Authors are thankful to K. P. Madhu, Nita Beliappa and staff of the Media Centre of Indian Institute of Science Education and Research, Pune for their help in the video production. The work was supported by funding under the Centre of Excellence program of Department of Biotechnology, Government of India to SG and postdoctoral fellowship by Department of Science and Technology, Government of India to RK.

1. Hydra, Kultur und Messung der Fütterung Antwort <ol><li> Aufrechtzuerhalten Hydra Polypen in Kultur durch tägliche Fütterung mit Artemia und halten sie in einem Medium (1 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 0,1 mM KCl und 0,1 mM MgSO 4) in ein enthaltenes Glasschale bei 18 ° C unter 12 Stunden Licht-12 h Dunkel-Zyklen wie zuvor 12 beschrieben. </li><li> Zur Messung der Fütterung Antwort übertragen Älterer Hydra Polypen mit 5 bis 6 Tentakeln zu einem einzelnen Well einer 24-Well-Platte. Entfernen Sie die Restmittel aus dem Brunnen durch Kippen und dann sofort hinzuzufügen 500 ml frisches Medium. </li><li> Bereiten 9 uM Glutathion-Lösung in Hydra Medium. Da die Glutathion-Lösung ist anfällig für Oxidation, immer frisch zubereitet Glutathion-Lösung für jedes Experiment. </li><li> Übertragen Sie die Platte an der Imaging-Plattform eines Mikroskops mit Bestimmungen für die Bildaufzeichnung. Verwenden Sie einen dunklen Hintergrund, so dass das Verhalten of Hydra Polypen deutlich gegen den kontrastierenden Hintergrund abgebildet werden. </li><li> Der Raum für die Beobachtung und Abbildung des Verhaltens von Hydra frei von Lichtern von schwankenden Intensitäten, Luftströmungen und Lärm gewöhnt. Solche Störungen könnten auch dazu führen, die Hydra Polypen zu einer Kontraktion der Tentakeln zeigen - auch in Abwesenheit von Glutathion. </li><li> Lassen Sie die Polypen zu 5 min zu entspannen. </li><li> Sicherzustellen, dass der Polyp ist entlang der zentralen Region der Vertiefung, so daß das Verhalten deutlich abgebildet werden entfernt. Wenn der Polyp ist am Rand des Brunnens, bringen Sie es in die Mitte durch Spülen des Mediums mit einer Pipette und wieder erlauben zu entspannen. </li><li> Aufnehmen eines Bildes von Hydra im entspannten Zustand. Dies wird die Null-Zeitpunkt Beobachtung stehen. </li><li> Hinzuzufügen schnell 9 uM Glutathion-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 3 &amp; mgr; M in dem Bohrloch zu erreichen. Je nach dem Zweck des Experiments und der Reaktion von Hydra gezeigt, testen eine Reihe von verschiedenen Konzentrationen von Glutathion und ChooSE Die geeignete Konzentration erforderlich. </li><li> Starten Sie den Timer unmittelbar nach dem Hinzufügen Glutathion-Lösung und die Aufnahmen nach jedem 15 bis 30 sec für 4-5 min. Die Vergrößerungseinstellungen während der Zeitraffer-Bildgebung nicht verändern. </li><li> Hinzufügen des Glutathion-Lösung schonend und gleichförmige Strömung, so dass die Position des Tieres in der gut wäre minimal in das Sichtfeld des Mikroskops gestört werden. Allerdings, wenn der Polyp bewegt ausgiebig nach Zugabe Glutathion-Lösung, bewegen Sie die Platte sehr vorsichtig, um die Polypen in das Blickfeld für die Bilderfassung zu bringen. </li><li> Im Kontrollexperiment verwenden Medium ohne Glutathion und gleichzeitig alle anderen Parameter gleich. </li><li> Achten Sie darauf, alle der oben genannten experimentellen Schritte in der ersten Hälfte des Tages durchzuführen - vor 13.00 Uhr, um die möglichen Auswirkungen der zirkadianen Rhythmus auf das Ausmaß der Fütterung Reaktion zu vermeiden. </li><li> Öffnen Sie jedes der aufgenommenen Bilder unter Verwendung der GNU Image Manipulation Program (GIMP). </li&gt; <li> Verwenden Sie die &quot;Messen&quot; Werkzeug von Menü&gt; Extras&gt; Messen Sie den Abstand zwischen apikalen Ende von jedem der Tentakeln und Hypostom bestimmen. Wenn die Mündungsöffnung in einem der Bilder beobachtet, den Abstand zwischen der Mitte des geöffneten Mund und dem apikalen Ende der Tentakel. Beziehen sich auf diese Distanz als die Tentakel Verbreitung. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Tentakel Spread für jeden Polypen vor und nach Glutathion Exposition. Berechnen des Verhältnisses der durchschnittlichen Tentakel Ausbreitung bei Null-Zeitpunkt an, dass an jedem der folgenden Zeitpunkte. Dieses Verhältnis wird relativ Tentakel Spread bezeichnet werden. </li><li> Wiederholungsmessungen für mindestens 20 Polypen. </li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq1.jpg" width="400" /> <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq2.jpg" width="450" /> 2. Methodenvalidierung mit Hilfe derStarvation Modell <ol><li> Für Hunger, übertragen einige Hydra Polypen zu einer separaten Glasschale und sie nicht für 5 Tage zu ernähren. Führen Sie das Kontrollgruppe von wenigen Polypen täglich mit Artemia in einem ähnlich großen Schüssel. Ändern Sie das Medium aus experimentellen Schalen täglich Pilzwachstum im Medium zu vermeiden. </li><li> Am Tag des Experiments, füttern die Kontrollgruppe von Hydra mit Artemia für 1 Stunde und verwenden Sie diese Hydra für die nachfolgenden Experimente nach dem Entfernen aller uneaten und toten Artemia aus dem Medium. </li><li> Messung der Vorschub Reaktion des Hydra ausgehungert im Vergleich mit der Kontrollgruppe Hydra aus der zuvor in Schritt 1 beschrieben, um jegliche Verzerrungen zu vermeiden Verfahren aufgrund Beobachtungszeit, abwechselnd die Messungen jedes der ausgehungert und steuern Hydra Polypen. </li></ol>

<ol>
	<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+control+of+the+specific+feeding+reactions+of+hydra.">Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra.</a> Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).</li><li>Beckmann, A., Ozbek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nematocyst:+a+molecular+map+of+the+Cnidarian+stinging+organelle.">The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle.</a> Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).</li><li>Venturini, G., Carolei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+receptors+in+Hydra.+Pharmacological+and+biochemical+observations.">Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).</li><li>Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+and+GABAnergic+control+in+the+tentacle+effector+systems+of+Hydra+vulgaris.">Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris.</a> Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).</li><li>Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+GABA+and+glycine+in+the+modulation+of+chemosensory+responses+in+Hydra+vulgaris+(Cnidaria,+Hydrozoa).">Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa).</a> Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).</li><li>Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+NMDA+receptors+in+Hydra:+a+biochemical+and+functional+study.">Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study.</a> Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).</li><li>Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allatotropin:+An+ancestral+myotropic+neuropeptide+involved+in+feeding.">Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+Hydra+glutathione+binding+proteins.">Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins.</a> FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).</li><li>Lenhoff, H. M., Shaw, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+the+GSH+receptor+in+Hydra+and+its+evolutionary+significance.">The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance.</a> Glutathione in the Nervous System. , 25-43 (1998).</li><li>Venturini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydra+GSH+receptor.+Pharmacological+and+radioligand+binding+studies.">The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).</li><li>Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+and+phylogenetic+characterization+of+common+hydra+from+India.">Description and phylogenetic characterization of common hydra from India.</a> Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).</li><li>Horibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+catabolic+pathway+of+glycosphingolipids+in+a+hydrozoan,+Hydra+magnipapillata.+Involving+endoglycoceramidase.">Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase.</a> J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).</li><li>Koizumi, O., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rise+of+feeding+threshold+in+satiated+Hydra.">Rise of feeding threshold in satiated Hydra.</a> J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).</li><li>Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+and+detergent+solubilization+of+the+putative+glutathione+chemoreceptor+from+hydra.">Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra.</a> Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).</li><li>Morita, H., Hanai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+receptor+proteins+in+invertebrates+-+with+special+reference+to+glutathione+receptor+of+hydra.">Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra.</a> Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).</li><li>Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+involvement+in+Hydra+vulgaris+very+primitive+olfactory-+like+system.">Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system.</a> Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).</li><li>Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gr&#252;nder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+homologous+subunits+form+a+high+affinity+peptide-gated+ion+channel+in+Hydra.">Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra.</a> J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).</li><li>Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+family+C+G-protein-coupled+receptors+by+the+tripeptide+glutathione.">Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione.</a> J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).</li><li>Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+activity+in+hydra+is+modulated+by+glycine+receptor+ligands.">Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).</li><li>Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+automated+movement+detection+for+the+analysis+of+behavior.">Computer automated movement detection for the analysis of behavior.</a> J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Fressverhalten in Hydra stellt eines der Vorfahren chemosensory Systeme der Metazoen. Obwohl die Anwesenheit von GSH in der nach nematocyst gestützte Beutefang freigegeben Krustentier Flüssigkeit wurde schon vor langer Zeit erkannt 1, haben weder die GSHR Proteine ​​noch die mutmaßlichen kodierenden Gens / s von Hydra bisher geprägt. Einige Versuche wurden unternommen, um zu charakterisieren GSH-bindende Proteine ​​in Hydra 8, 14, 15. Jedoch bleibt die Identität dieser putativen Rezeptorproteine ​​dunkel und sehr wenige andere molekulare Komponenten, die wahrscheinlich zu der Vorschub Reaktion beitragen, haben berichtet Datum 16, 17. Die einzige dadurch GSHR im Tierreich ist aus dem Goldfisch 18. Klassische Techniken, wie die Verwendung der Inhibitoren von verschiedenen Proteinen der GPCR-Signalkaskade als auch die erweiterten molekularbiologischen Techniken (RNAi-vermittelten Gen-Silencing und CRISPR-Cas9 vermittelte Genom Bearbeitung) kann pow liefernfähigen Werkzeugen für die Identifizierung der molekularen Komponenten der GSH-Signalkaskade in Hydra. Das bewertbare Auslesen von solchen veränderten Expression und Funktion des Rezeptors und der anderen Komponenten des GSH Signalisierungs würde Fressverhalten verändert werden. Es war daher wichtig, ein Verfahren zum Messen der Vorschub Reaktion in Hydra durch GSH induzierte entwickeln. Phänotypisch das Zuführen Reaktion beinhaltet Kräuseln der Fangarme in Richtung der Öffnung und dem anschließenden Öffnen des Mundes. Unter Verwendung der früheren Beobachtung, die wir eine einfache und robuste Methode zur Quantifizierung der Fressverhalten, die Messung des Abstands zwischen den apikalen Enden der Tentakel und Mund beinhaltet entwickelt. Es ist wichtig, (1) die frisch zubereiteten GSH-Lösung, (2) Verwenden Sie die entsprechende Konzentration von GSH, und (3) durchzuführen, das Experiment im Labor mit einer gleichmäßigen Lichtintensitäten und keine starke Luftströmungen, die reproduzierbare Messung der erhalten DSH-Gesellschafterd Fressverhalten. Füttern Antwort-ähnliches Verhalten konnte auch physikalisch durch einfaches Hinzufügen von Medium ohne GSH induziert werden. Allerdings ist ein solches Verhalten vorübergehend und nach 15-30 sec nicht spürbar. Daher war es notwendig, diese Steuerung in dem Experiment sind und die Vorschub Reaktion erst nach einer solchen reagiert die mechanische Störung verursacht wird, vollständig eingestellt messen. Um die Variation in der mechanischen Störung induzierte tentacular Kontraktion durch variable Strömungsgeschwindigkeit, mit der Glutathion-Lösung zugegeben zu minimieren, wäre es auch denkbar, den Hand Abgabe der Testlösung mit einer mechanischen Vorrichtung zu ersetzen, wie zuvor beschrieben 19. Mechanisierten Abgabe von Glutathion Lösung wäre eine strengere Kontrolle der Größe und Ausrichtung des mechanischen Stimulus, so dass es könnte in allen Abgabeereignisse einheitliche und daher intern normiert werden können. In diesem Verfahren wird die Tentakel verteilt auf zwei di gemessensungen; während in Wirklichkeit einige der Tentakeln werden auch entlang der dritten Achse in Richtung des Betrachters verteilt. In ähnlicher Weise kann die Ausrichtung der Tentakeln nach Zugabe Glutathion ändern. Allerdings Mittelung der Tentakel über mehrere Tentakeln eines einzelnen Polypen sowie über mehrere Polypen verbreiten normalisiert die durch zweidimensionale Messungen sowie die veränderte Ausrichtung der Tentakeln eingeführt Bias. Wir schlagen vor, dass die Polypen, die der extremen Peripherie der Wanne, wo klare Beobachtung der Tentakeln ist nicht immer machbar bewegen, von der Analyse ausgeschlossen werden. Darüber hinaus nehmen die relative Tentakel Spread, der das Verhältnis der Tentakel vor und nach Zugabe von GSH zu verbreiten, und nicht der Absolutwert des Tentakel Ausbreitung nach GSH-Behandlung ist, als Maß für die Fütterung Antwort könnte in Minimierung der Variation von Variabilität induzierte führen in der Armlänge der einzelnen Polypen. Dieses Protokoll zur Messung der Glutathion-induzierte feeding Reaktion könnte ebenso nützlich für alle Hydra Spezies sein. Zur Messung Tentakel Ausbreitung in den aus großen Populationen von Hydra erhaltenen Bilder, wäre es auch möglich sein, einen Computer-Algorithmus ähnlich denen für die Analyse des Verhaltens von Tieren 20 verfügbar zu schreiben.

Hydra is the most primitive organism possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey1. It feeds on a variety of animals such as nematode, crustacea, insect larvae, tadpoles and newly hatched fish1. The movement of these prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging capsules called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey2. GSH present in the fluid released from the injured prey subsequently activates the feeding response in hydra which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth, and consequent engulfing of the prey. Multiple molecules, such as dopamine3, glutamate4, GABA, glycine5, NMDA receptors6, and allatotropin7, have been shown to be involved in the feeding response in hydra. It has also been shown that the chemosensory response induced by GSH is modulated by the feeding status of the animal such that starved hydra exhibited enhanced feeding response1. Such an increase in the GSH sensitivity is biologically relevant since under starvation hydra need to find its prey at higher sensitivity. 
Although the feeding response induced by GSH can be clearly observed under microscope, the methods typically used for measuring the feeding response observations are non-quantitative. In most of the cases, the time during which the mouth of the hydra remains open was taken as a measure of the feeding response8,9; whereas in another case, quantitation was based on the number of hydra out of a population showing the feeding response10. However, observing the mouth opening time of the hydra polyps is cumbersome and subject to variation induced by uncontrollable parameters such as the direction of the mouth orientation during observations. Similarly, since the feeding response is a quantitative parameter, population-based approaches are subject to variations/errors caused by the opinion or observational bias of the individual observer. To circumvent these issues we have developed a method for the relative quantification of the feeding response in hydra (Hydra vulgaris Ind-Pune11) based on the distance of the apical end of the tentacle from the mouth of the hydra polyp.

<table><tbody><tr><td>Cooled Incubator</td><td>Panasonic&amp;nbsp;</td><td>MIR-254-PE</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>S8AP0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Camera for the microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>EC3</td><td></td></tr><tr><td>Reduced glutathione</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td>Stored at 4 &amp;deg;C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation</td></tr><tr><td>Image editing program</td><td>GIMP</td><td>Version 2.8</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring glutathione-induced feeding response in hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Glutathion bewirkt Hydra, um ein Kräuseln der Tentakeln zur Mündung zum Zwecke der engulfing die Beute zeigen. Solche Curling von Tentakeln bringt apikalen Enden der Tentakeln näher am Hypostom. Dies resultiert in der Reduktion der Tentakel zu verbreiten, oder der lineare Abstand zwischen apikalen Ende des Tentakel und Hypostom (Abbildung 1). Die relative Tentakel Ausbreitung, oder das Verhältnis der durchschnittlichen Tentakel vor verbreitet und nach Zugabe von Glutathion, gemittelt über mehrere Polypen reduziert über die Zeit. Die relative Tentakel Ausbreitung nach Zugabe des Medium ohne Glutathion, reduziert jedoch nur vorübergehend und erreicht Einheitswert in etwa einer Minute (Abbildung 2). Starvation ist bekannt, Steigerung der Fressverhalten durch Glutathion 1,13 induzierte verursachen. Das Verfahren zum Messen der hier beschriebenen Fütterungsverhalten wurde durch Hunger-Modells validiert. Die Tentakel ausgebreitet eine Minute nach Zugabe von Glutathion war significantly niedriger für die ausgehungerten Gruppe im Vergleich zum satt-Gruppe (p = 1 x 10 -16 durch Anlegen zweier seitigen t-Tests mit gleicher Varianz) (Abbildung 3). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52178/52178fig1highres.jpg" width="675" /> Abbildung 1: Verfahren zur Messung der durchschnittlichen Tentakel Verbreitung. Ein Bild von einer entspannten Hydra Polypen wurde vor der Zugabe GSH und der lineare Abstand zwischen Mund und apikalen Ende jedes der Tentakel des Polypen wurde im Hinblick auf die Anzahl der Pixel mit der GIMP Tool gemessen aufgezeichnet. Ein anderes Bild wurde nach der Zugabe von GSH erfasst und die Tentakel Ausbreitung wurde in ähnlicher Weise gemessen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178fig2highres.jpg" width="525" /> Abbildung 2: Die Quantifizierung des GSH-induzierte Fütterung Antwort in Hydra. Tentacle verteilt zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe von GSH wurde wie in Figur 1 beschrieben und relative Tentakel Aufstrich wurde als Verhältnis der Tentakel bevor verteilt und nach Zugabe von GSH (n = 14) bezeichnet, gemessen. Die Werte für die Kontrollgruppe stellen die relative Tentakel Ausbreitung nach Zugabe von Hydra-Medium ohne GSH (n = 14). Fehler Balken stellen ± SEM. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52178/52178fig3highres.jpg" width="625" /> Abbildung 3: Die Validierung des Verfahrens zur Quantifizierung der Fütterung Antwort Aushungern Modell. X-Achse stellt die Zeit nach der Zugabe von 3 &amp; mgr; M GSH für ausgehungert (n = 61) und gesättigt (n = 66) Gruppen.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra at JoVE.com

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

measuring-glutathione-induced-feeding-response-in-hydra

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Aufrufe.  India Institute of Science Education and Research, Pune. Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Serie: Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Forschung

Krebsforschung

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Verhalten

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Biochemie

Hochdurchsatz-Assay zur Messung der Nahrungsaufnahme und Lebensdauer von Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autor im Rampenlicht: Erforschung des Zusammenhangs zwischen Lipotoxizität und HFpEF 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

GSH/GSSG-Messung – Ein verfeinerter OPA-Assay für die Antioxidantienforschung

Rapid Quantification of Oxidized and Reduced Forms of Glutathione Using Ortho -phthalaldehyde in Cultured Mammalian Cells In Vitro

Glutathione has long been considered a key biomarker for determining the antioxidant response of the cell. Hence, it is a primary marker for reactive oxygen species studies. The method utilizes Ortho-phthalaldehyde (OPA) to quantify the cellular concentration of glutathione(s). OPA conjugates with reduced glutathione (GSH) via sulfhydryl binding to subsequently form an isoindole, resulting in a highly fluorescent conjugate. To attain an accurate result of both oxidized glutathione (GSSG) and GSH, a combination of masking agents and reducing agents, which have been implemented in this protocol, are required. Treatments may also impact cellular viability. Hence, normalization via protein assay is presented in this multiparametric assay. The assay demonstrates a pseudo-linear detection range of 0.234 - 30&#181;M (R2=0.9932&#177;0.007 (N=12)) specific to GSH. The proposed assay also allows for the determination of oxidized glutathione with the addition of the masking agent N-ethylmaleimide to bind reduced glutathione, and the reducing agent tris(2-carboxyethyl) phosphine is introduced to cleave the disulfide bond in GSSG to produce two molecules of GSH. The assay is used in combination with a validated bicinchoninic acid assay for protein quantification and an adenylate kinase assay for cytotoxicity assessment.

Autor im Rampenlicht: Innovative Thiol-Quantifizierung und Biomarker-Detektion für die Forschung zu oxidativem Stress 

Quantification of both oxidized and reduced forms of glutathione (GSSG and GSH, respectively) has been achieved through the use of Ortho-phthalaldehyde (OPA). OPA becomes highly fluorescent once conjugated to GSH but is unable to conjugate GSSG until reduced. Here, we describe a multiparametric assay to quantify both using protein quantification for normalization.

Schnelle Quantifizierung von oxidierten und reduzierten Formen von Glutathion unter Verwendung von ortho-Phthalaldehyd in kultivierten Säugetierzellen in vitro

Glutathione has long been considered a key biomarker for determining the antioxidant response of the cell. Hence, it is a primary marker for reactive ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Erzeugung und Langzeitpflege von Nervenfreiheit<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[³H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Schnelle Quantifizierung von oxidierten und reduzierten Formen von Glutathion unter Verwendung von ortho-Phthalaldehyd in kultivierten Säugetierzellen in vitro

Schnelle Quantifizierung von oxidierten und reduzierten Formen von Glutathion unter Verwendung von ortho-Phthalaldehyd in kultivierten Säugetierzellen in vitro

Schnelle Quantifizierung von oxidierten und reduzierten Formen von Glutathion unter Verwendung von ortho-Phthalaldehyd in kultivierten Säugetierzellen in vitro

Erzeugung und Langzeitpflege von Nervenfreiheit