 1 Zyklus 2) Samen. Die verbleibenden elf Platten sind nun für andere Verwendungen verfügbar sind und für die Herstellung Komponente des Systems. Bei diesem Tempo wird Gang von einer Platte bieten 11 Platten pro Zyklus oder alle 3-4 Tage. Diese Methodik kann mehr skaliert, wenn mehrere Platten werden passagiert, wie in dem Übergang von Zyklus 2 Zyklus 3 gezeigten Zyklus 3 ist, sind zwei Plattenimmer dann verwendet, um die Kolonie zu erhalten und Saatgut 24 neue Platten. Die verbleibenden 22 Platten werden dann zur Verwendung nach jedem Durchgang Zyklus zur Verfügung. An irgendeiner Stelle in der Wartungszyklus kann der Benutzer mehrere Platten zur Steigerung der Produktion Samen. Ein Beispiel wäre, um Durchgang jede Spalte für zwei Wachstumsperioden betragen. Der erste Durchgang wandelt einen Platte in zwölf Platten und jeder der zwölf Platten verwendet wird, um Platten 144 Samen. In diesem Fall beginnt ein Benutzer mit einer Platte und nach zwei Durchgängen oder etwa 1,5-2 Wochen Kultur mit 144 Platten. Beispielsweise ergeben die Fibroblasten und Fett iPSC Linien etwa 25 bis 75.000.000 Zellen pro Platte mit 96 Vertiefungen, wenn bereit, Durchgang. 144 Platten könnte daher repräsentieren etwa 4-7 x 10 9 Zellen. Was ist der Arbeitsaufwand für die 144 Platten mit 96 Vertiefungen Roboter trägt? Eines der Ziele für diese Arbeit war skalierbaren Stammzellproduktion, die Arbeit reduziert im Vergleich zu herkömmlichen (dh 6-Well-Platte) Stammzellkultur. Der Roboter accomplishes dies durch die Linderung der Notwendigkeit, jede Platte physisch hand während Fütterung und Passagieren. Während 96-Well-Platte Produktion Skalen linear, wie es wäre in der traditionellen 6-Well-Platten, ist die Zeit, ein Techniker verbringt die Arbeit mit den Platten deutlich weniger mit Roboter-Kultur. Die Produktionseffizienz von Roboterkultur aus dieser Differenz (Figur 9) abgeleitet wird. Es wurde festgestellt Techniker konnten eine 6-Well-Platte aus dem Inkubator der Platte in etwa 3,5 Minuten zu entfernen, überprüfen Sie es auf dem Mikroskop, dann absaugen und zu füttern. Demgegenüber verbringen Techniker etwa 30 sec eine 96-Well-Platte aus dem Inkubator entfernt und deren Prüfung unter dem Mikroskop auf Dichte und Verunreinigungen vor der Platzierung auf den Roboter. Mit einem erweiterten Fütterungsprotokoll ähnlich dem oben beschriebenen können sechs Platten mit 96 Vertiefungen geladen und zugeführt werden, was in etwa 21 min, bzw. 3,5 min pro Platte erfolgt. Die Gesamtzeit, um eine Platte zu ernähren ist vergleichbar zwischen Roboteric und manuellen Methoden, sondern auf Handanlage 6 Platten ein Techniker wird für alle 21 min benötigt, während die Techniker nur 3 min Umgang mit den sechs Platten für den Roboter (30 sec Inspektion pro Platte) verbringt. Wie Abbildung 9 zeigt, ist die Zeit ein Techniker verbringt Handhabung 144 Platten mit dem Roboter ist etwa 1,2 Stunden, im Gegensatz zu 8 Stunden von Hand und der Roboter werden nie einen Fehler machen, die Handhabung der Platten oder Überleiten von Flüssigkeiten. Die hier beschriebenen 96-well iPSC Kulturmethoden eine tractable Plattform für komplexe Screening-Aufgaben. Weil jede Vertiefung genetisch identisch und mit der gleichen Dichte aus der gleichen Ausgangspool ausgesät können Variablen über die Platte verteilt sind und durch den Roboter mit handelsüblichen Behältern, um Bedingungen zu trennen aufrechterhalten werden. Dies wäre nützlich für Experimente wie Stammzellenwachstumsmedien Entwicklung 34,35,47, Substrat oder Kulturbedingung Prüfung und Toxizitätsstudien unter Verwendung von Stammzellen51. Da jede Stammzelllinie ist in Bezug auf die optimale Koloniegröße und Durchgang Anforderungen einzigartig, kann man dieses System nutzen, um Aussaatdichte, Fütterung Frequenzgang und Handhabung durch die Manipulation der Spalten geerntet, die mechanische Bewegung während des Durchgangs und die Fütterung Frequenz zu modulieren. Durchlaufen dieser Variablen ermöglicht es dem Benutzer, eine Reihe von Bedingungen, die zur Kultur einer neuen Linie schnell zu finden oder neue Kulturtechniken. Das Robotersystem ist auch in der Lage ist die Aufrechterhaltung 96 parallel aber unabhängig Stammzellenkolonien. Wenn iPSC aus somatischen Zellen abgeleitet oder nach genetischer Manipulation kloniert werden viele parallel Klone gescreent, um potenzielle iPSC Linien ergeben. Sobald einzelne Zellen werden in 96-Well-Platten ausgesät, kann dieses System zu füttern und Durchgang der 96-Well-Platten halten jede Kolonie getrennt. Dies ermöglicht einen sehr hohen Durchsatz bei der Auswahl der potentiellen Klonen und beseitigt die Schwierigkeiten bei der Kultivierung von 96 körperlich parallelen Linien. Diese Methode auch einellows Produktion jedes Klons so skaliert, dass Material für die parallele Analyse ohne weiteres verfügbar ist. Schließlich stellen wir uns Integration dieser Kulturtechniken mit einer Roboter-Plattensystem, das Handels Platten zu und von den Inkubator ermöglicht vollautomatische Kultur liefert. Dies könnte mit komplexeren Robotik, die für eine größere Ausdehnung zu ermöglichen, da die hier beschriebenen grundlegenden Protokolle sind auf andere Platte basierte Systeme übertragbar erreicht werden. Die ersten wichtigen Schritte, die in den Protokollen zu adressieren sind diejenigen, die verhindern, und überprüfen Sie die Verunreinigungen wie die Schritte 1.5 und 4.2. Verunreinigungen, wie oben erörtert, kann erfolgreich vermieden werden, wenn gute steriler Technik und gesundem Menschenverstand eingesetzt werden wird. Es ist zwingend notwendig, unabhängig von Stammzellkultur-Format, dass der Betreiber-Check für Kontamination und damit in diesem Protokoll an den angegebenen Schritte wird deutlich das Risiko für die Kontamination zu verringern. Proper extrazellulären Matrix-Gel-Anwendung ist eine zweite esszielle Schritt zum Erfolg dieses Protokolls. Ohne den 96-Well-Platten richtig Beschichten werden die Stammzellen nicht wachsen. Ein häufiges Problem ist unvollständig und Beschichtung. Die Erfahrung hat gezeigt, dass Luftblasen, elektrostatische Anziehung und Kapillarwirkung behindern auch komplette Beschichtung. Das Vornässen Schritt (1,6) entwickelt, um auch Seitenbeschichtung deutlich verbessern und sollte nicht übersprungen werden. Diese Vorbenetzung Schritt erscheint, um die scheinbare Hydrophobie des Kunststoff 96-Well-Platte, so daß zu reduzieren, wenn die extrazelluläre Matrix-Gel-Beschichtung aufgebracht wird gleichmäßig über den Boden und die Seiten gut verteilt. Es wird auch empfohlen, um leicht auf die 96-Lochplatten gegen eine saubere Hand einmal beschichtet, um auch extrazelluläre Matrix-Gel-Lösung Verteilung zu gewährleisten. Die Dissoziation Parameter sind auch wichtig, um zu optimieren. Erweiterte Inkubation mit Enzym oder EDTA basiert Dissoziation Reagenz wird in einzelnen Zellen, die möglicherweise nicht das Ziel während des Durchgangs werden die Folge sein. Daher der Betreibersollte besonderes Augenmerk auf wie Dissoziation Zeit, Verreiben Kraft und Wasch Wiederholungen beeinflussen Koloniemorphologie und Gesundheit und passen zu zahlen. Das Verständnis der Beschränkungen in Bezug auf den hier beschriebenen Techniken sind ausschlaggebend für die erfolgreiche Operation. Wie in irgendeinem anderen Zellkultur-Einstellung, die Verwendung von 96-Well-Platten zeigt eine relativ hohe Kontaminationsgefahr. Wie oben beschrieben, ist ein Techniker Handhabungs jede Platte während der Zuführung und die Passage; beispielsweise beim Öffnen des Deckels, indem die Platte auf dem Roboter-Bett, und Prüfen der Platte auf dem Mikroskop. Daher ist, wie nach dem Schritt 1.5 erwähnt, ist es unerlässlich, die Innenseite jeder Platte Deckel nicht zu berühren oder aussetzen, diesen Teil zu einer potenziell kontaminierten Fläche wie die geneigte Heizblöcke oder vertikale Stifte auf dem Bett. Während der Protokollentwicklung wurde diese Einschränkung entdeckt und war der Anstoß, um eine Zahnstange, um Platte Deckel zu halten, um die Sterilität zu erhalten entwickeln. Ebenso sind die Trog Stauseen, Pipettenspitzen und other Lieferungen auf der Liquid-Handling-Roboter Bett sind potentielle Kontaminationsquellen, da sie offen für Umwelt und durch den Techniker behandelt sind. Daher sollten gute sterile Technik, die als Reduktionsbewegungen über ausgesetzt Kultur Materialien oder Flüssigkeiten offen angelegt, so werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass, wenn das Protokoll skaliert, visuelles Prüfen jedes gut&gt; 100 96-Well-Platten ist umständlich. Dies kann mit durch Sichtkontrolle die ganze Platte auf Anzeichen von Kontamination, wie trüben Medien behandelt werden, um verdächtige Brunnen zu identifizieren. Für zukünftige Maßstab up wird die Verwendung eines automatisierten Mikroskop und Indikator für Zellwachstum und mögliche Verunreinigungen eingebracht werden. Zusammenfassend ist die hier beschriebene Hochdurchsatz-96-Well-basierte Plattform bietet eine reproduzierbare, hohe Wiedergabetreue Verfahren zur Stammzellkultur und Produktion in einem Plattenformat. Dieses Verfahren reduziert die erforderliche Erfahrung, Ausrüstung notwendig und Arbeitszeit gewidmet Stammzellkultur, währenddie Aufrechterhaltung der Vorteile der traditionellen adhärenten Kultur.

6 - Die Verwendung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) hat sich seit ihrer Ableitung im Jahr 2007 für 1 Verbindung Test, der regenerativen Medizin und Krankheit Modellierung 2 erhöht. Dieser Forderung kommt von iPSC die Fähigkeit, eine große Zahl von pluripotenten Zellen, die in somatische Zellen bei einer beispiellosen Quantität differenziert werden kann ergeben. Wie verwiesen Differenzierung Techniken zu verbessern 7-10 und Entwicklung der menschlichen Zell- oder Gewebemodellierung und Zelltherapie erhöht 11-14, nimmt auch die Voraussetzung für die Massenproduktion von hochwertigen iPSCs. Es ist weithin zitiert, dass unter anderen Krankheiten, Herzinfarkt oder B-Zell-Funktions Ersatz wird hunderte Millionen erforderlich, um Milliarden von iPSC abgeleiteten somatischen Zellen 15-18. Außerdem immer komplexer 3D-Gewebemodelle für Wirkstoffforschung und therapy wird eine große Zahl von Zellen 9,13,19 verlangen. In all diesen Beispielen, definierte, gleichmäßige und reproduzierbare iPSCs müssen verfügbar sein und einfach herzustellen sein. Zur Herstellung der Stammzell abgeleitet Biopharmazie und Zellen für Tissue Engineering und der Transplantation ist eine kostengünstige Zellfertigungstechnik unerlässlich. 25 oder Suspension mit dem Einsatz von Mikroträgersubstrate 26 - - 28 zum Teil, weil diese Techniken erfolgreich für große, nicht-iPSC, eukaryotischen basierte Produktion eingesetzt skaliert Herstellung von iPS-Zellen wurde auf Suspensionskultur 20 konzentriert. Mehrere Gruppen haben Suspensionskultur-Systeme, die pluripotenten Stammzellen 20,21,23,24,29 ergeben demonstriert. Allerdings sind diese Ansätze verwenden teure und komplexe Systeme nicht ohne weiteres verfügbar, um Forschern die Entwicklung neuer Differenzierungsprogramme, Fahr Tissue Engineering und tut laboratory Skala Forschung. Außerdem Federung und Mikro iPSC Kulturen erfordern Anpassung und Techniken oder Chemikalien nicht in traditionellen haft iPSC Kultur gefunden, wie kontinuierliche Verwendung von Rho-Kinase-Inhibitor, Antischaummittel und Filtration, um die Aggregation zu regulieren. Körperliche Belastung für die Zellen häufiger in Suspensionskultur, durch mechanische Bewegung als auch bei Mikro Zusammenstoß eingeleitet. Diese Probleme begrenzen die Berechenbarkeit und Geschwindigkeit, mit der neu generierten Stammzelllinien können in Suspension kultiviert werden. Andere haben Roboter-Plattenhandling-Systeme, die Platte Kultur Techniken 30,31 nachahmen entwickelt, aber diese Plattformen verlangen erhebliche Investitionen für Ausrüstung und Know-how, um zusätzlich zu den grundlegenden Herausforderungen mit Stammzellkultur assoziiert zu betreiben. Die folgende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Praxis einer skalierbaren iPSC Kultursystem, das eine in sich geschlossene, Standard-8-Kanal-Roboter-Flüssigkeit verwendetHandler und 96-Well-Platten. Diese Methode wurde entwickelt, um Labormaßstab iPSC Kultur und High-Volume-Produktion iPSC brücken (zB 10 7 bis 1,5 x 10 9 Zellen pro Woche pro Techniker) es denjenigen die Entwicklung neuer Technologien, um iPSC leicht skalieren Produktion ohne große Hardware oder Arbeits Investitionen. Diese Methode ist relativ kostengünstig einzurichten, erfordert wenig bis gar keine Stammzellkultur, Programmierung oder Engineering-Erfahrung, hat eine kleine Stellfläche Ausrüstung, ohne die Notwendigkeit für einen dedizierten Zellkultur Kapuze und nutzt Standard-Zellkulturanlagen zu mittleren bis hohen Durchsatz ermöglichen automatisierte Zellproduktion. Ziel war es, ein System, das skalierbare Stammzellkultur, die von Labors neue Zellkultur Stammzellen verwendet werden können zu entwickeln, die, die manuelle Pflege ein Hindernis für die Entwicklung ihrer Ideen oder diejenigen, die eine wirtschaftliche Möglichkeit, eine große Anzahl von Stammzellen zu produzieren finden. Die hier vorgestellte Plattform entfernt Techniker Einfluss aufStammzellkultur und normalisiert die Fütterung und Passage, um die kontinuierlich Stammzellproduktion zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>96-well plates</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96-well; Well volume: 360&amp;nbsp;&amp;#956;l; Cell growth area: 0.32&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;; Individually wrapped</td></tr><tr><td>Seahorse Trough</td><td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Gilson Tips</td><td>Gilson</td><td>F167023</td><td>10 racks gilson 96 tips D200 tips</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>DMEM/F12 powder.&amp;nbsp; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td></tr><tr><td>Growth Factor Reduced Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Referred to as, &quot;extracellular matrix gel&quot; in the text. Matrigel GFR, 10&amp;nbsp;ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td></tr><tr><td>E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>ACCUTASE</td><td>Referred to as, &quot;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&quot; in the text. Accutase 500&amp;nbsp;ml sterile cell solution</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td>PBS w/o Ca Mg 500&amp;nbsp;ml, 6/pk</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

Kontinuierliche Weiterentwicklung in pluripotente Stammzellkultur ist, die Lücke zwischen Labor und Krankenbett für die Verwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin, Arzneimittelforschung und Sicherheitsprüfung. Zur Herstellung der Stammzell abgeleitet Biopharmazie und Zellen für Tissue Engineering und der Transplantation ist eine kostengünstige Zellfertigungstechnik unerlässlich. Aufrechterhaltung der Pluripotenz und stabile Leistung von Zellen in Downstream-Anwendungen (beispielsweise Zelldifferenzierung) über die Zeit ist von größter Bedeutung, um im großen Maßstab Zellproduktion. Noch so schwer sein kann, zu erreichen insbesondere wenn Zellen kultiviert werden manuell in dem der Betreiber kann erhebliche Variabilität einführen sowie prohibitiv teuer Maßstab übertragbar ist. Hochdurchsatz, groß angelegte Stammzellproduktion zu ermöglichen und zu entfernen Bedienereinfluss neuartigen Stammzellkultur-Protokolle mit einem Tischmultikanal Flüssigkeitshandhabungsroboter entwickelt wurden, die eine minimale Beteiligung Techniker oder Erfahrung erfordern. MitDiese Protokolle menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) wurden in Feeder-freien Bedingungen kultiviert direkt von einem gefrorenen Lager und in 96-Well-Platten gehalten. Abhängig von der Zelllinie und gewünschten Maßstab Aufnahmegeschwindigkeit, kann der Bediener leicht bestimmen, wann die Passage auf der Basis einer Reihe von Bildern, die optimalen Kolonie Dichten zur Aufspaltung. Dann werden die notwendigen Reagenzien sind bereit, eine Kolonie Split auf neue Platten ohne einen Zentrifugationsschritt durchzuführen. Nach 20 Durchgängen (ca. 3 Monate) aufrechterhalten zwei iPSC Linien stabil Karyotypen, ausgedrückt Stammzellmarkern und differenziert zu Kardiomyozyten mit hohem Wirkungsgrad. Das System kann anschließende Hochdurchsatz-Screening neuer Differenzierungsprotokollen oder genetische Manipulation für 96-Well-Platten entwickelt auszuführen. Diese Technologie wird den Arbeitsaufwand zu verringern und technische, eine große Anzahl von identischen Stammzellen für eine Vielzahl von Anwendungen.

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Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Scalable Platte mit 96 Vertiefungen Basierend iPSC Kultur und Produktion Mit einem Robotic Flüssigkeitshandhabungssystem

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.5K Aufrufe.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

Serie: Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Forschung

Genetik

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

Die Produktion der großen Zahlen von Größe gesteuerte Tumorsphäroide Mit Microwell Platten

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Biotechnik

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Biologie

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Induzierte Differenzierung pluripotenter Stammzellen mit Hilfe eines automatisierten Kultursystems

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Autor im Rampenlicht: Automatisierung der iPSC-Kultur für verbesserte Reproduzierbarkeit 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Entwicklungsbiologie

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.

Scalable Platte mit 96 Vertiefungen Basierend iPSC Kultur und Produktion Mit einem Robotic Flüssigkeitshandhabungssystem

Zusammenfassung

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Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format