Die Autoren danken Dr. Kent Seeley, Direktor des Center for Drug Discovery and Innovation (CDDI) Proteomics Core Facility an der Universität von Süd-Florida für die von dieser Möglichkeit Gebrauch. Diese Arbeit wurde vom NIH / NIDCD Zuschuss R01 DC004295 zu BHAS unterstützt

Ethikerklärung Experimente mit Mäusen Gewebe wurden von der University of South Florida Institutional Animal Care und Verwenden Committee (Protokolle 3931R, 3482R) zugelassen nach unter den Richtlinien der National Institutes of Health gesetzt. 1. Proteinextraktion <ol><li> Isolieren Cochlea sensorischen Epithel von 16 30 Tage alten (P30) CBA / J-Mäusen und bei -80 ° C </li><li> Am Tag des Experiments, waschen Gewebe mit 500 &amp;mgr; l 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Zentrifugieren für 3 min bei 1000 · g, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholt für insgesamt drei Waschungen. </li><li> Beschallen Gewebe für 30 sec auf Eis in 100 &amp;mgr; l Lyse-Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 ug / ml AEBSF, 10 ug / ml Leupeptin, 100 ug / ml Pepstatin, 2 ug / ml Aprotinin und 0,5 ug / ml unter Verwendung eines Schall Microcystin Dismembrator (Modell 100, Thermo Fisher). Coole Lysat auf Eisfür 1 Minute zwischen jeder Beschallung. Beschallen insgesamt 3x. </li><li> Zentrifugieren des Extrakts bei 750 × g bei 4 ° C für 2 min und Überstand in ein neues Mikroröhrchen. Extrahieren des Pellets in 50 &amp;mgr; l Lyse-Puffer durch Beschallung für 30 sec auf Eis. Der Extrakt wird zentrifugiert bei 750 × g bei 4 ° C für 2 min. Kombinieren beide Lysaten und Zentrifuge bei 28.600 × g bei 4 ° C für 60 min. Den Überstand in ein neues Mikroröhrchen und mit 20 &amp;mgr; l Lyse-Puffer, der 0,1% ASB-14 zu dem Pellet. Wirbel für 1 min und Inkubation für 60 min bei 4 ° C. </li><li> Erwärmen die Probe bei 95 ° C für 5 min, dann kühlen auf 4 ° C für 60 min. Folgen mit Zentrifugation bei 16.000 × g bei 25 ° C für 10 min. Sammeln Sie den Überstand und übertragen in ein neues Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren der Suspension bei 16.000 × g bei 4 ° C für 5 min und unter Beibehaltung der Überstand für die Verdauung. </li></ol> 2. Doppel CASO-Protein Verdauung von Whole Lysate Mit FASP <ol><li> Fügen Sie ein 30 μl Aliquot (≤ 400 &amp;mgr; g) der Cochlea-Proteinextrakt, enthaltend 4% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 und 0,1 M Dithiothreitol (DTT) direkt mit einem 30K Spinfilter und gemischt mit 200 ul 8 M Harnstoff in Tris-HCl. Zentrifugieren bei 14000 × g für 15 min. </li><li> Verdünnt das Konzentrat mit 200 ul 8 M Harnstofflösung und Zentrifugation bei 14.000 × g für 15 min. </li><li> Werden 10 ul 10x Iodacetamid (IAA) in 8 M Harnstofflösung zu dem Konzentrat in der Filter-und Wirbel für 1 min. Inkubieren der Spin-Filter für 20 min bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln, gefolgt von Zentrifugation bei 14.000 × g für 10 min. </li><li> 100 ul 8 M Harnstoff-Lösung zu dem Konzentrat auf der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 15 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. Füge 100 &amp;mgr; l 50 mM Ammoniumbicarbonat (ABC)-Lösung zu der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. </li><li> Hinzufügen von 0,4 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l Trypsin 1:100 (w / w) Enzym-zuProtein-Verhältnis und Inkubation über Nacht (O / N) bei 37 ° C. </li><li> Nach der Inkubation werden 40 ul 50 mM ABC-Lösung für 10 min Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 xg. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x. </li><li> Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu der Spinfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die tryptischen Peptide zu einem frischen Mikroröhrchen und säure mit Ameisensäure (FA) auf 1,0%, um die Verdauung zu stoppen. </li><li> Die Filtereinheit mit 40 ul 8 M Harnstoff waschen, und dann waschen mit 2x 18 M 40 ul Wasser. </li><li> Mit 100 ul 50 mM ABC Lösung waschen Sie die Filtereinheit 3x. Nach dem letzten Waschen hinzuzufügen 0,4 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l Trypsin 1:100 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis und inkubieren O / N bei 37 ° C. </li><li> Tryptischen Peptide eluieren von der zweiten Verdau durch Zugabe von 40 ul 50 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x. </li><li> Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung, um dieFiltereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat enthält die tryptischen Peptide in ein frisches Mikroröhrchen und säuert mit FA zu 1,0%. </li><li> Die Proben können mit Hilfe der Mikro kolorimetrischen Assay mit BSA als Standard quantifiziert werden. </li></ol> 3. Endoproteinase LysC und CASO-Protein Verdauung von Whole Lysate Mit FASP <ol><li> Hinzufügen eines 30-ul-Aliquot (≤ 400 &amp;mgr; g) der Cochlea-Proteinextrakt, der 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 und 0,1 M DTT direkt mit einem 30K Spinfilter und mit 200 &amp;mgr; l 8 M Harnstoff in Tris-HCl-Mischungs . Zentrifugieren bei 14000 × g für 15 min. </li><li> Verdünnt das Konzentrat mit 200 ul 8 M Harnstofflösung und Zentrifugation bei 14.000 × g für 15 min. </li><li> Werden 10 ul 10x IAA in 8 M Harnstofflösung zu dem Konzentrat in der Filter-und Wirbel für 1 min. Inkubieren der Spin-Filter für 20 min bei RT im Dunkeln dann bei 14.000 × g für 10 min zentrifugiert. </li><li> 100 l 8 M Harnstoff Solution zu dem Konzentrat auf der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 15 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. Füge 100 &amp;mgr; l 100 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. </li><li> Mit 0,1 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l Endoproteinase LysC in einer 1:50 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis und inkubieren O / N bei 30 ° C. </li><li> Nach der Inkubation werden 40 &amp;mgr; l 100 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x. </li><li> Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu der Spinfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die LysC Peptide zu einem frischen Mikroröhrchen und säure mit FA auf 1,0%, um die Verdauung zu stoppen. </li><li> Die Filtereinheit mit 40 ul 8 M Harnstoff waschen, und dann waschen mit 2x 18 M 40 ul Wasser. </li><li> Mit 100 ul 50 mM ABC Lösung waschen Sie die Filtereinheit 3x. Nach dem letzten Waschen hinzuzufügen 0,4 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l Trypsin 1:100 Enzym-zu-ProProtein-Verhältnis und Inkubation O / N bei 37 ° C </li><li> Eluieren tryptischen Peptiden durch Zugabe von 40 ul 50 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x. </li><li> Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die tryptischen Peptide zu einem frischen Mikroröhrchen und säure mit 1,0% FA. </li><li> Die Probe kann unter Verwendung des Mikroplatten-kolorimetrischen Test mit BSA als Standard quantifiziert. </li></ol> 4. Entsalzung Peptiden mithilfe der Spin Columns <ol><li> Aktivieren einer C 18-Säule MacroSpin durch Zugabe von 500 &amp;mgr; l Acetonitril (ACN) und Zentrifugieren bei 1100 × g für 1 min. Entsorgen Sie die Durchfluss nach Zentrifugation. </li><li> Äquilibrieren der Säule mit 500 ul 0,1% FA und Zentrifuge bei 1100 × g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und wiederholen Sie diesen Schritt 1x. </li><li> Fügen Sie bis zu 500 ul des Peptids verdauen zu der Säule eind Zentrifuge bei 1100 g für 1 min. Wenn das Probenvolumen größer als 500 ul ist dann wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Die Säule wird mit 500 ul 0,1% FA und Zentrifuge bei 1100 × g für 1 min. Entsorgen Sie die Durchströmung. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x. </li><li> Add 250 &amp;mgr; l einer 90:10-ACN zu-Wasser-Verhältnis auf die Säule und Zentrifugieren bei 1.100 × g für 1 min. Sammeln Sie die Laufmittel, die die Peptide entsalzt und Transfer zu einem neuen Mikroröhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x. </li><li> Trocknen Sie die entsalzt Peptidprobe in einer Vakuumzentrifuge und komplett zu vermeiden, ließ die Probe trocken. </li></ol> 5. Ionenaustauschchromatographie <ol><li> Spritzen 50-100 ug verdauten Proteinprobe auf eine 200 x 2,1 mm, 5 um SCX-Säule (Polysulfoethyl A), um Peptide zu trennen. </li><li> Verwenden eines Gradienten von 2-40% B über 50 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 250 ul / min. Lösemittel A ist 5 mM Ammoniumformiat, pH 3,0 in 25% Acetonitril und 75% ddH 2 O. Lösungsmittel B 500 mM Ammoniumformiat, pH-Wert6.0 in 25% ACN und 75% ddH 2 O. </li><li> Überwachung der Peptidfraktionen bei 280 nm und sammelt die Fraktionen, die in 2-Minuten-Intervallen unter Verwendung eines Fraktionssammlers. </li><li> Trocken Fraktionen im Vakuum-Konzentrator und Resuspension in 500 ul 50% Acetonitril in ddH2O mit 5% FA mit Salz Entfernung unterstützen. </li><li> Fraktionen wieder zu trocknen und lagern bei -80 ° C bis bereit sind, für nano LC-MS/MS Analyse zu verwenden. </li></ol> 6. Aceton Niederschlag Vor GELFrEE Trennung der Cochlea Proteinüberstand hat, entsalzt werden. Aceton Fällung kann verwendet werden, um Proteine ​​zu entsalzen und konzentrieren werden. <ol><li> In drei Bänden von eiskaltem Aceton zu dem Cochlea-Überstand. Vorsichtig vortexen und Inkubation bei -20 ° CO / N. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben-Mischung bei 15.000 g für 15 min bei 4 ° C und Überstand. </li><li> Waschen des Proteinpellet 3x mit gekühltem Aceton und Zentrifuge bei 14.000 × g für 5 min bei 4° C. </li><li> Luft trocknen den Pellet-und in 112 ul 18 M Wasser auflösen. </li><li> Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit Hilfe der Mikrofarbtest. </li></ol> 7. GELFrEE Fraktionierung von Cochlear Sinnes Epithel <ol><li> Werden 30 ul 5x Probenpuffer (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w / v) SDS, 50% Glycerin, 0,5% (w / v) Bromphenolblau) auf die entsalzte Protein in 112 ul 18 M suspendiert Wasser. </li><li> Hinzufügen 8 ul 1 M DTT und Wärme bei 95 ° C für 5 min auf Protein-Disulfid-Bindungen zu reduzieren. Nach dem Erhitzen ermöglichen Abkühlen auf Raumtemperatur. </li><li> 8 ml Laufpuffer zum Anodenbehälter, 150 ul Laufpuffer zur Sammelkammer abzutasten, und 6 ml Laufpuffer Kathodenreservoir. </li><li> Entfernen jeder Puffer, der in der Probenaufnahmekammer mit einer Pipette geflossen sein kann. </li><li> Last 150 ul (≤ 1 mg) der Cochlea-Proteinmischung, in die Probenaufnahmekammer mit einem 8% Trist Acetat-Patrone mit einem Massenbereich von 3,5 bis 150 kDa. </li><li> Nieder Elektroden und Deckel schließen Instrument, um den Lauf zu starten. </li><li> An der ersten Pausenzeit des Instruments 2 ml Laufpuffer auf den Kathodenreservoir und wieder laufen. </li><li> Bei jeder Pause Intervall auf das Instrument, sammeln die Probe aus der Probensammelkammer mit einer Pipette und in den frisch markierten Mikroröhrchen. Waschen Sie die Sammelkammer 2x mit 150 ul Laufpuffer und entsorgen. </li><li> In 150 ml frisches Laufpuffer auf das Probensammelkammer und wieder laufen. Sammle die Proteinfraktionen über einen Zeitraum von 2,6 h in einem Gesamtvolumen von 150 ul / Fraktion. </li></ol> 8. 1D-Gel-Elektrophorese von GELFrEE Fraktionen 1D-Gel-Elektrophorese verwendet werden, um die Ergebnisse aus GELFrEE Fraktionierung vor der enzymatischen Verdauung und MS-Analyse zu visualisieren. GELFrEE Proteinfraktionen können auf einem 4-15% Tris-HCl-Gel getrennt werden. </p&gt; <ol><li> Mischen ein 5 ul Aliquot von jeder GELFrEE Fraktion mit 5 ul der Probenverdünnungspuffer (350 mM DTT in Probenpuffer). </li><li> Erhitzen Sie die Proben bei 95 ° C für 3 min. </li><li> Coole Proben auf RT. </li><li> Last 10 ul jeder GELFrEE Fraktion in einzelnen Gelspuren und Last 5 ul der Molekulargewichtsstandard in der letzten ungenutzten Spur. </li><li> Die Elektrophorese bei 125 V für 1,5 Stunden oder bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Gel und Flecken mit Silber Stain Plus, um die Proteintrennung zu visualisieren. </li></ol> 9. Protein Verdauung von GELFrEE Fraktionen Mit FASP Eine modifizierte FASP Verfahren ist für Reinigungsmittel entfernen und Verdauung der GELFrEE Fraktionen eingesetzt. <ol><li> Fügen jedes einzelne Fraktion direkt zu einer Filtereinheit 30K, mit 200 ul 8 M Harnstoff in Tris-HCl und Zentrifugation bei 14.000 × g für 25 min gemischt. </li><li> Verdünnt das Konzentrat mit 200 ul Harnstofflösungund Zentrifuge bei 14.000 × g für 12 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x. </li><li> Werden 10 ul 10x IAA in Harnstofflösung zu dem Konzentrat in jeder Filtereinheit, Wirbel für 1 min und Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln. </li><li> 100 l Harnstofflösung zu dem Konzentrat auf den Filtereinheiten und Zentrifuge bei 14.000 × g für 15 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. 100 l 100 mM ABC-Lösung für die Filtereinheiten und Zentrifuge bei 14.000 g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. </li><li> Mit 0,1 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l für LysC 1:50 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis zu den Filtereinheiten und Inkubieren O / N bei 30 ° C. </li><li> Nach der Inkubation werden 40 ul 100 mM ABC-Lösung für die Spin-Filter und Zentrifuge bei 14.000 g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x. </li><li> Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu der Drehfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die LysC Peptide aus jedem Spin Filter in ein frisches Mikroröhrchen und säure mit trifluoroacessigsäure (TFA). </li><li> Die Spin-Filter mit 40 ul 8 M Harnstoff waschen, dann waschen 2x mit 40 ul 18 M Wasser. </li><li> Waschen Sie die Spin-Filter 3x mit 100 ul 50 mM ABC-Lösung. Nach dem letzten Waschen hinzuzufügen 0,4 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l Trypsin in einer 1:100 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis und inkubieren O / N bei 37 ° C. </li><li> Eluieren tryptischen Peptide aus jeder Filtereinheit durch Zugabe von 40 ul 50 mM ABC-Lösung und Zentrifugieren bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x. </li><li> Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu den Filtereinheiten und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die tryptischen Peptide aus jeder Filtereinheit in ein frisches Mikroröhrchen und säure mit TFA. </li><li> Trocknen Sie alle verdaut, in einem Vakuum-Konzentrator. </li></ol> 10. Probenvorbereitung für die LC-MS/MS <ol><li> Rekonstituieren getrocknet LysC und tryptischen Peptid verdaut Fraktionen in 20 ul 0,1% FA und Wirbel. </li><li> Zentrifuge Proben bei 20.000 × g für 10min und entfernen Sie die obere 95% der Probe in ein neues Probengefäß. </li><li> Injizieren 5 ul jeder Peptidfraktion auf einen 100 um x 25 mm Probenfalle, um Salze und Verunreinigungen zu entfernen, und chromatographische Trennung auf einer 75 &amp;mgr; m × 10 cm C 18 Säule. </li><li> Verwenden eines Gradienten von 2-40% B im Verlauf von 100 min mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 nl / min. Lösungsmittel A ist 95% ddH2O und 5% Acetonitril mit 0,1% FA. Lösungsmittel B ist 80% ACN und 20% ddH 2 O mit 0,1% FA. </li><li> Sammeln Sie zehn Tandem-Massenspektren für jeden MS-Scan auf einem hochauflösenden Massenspektrometer. Ein LTQ Orbitrap-Massenspektrometer wurde in diesem Experiment verwendet. </li></ol> 11. Proteinidentifizierung <ol><li> Identifizieren Proteine ​​mit der Maus UniProt Datenbank mit Vorwärts-und Rückwärtsproteinsequenzen und gemeinsame Verunreinigungen. MaxQuant Software mit MASCOT Suchmaschine verwendet wird, um die Protein-Datenbank. </li><li> Die Suchparameter, die verwendet werden können, umfassen, fest modification von carbamidomethyl Cystein, variable Modifikationen der Oxidation von Methionin, Protein N-terminale Acetylierung, maximal 2 verpasst Spaltung. Die Mindestpeptidlänge zu prüfen, ist für die Identifizierung sechs Aminosäuren. Geben Sie eine Peptidmassenkonzentrationsfehler von ± 8 ppm und ein Fragment Massentoleranz von 1,2 Da (Massenfehler ist abhängig von der Massenspektrometer verwendet werden). </li><li> In der MaxQuant Software, verwenden Sie eine 1% False Discovery Rate (FDR) für Peptid-und Proteinidentifizierung. Proteinbestimmung mit der Anzahl der übereinstimm Peptide, die prozentuale Proteinsequenzabdeckung, und Peptidsequenzen aufgeführt. </li></ol>

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Die Autoren erklären, keine Interessenskonflikte.

<html> Die wichtigsten Schritte zur Maximierung Proteinidentifizierung aus dem Riechepithel Cochlea sind: 1) Verwendung von mehreren Endoproteinasen für die Verdauung, 2) Verwendung von mehreren Trenntechniken, und 3) Einsatz einer hochauflösenden Massenspektrometer. Die Anwendung von mehreren Enzymen erhöht die Anzahl von Peptiden und verbessert die Proteinsequenzabdeckung, damit eine Verbesserung der Anzahl der identifizierten Proteine ​​aus der Cochlea Gewebe. Trypsin, das am häufigsten verwendete Protease stellt eine effiziente und spezifische Spaltung von Proteinen, Peptide, die gut für MS-Ionisierung und Fragmentierung. Jedoch unter Verwendung eines anderen Enzyms vor Trypsin, wie LysC, auch spaltet Lysinrest, effizienter Peptidspaltung bietet. Es wurde beobachtet, dass die Sequenzabdeckung der aus dem LysC / Trypsin-Verdauung erzeugten Proteine ​​zeigten einen Anstieg in der Proteinsequenzabdeckung relativ zu der Proteinsequenzabdeckung von der Trypsin / Trypsin-Verdau. ove_content &quot;&gt; Umsetzung der mehrdimensionalen Trennung vor MS reduziert die hohe Cochlea Probenkomplexität in der Schrotflinte Proteom-Ansatz. Dies erlaubte die Identifizierung von Proteinen, einschließlich Membranproteine, die in der Regel schwer zu identifizieren sind. Eine größere Anzahl von Membranproteine ​​wurden unter Verwendung von identifizierten die Schrotflinte Ansatz im Gegensatz zu dem Bottom-up-Ansatz.,. Allerdings ist die Bottom-up-Ansatz unter Verwendung GELFrEE für die Identifizierung von mehr Low vorkommenden Proteine ​​erlaubt Diese aufgrund der Isolierung von höheren reichlich Proteine, wie Cochlin von der Cochlea, in einzelne Fraktionen. Die hohe Qualität der Daten in der vorliegenden Protokoll, das von einem hochauflösenden Massenspektrometer, wie ein LTQ-Orbitrap, verbessert und erhöht die Anzahl von Proteinen, die in der Cochlea identifiziert werden können, erreicht. Die LTQ-Orbitrap bietet hohe Auflösung, hohe Massengenauigkeit und eine hohe Empfindlichkeit für die Analyse von Peptiden. Daher Anwendung dieses Instruments enables Identifizierung von Proteinen aus komplexen biologischen Proben, wie beispielsweise die Cochlea sensorischen Epithel und verbessert Identifizierung von Peptiden niedrigen reichlich. Die Nutzung dieser kombinierten experimentellen Ansätzen mit dem mächtigen Werkzeug der MS hilft, die Cochlea-Proteindatenmenge deutlich zu erhöhen, also die Verbesserung der Möglichkeit, neuartige Protein-Biomarker im Hören und Taubheit beteiligt sind.

Proteomics ist die Untersuchung komplexer biologischer Systeme durch die Analyse von Protein-Expression, Funktion, Änderungen und Wechselwirkungen ein. Verschiedene Verfahren wurden für die Proteomanalyse des Innenohrs, einschließlich Antikörper-Microarray 2, zweidimensionale Gelelektrophorese 3-5 und DIGE 6 verwendet worden. Jedoch nur eine beschränkte Anzahl von Proteinen identifiziert und charakterisiert 2,7-10, im Vergleich zu den mehr als 10.000 Gene und exprimierten Sequenz-Tags (ESTs) in das Innenohr 11,12 identifiziert, MS ist das am häufigsten verwendete und umfassende Technik in der Proteomik zur Proteincharakterisierung. Proteom-Analyse von komplexen Proben, wie der Cochlea, kann schwierig sein. Allerdings ist die Kombination von mehreren Trenntechniken mit MS ermöglicht die Identifizierung einer größeren Anzahl von Peptiden und Proteinen aufgrund einer erhöhten dynamischen Konzentrationsbereich und die Spitzenleistung 13. Mehrdimensionale ChromatographiePHY reduziert sehr komplexe Proteingemische indem die Verwendung von verschiedenen Mechanismen Adsorption. Es gibt zwei häufig verwendete MS Proteomanalyse Ansätze, Schrotflinte und Bottom-up-Proteomics. Schrotflinte in der Proteomik, wird eine Mischung von intakten Proteinen enzymatisch verdaut und getrennt unter Verwendung multidimensionaler Chromatographie mit einem starken Kationenaustausch-Chromatographie (SCX), gefolgt von Umkehrphasen-Flüssigchromatographie (RPLC) 14,15. Die getrennten Peptide an Tandem-MS unterzogen und Datenbank-Suche 15. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Tausende von Proteinen in einer einzigen Analyse identifiziert werden, und die Technik ist besser, Membranproteine ​​geeignet. Im Bottom-up-Ansatz wird das Proteingemisch abgetrennt, in der Regel durch ein-oder zweidimensionale Elektrophorese, und die einzelnen Proteinbanden oder Flecken ausgeschnitten und mit einem Enzym wie Trypsin verdaut, was in der Regel mehrere Peptide. Jedoch kann eine andere neuerely entwickelt elektrophoretische Ansatz, in bottom-up Proteomik verwendet wird, ist GELFrEE. Diese Technik fraktioniert Proteinproben in flüssiger Phase und macht sie weniger komplex vor der Analyse. Diese Technik ist reproduzierbar, bietet eine hohe Proteinausbeute und reduziert den Vertrieb von qualitativ vorkommenden Proteine ​​in komplexen Proteinproben 16. Peptide aus getrennten Proteine ​​entstehen, werden von MS analysiert, mithilfe von Peptidmassenfingerprinting-oder Tandem-MS (MS / MS), um Sequenz-Tags für die Datenbanksuche 17-19 erstellen. Einige der wichtigsten Vorteile der Verwendung des Bottom-up-Ansatz sind die Fähigkeit, hochauflösende Trennungen und umfassende Berichterstattung Protein zu erhalten. Bottom-up Proteomik ist die am häufigsten verwendete Technik in der Proteomik 20, daher sind mehrere Bioinformatik-Werkzeuge zur Verfügung. Darüber hinaus können Proteine ​​in einem komplexen Gemisch vor Verdauung getrennt werden, so gibt es eine größere Wahrscheinlichkeit der Identifikation. Eine der großen Herausforderungenim Umgang mit dem inneren Ohr für Proteomanalyse ist seine geringe Größe, eingeschränkte Zugänglichkeit und Zelltyp Vielfalt 21. Zusätzlich Schlüsselproteine, die die Funktionalität unterscheiden, wie Ionenkanäle, Transporter und Rezeptoren sind Membranproteine, die schwierig sein kann, zu isolieren 22. So ist Filter gestützten Probenvorbereitung (FASP) für Proteom-Analysen von Geweben, die für die Proteinextraktion beschränkt sind vorteilhaft und Reinigungsmittel, die erfordern, um Membranen 23 zu lösen. Diese Filterung ermöglicht die MS-Analyse von Membran-und löslichen Proteinen und für die Fähigkeit, Peptide, die von niedrigmolekulargewichtigen Verunreinigungen 23,24 isolieren. Dieses Protokoll beschreibt häufig verwendete Proteomics, die kombiniert werden und geändert werden, um lösliche und Membranproteine ​​zu analysieren und um die Anzahl der Protein-IDs aus der Cochlea Sinnesepithels maximieren. Wir beschreiben mit Shotgun Proteomics mit FASP Mehr verdauenIonen, Ionenaustausch-Chromatographie, hochauflösende MS, und Datenanalyse. Darüber hinaus werden wir Bottom-up Proteomik mit GELFrEE, FASP Mehr Verdauung, hochauflösende MS und Datenanalyse zu beschreiben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

Proteomik ist eine häufig verwendete Ansatz, der Einblicke in komplexe biologische Systeme bieten können. Die Cochlea Sinnesepithels enthält Rezeptoren, die mechanische Energie der Ton in einer elektrochemischen Energie durch die peripheren und zentralen Nervensystem verarbeitet zu transduzieren. Mehrere Proteomics Techniken entwickelt worden, um die Cochlea Innenohr, wie zum Beispiel zweidimensionale Differenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE), Antikörper-Microarray und Massenspektrometrie (MS) zu untersuchen. MS ist die umfassende und vielseitiges Werkzeug in der Proteomik und in Verbindung mit Trennverfahren kann eine eingehende Proteom von biologischen Proben. Trennmethoden in Kombination mit MS hat die Fähigkeit, Proteinproben zu bereichern, zu erkennen niedrigem Molekulargewicht und hydrophoben Proteinen und identifizieren niedrigen reichlich Proteine, die durch die Verringerung der Proteom-Dynamikbereich. Verschiedene Strategien zur Verdauung gesamte Lysat oder fraktionierte Protein-Lysat aufgetragen, um Peptid-und Protein verbessernSequenzabdeckung. Die Verwendung von unterschiedlichen Trenntechniken, einschließlich starker Kationenaustausch (SCX), Reversed-Phase (RP) und geleluiert flüssige Fraktion Einschluss-Elektrophorese (GELFrEE) angewendet werden, um die Komplexität Probe vor der MS-Analyse zur Identifizierung von Proteinen zu reduzieren.

Um die umfassendste Proteom des Cochlea-sensorischen Epithel zu erhalten, wird schnell Gewebedissektion vor der Proteinextraktion und Probenvorbereitung erforderlich. Zwei Proteom-Techniken verwendet werden können, Schrotflinte und Bottom-up-Proteomics. Um Proben für Schrot Proteomik vorzubereiten, wurde FASP Aufschlussverfahren verwendet, wie in Abbildung 1 dargestellt. Das Verfahren ermöglicht FASP Konzentration von Proteinen, die Entfernung von Detergenzien und Verdauung der Proteine ​​mit mehreren Enzymen. Es gab zwei Doppelverdauung Verfahren verwendet, das erste war eine tryptische Verdauung, gefolgt von einer zweiten Verdauung mit Trypsin, das vereinigt wurden, auf eine SCX-Säule in 18 Fraktionen aufgetrennt und durch Nano LC-MS/MS analysiert. Insgesamt 1.485 Proteine ​​wurden mit einer 1% FDR bei der Durchführung einer Einzel laufen LC-MS/MS mit diesem experimentellen Ansatz identifiziert. Unter den identifizierten Proteine ​​wurden 329 und 258 Proteine ​​in Mitochondrien und Plasmamembran (Fig. kategorisiert bzw.2A). Das zweite Doppelaufschlussverfahren bestand aus LysC Verdauung, gefolgt von Trypsin Verdauung. Jeder Digest wurde einzeln geladen und in 18 Fraktionen auf der Säule SCX getrennt und durch Nano LC-MS/MS analysiert. Die Ergebnisse des lysC-und Trypsin-Verdaus produziert insgesamt 3.503 Proteine ​​mit einer 1% FDR. 2B zeigt, dass 605 und 617 Proteine ​​in Mitochondrien und Plasmamembran unterteilt sind. Dieser Ansatz vorgesehen, die größte Anzahl von membranassoziierten Protein-IDs. Doppelte Analyse der LysC und Trypsin Fraktionen zeigten mehr als 65% der identifizierten Proteine ​​wurden zwischen den Experimenten geteilt. Es gab jedoch auch neu identifizierten Proteine ​​in der Wiederholungsanalysen. Die zusätzlichen Peptide und Proteine ​​wurden durch kleine Änderungen in der Chromatographie identifiziert daher die zu unterschiedlichen Peptiden zur Fragmentierung 25. Bottom-up Proteomik wurde mit GELFrEE Fraktionierung angewendetvor LC-MS/MS wie in Fig. 3 dargestellt. Es waren 12 GELFrEE Fraktionen gesammelt. Vor der Verdauung und LC-MS/MS Analyse wurde ein silbergefärbtes Gel bereit, um die Ergebnisse von GELFrEE Fraktionierung wie in Fig. 4 dargestellt visualisieren. Das Gel zeigte Proteintrennung durch die Erhöhung des Molekulargewichts für jede Fraktion in Folge. Daher wurden die 12 GELFrEE flüssigen Fraktionen mit zwei unterschiedlichen Mehr FASP Verdauungsansätze verdaut und mittels LC-MS/MS analysiert. Der erste Ansatz Verdauung wurde unter Verwendung eines Doppel-Trypsin-Verdauung, die zur Identifizierung von 2.165 Proteine ​​mit einer 1% FDR führte bei der Durchführung einer Einzellauf LC-MS/MS. 5A zeigt, daß es 516 und 399 Proteine ​​in Mitochondrien kategorisiert und Plasmamembran sind. Der zweite Ansatz Verdauung wurde mit Endoproteinase LysC gefolgt von Trypsin Verdauung. Einzel-run LC-MS/MS Analyse identifiziert 2.211 Proteine ​​mit einer 1% FDR. DiesAnsatz zeigte eine ähnliche Anzahl von Membranproteine ​​wie bei Verwendung des Trypsin / Trypsin-Ansatz (Abbildung 5B). Die Massenspektrometrie Proteomik Daten auf die ProteomeXchange Consortium 26 mit dem Datensatz-Identifizierer 25 PXD000231 hinterlegt. Kombinieren der Ergebnisse aus den verschiedenen Techniken resultiert in einer Vielzahl von Membran-und löslichen Proteinen aus der Maus Cochlea Riechepithel (Abbildung 6). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51186/51186fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51186/51186fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung einer Schrotflinte Proteom-Experiment mit FASP, Ionenaustausch-Chromatographie, und hochauflösende MS. Proteine ​​werden extrahiert, solubilisiert und verdaut mit FASP mit LysC und Trypsin Endoproteinasen. Die LysC (grün Rohr) und Trypsin-Peptide (lila<html> Rohr) in weniger komplexen Fraktionen mit SCX-Chromatographie getrennt und mit Nano LC-MS/MS analysiert. Die MASCOT Suchmaschine wurde verwendet, um die MS-Daten zur Proteinidentifizierung verarbeiten. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51186/51186fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51186/51186fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51186/51186fig2.jpg" /> 2. GO zellulären Komponenten von Protein IDs bei der Durchführung einer (A) ersten und zweiten Verdau mit Trypsin, gefolgt von Trennung und SCX (B) zunächst mit LysC Verdauung, gefolgt von einer zweiten Verdauung mit Trypsin, gefolgt von Trennung SCX. Alle Kategorien gezählt nicht ausschließlich, wenn ein Protein hat mehr als eine Kategorie für Zellkomponenten.ES.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51186/51186fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51186/51186fig3.jpg" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung eines Bottom-up-Proteom-Experiment mit GELFrEE, FASP, und hochauflösende MS. Extrahierten Proteine ​​solubilisiert und Proteine ​​werden mit Aceton (blaue Röhre), um unerwünschte Salze und Verunreinigungen aus dem Lysat zu entfernen fällt. Das Protein Pellet solubilisiert und Proteine ​​mit GELFrEE fraktioniert. Jede Fraktion wurde mit FASP mit LysC und Trypsin Endoproteinasen verdaut. Die LysC (grüne Rohre) und Trypsin-Peptide (lila Röhren) von jeder Fraktion werden mit nano LC-MS/MS und Proteine ​​durch die Suche MS-Daten mit MASCOT identifiziert analysiert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51186/51186fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um zu sehen große</a><html> r Bild. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51186/51186fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51186/51186fig4.jpg" /> 4. Silber-gefärbtes Gel Cochlea Sinnesepithels GELFrEE Fraktionen, um Proteintrennung in jeder Fraktion vor der MS-Analyse zu visualisieren. (M) Protein-Marker (1) Fraktion 1 (3) Die Fraktion 2 (5) Die Fraktion 5 (7) Fraktion 7, (8) Fraktion 8 (9)-Fraktion 9 (10), Fraktion 10 (11), Fraktion 11 (12), Fraktion 12. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung aus Darville und 24 Sokolowski. Urheberrecht 2013 von der American Chemical Society. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51186/51186fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> / Files/ftp_upload/51186/51186fig5.jpg &quot;/&gt; 5. GO zellulären Komponenten von Protein IDs bei der Durchführung einer (A) ersten und zweiten Verdau mit Trypsin nach GELFrEE Trennung und (B) zunächst mit LysC Verdauung, gefolgt von einer zweiten Verdauung mit Trypsin nach GELFrEE Trennung. Alle Kategorien sind nicht ausschließlich gezählt, wenn ein Protein mehr als eine Kategorie für zelluläre Komponenten. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51186/51186fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51186/51186fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51186/51186fig6.jpg" /> 6. GO zellulären Komponenten Profil für alle, die anhand SCX, WAX, oder GELFrEE Trennung Proteinen. Wenn ein Protein hatten mehr als eine Kategorie für Zellkomponenten, alle seine Kategories wurden nicht ausschließlich gezählt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51186/51186fig6highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

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Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Proteomanalyse des Cochlea-sensorischen Epithel kann eine Herausforderung aufgrund seiner geringen Größe und weil Membranproteine ​​sind schwer zu isolieren und zu identifizieren. Sowohl Membran und lösliche Proteine ​​können durch die Kombination mehrerer Herstellungsverfahren und Trennverfahren mit hochauflösenden Massenspektrometrie identifiziert werden.

Bottom-up-und Shotgun Proteomics, um eine umfassende Cochlear Proteome Identifizieren

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

bottom-up-shotgun-proteomics-to-identify-comprehensive-cochlear

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Aufrufe.  University of South Florida.  Proteomanalyse des Cochlea-sensorischen Epithel kann eine Herausforderung aufgrund seiner geringen Größe und weil Membranproteine ​​sind schwer zu isolieren und zu identifizieren. Sowohl Membran und lösliche Proteine ​​können durch die Kombination mehrerer Herstellungsverfahren und Trennverfahren mit hochauflösenden Massenspektrometrie identifiziert werden. 

Serie: Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Forschung

Biologie

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Capture Compound Mass Spectrometry - Ein leistungsfähiges Tool zum Identifizieren Novel c-di-GMP Effektorproteinen

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without breaching the collagenous basement membrane. While DCIS is a non-obligate precursor to invasive breast cancers, the molecular mechanisms and cell populations that permit progression to invasive cancer are not fully known. To determine if progenitor cells capable of invasion existed within the DCIS cell population, we developed a methodology for collecting and culturing sterile human breast tissue at the time of surgery, without enzymatic disruption of tissue.
Sterile breast tissue containing ductal segments is harvested from surgically excised breast tissue following routine pathological examination. Tissue containing DCIS is placed in nutrient rich, antibiotic-containing, serum free medium, and transported to the tissue culture laboratory. The breast tissue is further dissected to isolate the calcified areas. Multiple breast tissue pieces (organoids) are placed in a minimal volume of serum free medium in a flask with a removable lid and cultured in a humidified CO2 incubator. Epithelial and fibroblast cell populations emerge from the organoid after 10 - 14 days. Mammospheres spontaneously form on and around the epithelial cell monolayer. Specific cell populations can be harvested directly from the flask without disrupting neighboring cells. Our non-enzymatic tissue culture system reliably reveals cytogenetically abnormal, invasive progenitor cells from fresh human DCIS lesions.

Primary cell culture using intact tissue organoids provides a model system that mimics the multi-cellular in vivo microenvironment. We developed a serum-free primary breast epithelium tissue culture model that perpetuates mixed cell culture lineages and exhibits differentiated morphology, without enzymatic tissue disruption. Breast organoids remain viable for &#62;6 months.

Nicht-enzymatische, Serumfreie Zellkultur von Pre-invasive Brustläsionen für Spontane Erzeugung Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...