Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Heart and Lung Institute (R01 HL086582) und der New York Stammzellwissenschaftsfonds (NYSTEM, Vertrag # unterstützt &#160; C024316), um STA und in JoVE Video verwendet wurden von John Nyquist abgeschlossen DDS Abbildungen; Medical Illustrator von State University of New York in Buffalo.

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von der Animal Care und Verwenden Committee an der State University of New York in Buffalo zugelassen. 1. Präoperative Vorbereitung <ol><li> Verwenden Schafe (Dorset Quer, weiblich, ca. 1-3 Jahre alt mit einem Gewicht von 40 bis 60 kg) für die folgende Studie. Verwalten Cyclosporin A (200 mg / Tag), Aspirin (975 mg / Tag) und Coumadin (20-30 mg / Tag) durch den Mund, ab 3 Tage vor der Operation und auch weiterhin für die Dauer aller Studien. </li><li> Stellen Sie sicher, das Schaf hat 12 Stunden vor der Operation (normales Futter = 1,8 kg Heu und 0,4 kg Getreide) gefastet. </li><li> Sterilisieren Sie alle chirurgisches Material werden in einem Autoklav bei 121 ° C und 15 psi für 30 Minuten. </li><li> Setzen Sie die folgenden Elemente in einer Para Exsikkator 48 Stunden vor der Operation: 4 mm Doppler Strömungssonden, 1 mm Ultraschallkristallen, Dauer arteriellen Katheter, Verlängerungsschlauch, und 42 &quot;Tygon Schläuche. HINWEIS: Eine Tabelle mit den relevanten medizinischen Geräten für die notwendigeChirurgie und für die Sterilisation ist in Tabelle 1 aufgeführt. Vorabplatzierung der Instrumente in die Tygon-Schlauch in diesem Schritt wird dazu beitragen, sparen Zeit während der Operation. <ol><li> Beschriften jedes Ende der Sonden, Katheter und Kristalle als links und rechts, falls zutreffend. </li></ol></li></ol> 2. Chirurgische Operation <ol><li> Induzieren Schafe Anästhesie mit Diazepam (0,5 mg / kg) und Ketamin (4 mg / kg) intravenös (IV). Alternativ können Sie Telazol (4 mg / kg) IV. <ol><li> Führen orotracheale Intubation mit einem 8,5 bis 10,0 mm Innendurchmesser Endotrachealtubus mit Manschette 7. </li><li> Verabreichen Inhalationsnarkose durch eine Rückatmungskreislauf mit einem Tidalvolumen Ventilator (7-10 ml / kg) oder eine druckgeregelte Ventilator (15-20 cm H 2 O). Verwenden Sie einen Präzisions Verdampfer zu Isofluran oder Sevofluran in angemessener Höhe (3% -4% zunächst) zu verabreichen, um einen mittleren bis tiefen chirurgischen Narkosestadium zu erreichen. Die minimale alveoläre KonzentrationSchaf ist 1,4% oder 1,9% 8. </li><li> Beurteilen Sie Narkosetiefe durch Beobachtung motorische Reaktion auf Reize, Augenlidreflexe, Augenposition, und die Herzfrequenz. Überwachen der Blutsauerstoffsättigung (95% -100%) mittels Pulsoximetrie, CO 2 -Konzentration (45-55 mmHg) in Ausatmungsgase Verwendung capnography und Aufrechterhaltung der Körpertemperatur während der Prozedur (38,5 bis 39,5 ° C) mit Hilfe eines automatisch regulierten Wärmedecke. </li></ol></li><li> Rasur Wolle aus dem gesamten Hals der Schafe, und über eine Kopfvene, mit einem # 40 Klinge auf Standard-Schneidemaschinen. Bereiten Sie die Haut von beiden Standorten für die Chirurgie mit 70% Isopropylalkohol und 7,5% betadine Peeling gesättigten Gaze. Beginnen Sie mit Alkohol Gaze um die Entfernung von Hautöle zu erleichtern. Wechseln Sie zwischen Betadin und Alkohol Gaze Gaze dreimal. </li><li> Zeigen Schafe auf dem Operationstisch in Rückenlage auf einer Wärmedecke. Übergeben Sie einen mittelgroßen Magensonde für passive Vertreibung der Mageninhalt zu ermöglichen. Verlängern Sie dieSchafs Hals und nutzen unterstützende Polsterung wie nötig, um die Platzierung zu halten. <ol><li> Führen Sie eine abschließende aseptischen Peeling mit 7,5% betadine getränkten Gaze und lassen Sie es für 5 min vor der Operation zu sitzen. </li></ol></li><li> Verabreichen Infusionen (Ringer Lactatlösung oder 0,9% Salzlösung) mit 10 ml / kg / h durch ein Angiokatheter in der Vena cephalica gegeben. Verwalten Sie intraoperative Antibiotika und Analgetika: Procain Penicillin G 6600 U / kg intramuskulär (IM), Gentamicin 1,6 mg / kg IM und Buprenorphin 0,005-0,01 mg iv oder im. </li><li> Machen Sie eine ~ 12 cm langer Schnitt in Längsrichtung über den ventralen Mittellinie Hals mit Elektrokauter. Isolieren linken und rechten Halsschlagadern (~ 6 cm) durch Entfernen des Bindegewebes mit einem stumpfen Dissektionstechnik. Binden Sie ab und ätzen Mikrogefäße Verzweigung von der Halsschlagadern, um Blutungen zu minimieren. </li><li> Pflegen Sterilität durch den Einsatz (eine nicht sterile) OP-Schwester mit grab alle Kabel und Rohre verlegt (Strömungssonde, Ultraschallkristall Leitungen unterstützenund der Katheterschlauch) in die subkutane Schicht der Haut. Verwenden Sie einen stumpfen Trokar, der durch den chirurgisch vorbereitet Schnitt an der dorsolateralen Hals verlässt. <ol><li> Zu erreichen unter der sterilen Tuch und drehen Sie den Kopf der Schafe, so dass die Seite des Halses unter dem Tuch sichtbar gemacht werden. </li><li> Einen 8 cm gekrümmten hemostat tunneln durch den subkutanen Raum zwischen dem ventralen Mittellinie Halsschnitt auf und die Seite des Halses. Öffnen und Schließen der Gefäßklemme, einen Raum breit stumpf sezieren für den Schlauch ~ 1,5 cm. Die Spitzen der Gefäßklemme sollte in der Mitte zwischen den Kopf und die Schultern, ca. 10 cm kaudal des rechten oder linken Ohr befinden. Drehen Sie den Gefäßklemme, so dass die Spitzen in Richtung der oberflächlichen Haut zeigt. </li><li> Zu erreichen unter der sterilen Tuch und einen 1,5 cm Inzision durch die Haut, über die Spitzen der Hämostat mit einer sterilen # 11 Klinge. Visualisieren Sie die Spitzen der Gefäßklemme, um eine klare Exit durch die Haut zu bestätigen. </li><li> Übergeben Sie die Tygon Röhrchen, das einell Kabel und Rohre verlegt durch den subkutanen Tunnel. Halten Sie die Kabel und Schläuche über dem sterilen Tuch. </li><li> Zu erreichen unter der Abdeckung, um die äußere Tygon-Schlauch vom Hals zu entfernen, indem die implantierte Verdrahtung wie es den Hals der Schafe verlässt. Ziehen Sie einzelne Zeilen aus den Schlaufen im subkutanen Raum zu minimieren. Lassen Sie genügend Abstand, um die Instrumente richtig zu befestigen, um die Arterie. </li></ol></li><li> Zeigen 4 mm Doppler-Sonden auf beiden Halsschlagadern und erreichen eine erste Lesung (Abbildung 1). Verabreichen 100 U / kg Heparin IV 30 min vor dem Spannen der Arterie. </li><li> Weiter Heparingabe bei 100 U / kg / h bis zum Ende der Operation. Klemmen Sie die Halsschlagader unter Verwendung von nicht-Brech-Gefäßklemmen und Verbrauchsteuern einen Teil (ca. 4 cm Länge). Die kontralaterale Halsschlag Flußrate erhöht 50% -100%, um den Blutfluß zum Gehirn aufrechtzuerhalten. HINWEIS: Es ist möglich, Längsdehnung durch Rückstoß der Mutterbehälter zu begrenzen, indem Siekürzere Segmente als ersetzt und / oder Dehnung der nativen Arterie mit Gefäßklemmen zu verkürzen Lücke bis zur vollständigen anastomotischen Verfahren abgeschlossen ist. Dies wird helfen, die Spannung auf einzelnen Haltenähte und die implantierte Transplantat zu begrenzen. </li><li> Naht der TEV an Ort und Stelle mit einfachen unterbrochenen Stichen mit 7-0 Prolin ethalloy Doppel bewaffneten Monofilamentnaht. Falls erforderlich, vaskuläre glatte Muskelrelaxantien wie Papaverin (15 mg / ml) oder Nicardipin (1,25 mg / ml) topisch auf das native Vaskulatur um Vasokonstriktion der anastomotischen Naht behindern würde, zu verhindern. HINWEIS: Beginnen Sie, indem Nähte mit ca. 1 mm Abstand. Dies kann von Fall zu Fall variieren. Die Zusammensetzung und Dicke TEV wird die effektive Abstand zwischen Fäden beeinflussen. Da die Dicke des nativen Gewebes oder TEV abnimmt, kann es notwendig sein, um die Nahtmaterialien näher zusammen zu platzieren. <ol><li> Erste Anker vier Punkte des TEV zur nativen Arterie, indem zwei gegenüberliegende stitches sowohl proximalen und distalen Ende (2 -Di). Halten Sie jede Anker mit Hämostatika unterrichtet. HINWEIS: Proximale und distale Beschreibungen sind in Bezug auf die Richtung des Blutflusses durch das Papier. </li><li> Hinzufügen 5-6 weitere Nähte auf der oberflächlichen Seite sowohl des proximalen und distalen Enden, um die Anastomose zu beginnen. (2-Pr). Gleichzeitig drehen sich die Gefäßklemmen 180 Grad. </li><li> Wieder herstellen Spannung auf den Verankerungsnähte. Hinzufügen zusätzlicher (5 bis 6) Nähten an proximalen und distalen Enden auf gedrehten Seite des TEV. </li></ol></li><li> Sobald der TEV fest eingenäht, drehen Sie es wieder in die ursprüngliche Position, und entfernen Sie die Gefäßklemmen ein zu einer Zeit, distalen Klemm ersten. Leichte Blutungen an den Anastomose Websites ist weit verbreitet. Dies kann natürlich nach einigen Minuten der Klemm Release beheben und Umspannen oder erfordern die Platzierung zusätzliche Nähte. Setzen Sie den Doppler-Sonde (Abbildung 3-fl) Wieder auf nativen Arterie proximal um den Blutfluss in die TEV und Monitor Durchfluss. HINWEIS: Erwarten die Strömungsgeschwindigkeiten der linken und rechten Halsschlag nach etwa 15 min äquilibrieren gelassen. Wenn die Strömungsrate auf der Halsschlagader implantiert TEV stetig fällt, ist es möglich, die TEV Blutgerinnung. Andere mögliche Anomalien bezüglich Strom zu Verengung der nativen Arterien proximal oder distal der TEV zurückzuführen. Wenn dies auftritt, kann die Verwendung von zusätzlichen glatten Gefäßmuskelentspannungs angewendet werden, und die ursprünglichen Gefßes sollte zu einer Basaltonus nach 30-60 min nach der Schließung des Gewebes über die Transplantationsstelle zurückzukehren. <ol><li> Wenn gewünscht, auszuschneiden die kontralateralen Halsschlagader und vernähen Sie es an seinen Platz als &quot;Sham&quot; Kontrolle. Dies ist klinisch relevant als Verlassen der rechten Halsschlagader allein und nur Anbringen der Strömungssonde, Ultraschallkristallen und Katheter. Wenn eine scheinbehandelte Kontroll wird gesucht, führen Sie diese, bevor Sie fortfahren mit Schritt 2.11. </li></ol></li><li> Vernähen 1 mm Ultraschallkristalle (3 -CR 1 CR 2) an gegenüberliegenden Seiten des TEV mit 7-0 Prolin. Fädeln Naht durch die Ultraschallkristall Kopf und nähen sich nur auf die Oberflächenschicht des TEV. </li><li> Katheterisierung der Arterie unter Verwendung eines modifizierten 18G-Katheter mit einem Teflon Webleiste (Abbildung 3- Ca &amp; 4A). Setzen Sie den Katheter distal der TEV auf nativen Arteriengewebe. <ol><li> Naht der Knopfleiste an der Arterienwand mit 5/0 Ethibond, um Blutungen zu kontrollieren. Verwenden Cyclohexanon die Microbore Schlauch zum Katheter, die mit Kochsalzlösung gespült worden ist, haften. Verwenden Sie den Schlauch als Erweiterung Linie. </li><li> Verwenden Sie eine 20 G Luer Stub Adapter mit einem Surflo Injection Stecker, um die nach außen gelegt Ende Schlauch (4B) zu versiegeln. , Um die Durchgängigkeit des Katheters zu halten, benötigen Sie das Füllvolumen der Linie und spülen Sie es mit 10 ml Kochsalzlösung und 5.000 U / ml Heparin-Natrium zur Injektion alle 2-3 Tage. </li></ol></li><li> Nehmen die Entfernung zwischen dem Strömungssonde und der Ultraschallkristallen sowie dem Abstand zwischen dem Strömungssonde und dem Katheter. Dies ermöglicht der Pulswellengeschwindigkeit, die in Verbindung mit der Software berechnet werden. Wenn solche Berechnungen nicht benötigt werden, nicht zu implantieren einen Katheter. </li><li> Erhalten eine intraoperative Mess wenn gewünscht, alle implantierten Hardware zu gewährleisten ist funktional (siehe Abschnitt 3). </li><li> Sichern Sie implantierten Leitungen und Leitungen in der Nähe der Muskulatur mit 2/0 Silk und eine Verjüngung Nadel (Abbildung 3). <ol><li> Positionieren Sie den Gefäßströmungssonde Draht parallel zum Schiff, mit der Sonde und dem Schwanz Draht, der sich nach kranial, und dann eine &quot;U-Turn&quot; in Richtung der seitlichen Muskulatur. Sichern des Drahtes an benachbarten Muskulatur, mit 2-0 Seide auf einem Kegel Nadel an zwei Orten, so daß der Draht oder die Strömungssonde ist nicht in der Lage, jede Belastung auf das Gefäß legen. Achten Sie darauf, Nähte anliegen, aber nicht überdrehen und strangulieren musculatur (Abbildung 3). </li><li> Naht der Kristalldrähte und arterielle Katheterleitung zur lateralen Muskulatur, so dass für ~ 1,5 cm von schlaff, ähnlich zu vorhergehenden Schritte zum Befestigen Strömungssonde (Abbildung 3). </li><li> Gruppieren Sie alle Kabel und Leitungen zusammen und verankern sie Muskulatur, kurz bevor Sie verlassen durch subkutanen Tunnel, ähnlich wie bei vorherigen Schritte. </li></ol></li><li> Schließen Sie die Operationsstelle mit einem 2-0 Vicryl Nahtmaterial in Schichten mit einer fortlaufenden Naht Muster auf Armaturenbrett und subdermale, läuft Matratze Stich auf der Haut (Armaturenbrett, nicht schneidenden Nadel, Haut, Schneiden Nadel). Schließen Sie den 1,5 cm Schnitt am Rücken Hals um die exteriorisierten Kabel und Leitungen, mit 2/0 Vicryl und einem Schneid Nadel. </li><li> Ort Strömungssondendrähte, Katheterleitungen und Ultraschallkristall Drähte in einen Beutel (10 cm x 10 cm), die fest an der Haut des Schaf (5 - nach Wiederherstellung) vernäht wird. </li><li> Allmählich entwöhnen die Schafe aus der Anästhesieund das Atemvolumen Ventilator dann extubieren die Schafe, wenn die Spontanatmung wieder aufgenommen wird. Entfernen Sie die Angiokatheter in die V. cephalica und Verband bei Bedarf eingesetzt. </li><li> Verbinden Sie den Hals mit Dreifach-antibiotische Salbe auf die Einschnitte eine Telfa Pad, Spannwalze Gaze und elasticon. </li><li> Verwalten postoperativen Analgesie: Flunixinmeglumin 2,2 mg / kg IM einmal während der Wiederherstellung, dann 1,1 mg / kg IM einmal täglich für zwei Tage, Buprenorphin 0,005 bis 0,01 mg iv oder im zweimal am Tag für einen Tag. </li></ol> 3. In-vivo-Überwachung <ol><li> Zeigen Schafe in mobilen Wagen, um die ordnungsgemäße Zurückhaltung zu gewährleisten. Auf diese Weise können die Schafe, ohne die Hardware ruhig und bewusst zu bleiben. Möglicherweise müssen Sie Schafe den Warenkorb 30 min vor Einholung Instrumentenaufnahmen akklimatisieren 2 oder 3 mal. </li><li> Entfernen Sie alle Kabel und Leitungen von Beutel und eine Verbindung zu den Überwachungseinrichtungen. Schließen Strömungssonde an einen Durchflussmesser, 1 mm Ultraschallkristalle TRB angeschlossen-USB-Box und Katheterleitungen Druckaufnehmer. Ein Flussdiagramm dieses Setup wird (Abbildung 6). </li><li> Kalibrieren Strömungssonden und Drucksensoren vor der Datenerfassung. HINWEIS: Aufgrund der potentiellen Variabilität zwischen den Softwareversionen und Unterschiede in der Ausrüstung, Kalibrierungen und Einstellungen werden von Fall zu Fall variieren. </li><li> Nutzen Sie ein Oszilloskop an die Feinabstimmung des Sonometrics Kristallmessung, nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Datensätzen mit Computer-Software (Abbildung 7). Spuren in der oberen Hälfte der Figur 7 in der Farbe weiß entspricht dem implantierten TEV, während Spuren in der unteren Hälfte in der roten Farbe entspricht der Sham / Native. Sowohl für die TEV und Sham der Flussrate (ml / min), arterieller Blutdruck (mm Hg) und Durchmesser (mm) werden live aufgenommen. </li><li> Nehmen Sie für mindestens 1 min, ohne Störungen. Exportieren Sie diese Daten für eine detailliertere Analyse. Nach der Aufnahme DISCONNect alle Leitungen und den Ort wieder in Beutel auf dem Hals des Schafes vernäht. </li></ol>

<ol>
	<li>Goldman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+patency+of+saphenous+vein+and+left+internal+mammary+artery+grafts+after+coronary+artery+bypass+surgery:+Results+from+a+Department+of+Veterans+Affairs+Cooperative+Study.">Long-term patency of saphenous vein and left internal mammary artery grafts after coronary artery bypass surgery: Results from a Department of Veterans Affairs Cooperative Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44, 2149-2156 (2004).</li><li>Achouh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+(5-+to+20-year)+patency+of+the+radial+artery+for+coronary+bypass+grafting.">Long-term (5- to 20-year) patency of the radial artery for coronary bypass grafting.</a> The Journal of Thoracic And Cardiovascular Surgery. 140, 73-79 (2010).</li><li>Conklin, B. S., Richter, E. R., Kreutziger, K. L., Zhong, D. S., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+novel+decellularized+vascular+xenograft.">Development and evaluation of a novel decellularized vascular xenograft.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 24, 173-183 (2002).</li><li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-atherosclerotic+tissue-engineered+blood+vessel+by+A20-regulated+endothelial+progenitor+cells+seeding+decellularized+vascular+matrix.">Development of anti-atherosclerotic tissue-engineered blood vessel by A20-regulated endothelial progenitor cells seeding decellularized vascular matrix.</a> Biomaterials. 29, 2628-2636 (2008).</li><li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 9214-9219 (2011).</li><li>Kaushal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+small-diameter+neovessels+created+using+endothelial+progenitor+cells+expanded+ex+vivo.">Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo.</a> Nat Med. 7, 1035-1040 (2001).</li><li>Galatos, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+Analgesia+in+Sheep+and+Goats.">Anesthesia and Analgesia in Sheep and Goats.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 27, 47-59 (2011).</li><li>Okutomi, T., Whittington, R. A., Stein, D. J., Morishima, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+sevoflurane+and+isoflurane+anesthesia+on+the+maternal-fetal+unit+in+sheep.">Comparison of the effects of sevoflurane and isoflurane anesthesia on the maternal-fetal unit in sheep.</a> J Anesth. 23, 392-398 (2009).</li><li>Swartz, D. D., Russell, J. A., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+fibrin-based+functional+and+implantable+small-diameter+blood+vessels.">Engineering of fibrin-based functional and implantable small-diameter blood vessels.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 288, H1451-H1460 (2005).</li><li>Niklason, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+arteries+grown+in+vitro.">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li><li>Dahl, S. L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+Available+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts.">Readily Available Tissue-Engineered Vascular Grafts.</a> Science Translational Medicine. 3, 68ra69 (2011).</li><li>Wu, W., Allen, R. A., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-degrading+elastomer+enables+rapid+remodeling+of+a+cell-free+synthetic+graft+into+a+neoartery.">Fast-degrading elastomer enables rapid remodeling of a cell-free synthetic graft into a neoartery.</a> Nature Medicine. 18, 1148-1153 (2012).</li><li>Saami, K. Y., Bryan, W. T., Joel, L. B., Shay, S., Randolph, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+an+endothelium+layer+after+preconditioning.">The fate of an endothelium layer after preconditioning.</a> Journal of vascular surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 51, 174-183 (2010).</li><li>Ueberrueck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+ovine+and+porcine+animal+models+for+biocompatibility+testing+of+vascular+prostheses.">Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses.</a> Journal of Surgical Research. 124, 305-311 (2005).</li><li>Labb&#233;, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel.">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> The FASEB Journal. 12, 47-56 (1998).</li><li>Samaha, F. J., Oliva, A., Buncke, G. M., Buncke, H. J., Siko, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+study+of+end-to-end+versus+end-to-side+techniques+for+microvascular+anastomosis.">A clinical study of end-to-end versus end-to-side techniques for microvascular anastomosis.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99, 1109-1111 (1997).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+end-to-side+anastomosis+technique+for+hepatic+rearterialization+in+rat+orthotopic+liver+transplantation+to+accommodate+size+mismatches+between+vessels.">A novel end-to-side anastomosis technique for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation to accommodate size mismatches between vessels.</a> European Surgical Research. 47, 53-62 (2011).</li><li>Peng, H., Schlaich, E. M., Row, S., Andreadis, S. T., Swartz, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ovine+ex+vivo+Arteriovenous+Shunt+Model+to+Test+Vascular+Implantability.">A Novel Ovine ex vivo Arteriovenous Shunt Model to Test Vascular Implantability.</a> Cells, Tissues, Organs. 195, 108 (2011).</li><li>Zilla, P., Bezuidenhout, D., Human, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prosthetic+vascular+grafts:+Wrong+models,+wrong+questions+and+no+healing.">Prosthetic vascular grafts: Wrong models, wrong questions and no healing.</a> Biomaterials. 28, 5009-5027 (2007).</li><li>Berger, K., Sauvage, L. R., Rao, A. M., Wood, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+Arterial+Prostheses+in+Man:+Its+Incompleteness.">Healing of Arterial Prostheses in Man: Its Incompleteness.</a> Annals of Surgery. 175, 118-127 (1972).</li><li>Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+the+assessment+of+novel+vascular+conduits.">Animal models for the assessment of novel vascular conduits.</a> Journal of Vascular Surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 52, 176-195 (2010).</li><li>Swartz, D. D., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+vascular+tissue-engineering.">Animal models for vascular tissue-engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 916-925 (2013).</li><li>Liang, M. -. S., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+fibrin-binding+TGF-&#946;1+for+sustained+signaling+and+contractile+function+of+MSC+based+vascular+constructs.">Engineering fibrin-binding TGF-&#946;1 for sustained signaling and contractile function of MSC based vascular constructs.</a> Biomaterials. 32, 8684-8693 (2011).</li><li>Han, J., Liu, J. Y., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+effects+of+organismal+ageing+on+smooth+muscle+cells+derived+from+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Molecular and functional effects of organismal ageing on smooth muscle cells derived from bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Cardiovascular Research. 87, 147-155 (2010).</li></ol>

There are no disclosures to report.

Der Zweck dieses Berichts ist es, ein sicheres und reproduzierbares Verfahren zur Implantat TEVs von Interesse in der Schaf- Halsschlagader ist. Die Mutterhalsschlagadern, die in diesem Modell verwendeten Tiere waren 0,5-0,75 mm Dicke und 4,5 bis 5 mm Außendurchmesser. Die hier beschriebene Operationstechnik wurde zum Implantieren TEVs unterschiedlicher Geometrien messen 0,25-1 mm Dicke, 4-5 mm Außendurchmesser und 4 cm Länge mit großem Erfolg bewährt sich bis zu 3 Monaten Dauer der beabsichtigten Endpunkt erfolgreich. Die Verwendung dieser chirurgischen Technik wird mit der Datenerfassung aktiviert leichter erfasst und konsistent. Ferner ist die Fähigkeit, Echtzeitparameter in vivo Remodeling Messung beschrieben worden. Mit unterschiedlichen Durchmessern kann erfolgreich in diesem Modell in Abhängigkeit von gewünschten Bereich der Fehlpaarung und Gestaltung der implantierten TEV, ebenso verwendet werden, kann die Dauer der Implantation auf oder über 1 ja verlängertr. Einer der größten Fortschritte bei der Optimierung des Protokolls ist die Verwendung von Ende-zu-Ende-Anastomose unter Verwendung eines unterbrochenen Nahttechnik. Die aktuelle TEV-Design bei der Erstellung dieses Berichts zunächst zur End-to-End-Anastomosen mit einer fortlaufenden Naht-Technik, die in einer hohen Ausfallrate führte (n = 3). Die genaue Ursache hierfür ist nicht bekannt, aber es könnte möglicherweise nur um eine stenotische oder nicht konformen Wirkung einer fortlaufenden Naht an der Anastomose gewesen. Bei der Suche nach alternativen Methoden, um die chirurgische Prozedur zu optimieren wurde gefunden, dass bereits berichtet in der Literatur beschriebene chirurgische Techniken sind recht ungenau. Dies ist vor allem auf Wort Einschränkungen von Zeitschriften zwingt Forscher ihre Operationstechniken in einer kurzen und dunklen Fashion berichten verhängt. Einige Berichte einfach feststellen, dass die Tiere unterzogen TEV Implantation 10-12. Andere berichten über die Verwendung von Ende-zu-Seite-3,5,13,14 oderEnde-zu-Ende-Anastomose 4,6. Schließlich andere ausdrücklich, die Verwendung von unterbrochenen 4 oder Dauerbetrieb Naht 15. Dieser Mangel an Detail macht es schwierig, zu reproduzieren oder zu verbessern, bei der Gefäßforschung Operation erfordern, die speziell für Großtiermodellen. Während es keinen signifikanten Unterschied in der Durchlässigkeit zwischen der Ende-zu-Ende und Ende-zu-Seite-Technik 16 gemeldet, im Großtiermodell die hier berichtet wird Ende-zu-Ende von Vorteil, wenn die auf der Halsschlagader aufgrund der Anatomie und Länge der TEVs häufigsten bewertet. Wenn jedoch eine große Diskrepanz zwischen der nativen Arterie und TEV vorhanden ist, kann es ideal, um eine End-to-Side-Technik, die Versprechen an Ratten 17 gezeigt hat, erlassen. Sicherstellen, dass die OP-Technik ist kein Grund zur TEV Ausfall ermöglicht es den Forschern, sich auf andere mögliche Erklärungen für Okklusion konzentrieren. Bei kurzfristigen Durchgängigkeit und die Belastung durch physiologischen Bedingungen wie Blutund der Druck ist das einzige Interesse, eine bereits berichtet Manuskript zur Verfügung. Hier wird die Verwendung von einem Schaf ex vivo arteriovenösen Shunt-Modell entwickelt, um TEV Implantierbarkeit auszuwerten optimiert worden 18. Dieses Modell hat sich als sehr effektiv bei schnell Testen mehrerer TEVs mit einem Tier, bevor sich auf die Implantation eines TEV für Langzeitstudien. Wenn die Beurteilung der Integrität eines implantierten TEV gewünscht leider herkömmliche Techniken haben Nachteile. Derzeit Sonographie oder Angiogramm Bildgebung sind die einzigen Verfahren verwendet werden, um die Integrität des TEV in vivo 3,5,6,10-14 bewerten. Ultraschall-Bildgebung der Regel nicht bieten die erforderlich sind, um die Einhaltung Veränderungen des TEV beobachten Auflösung. Angiographie ist invasiv, teuer und erfordert Narkose des Tieres. Jedoch kann durch Implantieren Flusssonden, arteriellen Kathetern und Ultraschallkristallen viele dieser Daten kann in einer vereinfachten Weise erworben werden. DiesInstrumentierung des implantierten TEV ermöglicht auch Parameter wie Pulswellengeschwindigkeit und Augmentationsindex berechnet werden. Der Vorteil der Verwendung Schafe für TEV Implantation verleiht auch Kraft für die Übersetzung der TEVs in einer klinischen Umgebung. Kleintiermodellen, wie Mäuse, Ratten und Kaninchen nicht eine realistische parallel zu denen einer klinischen Umgebung und damit Großtiermodellen ist zu erforschen 19 werden. Doch während ein Großtiermodell ist ein zuverlässiger und klinisch relevanten Modell, gibt es Bedenken in Bezug auf die für die TEV-Implantationen verwendeten Arten. Hunden und Schweinen zum Beispiel, während häufig Gefäß Forschung, endothelialisieren sehr schnell. Schafe auf der anderen Seite nur endothelialisieren Nähe der Anastomose-Sites und nicht spontan innerhalb des TEV. Dies ähnelt stärker die Heilung von Menschen 14,19-22. Um besser zu verstehen, was im Hinblick auf aufgetreten Umbau, den GastgeberTEV muss explantiert und untersucht, um die Zellmigration, Immobilisierung und Differenzierung zu beschreiben. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass der Zusatz von lipophilen Farbstoff wie Dil sowie die Verwendung von GFP + Endothelzellen sind zuverlässige Verfahren, das Schicksal der implantierten Zellen auf der TEV 5,6 beurteilen. Unsere Arbeitsgruppe hat auch gezeigt, dass SRY-Färbung (Sex-bestimmenden Region Y-Protein) gegen männliche Y-Chromosom ist eine wirksame Methode, um zu verfolgen männlichen implantierten Zellen in einem weiblichen Host (im Druck). Kollagen und Elastin-Gehalt kann auch gemessen, nachdem Gewebe explantiert werden, mehr Licht auf das Ausmaß der in vivo Umbau. Es ist auch möglich, zu bestimmen, ob vor der Implantation sowie explantierten Geweben kann Vasokonstriktoren und Vasodilatatoren reagieren, wenn in ein Organ Gewebebad gebracht. Schließlich kann TEVs auch getestet, um ihre mechanischen Eigenschaften wie Elastizitätsmodul, Bruchfestigkeit und Zugdehnung 6,9,23,24 bestimmen.

Das Hauptaugenmerk bei der Entwicklung TEVs war es, einen Ersatz für autologes Transplantat Ersatz bieten, wenn autologe Gefäße sind nicht verfügbar und die Gebersicht Morbidität zu begrenzen. Beispielsweise hat die Zahl der koronaren Arterien-Bypass-Operationen pro Jahr in den USA 350.000 überschritten, und die ideale Quelle geeigneter Transplantate bleibt der linken Arteria mammaria interna, linke vordere absteigende Koronararterie und die Vena saphena 1. Da viele Menschen, die unter Gefässkrankheiten leiden, nicht geeignet Arterien und Venen für autologes Transplantat ausgetauscht werden müssen, hat die Entwicklung von TEVs somit ein intensives Forschungsfeld werden seit Jahrzehnten 1-6. Während die Konstruktion und Optimierung von neuen TEVs haben viele Fortschritte durchgemacht, die Berichterstattung über die Operationstechniken eingesetzt, um die TEVs sich nicht ein Thema von so intensiven Diskussion gewesen zu implantieren. Vielmehr werden Protokolle über die Implantation TEVs in Tiermodellen weitgehend linksbis zu Ermittler forschen. Die folgende Manuskript zeigt, wie TEVs durch die Verwendung einer End-zu-End-Anastomose Ansatz zu implantieren. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung eines spezifischen anastomotischen Nahtmuster, Stabilisierungsnahttechnik optimiert Längsspannung und der Zugabe von in-vivo-Überwachung Instrumentierung optimiert. Dieses Verfahren wird bei einigen der vielen Variationen, die zuvor verwendet wurden, gegenübergestellt. Darüber hinaus wird beschrieben, wie Sie diese Parameter wie arterieller Blutdruck, TEV Durchmesser / Compliance erwerben und Durchflussrate durch das TEV nach der Operation bis Explantation. Diese Datensammlung eine unverzichtbare Analyse des TEV, während es in dem Verfahren der Umbau ist.

<table><tbody><tr><td>Pressure Transducer</td><td>Becton Dickinson</td><td>P23XL-1</td><td>Quantity: 1+ (1 for each artery).&lt;br/&gt;Used with water-filled diaphragm domes.</td></tr><tr><td>Amplifier and transducer box</td><td>Gould</td><td>5900 Signal Conditioner Cage</td><td>Quantity: 1.&lt;br/&gt;Two transducers and amplifiers should be included in cage. While this specific unit may be discontinued, other commercially available pressure transducers with a BNC/analog output will communicate with the Sonometrics equipment.</td></tr><tr><td>T403 Console with TS420 perivascular flowmeter module (x2)</td><td>Transonic Systems</td><td>T403 module and TS420 (x2)</td><td>Quantity: 1.&lt;br/&gt;Flow probes measuring flow through each of the carotid arteries will connect to each of the TS420 units.</td></tr><tr><td>Digital ultrasonic measurement unit</td><td>Sonometrics</td><td>TR-USB</td><td>Quantity: 1</td></tr><tr><td>Flow Probe Precision S-Series 4&amp;nbsp;mm</td><td>Transonic Systems Inc.</td><td>MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA</td><td>Quantity: 2</td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;mm Sonometrics Crystals</td><td>Sonometrics Systems</td><td>1R-38S-20-NC-SH</td><td>Quantity: 2-4 (2 for each artery)</td></tr><tr><td>Catheter for implantation</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>&amp;nbsp;381447</td><td>Quantity: 1+ (1 for each artery).&lt;br/&gt;Catheter is cut and secured to microbore tubing, stylette is utilized for insertion.</td></tr><tr><td>Tygon Microbore Tubing</td><td>Norton Performance Plastics</td><td>(AAQ04127) Formulation S-54-HL</td><td>Cut to length for an extension set</td></tr><tr><td>Luer Stub Adapter</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>427564 (20 gauge)</td><td>Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter)</td></tr><tr><td>Surflo Injection Plug</td><td>Terumo</td><td>SR-IP2</td><td>Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter)</td></tr><tr><td>Meadox</td><td>PTFE (Teflon) Felt</td><td>19306</td><td>Cut to size.&lt;br/&gt;The PTFE felt used in our studies was discontinued. However, comparable companies such as &amp;ldquo;Surgical Mesh&amp;rdquo; offer products which are equivalent.</td></tr></tbody></table>

surgical technique for the implantation of tissue engineered vascular grafts and subsequent in vivo monitoring

Die Entwicklung von Tissue Engineered Vessels (TEVs) wird durch die Fähigkeit vorgeschoben, um routinemäßig und effektiv Implantat TEVs (4-5 mm Durchmesser) in einen großen Tiermodell. Ein Schritt-Schritt-Protokoll für interposition Platzierung des TEV und Echtzeit-Digital Beurteilung des TEV und nativen Karotiden wird hier beschrieben. Durch die Implantation von Flusssonden, Katheter und Ultraschallkristallen (fähig In-vivo-Überwachung ermöglicht wird Aufzeichnungs Änderungen implantierter TEVs und nativen Karotiden) zu der Zeit der Operation dynamisch Durchmesser. Nach der Implantation können Forscher arterielle Blutströmungsmuster, invasive Blutdruck und Arteriendurchmesser ergibt Parameter wie Pulswellengeschwindigkeit, Augmentationsindex, Pulsdruck und Einhaltung zu berechnen. Datenerfassung unter Verwendung eines einzelnen Computerprogramms zur Analyse der gesamten Dauer des Experiments durchgeführt. Solche unschätzbaren Daten gibt Einblick in TEV Matrixumbau, dessen resemblance, native / Schein-Kontrollen und Gesamt TEV Leistung in vivo.

Mehr als 30 Schafe, die in diesem Bericht für die Implantation von TEVs beschrieben (im Druck) Operationstechnik 9 unterzogen. Eine Tabelle mit einer Zusammenfassung der jüngsten Schafe Operationen nach Protokolloptimierung sind in Tabelle 2 dargestellt. Alle Schafe nach TEV Implantation mit nicht lebensbedrohliche Komplikationen erholt. Bei einigen Tieren wurde Fibrose im nativen Arterie nahe der Spitze des innewohnenden arteriellen Katheter beobachtet. Eine signifikante Zunahme der Entzündung, die mit der Anwesenheit von zugesetztem Instrumentierung wurde nicht beobachtet. Selten (1 von 18-Katheter), der Katheter Hindernis für den Blutfluss durch das TEV verursacht. Dieses Hindernis aufgetreten ist nach einem Monat. Minor Komplikationen aus dem Katheter enthalten Dämpfung des arteriellen Signals und die Unfähigkeit, saugen Blut. Die am häufigsten berichteten Daten bei der Verfolgung der Forschung in TEV Entwicklung sind in der Regel Offenheitsrate, Durchflussmengen und der Compliance. Dieses Protokoll zeigt, dass es POSS istIVK, solche wertvollen Daten während der gesamten Dauer des Experiments erhalten. Obwohl dieser Bericht konzentriert sich auf den Erwerb von Durchflussrate, Durchmesser und arteriellen Druck; Compliance, Augmentationsindex und Pulswellengeschwindigkeit kann auch berechnet werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52354/52354fig1.jpg" /> Abbildung 1. Isolierte Halsschlagader. Isolated Halsschlagader wird mit angeschlossener Strömungssonde angezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52354/52354fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52354/52354fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Implantation von TEV. 2-Di zeigt die distale Seite des TEV mit 2 der ursprünglichen vier Verankerungspunkte verwendet, um die TEV anstelle verankern. Sobald der TEV verankert, fügen addit<html> ional Stiche, wie in Abbildung 2-Pr, die den proximalen Seite des TEV bezeichnet angezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52354/52354fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52354/52354fig3.jpg" /> Abbildung 3. Besetzung des TEV. 1 mm Ultraschall-Kristalle werden auf jeder Seite des implantierten TEV genäht (CR1 und CR2). Di bezeichnet die distale Seite des TEV während Pr bezeichnet proximal. Die flowprobe (Fl) proximal platziert vom TEV, während der Katheter (Ca) wird distal platziert. Strömungssonde und der Katheter in der Nähe Muskulatur (gepunktete Oval) genäht. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52354/52354fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> ein &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52.354 / 52354fig4.jpg &quot;/&gt; 4A. Katheter für die Instrumentierung von TEV. Katheter in Verbindung mit einem Teflon plaquet bevor platziert distalen verwendet auf native Gewebe TEV. 4B. Die Endmontage der Katheter vor der Implantation. Katheter erweitert mit Tygon-Schlauch (durch eckige bezeichnet) zusammen mit 20 G Luer Stub-Adapter mit Surflo Injektion Kabel (durch oval bezeichnet). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52354/52354fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52354/52354fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beutel an der Haut von Schafen gesichert. Pouch ist, um den Hals der Schafe befestigt Verdrahtung von 1 mm Ultraschall-Kristalle zu schützen, Strömungssonde und Katheter, wenn er nicht in Gebrauch ist. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52354/52354fig5large.jpg" target="_blank">Bitte cli</a>ck Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52354/52354fig6.jpg" /> Abbildung 6. Flussdiagramm der Elektronik zur Aufzeichnung Ultraschallkristall Entfernungen, die Durchblutung und arteriellen Druck verwendet. Ablaufdiagramm der Einrichtung verwendet werden, um Abstände zwischen Ultraschallkristallen, arteriellen Durchblutung und arteriellen Druck zu erfassen. * Bei Verwendung eines Oszilloskops kann in der Klarheit der aus den 1 mm Ultraschallkristallen empfangenen Signale zu helfen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52354/52354fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/52354/52354fig7.jpg" /> Abbildung 7. Aufzeichnung von Echtzeit-Ultraschallschwinger Entfernungen, die Durchblutung und arteriellen Druck auf Computer-Software. Weiß farbenen Spuren indfindliche Aufnahmen von TEV. T01 R02, R01 und T02 zeigen Kommunikation zwischen Ultraschallkristall cr1 zu CR2 und cr2 jeweils CR1. ARP anzeigt aufgezeichnet arteriellen Druck während ABF zeigt arteriellen Durchblutung. Das gleiche Schreibweise für rote Spuren, die die native / Schein-Halsschlagader ist eingesetzt. Das aufgezeichnete Abstand zwischen den Ultraschallkristallen während der aufgezeichneten Pulsdruck des arteriellen Blutdrucks geben den Prozentanteil der Einhaltung der TEV / Sham. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52354/52354fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="5" > Medizinische Geräte </td></tr><tr><td> Die Ausstattung </td><td> Hersteller </td><td> Serial / Catalog # </td><td> Menge </td><td> Aufzeichnungen </td></tr><tr><td> Druck TransdÜçer </td><td> Becton Dickinson </td><td> P23XL-1 </td><td> 1+ (1 für jede Arterie) </td><td> Wird mit Wasser gefüllten Membran Kuppeln </td></tr><tr><td> Verstärker und Wandler-Box </td><td> Gould </td><td> 5900 Signal Conditioner Cage </td><td> 1 </td><td> Zwei Wandler und Verstärker sollten im Käfig aufgenommen werden. Während diese bestimmte Einheit kann abgesetzt werden, werden andere handelsübliche Druckwandler mit einem BNC / Analogausgang mit dem Sonometrics Geräte kommunizieren. </td></tr><tr><td> T403-Konsole mit TS420 perivaskuläre Durchflussmesser-Modul (x2) </td><td> Transonic Systems </td><td> T403 Modul und TS420 (x2) </td><td> 1 </td><td> Flusssonden Messstrom durch jede der Halsschlagadern werden an jede der TS420 Einheiten verbinden. </td></tr><tr><td> Digitale Ultraschall-Messeinheit </td><td> Sonometrics </td><td> TR-USB </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Strömungssonde Präzisions S-Serie 4 mm </td&gt; <td> Transonic Systems Inc. </td><td> MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mm Sonometrics Crystals </td><td> Sonometrics Systeme </td><td> 1R-38S-20-NC-SH </td><td> 2-4 (2 für jede Arterie) </td><td></td></tr><tr><td> Katheter zur Implantation </td><td> BD (Becton Dickinson) </td><td> 381.447 </td><td> 1+ (1 für jede Arterie) </td><td> Katheter wird geschnitten und gesichert, um Schläuche Microbore wird Stilett zum Einsetzen genutzt. </td></tr><tr><td> Tygon Microbore Schläuche </td><td> Norton Performance Plastics </td><td> (AAQ04127) Formulierung S-54-HL </td><td> N / A (Abgepasst, um eine Verlängerung Set) </td><td></td></tr><tr><td> Luer Stub Adapter </td><td> BD (Becton Dickinson) </td><td> 427.564 (20 g) </td><td> 1+ (1 für jedes Arterienkatheter) </td><td></td></tr><tr><td> Surflo Injection Stecker </td><td> Terumo </td&gt; <td> SR-IP2 </td><td> 1+ (1 für jedes Arterienkatheter) </td><td></td></tr><tr><td> Meadox </td><td> PTFE (Teflon) Felt </td><td> 019.306 </td><td> N / A (Zuschneiden) </td><td> Die PTFE-Filz in unseren Studien verwendet wurde eingestellt. Allerdings vergleichbaren Unternehmen wie &quot;Surgical Mesh&quot; bieten Produkte, die gleichwertig sind. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Tabelle aller relevanten Geräte für chirurgische Verfahren eingesetzt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="5" > Chirurgisches Verfahren Ergebnisse </td></tr><tr><td> Instrumentierung </td><td> TEV </td><td> Schein </td><td> Anzahl der Schafe </td><td> Verfahrenszeit (Stunden) </td></tr><tr><td> Keine </td><td> Ja </td><td> Keine </td><td> 8 </td><td> 2,61 ± 0,25 </td></tr><tr><td> Keine </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> 3 </td><td> 4,17 ± 0,28 </td></tr><tr><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> 10 </td><td> 6,26 ± 0,75 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Zusammenfassende Darstellung jüngsten Schafe, die TEV und / oder Sham-Implantation unterzogen wurden. Die folgende Tabelle fasst unsere jüngste TEV Implantate. Alle Schafe lebte durch chirurgische Operation und hatte keine Komplikationen veröffentlichen Erholung.

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring at JoVE.com

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die inter-Positions Platzierung von Tissue Engineered Vessels (TEVs) in die Halsschlagader eines Schafes mit End-to-End-Anastomose und digitale Echtzeit-Beurteilung in vivo bis Tieropfer.

Operationstechnik zur Implantation von Tissue Engineered Gefäßprothesen und Folge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Überwachung

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

surgical-technique-for-implantation-tissue-engineered-vascular-grafts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

11.7K Aufrufe.  State University of New York Buffalo School of Medicine.  Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die inter-Positions Platzierung von Tissue Engineered Vessels (TEVs) in die Halsschlagader eines Schafes mit End-to-End-Anastomose und digitale Echtzeit-Beurteilung in vivo bis Tieropfer. 

Serie: Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Forschung

Biotechnik

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Engineered Vaskularisierte Muskellappen

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Computertomographie und Optical Imaging von Osteogenesis-Angiogenese-Kopplung an Integration von Schädelknochen Autografts und Allografts Beurteilen

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

Die Implantation von Vena Cava Interposition Graft in Maus-Modell

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Medizin

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Tissue Engineering von Intrinsic Vaskularisation in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

Die arteriovenöse (AV) Loop in einem Kleintiermodell zur Untersuchung Angiogenesis und Vaskularisierte Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Die Skalierung von Engineered Gefäßprothesen Mit 3D-gedruckte Führer und den Ring Stapelverfahren

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

Zerstörungsfreie Überwachung der abbaubaren Gerüst-basierten Tissue-Engineering Blutgefäß Entwicklung mit optischen Kohärenztomographie

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Operationstechnik zur Implantation von Tissue Engineered Gefäßprothesen und Folge

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video