Wir erkennen an, Scott and White Hospital Research Grants Program für die finanzielle Unterstützung und die Texas A &amp; M Health Science Center College of Medicine Integrated Imaging Laboratory für die Verwendung des konfokalen Lasermikroskop. Wir erkennen an, Mr. Glen Cryer für die Hilfe bei Manuskriptbearbeitung.

1. Seeding von Endothelzellen <ol><li> Erhalten Primärkulturen von RBMEC die von erwachsenen Sprague Dawley Ratten (oder erhalten sie im Handel). </li><li> Kulti RBMECs in 100 cm Fibronectin (50 ug / ml) beschichtete Petrischalen unter Verwendung des Rattenhirn endothelialen Zellwachstumsmedium. Ändern Sie das Medium alle zwei Tage, bis Konfluenz erreicht ist. </li><li> Bei Erreichen von 80 bis 90% Konfluenz, vorsichtig waschen Sie die Zellen in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Schwenken. Die Zellen werden dann, indem man sie 1 ml warmem 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung, auf 37 ° C äquilibriert abgelöst. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 2-5 min, bis die Zellen abgelöst und dispergiert. HINWEIS: Tippen Sie auf die Kulturschale, um die Zellen zu lösen. Ansicht Zellen unter dem Mikroskop, um eine vollständige Ablösung der Zellen von der Oberfläche der Schale zu bestätigen. </li><li> 5 ml vollständigem Medium in eine Petrischale, um Trypsin zu neutralisieren.Pipettieren Sie das Medium, das abgelösten Zellen und sammeln sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. . </li><li> Zentrifugieren Sie die Medien, die Endothelzellen bei 220 xg für 5 min. </li><li> Saugen Sie den Überstand und die Erhaltung der Pellet, das cells.Suspend das Pellet in 3-5 ml frischem Rattenhirn endothelialen Zellwachstumsmedium durch sanftes Mischen nach oben und unten mit Pipette Zellen werden dann unter Verwendung von automatisierten Zellzählers oder einer Zählkammer gezählt werden. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in Fibronektin (50 ug / ml) vorbeschichtet 8 auch sterile Kammer Schlittensystem, 0,7 cm 2 / gut mit einer Aussaatdichte im Bereich von 10.000-15.000 Zellen pro Vertiefung. Wachsen die Zellen bei 37 ° C bis zur Konfluenz erreicht ist HINWEIS: Für die Durchführung Western Blots oder anderen Experimenten Zellen in 10 cm Zellkulturschalen oder spezielle Gerichte wie durch das Experiment erforderlich gehalten werden. </li></ol> 2. Sauerstoff und Glukose-Entzug-Reoxygenierung In-vitro-Modell HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von Zulueta et al angepasst. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9. <ol><li> Verwenden Sie die Hypoxie Zellkultursystem, um die Auswirkungen der OGD-R auf RBMECs in (siehe Abbildung 1) zu studieren. Eingestellt und justiert die Hypoxie Zellkultursystem vor Beginn des Experiments gemß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Entfernen der zusammenlaufenden Kammerobjektträgern (Schritt 1.8) von dem 37 ° C Inkubator. Ersetzen die Vollmedium in der Kammer Schlitten mit desoxygeniertem, keine Glucose, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und Hypoxie Kammer mit 95% N 2 und 5% CO 2 für 2 h bei 37 ° C vorgelegt, auf OGD Zustand darzustellen. </li><li> Verschieben Sie die Zellen zurück in den Inkubator mit 95% O 2, 5% CO 2 bei 37 ° C und mit frischem Rattenhirn Endothelzellenkomplettmedium vorgesehen und inkubiere für 1 weitere Stunde bei 37 ° C. Hinweis: Dieser Schritt stellt eine Reoxygenierung Situation. </li><li> Mithilfe der Kammer-Objektträgern für Immunfluoreszenzlokalisierung und Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung (siehe Kapitel 3). </li></ol> 3. Immunfluoreszenz Lokalisierung von ZO-1 und f-Actin-Labeling Mit Rhodamin Phalloidin <ol><li> Setzen Sie das Kammer-Objektträgern enthalten RBMEC Monoschichten zu 100 ul opti-MEM / reduzierter Serum Medien / well 1 h. 3-mal in 100 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,0 bis 7,2) Waschen Sie die Kammer-Objektträgern. </li><li> Fixieren die Zellen unter Verwendung von 100 ul 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,0-7,2) für 15 min und Waschen der Kammer-Objektträgern für 3 weitere Male in PBS (pH 7,0-7,2). </li><li> Permeabilisierung der Zellen unter Verwendung von 100 ul 0,5% Triton X-100 in PBS (pH 7,0-7,2) für weitere 15 min. Blockieren mit 100 ul 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für eine Stunde. Nach diesem Schritt entweder Fleck / Label Zellen entweder für ZO-1 oder F-Actin. <ol><li> Für die Immunfluoreszenz staining Inkubieren der Zellen mit einem Anti-Kaninchen primären Antikörper gegen ZO-1 in 1: 150 in 2% BSA-PBS für O bei 4 ° C hergestellt / N. In PBS Waschen Sie die Zellen 3-mal, (pH 7,0 bis 7,2). Inkubieren mit 100 &amp; mgr; l Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -markierten anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper für 1 h bei RT. </li><li> Rhodamin Phalloidin Kennzeichnung, nach Blockierung, setzen die Zellen zu 100 ul von Rhodamin-Phalloidin 1:50 Verdünnung in 2% BSA-PBS für 20 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen von Immunfluoreszenzfärbung und Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung in PBS (pH 7,0 bis 7,2). Montieren Sie die Kammern mit Montage Medien, die anti-fade-Reagens mit DAPI. </li></ol></li><li> Visualisierung der Zellen unter Verwendung eines 60 X Wasser-Immersionslinse und die Zellen werden in einer einzigen optischen Ebene unter einem konfokalen Mikroskop gescannt. </li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

OGD-R als ein in vitro Modell für Ischämie-Reperfusion wurde auch für die Untersuchung Neuronen 10,11 hergestellt. Es gibt auch Studien, die die Wirkung auf OGD Hirnendothelzellen und Veränderungen der Permeabilität und TJ Integrität 9. Unsere Studie zeigt jedoch, die Wirkung von OGD und Reoxygenierung, die eine nähere Darstellung des ischämischen Reperfusionsschaden in In-vivo-Bedingungen, die folgende ischämischen Schlaganfalls auftreten. Hypoxisch-ischämischen Bedingungen ist bekannt, daß eine Entzündung im zentralen Nervensystem zu induzieren, was zu einer Störung durch die Erhöhung der parazellulären Permeabilität und vasogenes Ödem 4 BHS. Reperfusionsverletzung ist ein sehr komplexer und dynamischer Prozess, bei dem es übermäßige Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, ATP-Mangel, Anstieg der extrazellulären Kalium Freisetzung exzitatorischer Neurotransmitter, Endothelzellen und neuronalen Schwellung, Immunzellaktivierung. Dies wiederum causes Aktivierung verschiedener Entzündungswege, was zu einer Produktion, die Induktion von Nukleasen und Proteasen Cytokin, was zu Ödemen, die alle dargestellt sind, verschiedene Caspasen zu aktivieren, was zu einer Störung der Integrität BBB 5,12. Endothelzellen sind besonders anfällig für ischämische Verletzung, aufgrund der Anwesenheit einer großen Anzahl von Mitochondrien. Die benachbarten Endothelzellen sind miteinander durch feste Verbindungen von tight junction-Proteine ​​beibehalten verbunden. ZO-1 gezeigt ist, eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität TJ durch seine Wechselwirkung mit den anderen tight junction-Proteine ​​spielen und &#160; das Aktin Zytoskelett-Montage. Auch ist eine präzise Regelung von Aktin-Zytoskelett notwendig für viele Entwicklungs- und physiologischen Prozessen einschließlich Zell-Zell-Adhäsion. In Endothelzellen wird Aktin Spannungsfaserbildung als mit Barrierefunktionsstörungen und Hyperpermeabilität 13,14 zugeordnet sein. Rhodamin phalloidin Markierungstechnik in der vorliegenden Studie verwendet, um F-Aktin Stressfaserbildung zu beobachten ist eine Endpunkt-Studie. Allerdings kann dynamisch und Live-Bildgebung des Stressfaserbildung auch von Doggett und Breslin 15 gezeigt durchgeführt werden. Die aktuelle Studie betont majorly den Beitrag der ZO-1 in Richtung des BBB tight junction Integrität. Jedoch können andere Moleküle wie tight junction Claudin- 5, Occludin, junctional Adhäsionsmoleküle (JAM) etc auch als Marker verwendet, um die BBB tight junction Integrität folgenden OGD-R untersuchen. In dieser Studie verwendeten wir Immunlokalisierung und F-Actin Kennzeichnung als qualitative Technik, um die Tight Junction-Integrität zu bestimmen. Wir können aber auch studieren die andere wichtige Eigenschaften des BBB wie quantitative Messung der Durchlässigkeit unter Verwendung von fluoreszierenden Markern und transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER). Der OGD-R-Technik präsentiert in dieser Studie mit derBiospherix System kann nur für Hypoxie / Anoxie Studium an einer festen Konzentration von Sauerstoff verwendet werden; jedoch können wir dieses System nicht verwenden zur Untersuchung der Wirkung von unterschiedlichen Konzentrationen von Sauerstoff an Endothelzellen. Für die Untersuchung der Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Sauerstoff auf Endothelzellen müssen wir weitere Modelle für diesen Zweck geeignet zu verwenden. Diese Technik kann für die Untersuchung der mechanistischen Zusammenhänge zwischen verschiedenen zellulären und molekularen Ereignisse, die BBB Hyperpermeabilität und TJ Integrität regulieren verwendet werden. Verstehen sie wird einen Einblick für die Entwicklung von verschiedenen Molekular Strategien, um BBB-Störung und mikrovaskuläre Permeabilität zu dämpfen.

Ischämie-Reperfusions (IR) Verletzung festgestellt wird, das häufige Ursache verschiedener schwächende Komplikationen und Todesfälle im Zusammenhang mit Schlaganfall, Myokardinfarkt, Trauma, periphere Gefäßkrankheit und traumatischer Hirnverletzung 1,2 zugeordnet werden. IR Verletzungen in Hirngefäße ist eine frühe sekundäre Verletzungen, die zu Entzündungen und Ödeme 3. Einer der schwerwiegenden Komplikationen, die als Folge der oxidativen und metabolischen Stress folgenden Entzündung auftritt ist der Verlust der homöostatischen Gleichgewicht, was zu Bildung von freien Radikalen, Veränderungen in der Blut-Hirn-Schranke (BHS) Tight Junctions (TJs) und mikrovaskuläre Permeabilität 4,5. Derzeit werden in-vivo-Modellen verwendet werden, um die Auswirkungen von IR Verletzung am BBB Studie sind mittleren Hirnarterie (MCAO), Mikroembolien und transgenen oder Knockout-Tieren. Jedoch hat jede ihre Nachteile und Einschränkungen durch Hossmann 6 diskutiert. MCAO-Modell verwendet die effec zu studierents von Redox-Stress, Veränderungen in der Junction-Kommunikation des BBB und die Interaktionen zwischen Gehirn und Immunzellen. Jedoch weisen sie verschiedene technische Herausforderungen, wie die Notwendigkeit für eine präzise Mikrochirurgie und die Schwierigkeiten darin. Mikroembolie sofort bricht die BBB, während die Verwendung von transgenen oder Knockout-Tieren zu zerebraler Ischämie studieren können Herausforderungen wie Gen-abhängige Molekular Einflüsse auf Infarktbildung, Veränderungen in der Gefäßanatomie und unterschiedlichen Körpergewichte 6 haben. Daher wird in vitro-Modellen von Ischämie haben gefunden zunehmendes Interesse in der letzten Zeit vor allem aufgrund ihrer Eignung bei der Durchführung mechanistische Studien für Medikamente. Allerdings können die Ergebnisse der in-vitro-Studien nicht vollständig repräsentieren eine in-vivo-Studie und müssen mit Vorsicht interpretiert werden 6. Gegenläufig wirkte der geringe Sauerstoffkonzentrationen auf die endotheliale Zellmonoschichten und mikrovaskuläre Permeabilität wurdenstudierte von Ogawa 7. Rattenhirn-mikrovaskulären Endothelzellen (RBMECs) wurden verwendet, um die in vitro BBB entwickeln. Die Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung (OGD-R-Technik) in diesem Protokoll vorgestellt wurde von Studien, die von Zulueta et al und Zhu et al 8,9 angepasst. Wir exponierten Hirnendothelzellen auf OGD-R, indem sie in einer Hypoxie / Anoxie Raum mit 0% O 2, 5% CO 2 und 95% N 2. Die Zellen wurden später für die Veränderungen in TJ Integrität und Stressfaserbildung mittels Immunfluoreszenz-Lokalisierung und Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung bzw. beurteilt. Immunfluoreszenzfärbung für das Zonula-occludens-1 (ZO-1) durchgeführt, um festzustellen, TJ Integrität als ZO-1 eine wichtige Gerüst Membran gebunden TJ Protein. Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung bestimmt die filamentöse Aktin (F-Actin) in der Zelle Zytoskeletts und ist ein deutliches Zeichen von Aktin-Stressfaserbildung in Endothelzellen. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Das Ziel dieses Verfahrens ist, um einen Einblick in die Entwicklung OGD-R als in vitro-Modell zum Studium IR BBB Endothelzellen TJ Integrität und F-Actin Spannungsfaserbildung bereitzustellen. Die Ergebnisse werden Informationen über das Schicksal der TJ-Protein liefern, ZO-1 und Stressfaserbildung nach OGD-R. Das Verständnis dieser Zusammenhänge wird die Möglichkeit, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die ausgelöst folgenden OGD-R sind zu ermitteln und entwickeln mögliche therapeutische Strategien, um die Störung BBB folgenden OGD-R Behandlung zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>Proox model 110</td><td>Biospherix</td><td>Model 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, no glucose</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody</td><td>Life technologies</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&amp;nbsp;well sterile, glass&amp;nbsp;slides&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>Any other PBS available can be used</td></tr></tbody></table>

oxygen-glucose deprivation and reoxygenation as an in vitro ischemia-reperfusion injury model for studying blood-brain barrier dysfunction

Ischämie-Reperfusion (IR) Verletzung bekannt ist, wesentlich zur Morbidität und Mortalität bei ischämischen Schlaganfällen assoziiert beitragen. Ischämische Schlaganfälle machen 80% aller Schlaganfälle. Eine häufige Ursache für IR Verletzungen ist der schnelle Zustrom von Flüssigkeiten nach einer akuten / chronischen Verschluss von Blut, Nährstoffe, Sauerstoff zum Auslösen der Bildung von freien Radikalen Gewebe. Ischämischen Schlaganfall wird durch Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​Dysfunktion und vasogenic Hirnödem gefolgt. Strukturell Tight Junctions (TJs) zwischen den Endothelzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS). IR Verletzungen ist eine frühe Sekundärverletzung führt zu einer unspezifischen Entzündungsreaktion. Oxidativen und metabolischen Stress folgenden Entzündung auslöst sekundären Hirnschäden einschließlich BBB Lässigkeit und Unterbrechung der Tight Junction (TJ) Integrität. Unser Protokoll stellt ein in vitro &lt;/ Em&gt; Beispiel von Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung (OGD-R) auf Rattenhirn Endothelzellen TJ Integrität und Stressfaserbildung. Derzeit mehreren experimentellen in vivo-Modelle werden benutzt, um die Effekte von IR Schädigung zu untersuchen; sie haben jedoch mehrere Einschränkungen auf, wie die technischen Herausforderungen bei der Durchführung von Operationen, Gens abhängige Molekular Einflüsse und Schwierigkeiten bei der Untersuchung mechanistische Beziehungen. Jedoch kann in vitro Modellen in der Überwindung vieler dieser Einschränkungen zu unterstützen. Das vorgestellte Protokoll verwendet, um die verschiedenen molekularen Mechanismen und mechanistische Beziehungen zu studieren, um potentielle therapeutische Strategien bereitzustellen. Allerdings können die Ergebnisse der in-vitro-Studien von Standard-in-vivo-Studien unterscheiden und sollten mit Vorsicht interpretiert werden.

Zellen auf Fibronektin vorbeschichteten Nunc II Kammer-Objektträgern kultiviert wurden OGD-R, indem Sie in einem Biospherix ProOx Modell 110 Kammer unterzogen. Nach Aussetzen Zellen OGD-R, die sie für ZO-1 junctional Färbung mit Immunfluoreszenztechnik verarbeitet wurden, wie in Abbildung 2 und Zytoskelett Anordnung gezeigt anzeigt F-Aktin Bildung von Stressfasern mit Rhodamin-Phalloidin-Färbung Etikett, wie in Fig. 3 gezeigt, die Kontrollzellen waren nicht OGD-R unterzogen zeigte kontinuierliche junctional Integrität während Endothelzellen OGD-R unterzogen zeigte diskontinuierliche Übergänge, was den Verlust von TJ Integrität 2. Kontrollzellen, die nicht mit OGD-R-Behandlung unterzogen wurden, zeigten keine oder nur minimale f-Actin-Stress-Faser Bildung beim Endothelzellen OGD-R unterworfen gezeigt erhöhten f Actin-Spannungsfaserbildung, die die Veränderungen in der Aktin Zytoskelett Anordnung Figur 3; Vertreter<html> rint mit Genehmigung aus Lit. # 13 <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52699/52699fig1.jpg" /> Abbildung 1. Typische Konfiguration des Hypoxie-System ProOx Modell 110. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52536/52536fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52699/52699fig2.jpg" /> Abbildung 2. Immunfluoreszenz Lokalisierung von Tight Junction Protein (TJP) ZO-1 Nachweis Disruption der Tight Junctions folgenden OGD-R in RBMECs, wie Weiße Pfeile dargestellt. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52536/52536fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.</a> &quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52699/52699fig3.jpg" /> Abbildung 3. Rhodamin Phalloidin Labeling für f-Actin Bildung von Stressfasern Demonstration Veränderungen im Zytoskelett-Assembly Nach OGD-R in RBMECs, wie Weiße Pfeile dargestellt. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52536/52536fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ischämie-Reperfusion Injury Modell zum Studium der Blut-Hirnschranke Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

17.9K Aufrufe.  Texas A&M University Health Science Center College of Medicine. Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells. 

Serie: Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2-Gefäßverschluss / Hypotonie: Eine Ratte Modell der globalen Hirnischämie

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Forschung

Medizin

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Neurowissenschaften

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is characterized by an interruption in blood supply to the brain leading to cell death and cognitive dysfunction. During and after ischemic stroke, blood-brain barrier (BBB) dysfunction facilitates injury progression and contributes to poor patient recovery. Current BBB models primarily include endothelial monocultures and double co-cultures with either astrocytes or pericytes.
Such models lack the ability to fully imitate a dynamic brain microenvironment, which is essential for cell-to-cell communication. Additionally, commonly used BBB models often contain immortalized human endothelial cells or animal-derived (rodent, porcine, or bovine) cell cultures that pose translational limitations. This paper describes a novel well-insert-based BBB model containing only primary human cells (brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and brain vascular pericytes) enabling the investigation of ischemic brain injury in vitro. 
The effects of oxygen-glucose deprivation (OGD) on barrier integrity were assessed by passive permeability, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements,and direct visualization of hypoxic cells. The presented protocol offers a distinct advantage inmimicking the intercellular environment of the BBB in vivo, serving as a more realistic in vitro BBB model for developing new therapeutic strategies in the setting of ischemic brain injury.

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Here, we describe the method for establishing a triple cell culture model of the blood-brain barrier based on primary human brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. This multicellular model is suitable for studies of neurovascular unit dysfunction during ischemic stroke in vitro or for the screening of drug candidates.

Ein dreifaches primäres Zellkulturmodell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke zur Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls in vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Biochemie

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of oxygen and glucose, which causes energy failure and neuronal death. After an ischemic stroke insult, astrocytes become reactive and proliferate around the injury site as it develops. Under this scenario, it is difficult to study the specific contribution of astrocytes to the brain region exposed to ischemia. Therefore, this article introduces a methodology to study primary astrocyte reactivity and proliferation under an in vitro model of an ischemia-like environment, called oxygen glucose deprivation (OGD). Astrocytes were isolated from 1-4 day-old neonatal rats and the number of non-specific astrocytic cells was assessed using astrocyte selective marker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and nuclear staining. The period in which astrocytes are subjected to the OGD condition can be customized, as well as the percentage of oxygen they are exposed to. This flexibility allows scientists to characterize the duration of the ischemic-like condition in different groups of cells in vitro. This article discusses the timeframes of OGD that induce astrocyte reactivity, hypertrophic morphology, and proliferation as measured by immunofluorescence using Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Besides proliferation, astrocytes undergo energy and oxidative stress, and respond to OGD by releasing soluble factors into the cell medium. This medium can be collected and used to analyze the effects of molecules released by astrocytes in primary neuronal cultures without cell-to-cell interaction. In summary, this primary cell culture model can be efficiently used to understand the role of isolated astrocytes upon injury.

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex event in which the specific contribution of astrocytes to the affected brain region exposed to oxygen glucose deprivation (OGD) is difficult to study. This article introduces a methodology to obtain isolated astrocytes and study their reactivity and proliferation under OGD conditions.

Überwachung der Astrozyten Reaktivität und Proliferation in Vitro unter ischämischen-ähnlichen Bedingungen

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszenzfarbstoffbasierte Visualisierung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke bei Mäusen

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung als

Zusammenfassung

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