Wir möchten die Vodafone Americas Foundation, der Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung, und der São Paulo Research Foundation (FAPESP) für die Förderung dieses Forschungs danken. Wir möchten auch die vielen Mitglieder der Fakultät von der Abteilung für Entomologie an der Universität von Kalifornien, Riverside, danke ich für ihren Rat an diesem Projekt.

1. Insektenkolonie und Aufzucht <ol><li> Moskito Kolonie und Aufzucht <ol><li> Hinter Culex tarsalis, Culex quinquefasciatus, Culex stigmatosoma und Aedes aegypti Erwachsene aus Labor Kolonien, die aus Wildfänge stammen. </li><li> Hintermückenlarven in Emaille Pfannen unter Standardlaborbedingungen (27 ° C, 16: 8 Stunden Licht: dunkel [LD] Zyklus mit 1 Stunde der Dämmerung / Dämmerung Zeiten), und füttern sie ad libitum auf einer Mischung von Boden Nagerfutter und Bierhefe (3: 1, v: v). </li><li> Moskito sammeln Puppen in 200 ml Becher, und legen Sie sie in Versuchskammern. Alternativ aspirieren die erwachsenen Mücken in Versuchskammern innerhalb 1 Woche nach Entstehung. Stellen Sie sicher, jeder Experimentierkammer enthält von 20 bis 40 Individuen der gleichen Art / Sex. </li><li> Feed erwachsenen Mücken ad libitum auf einem 10% Saccharose-Wasser-Gemisch. Ersetzen Lebensmittel wöchentlich. </li><li> Befeuchten Baumwolle Handtücher zweimal pro Woche und place sie oben auf den Versuchskammern, um Feuchtigkeit in dem Käfig zu halten. Darüber hinaus legen Sie eine Tasse 200 ml Leitungswasser in der Kammer zu allen Zeiten zu helfen, die Gesamtfeuchtigkeitsniveau. </li><li> Pflegen Sie die Versuchskammern auf einem 16: 8 Stunden Licht: dunkel [LD] Zyklus 20,5-22 ° C und 30-50% RH für die Dauer des Experiments. </li></ol></li><li> Haus-Fliege und Fruit Fly Kolonie und Aufzucht <ol><li> Hinter Musca domestica von einem Labor-Kolonie, abgeleitet aus Wildfänge. Fangen wilde Drosophila simulans Personen und Hinter sie in den Versuchskammern. </li><li> Hinter Musca domestica-Larven in Plastikwannen unter Standard-Laborbedingungen (00.12 h Licht: Dunkelheit [LD] Zyklus, 26 ° C, 40% RH) in einem Gemisch aus Wasser, Kleie Mahlzeit, Luzerne, Hefe und Milchpulver. Hinter Drosophila simulans Larven in einem Aufzuchtraum und füttern sie ad libitum auf einer Mischung von FäulnisObst. </li><li> Absaugen Erwachsenen Musca domestica in Versuchskammern innerhalb 1 Woche nach Entstehung. Erwachsene Drosophila simulans können direkt in den Versuchskammern aufgezogen werden. Vor der Datenerhebung, sicherzustellen, dass jeder Versuchskammer nicht mehr als 10-15 Einzel Musca domestica oder 20-30 einzelnen Drosophila simulans. </li><li> Füttern Erwachsenen Musca domestica ad libitum auf einer Mischung aus Zucker und fettarme Trockenmilch, mit freiem Zugang zu Wasser. Feed erwachsenen Drosophila simulans ad libitum auf einer Mischung von faulenden Früchten. Ersetzen Lebensmittel wöchentlich. </li><li> Pflegen Versuchskammern auf einem 16: 8 Stunden Licht: dunkel [LD] Zyklus 20,5-22 ° C und 30-50% RH für die Dauer des Experiments. </li></ol></li></ol> 2. Notieren Fliegen Sounds in Versuchskammern <ol><li> Versuchskammer-Setup Hinweis: Ein &quot;Versuchs cHamber &quot;den Käfig in unserem Labor entwickelt, in denen die Daten aufgezeichnet wurden. Der Sensor ist relativ kostengünstig. Wenn in Groß gebaut, könnte ein Satz für weniger als $ 10 hergestellt werden. <ol><li> Konstruieren Sie einen Experimentierkammer, eine der größeren Größe: 67 cm L x 22 cm B x 24,75 cm H oder der geringeren Größe: 30 cm L x 20 cm B x 20 cm H. Die Experimentierkammer besteht aus einem Fototransistor und einem Array Laserlinie zeigt auf den Fototransistor-Array. HINWEIS: Zusätzlich kann die Kammer aus Kritter Wächter, die modifiziert sind, um die Sensorvorrichtung sowie eine Hülse mit einem Stück PVC-Rohr befestigt ist, um Zugang zu den Insekten gehören ermöglichen. </li><li> Schließen Sie den Fototransistor-Array zu einem elektronischen Bord. Die Ausgabe des elektronischen Bord-Feeds in eine digitale Audio-Recorder und wird als Audio-Daten im MP3-Format aufgezeichnet. Die Logik Aufbau des Sensors in Abbildung 1.II und einer physikalischen Ausführung der Kammer in 1.I. </li><li&gt; Ändern Sie die Deckel der Versuchskammern mit einem Stück Mesh-Stoff an der Innenseite befestigt, um ein Entweichen der Insekten zu verhindern. HINWEIS: Wenn ein Insekt fliegt über den Laserstrahl, der seine Flügel teilweise das Licht zu verschließen, so dass kleine Lichtschwankungen. Die Lichtschwankungen werden durch den Fototransistor-Array als Stromänderungen erfasst, und das Signal wird durch die kundenspezifische Elektronik-Platine gefiltert und verstärkt. </li></ol></li><li> Einrichten des Systems zum Treffer Sounds Produziert von fliegenden Insekten <ol><li> Verbinden der Experimentierkammer mit einer Stromversorgung. Schalten Sie das Gerät ein. </li><li> Auf der Experimentierkammer, finden Sie die Laser-Licht und photoarray. Richten Sie die Laser-Licht auf die photoarray. Um die korrekte Ausrichtung zu erreichen, stellen die photoarray mit den Magneten an der Außenseite der Versuchskammer, die mit den Magneten an der photoarray im Inneren der Kammer angebracht entsprechen, bis das Laserlicht wird auf allen der individuellen photodiod zentriertES. </li><li> Führen Sie zwei Gültigkeitsprüfungen, um sicherzustellen, dass das System ordnungsgemäß eingerichtet ist. Hinweis: Der erste Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass das System mit Strom versorgt wird, werden alle Leitungen ordnungsgemäß angeschlossen sind, und der Laser auf dem Foto-Array zeigt. Der zweite Schritt ist die weitere Kontrolle der Laserausrichtung durchführen, um sicherzustellen, dass sie den Klang der Insekten Flügelschläge zu erfassen. <ol><li> Schließen Sie einen Kopfhörer (nicht die Recorder) in die Audio-Buchse. Tauchen Sie ein in der Hand und aus der Experimentierkammer, in der Nähe des photoarray, um das Flugzeug des Laserlichts zu brechen. Stellen Sie sicher, dass das Laserlicht an ist (es wird ein roter Lichtstrahl sein) und dass Sie der Lichtebene ein paar Mal mit der Hand zu brechen. Hören Sie auf Veränderungen im Geräuschpegel der Hand geht in die und aus der Lichtstrahl. Wenn Sie einen hörbaren Unterschied zu erkennen, ist der Sensor in der Lage, Geräusche durch die Bewegung der großen Objekten hergestellt zu erfassen. Wenn dies gelingt, gehen Sie zum nächsten Plausibilitätsprüfung, sonst prüfen, ob die Kopfhörer richtig angeschlossen ist undob der Laser den photoarray zeigt. Stellen Sie die photoarray entsprechend, bis der Ton der Hand bewegt sich in und aus der Experimentierkammer zu hören ist. </li><li> Bringen Sie ein dünnes Stück von elektrischen Leitungen, um eine automatische Zahnbürste. Schalten Sie die Zahnbürste und tauchen die Verdrahtung in und aus der Experimentierkammer in der Nähe des phototarray. Sicherstellen, dass das Laserlicht trifft das Stück Verdrahtung wie es sich bewegt. Wenn Sie einen hörbaren Frequenzänderung zu erkennen, wenn das Stück von Verdrahtungs bricht das Flugzeug von Laserlicht, das System ist dann bereit, die durch die Bewegung der winzigen Objekte, dh, Insekten Klänge erzeugten Klänge zu erfassen. Wenn Sie nicht einen hörbaren Unterschied zu erkennen, gehen Sie zurück zu Schritt 2.2.2 neu ausrichten Laser-Licht und die photoarray. </li></ol></li><li> Nachdem das System ordnungsgemäß eingerichtet ist, den Deckel schließen und fügen Sie die Insekten. </li></ol></li><li> Datensammlung: Rekord Sounds Produziert von fliegenden Insekten <ol><li> Schalten Sie den Recorder und einen voicE-Annotation, die folgende Informationen enthält: Name der Art in der Versuchskammer, Alter der Insekten, Datum und Uhrzeit, aktuelle Umgebungs RT, und die relative Luftfeuchtigkeit. Unterbrechen Sie die Aufnahme. </li><li> Schließen Sie den Recorder an das System, über das Audio-Kabel, und setzen Sie die Aufnahme. Lassen Sie den Recorder für 3 Tage aufnehmen, dann stoppen Sie die Aufnahme. </li><li> Laden Sie die Daten vom Rekorder in einen neuen Ordner auf einem PC. Leeren Sie den Recorder durch das Löschen der Daten. </li><li> Wiederholen des obigen Aufzeichnungsverfahren, bis die verbleibenden Insekten ab und starb es nicht mehr als 5 Insekten leben in den Käfig verlassen. </li></ol></li></ol> 3. Sensordatenverarbeitung und Erkennung von Sounds Produziert von fliegenden Insekten <ol><li> Verwenden Sie Software, um Sounds Produziert von fliegenden Insekten zu erkennen. Hinweis: Die Software (Erkennungsalgorithmus) ist viel schneller als Echtzeit. Es dauert weniger als 3 h, um eine Aufzeichnungssitzung zu verarbeiten, das heißt, drei Tage von DATa, auf einem Standard-Maschine mit Intel (R) Core ™ Prozessor mit 2,00 GHz und 8 GB RAM. <ol><li> Für jeden Ordner mit Daten aus einer Aufnahme-Session, führen Sie den Erkennungssoftware, um Insektengeräusche zu erkennen. So führen Sie die Software, Open MATLAB, und geben Sie &quot;circandian_wbf (DataDir)&quot; im Befehlsfenster, wo DataDir ist das Verzeichnis der Aufnahmedaten. Dann &quot;Enter&quot; drücken, um zu beginnen. HINWEIS: Laden Sie die Software zur Erkennung von Referenz circadian_wbf # 16. </li><li> Warten, bis der Algorithmus terminiert, dann überprüfen Sie die Erkennungsergebnisse. Der Algorithmus gibt alle erkannt Insektengeräusche in einem neuen Ordner mit dem Namen &quot;DataDir _extf&quot;, wo DataDir ist die gleiche wie im vorherigen Schritt. Jeder Sound-Datei ist eine 1 Sekunde lange Audioclip ursprünglich aus dem Roh-Aufnahme extrahiert, mit einem digitalen Filter angewendet, um Rauschen zu entfernen. Die Auftrittszeit von jedem erkannten Ton wird in einer Datei namens &quot;DataDir _time.mat &amp; gerettet# 8221 ;. Am Beispiel eines erfassten Schallinsekten beobachten in 2. </li></ol></li><li> Erkennungsalgorithmus <ol><li> Verwenden Sie einen 0,1 s lang Schiebefenster, durch die Aufnahme gleiten. Das Schiebefenster beginnt mit dem Beginn der Aufzeichnung. Für jedes Fenster, die folgenden Schritte aus. <ol><li> Berechnen Sie die Grundfrequenz des aktuellen Fensters. </li><li> Wenn die Grundfrequenz ist im Bereich von 100 Hz bis 1200 Hz, dann tun Sie das folgende: <ol><li> Entpacken Sie die 1-Sekunden-langen Audio-Clip Zentrierung auf das aktuelle Fenster aus der Aufnahme; gelten ein Digitalfilter, um den Lärm in den Clip entfernen und den gefilterten Audio in den Ordner &quot;DataDir _extf&quot;. </li><li> Speichern Sie die Eintrittszeit des aktuellen Fensters in die Datei &quot;DataDir _time&quot;. </li><li> Bewegen Sie den Schiebefenster auf den Punkt, die unmittelbar auf die extrahierten Audioclip. </li></ol></li><li> Wenn der Grund frequency ist NICHT im Bereich von 100 Hz bis 1200 Hz, bewegen Sie einfach den Schiebefenster 0,01 sec nach vorne. </li></ol></li><li> Vorgang wiederholen, bis das Schiebefenster am Ende der Aufzeichnung erreicht. </li></ol></li></ol> 4. Insekten Klassifizierung <ol><li> Bayes-Klassifizierung mit den einfach das Fliegen Ton Hinweis: Bayes-Klassifikator ist eine probabilistische Klassifikator, die ein Objekt um seine wahrscheinlichste Klasse klassifiziert. <ol><li> Sound-Funktion Berechnung <ol><li> Für jedes Insekt Ton, zu berechnen, das Frequenzspektrum des Klangs mit Hilfe der diskreten Fourier-Transformation (DFT). Abzuschneiden das Frequenzspektrum nur diejenigen Datenpunkte entsprechend dem Frequenzbereich sind: 100 Hz bis 2.000 Hz ist. Der Kegelfrequenzspektrum wird dann in der Klassifizierung als &quot;Vertreter&quot; der Insekten Ton verwendet. HINWEIS: Die DFT ist ein Algorithmus, der Signale in der Zeitdomäne transformiert in den Frequenzbereich. Es ist ein Built-in-Funktion in den meisten Programmiersprachen Bibliotheken, und kann im Programm mit nur einer Codezeile aufgerufen werden. </li></ol></li><li> Zug ein Bayes-Klassifikator <ol><li> Verwenden Sie die KNN Dichte Schätzansatz 14, um die hinteren Wahrscheinlichkeitsverteilung mit Hilfe des Sound-Funktion zu erlernen. Mit der KNN-Ansatz ist das Trainingsphase, um eine Trainingsdatenmenge zu bauen. <ol><li> Zufällig probieren eine Reihe von Insekten Klänge aus den für die einzelnen Arten von Insekten gesammelt werden. </li><li> Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 4.1.1 und berechnen die abgeschnittenen Frequenzspektrum für jeden abgetasteten Klang. Die verkürzten Spektren zusammen mit Klasse Etiketten der Proben &quot;(Insektenarten Name) komponierte die Trainingsdatenmenge. </li></ol></li></ol></li><li> Verwenden Sie den Bayes-Klassifikator, um einen unbekannten Insekt klassifizieren <ol><li> Berechnen Sie die abgeschnittenen Frequenzspektrum des unbekannten Insekten Sound. </li><li> Berechnen Sie die euklidische Distanz zwischen den Kegel Spektrum der unknown Objekt und alle die abgeschnittenen Spektren in der Trainingsdatenmenge. </li><li> Finden Sie die Top-k (k = 8 in diesem Beitrag) nächsten Nachbarn des unbekannten Objekts in der Trainingsdatenmenge. Berechnen Sie die Wahrscheinlichkeit, dass der hintere unbekannte Insekten Sound gehört zu einer Klasse als der Anteil der Top-k nächsten Nachbarn, die als Klasse gekennzeichnet sind. </li><li> Bewerte das unbekannte Objekt in die Klasse, die die höchste Wahrscheinlichkeit hat posterior. </li></ol></li></ol></li><li> Fügen Sie eine Funktion, um die Classifier: Insektenzirkadianen Rhythmus <ol><li> Lernen Sie die Klasse Anlage Verteilungen der Auftrittszeit von Insekten-Sound, das heißt, die zirkadianen Rhythmus für jede Art von Insekten. <ol><li> Besorgen Sie sich die Auftrittszeit der einzelnen Ton von den Detektionsergebnisse (siehe Abschnitt 3.2). </li><li> Für jede Art, bauen ein Histogramm der Insekten Sound Auftrittszeit. </li><li> Normalisieren des Histogramms, so dass der Bereich des Histogramms gehört. Die normaleized Histogramm ist der circadiane Rhythmus der gegebenen Spezies. Es sagt die Wahrscheinlichkeit der Beobachtung eines Insekts der betreffenden Art im Flug innerhalb eines bestimmten Zeitraums. </li></ol></li><li> Klassifizieren eine unbekannte &quot;Insekt Sound&quot; durch die Kombination der &quot;Insekten Sound&quot; und den zirkadianen Rhythmus <ol><li> Angesichts der besonderen Punkt in der Zeit, in der die unbekannten Insekten Sound aufgetreten ist, erhalten die Wahrscheinlichkeit der Beobachtung ein Insekt der Klasse auf der Grundlage des zirkadianen Rhythmus der Klasse. HINWEIS: Der zirkadiane Rhythmus ist eine Wahrscheinlichkeitsverteilung. Es ist ein Array, das die Wahrscheinlichkeit der Erfassung eines Schall, durch eine bestimmte Insektenarten erzeugt, zu einer bestimmten Zeit des Tages. Also einmal eine Zeit gegeben ist, kann man einfach überprüfen, das Array, um die Wahrscheinlichkeit zu erhalten. </li><li> Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 4.1.2, um die spätere Wahrscheinlichkeit, dass die unbekannte Klang gehört zur Klasse unter Verwendung der Sound-Funktionen berechnen. Multiplizieren Sie die spätere Wahrscheinlichkeit zu den Ergebnissen herm den vorherigen Schritt, um die neue spätere Wahrscheinlichkeit zu erhalten. </li><li> Klassifizieren Sie die &quot;unbekannten Sound&quot; auf die Klasse, die die höchste Wahrscheinlichkeit hat neue Hinter. </li></ol></li></ol></li><li> Fügen Sie eine weitere Funktion, um die Classifier: Insekten Geographic Verteilung <ol><li> Lernen Sie die geographische Verteilung der Spezies von Interesse, entweder von Daten in historischen Aufzeichnungen veröffentlicht, einschlägige Literatur oder einfach sammeln die Wissen aus erster Hand von Feldtechniker / Biologen. Zu Demonstrationszwecken verwenden eine Simulation der Grafik Verteilung, wie in Abbildung 7 gezeigt. </li><li> Klassifizieren &quot;Unbekanntes Insekt Sound&quot; mit &quot;fliegenden Sound&quot; und die beiden zusätzlichen Funktionen. <ol><li> Angesichts der geografischen Lage, wo das Insekt Sound abgefangen wurde, berechnen die Wahrscheinlichkeit der Beobachtung ein Insekt aus der Klasse an diesem bestimmten Ort über die grafische Verteilung der Arten. <ol><li> Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 4.2.2 einnd berechnen die Wahrscheinlichkeit, dass der posteriore &quot;unbekannten Sound&quot; gehört zu Klasse unter Verwendung der Sound-Features und die zirkadianen Rhythmen. Multiplizieren das Ergebnis dieses Schritts der Ergebnisse aus dem vorherigen Schritt, um den neuen spätere Wahrscheinlichkeit zu erhalten. </li></ol></li><li> Klassifizieren Sie die &quot;unbekannten Sound&quot; auf die Klasse, die die höchste Wahrscheinlichkeit hat neue Hinter. </li></ol></li></ol></li><li> Eines allgemeinen Rahmens für Hinzufügen von Funktionen <ol><li> Betrachten Sie die Bayes-Klassifikator, der gerade Sound-Funktionen als primäre Klassifizierer verwendet. Folgen Sie den Schritten unten, um neue Funktionen, die den Klassifikator hinzuzufügen. <ol><li> In der Trainingsphase, lernen die Klasse Anlage Dichtefunktionen der neuen Funktion. </li><li> In der Klassifizierungsphase, angesichts der neuen Funktion des &quot;unbekannten Sound&quot;, berechnen Sie die Wahrscheinlichkeit der Beobachtung der Funktion in der Klasse mit den Dichtefunktionen im vorherigen Schritt gelernt. Multiplizieren Sie die neue Wahrscheinlichkeit auf die previous spätere Wahrscheinlichkeit entsprechend dem &quot;unbekannten Sound&quot;, um Klasse gehören, die der auf Basis wurden nur die ungeraden Funktionen, um die neue spätere Wahrscheinlichkeit zu erhalten. Bewerte das unbekannte Objekt in die höchste Klasse, die neue Hinter Wahrscheinlichkeit hat. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier beschriebene Sensor / Classification Framework ermöglicht die kostengünstige und skalierbare Klassifikation von fliegenden Insekten. Die vom System erreichbaren Genauigkeiten sind gut genug, um die Entwicklung kommerzieller Produkte ermöglichen und könnte ein nützliches Werkzeug in der entomologischen Forschung sein. Die Fähigkeit, preiswert, nicht-invasiven Sensoren verwenden, um präzise und automatisch zu klassifizieren fliegenden Insekten würde erhebliche Auswirkungen auf die entomologische Forschung haben. Zum Beispiel durch den Einsatz des Systems in das Feld zu zählen und zu klassifizieren Insektenvektoren, kann das System in Echtzeit zählt der Zielarten geben, bieten Echtzeit-Informationen, die verwendet werden, um Intervention / Unterdrückung Programme zur Bekämpfung der Malaria zu planen. Darüber hinaus kann das System automatisch Insekten trennen nach Geschlecht, und so kann es zu freien Entomologen Arbeiten an der Sterile Insect Technique 15 von der mühsame und zeitaufwändige manuelle Geschlechtsbestimmung die Insekten verwendet werden. &lt;/ P&gt; In der Verwendung dieses Systems ist der wichtigste Schritt, um den Sensor für die Datensammlung richtig eingestellt. Wenn der Laser und die Fotoarray nicht richtig ausgerichtet ist, werden die Daten sehr laut sein. Nachdem die Insekten in den Käfig gesetzt, sollte die foto Array immer abgestimmt mit den Magneten an der Außenseite des Käfigs. Beachten Sie, dass blinkende Lichter, Kamerablitze und Vibrationen in der Nähe der Käfige Lärm auf die Daten einzuführen. Deshalb, um saubere Daten zu erhalten, setzen Sie den Käfig in einem dunklen Raum, und wo immer nötig, legen Sie trockene Handtücher unter den Käfigen, um die Schwingungsebene zu vermindern. Die in dieser Arbeit vorgestellten Klassifizierer verwendet nur zwei zusätzliche Features. Allerdings kann es Dutzende von zusätzlichen Funktionen, die helfen könnten, die Verbesserung der Klassifikationsleistung sein. Da die potenziellen Funktionen sind Domain-und anwendungsspezifische, konnten die Benutzer Funktionen basierend auf ihren spezifischen Bedarf oder Anwendungen zu wählen. Der allgemeine Rahmen der classifier ermöglicht die einfache Funktionen, um den Klassifikator hinzufügen, um die Klassifikationsleistung zu verbessern. Um die Übernahme und Erweiterung unserer Ideen zu fördern, machen wir alle Code, Daten und Schaltpläne Sensor an der UCR Computational Entomologie Seite 16-17 frei verfügbar. Darüber hinaus innerhalb der Grenzen unseres Budgets werden wir unsere Praxis des Gebens ein komplettes System zu jedem Forschungs Entomologe, der dies verlangt (wie in Abbildung 1 gezeigt) fortsetzen.

Die Idee der automatischen Klassifizierung von Insekten mit dem Neben Klang ihrer Flug stammt aus den frühen Tagen der Computer und handelsüblichen Audio-Aufnahmegeräte 1. Allerdings hat kaum Fortschritte auf dieses Problem in den folgenden Jahrzehnten gemacht worden. Der mangelnde Fortschritt in diesem Streben kann auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden verwandten. Erstens hat das Fehlen einer wirksamen Sensoren Datenerfassung erschwert. Die meisten Versuche, die Daten zu sammeln haben akustische Mikrofone 2-5 verwendet. Solche Vorrichtungen sind sehr empfindlich gegenüber Rauschen und Umgebungsrauschen Wind in der Umgebung, was zu sehr spärlich und Daten geringer Qualität. Zweitens Compoundierung diese Datenqualitätsprobleme ist die Tatsache, dass viele Forscher haben versucht, sehr kompliziert Klassifikationsmodelle, insbesondere neuronale Netze 6-8 zu lernen. Der Versuch, komplizierte Klassifikationsmodelle zu lernen, mit gerade einmal zehn Beispiele,ist ein Rezept für Überanpassung. Drittens, die schwer zu erhalten, Daten dazu geführt, dass viele Forscher als 300 Fällen 9 oder weniger versucht, Klassifikationsmodelle mit sehr begrenzte Daten zu bauen, da nur wenige. Es ist jedoch bekannt, dass für den Aufbau eine genaue Klassifizierungsmodelle, besser 10-13 mehr Daten. Diese Arbeit richtet sich an alle drei Fragen. Optische (und nicht akustisch) Sensoren können verwendet werden, um die Aufnahme &quot;Sound&quot; der Insektenflug von Meter entfernt, mit kompletter Invarianz gegen Windgeräusche und Umgebungsgeräusche. Diese Sensoren haben die Aufnahme von Millionen von markierten Trainingsinstanzen, weit mehr Daten als alle bisherigen Bemühungen kombiniert erlaubt, und so dazu beitragen, die Überanpassung geplagt hat, dass vorherige Forschungsanstrengungen zu vermeiden. Eine prinzipielle Verfahren wird unten gezeigt, dass ermöglicht den Einbau von zusätzlichen Informationen in die Klassifikationsmodell. Diese zusätzlichen Informationen können als alltägliche und als seineinfach zu erhalten, als die Zeit der Tage, doch erzeugen erhebliche Gewinne in der Genauigkeit des Modells. Schließlich wird gezeigt, dass die enormen Mengen an Daten, die wir gesammelt erlauben es uns, die Vorteile von &quot;The unvernünftig Wirksamkeit der Daten&quot; 10, um einfache, genaue und robuste Klassifikatoren zu produzieren. Zusammenfassend hat Fluginsekten Klassifizierung über die zweifelhafte Ansprüche im Forschungslabor erstellt verschoben und ist nun bereit für die realen Einsatz. Die Sensoren und Software in dieser Arbeit vorgestellt werden Forscher weltweit bieten robuste Werkzeuge, um ihre Forschung zu beschleunigen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1293">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:237px;">Company</td>
			<td style="width:257px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:471px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Audio Recorder: ICD-PX312</td>
			<td style="width:237px;">Sony</td>
			<td style="width:257px;">4-267-065-11(2)</td>
			<td>With a 8 GB microSD extra memory</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Insectary</td>
			<td style="width:237px;">Lee&#39;s Aquarium &#38; Pet Products.</td>
			<td style="width:257px;">20088 HerpHaven&#174;, Large Rectangle</td>
			<td style="width:471px;">14 1/2&#34; Long x 8 3/4&#34; Wide x 9 3/4&#34; high. Modified to house insects.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Laser Line Generator, 650nm (red)</td>
			<td style="width:237px;">Apinex (www.apinex.com)</td>
			<td style="width:257px;">LN60-650</td>
			<td style="width:471px;">5mW. This is a low powered laser, similar to a teachers lasers pointer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Photodiode Array</td>
			<td style="width:237px;">VISHAY SEMICONDUCTOR&#160; TEFD4300&#160; PIN PHOTODIODE, 650NM, 20DEG, T1</td>
			<td style="width:257px;">TEFD4300</td>
			<td style="width:471px;">We made a custom array of 15 of these Photodiodes wired in parallel</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Analogue to Digital Convertor Integrated Circuit&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Custom made in our lab</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:471px;">We made this item ourselves, but an easily available commercial product, Gino PCF8591 AD/DA Converter, provides the same functionality.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flying insect detection and classification with inexpensive sensors

Eine preiswerte, nicht-invasive System, das genau zu klassifizieren könnte fliegenden Insekten würden wichtige Implikationen für die entomologische Forschung haben, und damit für die Entwicklung von vielen nützlichen Anwendungen in Vektor-und Schädlingsbekämpfung für medizinische und landwirtschaftliche Entomologie. Angesichts dieser, haben die letzten 60 Jahre viele Forschungsanstrengungen dieser Aufgabe gewidmet gesehen. Bis heute ist jedoch keine dieser Forschung hat einen bleibenden Einfluss hatte. In dieser Arbeit zeigen wir, dass Pseudo-akustisch-optische Sensoren überlegen Daten zu erzeugen; dass zusätzliche Funktionen, sowohl intrinsische als auch extrinsische, um das Flugverhalten der Insekten, kann der Angreifer ausnutzen, um Insekten Klassifizierung zu verbessern; dass ein Bayes-Klassifizierung Ansatz erlaubt es, Klassifikationsmodelle, die sehr robust zu Überanpassung sind effizient zu lernen, und eine allgemeine Klassifizierung Rahmen erlaubt es, einfach zu integrieren beliebige Anzahl von Funktionen. Wir zeigen die Ergebnisse mit großen Experimente, die in den Schatten stellen alle bisherigen Werke combiNed, wie durch die Anzahl der Insekten und der Anzahl der betrachteten Spezies gemessen.

Zwei Experimente werden hier vorgestellt. Für beide Experimente wurden die verwendeten Daten zufällig aus einer Datenmenge, die über 100.000 Objekte enthält abgetastet. Das erste Experiment zeigt die Fähigkeit der vorgeschlagenen Klassifizierer genau klassifizieren verschiedene Arten / Geschlechtern der Insekten. Da die Klassifikationsgenauigkeit hängt von den Insekten klassifiziert werden, wird eine einzige absolute Wert für Klassifikationsgenauigkeit nicht geben dem Leser eine gute Intuition über die Leistung des Systems. Statt, eher als die Genauigkeit der Berichterstattung Klassifiziergeräts auf einem festen Satz von Insekten, die für die Einstufung wurde auf Datensätzen mit einer inkrementell wachsenden Zahl von Arten angewendet und erhöht somit Einstufung Schwierigkeit. Der Datensatz begann mit nur 2 Arten von Insekten; dann bei jedem Schritt eine weitere Spezies (oder ein einzelnes Geschlecht eines geschlechtsdimorphischen Arten) wurde zugegeben und der Klassifikator wurde verwendet, um die erhöhte klassifizierenAnzahl der Arten (der neue Datensatz). Insgesamt zehn Klassen der Insekten (verschiedene Geschlechter von der gleichen Spezies zu zählen als unterschiedliche Klassen) wurden als mit 5.000 Exemplaren in jeder Klasse. Der Klassifikator verwendet sowohl Insekten-Sound (Frequenzspektrum) und Time-of-Achsenabschnitt für die Einstufung. Tabelle 1 zeigt die Klassifikationsgenauigkeit gemessen bei jedem Schritt und der entsprechenden Klasse bei diesem Schritt aufgenommen. Nach Tabelle 1, die für die Einstufung erzielt mehr als 96% Genauigkeit bei der Klassifizierung nicht mehr als 5 Arten von Insekten, deutlich höher als die Ausfallrate von 20% Genauigkeit. Auch wenn die Anzahl der Klassen betrachtet steigt auf 10, ist die Klassifikationsgenauigkeit nie niedriger als 79%, noch einmal deutlich höher als die Ausfallrate von 10%. Beachten Sie, dass die zehn Klassen sind nicht leicht zu trennen, auch durch menschliche Inspektion. Unter den zehn Arten, acht von ihnen sind Mücken, Witzh davon sechs aus der gleichen Gattung. Der zweite Versuch ist, zu zeigen, wie genau das System Sex fliegenden Insekten, insbesondere auf männliche Ae. Aegypti Moskitos von den Weibchen zu unterscheiden. Für den ersten Teil des Versuchs an, dass der &quot;Fehlklassifizierungskosten&quot; für die Fehlklassifizierung Männer als Frauen ist die gleiche wie die Kosten der Fehlklassifizierung von Frauen als Männer. Mit dieser Annahme sind die Einstufungsergebnisse in Tabelle 2.Ich gezeigt. Die Klassifikationsgenauigkeit Sex Ae. Aegypti ist etwa 99,4%. Für den zweiten Teil des Experiments liegen die Kosten nicht asymmetrisch, dh Fehlklassifizierung von Frauen als Männer viel teurer als umgekehrt. Unter dieser Annahme wurde die Entscheidungsschwelle des Klassifikators geändert, um die Anzahl von Fehlklassifikationen hohen Kosten zu reduzieren. Mit der Schwelle richtig eingestellt ist, die Klassifizierungsergebnisse in Tabelle 2.II erreicht wurden. Von 2.000 Insekten in dem Experiment wurden zweiundzwanzig Männer, Frauen und Null falsch klassifiziert. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52111/52111fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. (I) Eine der Versuchskäfige verwendet, um die Daten zu sammeln. (II) Eine logische Version des Sensor-Setup mit den Komponenten kommentiert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52111/52111fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52111/52111fig2highres.jpg" /> Figur 2 (i) ein Beispiel eines 1 sec Audioclips, die einen &quot;fliegenden Insekten sound&quot; durch den Sensor erzeugt wird. Der Ton wurde von einer weiblichen Cx. Stigmatosoma produziert. Die Insect Ton wird in rot / fett hervorgehoben. (II) Das &quot;Insekt Sound&quot;, die durch das Zentrieren des Insektensignal und Polsterung mit 0s anderswo gereinigt wurde und in einen 1-sec langen Audioclip gespeichert. (III) Das Frequenzspektrum des das Insekt Sound, mit diskreten Fourier-Transformation erhalten. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52111/52111fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52111/52111fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Ein Bayes-Netzwerk, das eine einzelne Funktion zur Klassifizierung verwendet. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52111/52111fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Ein Bayes-Netzwerk, das zwei unabhängige Funktionen für classificat verwendet<html> Ion <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52111/52111fig5highres.jpg" /> Abbildung 5. Die zirkadianen Rhythmen der Cx. stigmatosoma (weiblich), Cx. tarsalis (männlich) und Ae. aegypti (weiblich), lernte auf Beobachtungen von dem Sensor, die über 1 Monat Laufzeit gesammelt wurden, erzeugt wird. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52111/52111fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52111/52111fig6highres.jpg" /> Abbildung 6. Ein Bayes-Netzwerk, das drei unabhängige Funktionen zur Klassifikation verwendet. g &quot;/&gt; Abbildung 7. Die Annahmen der geographischen Verteilung der einzelnen Insektenarten und Sensorpositionen in der Simulation, um die Wirksamkeit der Verwendung von Standort-of-Intercept-Funktion in der Klassifizierung demonstrieren. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52111/52111fig7highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/52111/52111fig8highres.jpg" /> Abbildung 8. Die allgemeine Bayes-Netzwerk, das n Funktionen für die Klassifizierung, wobei n eine positive ganze Zahl verwendet. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52111/52111fig8highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Schritt </td><td> Species hinzugekommen </td><td> Klassifikationsgenauigkeit </td><td></td><td> Schritt </td><td> Arten hinzugekommen </td><td> Klassifikationsgenauigkeit </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Ae. aegypti ♂ </td><td> N / A </td><td></td><td> 6 </td><td> Cx. quinquefasciatus ♂ </td><td> 92.69% </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Musca domestica </td><td> 98.99% </td><td></td><td> 7 </td><td> Cx. stigmatosoma ♀ </td><td> 89.66% </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Ae. aegypti ♀ </td><td> 98.27% </td><td></td><td> 8 </td><td> Cx. tarsalis ♂ </td><td> 83.54% </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Cx. stigmatosoma ♂ </td><td> 97.31% </td><td></td><td> 9 </td><td> Cx. quinquefasciatus ♀ </td><td> 81.04% </td></tr><tr><td> 5 </td><td> &lt;em&gt; Cx. tarsalis ♀ </td><td> 96.10% </td><td></td><td> 10 </td><td> Drosophila simulans </td><td> 79.44% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Klassifizierung Genauigkeit mit zunehmender Anzahl von Klassen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> Vorhergesagt Klasse </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> Vorhergesagt Klasse </td></tr><tr><td colspan="2"> Ich (Symmetric Kosten) </td><td> weiblich </td><td> männlich </td><td></td><td colspan="2"> II (Asymmetric Kosten) </td><td> weiblich </td><td> männlich </td></tr><tr><td rowspan="2"> Eigentliche Klasse </td><td> weiblich </td><td> 993 </td><td> 7 </td><td></td><td rowspan="2"> Eigentliche Klasse </td><td> weiblich </td><td> 1000 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> männlich </td&gt; <td> 5 </td><td> 995 </td><td></td><td> männlich </td><td> 22 </td><td> 978 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2 (I) Die Verwirrung Matrix für Diskriminierung aufgrund des Geschlechts von Ae. Aegypti Mücken mit der Entscheidungsschwelle für Frauen bei 0,5 (dh gleiche Kostenübernahme) gesetzt. (II) Die Verwechslungsmatrix des Geschlechts die gleichen Mücken, mit der Entscheidung Schwelle für Frauen bei 0,1 eingestellt.

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Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

Wir haben vorgeschlagen, ein System, das preiswert, nicht-invasive Pseudo-akustisch-optische Sensoren verwendet, um automatisch und genau zu erfassen, zu zählen und zu klassifizieren fliegenden Insekten basierend auf ihren fliegenden Sound.

Fliegen-Insekt Erkennung und Klassifizierung mit preiswerten Sensoren

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

flying-insect-detection-and-classification-with-inexpensive-sensors

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.0K Aufrufe.  University of California, Riverside.  Wir haben vorgeschlagen, ein System, das preiswert, nicht-invasive Pseudo-akustisch-optische Sensoren verwendet, um automatisch und genau zu erfassen, zu zählen und zu klassifizieren fliegenden Insekten basierend auf ihren fliegenden Sound. 

Serie: Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Forschung

Biotechnik

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Erkennung und Isolierung von zirkulierenden Melanomzellen mit Photoakustische Flowmetrie

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

Glutamin Flux Imaging Verwendung genetisch codierten Sensoren

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Schnelle enzymatische Prozessierung von Proteinen für MS-Detektion mit einem Durchfluss-Mikroreaktor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...