We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.

Alle Versuche der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen und Vision Research von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) eingehalten werden. 1. Tiere <ol><li> Pflegen Sie die Wildtyp-Zebrafisch (Danio rerio) der AB (Oregon) Spannung zwischen 6-12 Monaten unter Standardbedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 ° C und einem 14/10 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus 15 Jahren. </li><li> Befolgen Sie die Tierpflege-Richtlinien der beteiligten Institutionen für die Tierversuche nach Genehmigung durch die kantonalen Veterinäramt. </li></ol> 2. MNU-Behandlung <ol><li> Bereiten Sie Wasser mit 150 mg / L Trockensubstanz von N-Methyl-N -nitrosourea (MNU). VORSICHT! MNU ist giftig; kann Krebs, vererbbare Schäden oder Schädigung des ungeborenen Kindes führen. </li><li> Inkubieren Zebrafisch in Wasser, das das MNU für 60 min bei Raumtemperatur. </li><li> Schnell mit spülen Zebrafischfrischem Wasser und setzen die Fische in ein neues Aquarium ohne MNU. Pflegen Fisch unter Standardbedingungen, so lange für die Experimente gewünscht. </li></ol> 3. Sehschärfe Mess <ol><li> Starten Sie den optomotorischen System, wählen Sie &quot;Test&quot; aus dem Menü und die Optionen auf &quot;Simple Treppe&quot;, &quot;Acuity (Freq)&quot; und &quot;Randomisierte / Separate&quot; 16. </li><li> Installieren Sie eine Infusionsflasche mit 500 ml Wasser gefüllt ca. 1 m über der optomotorischen Systems. </li><li> Legen Sie ein Zebrafisch in der Untersuchungskammer und an die Infusionsflasche. Legen Sie die Prüfung Kammer in der optomotorischen Systems. </li><li> Starten Sie die Messung und die Augenbewegungen in Echtzeit auf dem Computerbildschirm zu beobachten. Dadurch wird eine positive Antwort (&quot;Ja&quot;) als aufeinander folgende Sakkaden in die richtige Richtung definiert, während eine negative Antwort (&quot;nein&quot;) stellt zufälligen Augenbewegungen ähnlich wie die mit der Station beobachtet wirdary Gitter. Wenn die Augen der Zebrafisch zeigen drei oder mehr aufeinanderfolgenden optokinetischen Antworten (OKR), drücken Sie &quot;Ja&quot;; Wenn nicht, drücken Sie &quot;Nein&quot;. </li><li> Extrahieren der Sehschärfe, die durch die Software durch Bestimmen der Schwelle der Raumfrequenz des optokinetischen Stimulus unter &quot;Ergebnisse&quot; im Menü berechnet wurde. </li></ol> 4. Histologie <ol><li> Einschläfern Der Zebrafisch durch eine Überdosis von Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat- (200-300 mg / L) und entkernen Sie die Augen. </li><li> Fixierung der ganzen Augen in 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 ° C für 12 h und dann Dehydratisierung der Proben in einer abgestuften Alkoholreihe. </li><li> Einbetten der Proben in Paraffin, schneiden 5 um Schnitte durch den Sehnervenkopf (Papille) und montieren sie auf einen Glasobjektträger. </li><li> Färben die deparaffized Paraffinschnitten mit Hämalaun für 4 min und tauchen die Dias zweimal in destilliertem Wasser, gefolgt von 0,2% iger acid und 0,8% Ammoniak. Färben die Schnitte mit Eosin für 3 min nach der Entwicklung der Hämalaun-Färbung in Leitungswasser für mindestens 10 min (H &amp; E). </li><li> Betten Sie die Folien in dehydriert Montagemedium und unter dem Lichtmikroskop beobachten die Folien. </li></ol> 5. Immunhistochemie <ol><li> Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) <ol><li> Inkubiere die entparaffinierten Schnitte mit 20 ug / ml Proteinase K bei Raumtemperatur für 15 min. Dreimal mit Tris waschen Sie die Abschnitte Kochsalzlösung (TBS) für jeweils 5 min. </li><li> In einer feuchten Kammer inkubieren die Abschnitte mit 50 ul TUNEL Reaktionsmischung (10% Markierungslösung und 90% Enzym-Lösung) bei 37 ° C für 60 min. Dreimal waschen mit TBS für jeweils 5 min. </li><li> Montieren Sie die Folien mit Montage-Medium mit DAPI und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten die Folien. </li></ol></li><li> Wuchernden Cell Nuclear Antigen (PCNA) Färbung <ol><li> Man kocht die entparaffiniert Abschnitte in Antigen-Retrieval-Puffer (Tris-EDTA + 0,05% Tween 20, pH 9,0) für 3 min und dreimal mit TBS für jeweils 5 min. Block mit 100 ul Blockierungslösung (TBS + 10% Ziegennormalserum + 1% Rinderserumalbumin, pH 7,6) bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Fleck mit Anti-PCNA primäre Antikörper in einer 1: 200-Verdünnung in einer befeuchteten Kammer bei 4 ° C über Nacht. Dreimal für je 5 min waschen mit TBS + Tween 20. </li><li> Beenden Sie die Erkennung mit den entsprechenden Sekundärantikörper in einer 1: 500-Verdünnung bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Montieren Sie die Folien mit Montage-Medium mit DAPI und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten die Folien. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Histopathol. 25, 233-248 (2010).</li><li>Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura, T., Usui, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+comparative+study+on+rasH2+mice+produced+by+two+breeding+facilities.">Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities.</a> J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).</li><li>Morton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Methyl-N-Nitrosourea+(MNU):+A+positive+control+chemical+for+p53+/-+mouse+carcinogenicity+studies.">N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies.</a> Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).</li><li>Terracini, B., Testa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenicity+of+a+single+administration+of+N-nitrosomethylurea:+a+comparison+between+newborn+and+5-week-old+mice+and+rats.">Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats.</a> 24, 588-598 (1970).</li><li>Zulliger, R., Lecaud&#233;, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-3-independent+photoreceptor+degeneration+by+N-methyl-N-nitrosourea+(MNU)+induces+morphological+and+functional+changes+in+the+mouse+retina.">Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li><li>Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+photoreceptor+degeneration+and+regeneration+in+zebrafish.">Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C., N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).</li><li>Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+acuity+and+contrast+sensitivity+of+adult+zebrafish.">Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish.</a> Front. Zool. 9 (1), 10 (2012).</li><li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitor+of+phagocytosis,+O-phospho-L-serine,+suppresses+M&#252;ller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina.">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses M&#252;ller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).</li><li>Nelson, C. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+a+source+of+neuronal+progenitor+cells+to+regenerate+the+damaged+zebrafish+retina.">M&#252;ller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).</li><li>Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+adult+and+developing+mouse+spatial+vision+using+a+virtual+optomotor+system.">Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system.</a> Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).</li><li>Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+ontogeny+of+optokinetic+and+vestibulo-ocular+behaviors+in+zebrafish,+medaka,+and+goldfish.">Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish.</a> J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).</li><li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Inner+Retinal+Neurons+after+Intravitreal+Injection+of+Ouabain+in.">Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in.</a> Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li><li>Sherpa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish.">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).</li><li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+M&#252;ller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish.">Responses of M&#252;ller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bisher hat unsere Gruppe die MNU Modell der Photorezeptordegeneration von Nagetieren in den Zebrafisch-System 9 übertragen. Die folgenden Ereignisse wurden beschrieben und anschließend für bis zu 30 Tage. In dieser Zeit trat vollständige Netzhaut morphologischen Degeneration und Regeneration nach der ersten Behandlung. Erstens zeigt die Histologie eine reduzierte Stange Zellzahl von Tag 3 auf mit einem Minimum an Tag 8. Entsprechend identifiziert TUNEL-Färbung Apoptose von Stäbchen-Photorezeptoren 3 Tage nach MNU-Behandlung. Regeneration beginnt in der INL am Tag 3, mit einem Maximum an Tag 5. ONL, bis zum Ende der Beobachtungszeit mit einem Maximum an Tag 5. Dies ist im Gegensatz zu der INL wo keine erhöhte Proliferation proliferierenden Zellen beobachtet werden wurde nach Tag 15. Der ciliare Randzone beobachtet wird, ist die einzige Stelle der Netzhaut, wo einige PCNA-positiven Zellen wurden in der unbehandelten Netzhaut. Dies zeigt eine Fläche mit ständig Netzhautneurogenese throughout Lebensdauer 14. Die Identifizierung der bei der Regeneration von Photorezeptoren pharmakologisch beschädigt im Zebrafisch beteiligt Zelltypen war nicht im Fokus dieses Manuskript. Doch in früheren Veröffentlichungen der Prozess zu regenerierenden Zellen in der INL, die vorgeschlagen wurden, um Müllerzellen 9,17,18 verfolgt worden sein. In der vorliegenden Studie haben wir ebenfalls bewertet funktionelle Veränderungen in der MNU-induzierte Zebrafisch-Modell. Um die visuelle Funktion bei erwachsenen Fische zu quantifizieren, Beurteilung des OKR angewendet worden, eine von mehreren Techniken, um zuverlässig messen die Sehschärfe (VA) von Kleintieren 19. Dadurch wird die OKR, basierend auf einer angeborenen Verhalten, braucht nicht vor zeitraubend Ausbildung der Tiere 20. Darüber, wie der OKR wiederholt unabhängig von der Zusammenarbeit der Tiere hervorgerufen werden, und die großen Augen leicht beobachtet werden kann, ist Beurteilung des OKR eine ideale Methode, um die Sehschärfe Durin folgeng Degeneration und Regeneration im Zebrafisch. OKR Messungen in der vorliegenden Studie zeigte eine abnehmende Sehschärfe bis Tag 3, gefolgt von einer vollständigen Wiederherstellung der Sehfunktion an Tag 30. Dies ist in Übereinstimmung mit den histologischen De- und regenerativen Veränderungen nach MNU-Anwendung, die ein Maximum von Apoptose bei Shows Tag 3. Ein Vorteil des Modells ist seine Einfachheit als MNU ist schnell zuzubereiten und können direkt in den Wassertank des Zebrafisches aufgelöst werden. Behandlung von Zebrafisch mit MNU ist in einer Stunde durchgeführt. Die Anzahl der Fische, die in Massen behandelt werden können, ist nur durch die Größe des Beckens begrenzt. Insgesamt ermöglicht diese einfache Induktion von Retina-Degeneration in einer Vielzahl von Zebrafisch ohne die Notwendigkeit einer Manipulation der Fische. Daher ist dieses Modell weniger invasiv als andere Modelle der Netzhautdegeneration, die intravitreale oder chirurgische Techniken induziert 21-23 verwenden, und es kann dadurch eine bessere Reproduzierbarkeit aufweisen. In der Regel ist dies Zebrafisch MNU Modell ein vielseitiges Instrument zur Photorezeptor-Degeneration spezifischer zu induzieren und die folgende Regeneration nicht nur morphologisch, sondern auch funktionell zu visualisieren. Daher sind wir zuversichtlich, dass das Modell hilft, die Degeneration und Regeneration Prozess in der sensorischen Netzhaut im Allgemeinen besser zu verstehen und eröffnet die Möglichkeit, ihre Ergebnisse mit dem Säugersystem zu vergleichen.

Vision ist der wichtigste Sinn für den Menschen und seine Wertminderung hat einen hohen sozioökonomischen Auswirkungen. In der entwickelten Welt sind degenerativer Netzhauterkrankungen die häufigste Ursache für Sehverlust und Erblindung bei älteren Erwachsenen 1. Die Ursache der meisten degenerativen Netzhauterkrankungen ist nur teilweise verstanden und therapeutische Lösungen, um verlorene Vision wieder sehr eingeschränkt. Retinitis pigmentosa ist ein typisches Beispiel einer degenerativen Netzhauterkrankungen mit primären Photorezeptorverlust 2-3. N-Methyl-N -nitrosourea (MNU) induziert Degeneration der Netzhaut und ist deshalb weit verbreitet in Nagetieren verwendet, um Krankheiten mit primären Photorezeptorzelle Tod 4-Modell. Es ist ein Alkylierungsmittel und führt zu gutartigen und bösartigen Tumoren, die in der Regel werden mehrere Monate nach der Belichtung 5-7. Darüber hinaus werden spezifische Photorezeptor Zelltod bewirkt, dass es innerhalb eines kurzen Zeitbeobachtungszeitraum. Dadurch wird der Verlust an retinalen Schicht structure und der wesentlichen Netzhautverdünnung wurden in einer konzentrationsabhängigen Weise beobachtet. Netzhaut-Gliazellen aktiviert wurden, aber keine Änderungen im retinalen Pigmentepithel (RPE) wurden gefunden. Endoplasmatischen Retikulum (ER) Stress-Apoptose scheint der Hauptweg von MNU Aktion in der Netzhaut 8 sein. Wir haben vor kurzem MNU als chemisches Modell Photorezeptordegeneration im Zebrafisch 9 induzieren. Neben anderen Gründen ist der Zebrafisch (Danio rerio) ist wegen der Ähnlichkeiten der visuellen System zu anderen Wirbeltieren 10 in der visuellen Forschung wichtig. Die äußere Netzhaut enthält den Photorezeptoren, die in vier verschiedenen Zapfentypen mit Spitzenempfindlichkeiten in den ultravioletten, kurze, mittlere und lange Wellenlängen des sichtbaren Spektrums und eine Stange Photorezeptor-Typ gruppiert werden können. In der inneren Körnerschicht (INL) werden die Zellkörper der bipolaren, horizontalen und amacrine Inter gefunden, als well als Zellsoma Müller Gliazellen. In der äußeren plexiformen Schicht (OPL) die synaptischen Kontakte zwischen Photorezeptoren und der inneren Netzhaut gebildet werden, wohingegen die Zellschicht am nächsten an der Linse ist die Ganglienzellschicht (GC), die Bestandteile lange Axone, die den Sehnerv und die Sehbahn bilden . Synaptischen Kontakte zwischen Ganglienzellen und die Zellen in der inneren Kernschicht in der inneren plexiformen Schicht (IPL) 11 ausgebildet sind. Die RPE liegt außerhalb der neurosensorischen Netzhaut und umgibt die Photorezeptoraußensegmente mit langen apikalen Mikrovilli 12. Weiterhin ist die Zebrafisch hoch regenerativen und Verletzungen ist in der Lage, Gehirn, Retina, Rückenmark, Herz und anderen Geweben 13 nachwachsen. Wenn Netzhautschädigung auftritt, Zellen in der INL, die vermutlich Müller Zellen werden aktiviert und das Potential haben, in verschiedenen Netzhautzelltypen zu differenzieren. Darüber hinaus erzeugen sie auch Stange Vorläufern, die in der ONL befinden. Ein weiteres source, die die Netzhaut des erwachsenen Zebrafisch mit neuen Zellen liefert die ciliary Randzone. Diese Quelle ist erforderlich, um eine konstante Dichte der Stäbchen-Photorezeptoren in den kontinuierlich wachsenden Zebrafischauge 14 zu erzielen. Die MNU-Modell kann als eine einfache und reproduzierbare Degeneration / Regeneration Ansatz für Netzhautgewebe eingesetzt werden. Aufgrund bestimmter Ähnlichkeiten der biologischen Prozesse im Zebrafisch und in den Menschen könnte dies die Türen zu öffnen, sich zu engagieren Zelltod Wege zu identifizieren und mögliche neuroprotektive Medikamente auszusortieren. Basierend auf einer früheren Studie aus unserer Gruppe, jetzt haben wir veranschaulichen die Methoden dieser MNU-induzierte Zebrafisch-Modell der Netzhaut De- und konsequente Regeneration einschließlich funktionelle Veränderungen mit nach Labor Videos 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonia</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>294993</td>
			<td>0.80%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>05470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dako Pen</td>
			<td>Dako, Glostrup, Danmark</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI mounting medium</td>
			<td>Vector Labs, Burlingame, CA, USA</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>45260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>2860</td>
			<td>100%, 96%, 70%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Tricaine</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eukitt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td>Life Technologies, Zug, Switzerland</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat normal serum</td>
			<td>Dako, Glostrup, Danmark</td>
			<td>X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>320331</td>
			<td>0.20%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >In situ Cell Death Detection Kit</td>
			<td>Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland</td>
			<td>11684795910</td>
			<td>TUNEL Kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mayer&#39;s hemalum solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>109249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylnitrosourea (MNU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>N4766</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OptoMotry</td>
			<td>CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>P5368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K</td>
			<td>Dako, Glostrup, Danmark</td>
			<td>S3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rabbit anti-PCNA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA</td>
			<td>sc-33756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost Plus glass slides</td>
			<td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris buffered saline (TBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>P5912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma&#210; base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain</td>
			<td>University of Fribourg, Dept. of Biology</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Own fish facility</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylnitrosourea (mnu)-induced retinal degeneration and regeneration in the zebrafish: histological and functional characteristics

Degenerativer Netzhauterkrankungen, beispielsweise Retinitis pigmentosa, mit daraus resultierenden Schäden Konto Photorezeptor für die Mehrheit der Verlust der Sehkraft in der industriellen Welt. Tiermodelle sind von zentraler Bedeutung, um solche Krankheiten zu studieren. In diesem Zusammenhang wird der Photorezeptor-spezifischen N-Methyl-N-Toxin -nitrosourea (MNU) ist weit verbreitet in Nagetieren verwendet, um pharmakologisch herbeiNetzHautDegeneration. Bisher haben wir eine MNU-induzierte Degeneration der Netzhaut-Modell in der Zebrafisch, ein weiteres beliebtes Modellsystem in der visuellen Forschung etabliert. Eine faszinierende Unterschied zu den Säugetieren ist die anhaltende Neurogenese im erwachsenen Zebrafisch Netzhaut und ihre Regeneration nach der Beschädigung. Um diese Beobachtung haben wir Sehschärfe Messungen im erwachsenen Zebrafisch eingesetzt quantifizieren. Dabei wurde die optokinetischen Reflex verwendet, um funktionelle Veränderungen in nicht-narkotisierten Fische folgen. Dies wurde mit der Histologie sowie immunhistochemischen staini ergänztng für die Apoptose (TUNEL) und Proliferation (PCNA), die Entwicklungs morphologischen Veränderungen zu korrelieren. Zusammenfassend, die Apoptose von Photorezeptoren erfolgt drei Tage nach MNU Behandlung, die durch eine deutliche Verringerung der Zellen in der äußeren Körnerschicht (ONL) folgt. Danach wird die Proliferation von Zellen in der inneren Kernschicht (INL) und ONL beobachtet. Hier offenbaren wir, dass nicht nur eine vollständige histologische sondern auch eine funktionelle Regeneration über einen Zeitraum von 30 Tagen auf. Jetzt zu veranschaulichen wir die Methoden zur Quantifizierung und Follow-up Zebrafisch Netzhaut De- und Regeneration mit MNU in einem Video-Format.

Sehschärfe: Der Versuchsaufbau [Ortsfrequenz: 0,042 Kreise / Grad (C / D); Kontrast: 100%; Driftgeschwindigkeit: 20 Grad / Sekunde (d / src); Hintergrundbeleuchtung Helligkeit: 152 cd / m 2] der Studie aktiviert OKR Beurteilung der erwachsenen Zebrafisch. Die mittlere Dauer der VA Messung war etwa 5 - 10 Minuten für jeden Zebrafisch, die das Verfahren gut vertragen. Sehschärfe vor MNU Exposition war 0,577 ± 0,014 Zyklen / Grad (c / d). Abbildung 1 zeigt den Verlauf der Sehschärfe nach der Anwendung von 150 mg / L MNU. Ausgehend von Tag 1 zeigten die Messungen eine deutliche Abnahme der Sehschärfe und erreichte Minimalwerte an Tag 3. Beginn von Tag 8, eine Erhöhung der Sehschärfe auftritt, die eine vollständige Wiederherstellung der Sehschärfe von 30 Tagen nach MNU-Exposition. Zur statistischen Analyse wird ein one-way ANOVA, gefolgt von Bonferroni-Mehrfachvergleichstest angewendet wurde. Dabei sind die Unterschiede in der Sehschärfe zwischen Baseline und Messungen nach der Behandlung signifikant für den Tagen 1, 3, 5 war, und 8 (p &lt;0,001, jeweils), aber nicht an den Tagen 15 und 30. Histologische Beurteilung der Netzhautdegeneration: H &amp; E-Färbung wurde verwendet, um morphologische Veränderungen in einem Auge des Zebrafisches pro Zeitpunkt (n = 3) an der Grundlinie als auch 3, 8, 15 und 30 Tage nach der Behandlung (Figur 2) zu quantifizieren. Histologie wurde wie von Tappeiner et al beschrieben durchgeführt. 9. Dadurch Retinadegeneration einschließlich Unterbrechung der INL und Hohlraumbildung der ONL beobachtet beginnend an Tag 3. Die Anzahl der Zellen in der Ganglienzellschicht (GC), der inneren Kernschicht (INL) und die Anzahl der Stange (RN) und Kegel (CN) Photorezeptoren wurden manuell 250 um von der Mitte des ONH auf beiden Seiten der Augenabschnitt bestimmt (Größe der gezählten Bereich bezieht sich auf einen Netzhautabschnitt von 100 um Länge). Die Degeneration wurde 30 gefolgtTage nach der Behandlung mit der maximalen Stab ONL Verlust an Tag 8. Dadurch gefunden, die Anzahl der Stäbchen-Photorezeptoren (RN) sank auf 82% an Tag 3 und 71% am Tag 8 und 77% an den Tagen 15 und 30 der ursprünglichen Anzahl . Weiterhin Akkumulation von Zellclustern wurde gefunden, hauptsächlich in der INL. Quantifizierung der Apoptose: TUNEL-Färbung wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt (in situ Cell Death Detection Kit, Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Schweiz). Die beobachtete Degeneration der Netzhaut nach MNU-Behandlung wurde durch Apoptose verursacht. Dies wurde durch positive TUNEL-Färbung in verschiedenen Zellschichten in der sensorischen Netzhaut offenbart. Für die Quantifizierung wurde die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen manuell an zwei Netzhautbereiche von 450 um Länge jedes bestimmt, ausgehend von der Peripherie der Retina. Dadurch wurde die Mehrheit der TUNEL-positiven Zellen in der ONL am Tag 3 jedoch gefunden, sterbende Zellen wurden auch in der INL zu diesem Zeitpunkt gesehen<html> (Abbildung 3). Keine relevanten TUNEL-positiven Zellen wurden vor der Behandlung nachweisbar. Quantifizierung der Zellproliferation: Proliferation nach Zelltod zu beurteilen, wurden die Netzhaut für wuchernden cell nuclear antigen (PCNA), wie von Tappeiner et al. 9 beschrieben gefärbt. Für die Quantifizierung wurde die Anzahl der PCNA-positiven Zellen wie oben beschrieben manuell bestimmt. Zelltod wurde durch induzierte Proliferation als PCNA-positiven Zellen (Figur 4) gesehen folgt. Dabei wurde das Maximum der proliferierenden Zellen in der INL am Tag 5 zusätzlich gemessenen Zellen im ONL (hauptsächlich Stäbe) zeigten eine positive Färbung für PCNA bis zum Ende der Studie (Tag 30). Wenige PCNA-positiven Zellen in der Randzone ciliary nachweisbar waren vor und zu allen Zeitpunkten nach der Behandlung. d / 51909 / 51909fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 1:. Sehschärfe Messung der Sehschärfe bei erwachsenen Zebrafisch nach der Anwendung von 150 mg / L MNU. Signifikante Abnahme der Sehschärfe mit einem Minimum an Tag 3 nach der Behandlung wurde durch vollständige Genesung folgte, beginnend am Tag 5 bis Tag 30 (Mittelwert ± SD, n = 3). <img alt="Figur 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/51909/51909fig2highres.jpg" width="700" /> Figur 2: Histologie Beispiele von H &amp; E gefärbten histologischen Schnitten der Zebrafisch Netzhaut an der Basislinie (A) und 3 (B), 8 (C), 15 (D) und 30 (E) Tage nach der Behandlung MNU.. CN, Kegel Kerne; RN, Stäbchenkerne; INL, innere Körnerschicht; GC, Ganglienzellschicht. Die Pfeile markieren Zellhaufen in der INL. Maßstab entspricht 50 um. Abbildung 3:. TUNEL-positiven Zellen TUNEL-positiven Zellen (rot) in der Zebrafisch Netzhaut am Tag 3 nach der MNU-Behandlung. Die Zellen wurden hauptsächlich im ONL sind, aber wurden auch in der INL gefunden. Panel A zeigt die Steuerung, während Panel B zeigt die Bilder nach der MNU-Behandlung. Maßstabsleiste zeigt an, 50 um. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51909/51909fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4:. PCNA-positiven Zellen PCNA-positive Zellen (rot) in Zebrafisch Retina am Tag 5 nach der MNU Behandlung im Vergleich zu der Kontrollprobe. Panel A zeigt die Steuerung, während Panel B zeigt die Bilder nach der MNU-Behandlung. Maßstabsleiste zeigt an, 100 um.

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Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Hier zeigen wir Quantifizierung der Netzhaut De- und Regeneration und ihre Auswirkungen auf die visuelle Funktion mit N-Methyl-N -nitrosourea im erwachsenen Zebrafisch. Verlust der Sehschärfe und verminderte Photorezeptorzahlen wurden durch Proliferation in der inneren Kernschicht gefolgt. Vollständige morphologische und funktionelle Regeneration aufgetreten 30 Tage nach der ersten Behandlung.

Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

methylnitrosourea-mnu-induced-retinal-degeneration-regeneration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

11.4K Aufrufe.  University of Bern.  Hier zeigen wir Quantifizierung der Netzhaut De- und Regeneration und ihre Auswirkungen auf die visuelle Funktion mit N-Methyl-N -nitrosourea im erwachsenen Zebrafisch. Verlust der Sehschärfe und verminderte Photorezeptorzahlen wurden durch Proliferation in der inneren Kernschicht gefolgt. Vollständige morphologische und funktionelle Regeneration aufgetreten 30 Tage nach der ersten Behandlung. 

Serie: Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic rat neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol, we outline the experimental methodology for preparing rats for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E15-E21 rats, however it is most commonly performed at E16 as shown in this video.

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E16 Rattenembryonen

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic rat neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Forschung

Biologie

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Adult Zebrafisch

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. Therapeutic options addressing the causes of muscular dystrophy pathogenesis are expected to alleviate muscle degeneration. Therefore, a method to assay and quantify the extent of cell death in muscle biopsies is needed. Conventional methods to observe myofiber degeneration in situ are either poorly quantitative or rely on the injection of vital dyes. In this article, an immunofluorescence protocol is described that stains necrotic myofibers by targeting immunoglobulin G (IgG) uptake by myofibers. The IgG uptake method is based on cell features characterizing the necrotic demise, including 1) the loss of plasma membrane integrity with the release of damage-associated molecular patterns and 2) the uptake of plasmatic proteins. In murine cross-sections, the co-immunolabelling of myofibers, extracellular matrix proteins, and mouse IgG allows clean and straightforward identification of myofibers with necrotic fate. This simple method is suitable for quantitative analysis and applicable to all species, including human samples, and does not require the injection of vital dye. The staining of necrotic myofibers by IgG uptake can also be paired with other co-immunolabelling.

Described here is a protocol for direct immunolabelling of necrotic myofibers in muscle cryosections. Necrotic cells are permeable to serum proteins, including immunoglobulin G (IgG). Revealing the uptake of IgG by myofibers allows the identification and quantification of myofibers that undergo necrosis regardless of muscle condition.